Gata4, Mef2c और Tbx5 का इष्टतम अनुपात व्यक्त एक Polycistronic निर्माण का उपयोग प्रेरित cardiomyocytes की बेहतर पीढ़ी

Developmental Biology

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Wang, L., Liu, Z., Yin, C., Zhou, Y., Liu, J., Qian, L. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. J. Vis. Exp. (105), e53426, doi:10.3791/53426 (2015).

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Abstract

प्रेरित cardiomyocytes में हृदय fibroblasts (सीएफएस) के प्रत्यक्ष रूपांतरण (ICMS) हृदय रोग के उपचार के लिए वैकल्पिक रणनीतियों की पेशकश के द्वारा पुनर्योजी चिकित्सा के लिए महान क्षमता रखती है। इस रूपांतरण ऐसे Gata4 (जी), Mef2c (एम) और Tbx5 (टी) के रूप में परिभाषित कारकों के लिए मजबूर अभिव्यक्ति द्वारा हासिल किया गया है। परंपरागत रूप से, ICMS इन व्यक्तिगत कारकों व्यक्त वायरस का एक कॉकटेल द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। हालांकि, दक्षता reprogramming अपेक्षाकृत कम है और इन विट्रो की सबसे जी, एम, फ़ाइब्रोब्लास्ट यह मुश्किल reprogramming के तंत्र का अध्ययन करने के लिए कर रही है, पूरी तरह से reprogrammed नहीं हो जाते टी transduced। हमने हाल ही में जी, एम के stoichiometry, टी कुशल आईसीएम reprogramming के लिए महत्वपूर्ण है कि पता चला है। एक एम और हमारे polycistronic MGT वेक्टर (इसके बाद MGT के रूप में करने के लिए कहा गया है) में काफी वृद्धि हुई reprogramming दक्षता का उपयोग करके हासिल जी और टी के निम्न स्तर के सापेक्ष उच्च स्तर के साथ जी, एम, टी का इष्टतम stoichiometry और इन विट्रो में सुधार आईसीएम गुणवत्ता। यहाँ हम हृदय fibroblasts से MGT निर्माण के साथ ICMS उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया पद्धति का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। हृदय फ़ाइब्रोब्लास्ट, reprogramming और reprogramming प्रक्रिया के मूल्यांकन के लिए वायरस की पीढ़ी के अलगाव भी ICMS के कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी के लिए एक मंच प्रदान करने के लिए शामिल किए गए हैं।

Protocol

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल नवजात चूहों का उपयोग करता है। जानवरों की देखभाल और प्रयोगों के उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में डिवीजन प्रयोगशाला पशु चिकित्सा (DLAM), चैपल हिल द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाता है।

बफ़र और मीडिया की 1. तैयारी

  1. Fibroblast (एफबी) के माध्यम से तैयार: 100 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 6 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ 500 मिलीलीटर IMDM मीडिया अनुपूरक।
  2. 100 मिलीलीटर M199 मीडिया और 50 मिलीलीटर FBS के साथ 400 मिलीलीटर DMEM मीडिया के पूरक: आईसीएम मध्यम तैयार।
  3. B27 मध्यम तैयार: 10 मिलीलीटर B27 मीडिया के साथ 490 मिलीलीटर RPMI1640 मीडिया अनुपूरक।
  4. बेनी-ई संस्कृति के माध्यम तैयार: 50 मिलीलीटर एफबीएस, 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 5 मिलीलीटर गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ 500 मिलीलीटर DMEM मीडिया अनुपूरक।
  5. बेनी-ई अभिकर्मक मध्यम तैयार: 50 मिलीलीटर FBS और 5 मिलीलीटर गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ 500 मिलीलीटर DMEM मीडिया अनुपूरक।
  6. पीआरepare जिलेटिन 24 अच्छी तरह से थाली में लिपटे: 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए 0.5 मिलीलीटर 0.1% जिलेटिन समाधान जोड़ें, सही उपयोग करने से पहले कम से कम 10 मिनट और महाप्राण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. FACS लेबलिंग बफर तैयार: 2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 10 मिलीलीटर FBS और 2 मिलीलीटर EDTA (0.5 एम) के साथ 500 मिलीलीटर DPBS अनुपूरक। 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से गुजरती हैं।
  8. बफर छँटाई एमएसीएस तैयार: 2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए 2.5 ग्राम बीएसए और 2 मिलीलीटर EDTA (0.5 एम) के साथ 500 मिलीलीटर DPBS अनुपूरक। 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से गुजरती हैं।
  9. अभिकर्मक के लिए 2x एचबीएस बफर तैयार: 280 मिमी NaCl (8.1816 छ), 10 मिमी KCl (0.३७,२७५ छ), 1.5 मिमी ना 2 4 HPO (०.१०,६४७ छ), 12 मिमी ग्लूकोज के साथ 500 मिलीलीटर HEPES बफर (50 मिमी) पूरक (१.०८०९६ जी )। 7.05-7.12 पीएच को समायोजित करने के लिए लगभग 650 μl 10 एन NaOH जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना फिल्टर और दुकान के माध्यम से फिल्टर।
  10. अभिकर्मक के लिए 2.5 एम 2 CaCl समाधान तैयार: 18.376 ग्राम सीए जोड़ेंसीएल 2-50 मिलीलीटर DDH 2 ओ 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना फिल्टर और दुकान के माध्यम से फिल्टर।
  11. आईसीसी (immunocytochemistry) निर्धारण बफर तैयार: 4% की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 35 मिलीलीटर DPBS के लिए 5 मिलीलीटर paraformaldehyde (पीएफए, 32%) जोड़ें।
  12. आईसीसी permeabilization बफर तैयार: 0.1% की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 100 मिलीलीटर DPBS के लिए 0.1 मिलीलीटर ट्राइटन जोड़ें।
  13. आईसीसी को अवरुद्ध बफर तैयार: 5% की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 100 मिलीलीटर DPBS के लिए 5 ग्राम गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) जोड़ें।
  14. आईसीसी धुंधला बफर तैयार: 1% की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 100 मिलीलीटर DPBS के लिए 1 ग्राम बीएसए जोड़ें।

