Bioluminescent कैल्शियम सूचक GFP-aequorin के आधार पर विवो कार्यात्मक ब्रेन इमेजिंग दृष्टिकोण में

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Neuroscience

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Summary

यहाँ हम एक bioluminescent संवाददाता का उपयोग कर दृष्टिकोण -imaging एक उपन्यास सीए 2 प्रस्तुत करते हैं। यह दृष्टिकोण सीए 2 को बांधता है और प्रकाश उत्तेजना के लिए दूर करने की जरूरत है, प्रकाश का उत्सर्जन करता है जो एक दूसरे से जुड़ने का निर्माण GFP-aequorin उपयोग करता है। गौरतलब है कि इस विधि गहरी मस्तिष्क संरचना और उच्च अस्थायी समाधान करने के लिए लंबे समय तक निरंतर इमेजिंग, पहुँच अनुमति देता है।

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Lark, A. R., Kitamoto, T., Martin, J. R. In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (107), e53705, doi:10.3791/53705 (2016).

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Abstract

Vivo इमेजिंग में कार्यात्मक समारोह और मस्तिष्क की कोशिकाओं और ब्याज की संरचनाओं के शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका बन गया है। हाल ही में bioluminescent संवाददाता GFP-aequorin (जीए) का उपयोग -imaging सीए 2 की एक नई विधि विकसित किया गया है। इसकी सहायक कारक coelenterazine के अलावा के साथ - - एक फोटान कलेक्टर के माध्यम से नजर रखी जा सकती है कि उज्ज्वल प्रकाश उत्सर्जक इस नई तकनीक कैल्शियम बंधन और के एक अणु सक्षम उत्पादन, GFP और aequorin जीनों के विलय पर निर्भर करता है। GFP-aequorin जीन ले जाने ट्रांसजेनिक लाइनों चूहों और ड्रोसोफिला दोनों के लिए