नवजात माउस कार्डिएक fibroblasts की 2. जनरेशन

  1. Explant संस्कृति विधि से हृदय fibroblasts उत्पन्न
    1. स्वच्छ नवजात αMHC-GFP ट्रांसजेनिक माउस 75% इथेनॉल के साथ (p2 करने के लिए पी 1)। बाँझ कैंची से सिर काट दिया। फिर एक दूसरे के बगल के नीचे से एक क्षैतिज चीरा बनाते हैं। एक बाँझ प्रयोग करेंकुंद और तुला संदंश दिल काटना और ठंडा पीबीएस बफर युक्त 24 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से में जगह के लिए।
      1. वैकल्पिक रूप से, क्षैतिज चीरा के बाद दिल बाहर निचोड़।
    2. फ्लोरोसेंट खुर्दबीन से दिल में GFP अभिव्यक्ति की जाँच करें। GFP अभिव्यक्ति एक हृदय विशिष्ट प्रमोटर है कि αMHC प्रमोटर द्वारा संचालित है, अत: नकारात्मक दिल किसी प्रतिदीप्ति में मंद है, जबकि ट्रांसजेनिक माउस से दिल, हरी 15 में होना चाहिए।
    3. एक 60 मिमी केंद्र अच्छी तरह से संस्कृति डिश में 3-4 GFP सकारात्मक दिल ले लो और बाँझ कैंची और संदंश द्वारा छोटे-छोटे टुकड़ों के आकार में कम से कम 1 मिमी 3 में उन्हें कीमा।
    4. 2 मिलीलीटर एफबी मीडिया के साथ एक 10 सेमी पकवान में 3-4 कीमा दिलों रखें। ऊतकों 3 घंटे के लिए नीचे तय है।
    5. धीरे-धीरे हृदय के ऊतकों से युक्त व्यंजनों के लिए 8 मिलीलीटर पूर्व गर्म एफबी मीडिया जोड़ें। तीन दिनों के लिए ऊतकों को परेशान मत करो।
    6. हर तीन दिन मीडिया बदलें।
    7. दिन 7, aspir परसंस्कृति के माध्यम से खाया और DPBS के साथ कोशिकाओं को धो लें। प्रत्येक थाली करने के लिए 3 मिलीलीटर 0.05% trypsin जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाने।
    8. ट्रिप्सिन बुझाने के लिए 5 मिलीलीटर एफबी मीडिया जोड़ें। धीरे से एक सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं को अलग। ऊपर और आगे यंत्रवत् ऊतक अलग कर देना करने के लिए नीचे मीडिया पिपेट।
    9. कोशिकाओं को इकट्ठा करने और हृदय के ऊतकों के टुकड़े के संक्रमण से बचने के लिए 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फिल्टर, और फिर 5 मिनट के लिए 200 XG पर कताई द्वारा गोली कोशिकाओं।
    10. कोशिकाओं को धो लें एक बार एमएसीएस के साथ बफर और कोशिकाओं छंटाई के लिए तैयार हैं।
  2. एंजाइम पाचन विधि से हृदय fibroblasts उत्पन्न
    1. हार्वेस्ट GFP 2.1.1 के रूप में सकारात्मक दिल। 10 मिलीलीटर ठंडा DPBS के साथ एक 10 सेमी डिश में सब के दिल स्थानांतरण।
    2. रक्त को हटा दें और ठंडा DPBS के साथ एक बार कुल्ला करने के लिए बाँझ संदंश के साथ निलय निचोड़।
    3. अन्य ऊतकों और वसा से मुक्त होने के दिलों ट्रिम।
    4. अभी भी शिथिल जुड़े हुए हैं कि मोटे तौर पर 4 टुकड़ों में हर दिल में कटौती।
    5. कम से कम 20 दिल, 8 मिलीलीटर गर्म 0.05% trypsin EDTA के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में दिल हस्तांतरण, और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      1. 20-30 दिलों देखते हैं, तो 10 मिलीलीटर गर्म 0.05% trypsin EDTA के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में दिल हस्तांतरण, और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    6. ट्रिप्सिन त्यागें और HBSS में या (20-30 दिलों के लिए) 10 मिलीलीटर गर्म प्रकार द्वितीय कोलैजिनेज़ (0.5 मिलीग्राम / एमएल) (कम से कम 20 दिलों के लिए) 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. भंवर 4-6 चारों ओर गति स्तर पर 1 मिनट के लिए vortexer पर ट्यूब (तरल ढकने के लिए ऊपर नहीं मिलता है, तो गति ठीक है)।
    8. 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब सेते हैं।
    9. 1 मिनट के लिए ट्यूब भंवर।
    10. ऊतक टुकड़े बसने जब तक गंभीरता से 1 मिनट के लिए तलछट, 5 मिलीलीटर ठंड एफबी मध्यम युक्त एक नया ट्यूब में तरल इकट्ठा।
    11. दोहराएँ 2.2.6-2.2.10 3-5 बार दोहराएँ।
    12. 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से छान कर सभी संग्रह का मिश्रणएकल कक्ष निलंबन बनाने के लिए।
    13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र।
    14. Resuspend 10 मिलीलीटर एमएसीएस बफर में कोशिकाओं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र।
    15. वैकल्पिक: 1 मिलीलीटर आरबीसी lysis बफर (150 मिमी एनएच 4 सीएल, 10 मिमी KHCO 3, और 0.1 मिमी EDTA) के साथ रक्त कोशिकाओं, resuspend कोशिकाओं का एक बहुत कुछ कर रहे हैं, तो 10 मिलीलीटर एमएसीएस के साथ पतला, 1 मिनट के लिए बर्फ पर रख बफर और 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र। एमएसीएस बफर के साथ एक बार धो लें।
  3. एमएसीएस द्वारा Thy1.2 + fibroblasts की अलगाव (चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई)
    1. Trypan नीले रंग धुंधला के माध्यम से व्यवहार्य सेल संख्या निर्धारित है।
      1. कदम 2.2.14 में 10 मिलीलीटर सेल निलंबन से 10 μl कोशिकाओं बाहर ले जाओ। 10 μl 0.4% trypan नीले समाधान के साथ मिश्रण।
      2. एक hemocytometer के लिए मिश्रण जोड़ें। यह 3-5 मिनट के लिए खड़े हैं और फिर एक खुर्दबीन के नीचे तुरंत जांच करने के लिए अनुमति दें। नीले और व्यवहार्य कोशिकाओं में दाग रहे हैं मृत कोशिकाओं को बेदाग हैं।
      3. 4 एक्स 10 10 (सेल निलंबन की कुल मात्रा) x।
    2. कम से कम 1 10 x 7 कोशिकाओं के लिए, 90 μl में 10 μl Thy1.2 microbeads के साथ resuspend कोशिकाओं एमएसीएस बफर ठंडा। 1 से अधिक 10 x 7 कोशिकाओं रहे हैं आनुपातिक यदि अधिक मोती जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और 30 मिनट के लिए एक रेफ्रिजरेटर (2-8 डिग्री सेल्सियस) में सेते हैं।
    3. 10 मिलीलीटर एमएसीएस बफर और स्पिन नमूने 5 मिनट के लिए 200 XG पर जोड़ें; फिर 10 मिलीलीटर एमएसीएस बफर और सेंट्रीफ्यूज के साथ एक बार धो लें।
    4. एमएसीएस बफर में 2 मिलीलीटर मात्रा लाओ।
    5. एक एमएसीएस सेपरेटर हुड में स्थापित की। विभाजक के लिए एक लोकसभा स्तंभ डालें। एमएसीएस स्तंभ के लिए बफर 3 मिलीग्राम यह संतुलित करने के लिए लागू करें।
    6. Equilibrated लोकसभा स्तंभ के माध्यम से सेल निलंबन से गुजरती हैं।
    7. हर बार बफर 2 मिलीलीटर एमएसीएस के साथ 3 बार धोएं।
    8. टी बंद लोकसभा स्तंभ लोवह सेपरेटर और एमएसीएस एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में बफर 2 मिलीलीटर के साथ 3 बार elute।
    9. 5 मिनट के लिए 200 XG पर स्पिन।
    10. 10 मिलीलीटर एफबी मीडिया में Resuspend कोशिकाओं, कोशिकाओं की गिनती और उचित घनत्व में प्लेटों में बीज। Explant संस्कृति विधि से उत्पन्न fibroblasts के लिए, बोने कोशिकाओं घनत्व लगभग 2-3 10 x 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से थाली हो सकता है। एंजाइम पाचन विधि से उत्पन्न fibroblasts के लिए, कोशिकाओं घनत्व लगभग 4-5 10 x 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से थाली हो सकता है।

आईसीएम reprogramming के लिए रेट्रोवायरस के 3. पीढ़ी

नोट: बाँझ शर्तों के तहत एक BSL2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट में निम्न चरणों का प्रदर्शन। कोशिकाओं, पिपेट सुझाव और ट्यूबों के उचित निपटान पर्यावरण और स्वास्थ्य के खतरों के जोखिम से बचने के लिए सिफारिश की है।

  1. 1 माइक्रोग्राम / एमएल puromycin और 10 माइक्रोग्राम / एमएल ख के साथ पूरक बेनी ई मीडिया में बेनी ई कोशिकाओं को बनाए रखें5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर lasticidin।
  2. 2 दिन, puromycin और blasticidin कमी बेनी ई संस्कृति के माध्यम से मध्यम जगह।
  3. 0 दिन पर, 10 सेमी व्यंजन लगभग अभिकर्मक पहले दिन प्रति प्लेट 4-5 एक्स 10 6 कोशिकाओं में बेनी ई कोशिकाओं को विभाजित। प्रकोष्ठों ~ अभिकर्मक के दिन पर 80-90% मिला हुआ होना चाहिए।
  4. 1 दिन, पूर्व अभिकर्मक के लिए एक घंटा के भीतर कोशिकाओं पर अभिकर्मक मीडिया के लिए परिवर्तन संस्कृति मीडिया। इस प्रकार के रूप अभिकर्मक प्रक्रिया है:
    1. वाणिज्यिक किट का उपयोग कर अभिकर्मक
      1. 20 μl अभिकर्मक अभिकर्मक (जैसे Lipofectamine) और 500 μl मिश्रण को कम सीरम मीडिया (जैसे, ऑप्टी सदस्य)। सीरम मीडिया के लिए कम एक और 500 μl रेट्रोवायरल प्लाज्मिड के 10 माइक्रोग्राम जोड़ें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रत्येक मिश्रण सेते हैं।
      2. धीरे धीरे अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए प्लाज्मिड मिश्रण जोड़ें। यह कदम 15-30 सेकंड लग सकते हैं। (समाधान बादल दिखाई दे सकते हैं) आरटी पर 20 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं। कोशिकाओं के लिए बुद्धिमान मिश्रण बूंद जोड़ें।
      3. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते हैं।
    2. कैल्शियम फास्फेट का उपयोग कर अभिकर्मक।
      1. 40 μl 2.5 एम 2 CaCl और 440 μL DDH 2 हे, तो रेट्रोवायरल प्लाज्मिड के 20 माइक्रोग्राम (कुल मात्रा 500 μl है कि इतनी DDH 2 हे की राशि को समायोजित) जोड़ मिलाएं।
      2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब एचबीएस 2x 500 μl जोड़ें।
      3. एचबीएस भंवर और इस बीच एचबीएस के लिए कैल्शियम डीएनए मिश्रण बुद्धिमान बूंद जोड़ें। यह कदम प्रत्येक नमूना के लिए 30 सेकंड के चारों ओर ले जाता है। तो ज़्यादा से ज़्यादा एक साथ 3-4 नमूने करते हैं।
      4. लंबे समय के वेग को ले जाएगा बड़े वेग और कम कोशिकाओं की ओर जाता है के लिए 3 मिनट ऊष्मायन के लिए आरटी पर सेते हैं।
      5. मिश्रण कोशिकाओं के लिए वार छोड़ देता है और 20X खुर्दबीन के नीचे का निरीक्षण जोड़ें। ललित अवक्षेप (छोटे लोगों का एक बहुत अच्छा कर रहे हैं, लेकिन कुछ बड़े लोगों में अच्छा नहीं कर रहे हैं) में देखा जाना चाहिए।
      6. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर सेते हैं।
    3. 2 दिन, संस्कृति मीडिया prewarmed 8 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं पर मीडिया बदल जाते हैं। 24 घंटे के लिए सेते हैं।
    4. दिन 3 और 4 दिन, एक 0.45 माइक्रोन रोमकूप आकार सेलूलोज एसीटेट फिल्टर के माध्यम से यह छान, एक 10 मिलीलीटर बाँझ डिस्पोजेबल सिरिंज का उपयोग कर, और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करके व्यंजन से संस्कृति सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। हर 8 मिलीलीटर वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला को रेट्रोवायरस वर्षा समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे यह मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    5. दिन 5, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,500 × छ पर वायरल मिश्रण स्पिन। वायरल कणों ट्यूब के नीचे सफेद गोली में दिखाई देनी चाहिए।
    6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 5 मिनट के लिए 1,500 × छ पर centrifugation द्वारा अवशिष्ट समाधान स्पिन। गोली में उपजी रेट्रोवायरल कणों को परेशान करने के लिए नहीं बहुत ख्याल रख रही है, आकांक्षा द्वारा तरल पदार्थ के सभी निशान हटाने।
    7. हर 8 मिलीलीटर वायरल सतह पर तैरनेवाला के लिए 100 μl DPBS के बफर के साथ रेट्रोवायरल छर्रों Resuspend। विभाज्यबर्फ पर वायरस। तुरंत प्रयोग करें या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

    कार्डिएक fibroblasts की 4. Reprogramming

    1. 10 मिलीलीटर आईसीएम माध्यम में 10 मिलीग्राम / एमएल polybrene समाधान के 4 μl जोड़ें, और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे मिश्रण। polybrene के अंतिम एकाग्रता 4 माइक्रोग्राम / एमएल है।
    2. Fibroblasts के साथ वरीयता प्राप्त 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 500 μl आईसीएम मीडिया वाले polybrene जोड़ें।
    3. Explant संस्कृति या एंजाइम पाचन विधि से 4-5 10 x 4 कोशिकाओं से प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त या तो 2-3 x 10 4 कोशिकाओं के लिए 10 μl रेट्रोवायरस जोड़ें। वायरस की राशि आनुपातिक अलग संस्कृति प्लेटों या बर्तन में बढ़ सेल नंबर के साथ वृद्धि की जानी चाहिए। वायरल संक्रमण अनुमति देने के लिए 24-48 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली रखो। हृदय reprogramming के लिए समय की रेखा चित्र 1 में दिखाया गया है।
    4. वायरल पारगमन के बाद, 500 μl नियमित आईसीएम मीडिया के साथ वायरस युक्त मीडिया की जगह।
    5. हर 2-3 दिनों मीडिया बदलें। वायरल transduced कोशिकाओं के सकारात्मक चयन के लिए, कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में puromycin के साथ पूरक आईसीएम मीडिया जोड़ें। तीन दिनों के लिए रखें। उसके बाद, एक माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में आईसीएम माध्यम में puromycin बनाए रखें।
    6. तीन दिनों वायरल संक्रमण के बाद इनक्यूबेटर से बाहर की थाली ले और GFP अभिव्यक्ति निरीक्षण करने के लिए एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (20X) के तहत जगह है।
      नोट: दस दिनों वायरल संक्रमण के बाद, कोशिकाओं FACS विश्लेषण और reprogramming क्षमता का निर्धारण करने के लिए आईसीसी के विश्लेषण के लिए काटा जा सकता है (चरण 5 और 6)।
    7. चौदह दिनों वायरल संक्रमण के बाद, B27 मीडिया के साथ आईसीएम मीडिया की जगह। हर तीन दिन मीडिया बदलें। उठना, पिटाई सेल लोकी तीन (एंजाइम पाचन विधि से कोशिकाओं) या वायरल पारगमन के बाद चार (explant संस्कृति विधि से कोशिकाओं) सप्ताह से दिखाई दे सकते हैं।

    Reprogramming दक्षता 5. Immunocytochemical विश्लेषण

    1. कुल्ला कोशिकाओंतीन बार पीबीएस ठंड बर्फ के साथ; अतिरिक्त समाधान निकालने।
    2. 24 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.5 मिलीलीटर आईसीसी निर्धारण बफर जोड़ें। 15-20 मिनट के लिए आरटी पर कोशिकाओं को ठीक करें।
    3. पीबीएस तीन बार के साथ कोशिकाओं कुल्ला।
    4. 24 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.5 मिलीलीटर आईसीसी permeabilization बफर जोड़ें। 15 मिनट के लिए आरटी पर कोशिकाओं permeabilize।
    5. पीबीएस तीन बार के साथ कोशिकाओं कुल्ला।
    6. 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए बफर अवरुद्ध 0.5 मिलीलीटर आईसीसी जोड़ें, 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
    7. आईसीसी धुंधला बफर के साथ पतला प्राथमिक एंटीबॉडी। अच्छी तरह से 200 μl प्रत्येक के लिए एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस सेते हैं। एंटीबॉडी कमजोर पड़ने कारकों सामग्री में सूचीबद्ध हैं।
    8. अगले दिन, पीबीएस तीन बार के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    9. कोशिकाओं के लिए 200 μl माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    10. तीन बार के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    11. समाधान अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए DAPI युक्त बढ़ते 150 μl जोड़ें। 1 मिनट के लिए नाभिक दाग करने की अनुमति दें। फिरदौर गिलास को कवर पर्ची के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक को कवर किया और धीरे हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए एक संदंश के साथ नीचे की सतह के खिलाफ पर्ची दबाएँ।
    12. अतिरिक्त समाधान Aspirate और नमूने इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं। D14 पर कि एक्सप्रेस reprogrammed कोशिकाओं कार्डियक मार्कर cTnT और αActinin दिखा प्रतिनिधि छवियों चित्रा 2 बी में दिखाया जाता है।

    Reprogramming क्षमता 6. FACS विश्लेषण

    1. अच्छी तरह से DPBS के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 0.3 मिलीलीटर trypsin (0.05%) जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. धीरे कोशिकाओं उठाने की सुविधा के लिए थाली नल। माइक्रोस्कोप के तहत सेल टुकड़ी की जाँच करें। सबसे कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं जब प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर FACS बफर जोड़ें। पिपेट और आगे यंत्रवत् कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए नीचे।
    3. अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से एक साथ 96 गहरी अच्छी तरह से थाली करने के लिए 24 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं स्थानांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर स्पिन कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए।
    4. एक बार के साथ कोशिकाओं को धो लेंFACS बफर।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं resuspend 100 μl निर्धारण / permeabilization के समाधान जोड़ें।
    6. 1x धोने समाधान, गोली के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    7. 1x धो बफर में GFP और cTnT के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है। अच्छी तरह से 50 μl एंटीबॉडी समाधान के साथ प्रत्येक नमूने resuspend और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    8. 1x धोने समाधान, गोली में एक बार कोशिकाओं को धो लें, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    9. प्रत्येक नमूने के लिए एलेक्सा स्त्राव 488 संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश आईजीजी और एलेक्सा स्त्राव 647 संयुग्मित गधा विरोधी माउस आईजीजी युक्त 50 μl माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। अंधेरे में 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    10. 1x धोने समाधान, गोली में एक बार कोशिकाओं को धो लें, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    11. 400 μl निर्धारण बफर (1% पीएफए ​​के साथ DPBS) में Resuspend कोशिकाओं। सेल झरनी टोपी के साथ FACS ट्यूब में सेल स्थानांतरण। नमूने FACS का पता लगाने के लिए तैयार हैं। reprogramming efficienc के प्रतिनिधि FACS विश्लेषणY pMxs-puromycin-MGT चित्रा 2A में दिखाया गया है, के साथ या puromycin चयन के बिना निर्माण के प्रयोग से।

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Representative Results

reprogramming के कदम। चित्रा 1 में योजनाबद्ध द्वारा संक्षेप हैं MGT पारगमन के बाद, कोशिकाओं reprogramming में GFP अभिव्यक्ति के रूप में जल्दी transduced कोशिकाओं 3. puromycin चयन 3 दिन से शुरू होता है और पहले दो हफ्तों के दौरान बनाए रखा है दिन के रूप में पता लगाया जा सकता है, तो PMX-Puro -MGT का निर्माण किया जाता है। 14 दिन के लिए 10 दिन तक, cTnT और αActinin की तरह हृदय मार्करों की अभिव्यक्ति शुरू करने fibroblasts एक हृदय सेल की ओर reprogramming के दौर से गुजर रहे हैं यह दर्शाता है कि दोनों आईसीसी (चित्रा 2 बी, चरण 5) और FACS (2A चित्रा, चरण 6) से पता लगाया जा सकता है भाग्य।

चित्र 1
चित्रा 1:। हर समय बिंदु पर सीधा हृदय reprogramming प्रक्रिया की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रक्रिया काले बक्से में वर्णित हैं। प्रत्येक चरण के लिए संस्कृति मीडिया समय नीचे रंग का बक्से में दिखाए जाते हैंलाइन।

चित्र 2
चित्रा 2: FACS और आईसीसी द्वारा मूल्यांकन Reprogramming दक्षता MGT पारगमन के बाद 10 दिन में हौसले से पृथक fibroblasts से उत्पन्न ICMS पर (ए) FACS विश्लेषण।। DAPI साथ αMHC GFP, हृदय cTnT, और αActinin साथ 2 सप्ताह में ICMS (बी) धुंधला (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole)। स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय सफल आईसीएम पीढ़ी के लिए, समग्र दक्षता पर प्रभाव पड़ता है कि कई महत्वपूर्ण कारक हैं। विशेष रूप से शुरू करने fibroblasts की स्थिति और रेट्रोवायरस एन्कोडिंग MGT की गुणवत्ता में काफी reprogramming क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं।

यह संभव के रूप में ताजा और स्वस्थ fibroblasts उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है। Explants के बाद सात दिनों के बर्तन पर चढ़ाया गया से पहले explant संस्कृति विधि के लिए, fibroblasts के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एंजाइम पाचन विधि के लिए, fibroblasts के रूप में जल्दी अलगाव के अगले दिन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ठंड या reprogramming के लिए fibroblasts passaging सिफारिश नहीं है। Fibroblasts की ये अतिरिक्त उपचार काफी reprogramming दक्षता में कमी होगी। बोने घनत्व reprogramming क्षमता को प्रभावित करता है कि एक और महत्वपूर्ण कारक है। कोशिकाओं कम वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, वे अनियमित सेल आकृति विज्ञान के साथ और बड़े आकार में अस्वस्थ हो जाते हैं। शायद ही कभी सहULD उन कोशिकाओं ICMS में परिवर्तित किया। कोशिकाओं को भी घनी वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, तो वायरल संक्रमण के लिए MOI (संक्रमण की बहुलता) में कमी आई है। असंक्रमित fibroblasts की अतिवृद्धि काफी इस प्रकार ICMS के कम प्रतिशत में जिसके परिणामस्वरूप reprogramming घटनाओं dilutes। अधिक कोशिकाओं reprogramming के लिए वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, तो हम भी पत्थर की तरह आकारिकी में छोटे कोशिकाओं के उद्भव नोटिस। वे शायद ही reprogrammed किया और इस प्रकार कम reprogramming दक्षता में परिणाम सकता है। टिशू कल्चर व्यंजन के विभिन्न आकार के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित करते हैं, यह सेल नंबर बोने संस्कृति डिश की सतह क्षेत्र के लिए आनुपातिक रूप से समायोजित किया जा सिफारिश की है।

fibroblasts की पवित्रता reprogramming के लिए महत्वपूर्ण है। fibroblasts की उच्च शुद्धता हम यहाँ के रूप में वर्णित FACS 15 या एमएसीएस संवर्धन छँटाई द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। FACS छँटाई की तुलना में, एमएसीएस छंटाई, आसान gentler, और अधिक सुविधाजनक है। एमएसीएस के बाद सेल शुद्धता 90% w पर पहुँच सकता हैमुर्गी सख्ती प्रोटोकॉल के बाद। दूषित कोशिकाओं fibroblasts से reprogrammed किया जा करने के लिए कठिन हैं, क्योंकि fibroblasts की कम शुद्धता reprogramming दक्षता कम हो सकती है और वे reprogramming कोशिकाओं की तुलना में ज्यादा तेजी से पैदा करना है। यह भी अत्यधिक सही एमएसीएस के बाद कोशिकाओं बीज और रात में बोने के बाद वायरल संक्रमण प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है। छाँटे गए fibroblasts आंशिक रूप से ही proliferating कोशिकाओं को संक्रमित करता है कि रेट्रोवायरस के तेज कम हो जाती है, जो एक लंबे समय के लिए पकवान में बढ़ के बाद वृद्ध होनेवाला बन सकता है। पूंछ की नोक fibroblasts (TTFs) और भ्रूण (MEFs) fibroblasts 10,12,19,26 कारकों को कुछ अन्य प्रतिलेखन के साथ ICMS में परिवर्तित करने की सूचना दी गई है। हमारी प्रोटोकॉल यहां केवल हृदय fibroblasts पर केंद्रित है। अन्य fibroblast प्रकार के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन आगे होने के कारण इस तरह के प्रसार आनुवंशिक स्थिति, और epigenetic स्थलों के रूप में fibroblast हस्ताक्षर के निहित बदलाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

गुपारगमन के लिए रेट्रोवायरस की ई गुणवत्ता अत्यंत महत्व का है। कम अनुमापांक वायरस ICMS में fibroblasts परिवर्तित करने के लिए असफल। जबकि अत्यधिक मात्रा में वायरस सीधे कोशिका मृत्यु fibroblast की ओर जाता है कि cytotoxicity का कारण होगा। यह प्रयोगशाला सेट-अप और प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर reprogramming के लिए वायरल खुराक वायरल अनुमापांक निर्धारण और अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है। वायरल अनुमापन के लिए विधि को अच्छी तरह से 23 से पहले वर्णित किया गया है। वास्तव में हम बेनी ई कोशिकाओं के विकास हालत सीधे वायरल गुणवत्ता से संबंधित है कि पाया। यह कम बीतने (<30) प्रत्येक समय पर बेनी ई कोशिकाओं पिघलना करने के लिए सिफारिश की है। पारित होने के तीन से प्राप्त कोशिकाओं के घनत्व पर 10 सेमी संस्कृति डिश के अनुसार लगभग 4-5 x 10 6 कोशिकाओं पैकेजिंग वायरस के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, हौसले से काटा वायरस जमे हुए वायरस की तुलना में अधिक reprogramming दक्षता उपज। Reprogramming दक्षता possib कमी होगी एक और pMxs वेक्टर आधारित रेट्रोवायरस साथ MGT वायरस की है कि सह-संक्रमण कृपया ध्यान देंएक ही प्रकार के दो वायरस के बीच प्रतिस्पर्धा की वजह से Ly। दो अलग अलग अभिकर्मक तरीकों यहां प्रदान की जाती हैं। दोनों ही तरीकों से तुलनीय रेट्रोवायरस उत्पादन। वाणिज्यिक Lipofectamine महंगा, लेकिन स्थिर है, जबकि कैल्शियम फास्फेट के साथ अभिकर्मक सस्ता है। एचबीएस बफर की तैयारी एचबीएस बफर का पीएच काफी अभिकर्मक क्षमता को प्रभावित करता है, क्योंकि बड़ी सावधानी लेने की जरूरत है।

संबोधित करने की जरूरत है कि इस प्रोटोकॉल के कुछ सीमाएं हैं। सीमाओं में से एक अनिवार्य रूप से जैव सुरक्षा के मुद्दों के लिए दान करता है जो रेट्रोवायरस के उपयोग में निहित है। fibroblasts की विविधता और अलगाव के लिए विशिष्ट हृदय fibroblast मार्कर की कमी भी reprogrammable हैं कि कोशिकाओं की पवित्रता प्रभावित करते हैं। Reprogramming दक्षता की भिन्नता के कारण fibroblast हालत और वायरस के उत्पादन के लिए निहित बैच परिवर्तनशीलता के लिए मनाया जा सकता है। इसके अलावा, reprogrammed कोशिकाओं कार्डियक ट्रोपोनिन टी के रूप में sarcomere संरचना प्रोटीन व्यक्त हालांकिऔर αActinin, वे इस तरह सिकुड़ना और बिजली के प्रसार के रूप में कार्यात्मक गुणों की विशेषता परिपक्व cardiomyocytes अभी भी नहीं हैं।

संक्षेप में, यहाँ वर्णित कार्यप्रणाली एक भी निर्माण में एम, जी, टी प्रतिलेखन कारक की रेट्रोवायरल वितरण पर आधारित ICMS के कुशल पीढ़ी की अनुमति देता है। हमारी प्रोटोकॉल आईसीएम अनुसंधान के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और बहुमूल्य मंच प्रदान करता है, और उच्च throughput स्क्रीनिंग और आईसीएम reprogramming की यंत्रवत अध्ययनों पर चल रहे प्रयासों की सुविधा होगी, और अंततः नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए आईसीएम reprogramming के क्षेत्र के करीब ले जाते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-cardiac troponin T Thermo Scientific MS-295-PO 1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFP Life Technologies A11122 1:500 for both FACS and ICC
anti- aActinin Sigma-Aldrich A7811 1:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43 Sigma-Aldrich C6219 1:500 for  ICC
anit-Mef2c Abcam ab64644 1:1,000 for ICC 
anti-Gata4 Santa Cruz Biotechnology sc-1237 1:200 for ICC
anti-Tbx5 Santa Cruz Biotechnology sc-17866 1:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Inc 711-545-152 1:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Inc 715-605-150 1:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining BD Biosciences 554722
Rhod-3 Calcium Imaging Kit Life Technologies R10145
Thy1.2 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-101
Vectashield solution with DAPI Vector labs H-1500
FBS Sigma-Aldrich F-2442
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052
PRMI1640 medium Life Technologies 11875-093
B27 supplement Life Technologies 17504-044
IMDM Life Technologies 12440-053
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070
M199 medium Life Technologies 10-060
DMEM, high glucose Life Technologies 10-013
Penicillin-streptomycin Corning 30-002
Non-essential amino acids Life Technologies 11130-050
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668500
blasticidin Life Technologies A11139-03
puromycin Life Technologies A11138-03
Collagenase II Worthington LS004176
polybrene Millipore TR-1003-G
Triton X-100 Fisher BP151-100
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Sigma-Aldrich BP358-212
KCl Sigma-Aldrich PX1405
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
Glucose Sigma-Aldrich G6152
Bovine serum albumin Fisher 9048-46-8
paraformaldehyde EMS 15714
Retrovirus Precipitation Solution ALSTEM VC-200
0.4% Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
gelatin Sigma-Aldrich G1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) Sigma-Aldrich D8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Corning 21022
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter  Thermo Scientific 190-2545
24-well plates Corning 3524
10 cm Tissue culture dishes  Thermo Scientific 172958
60 mm center well culture dish   Corning 3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate Denville Scientific P9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
Centrifuge Eppendorf 5810R
Vortexer MINI VWR 58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging System Life Technologies AMAFD1000
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Round glass cover slip Electron Microscopy Sciences 72195-15

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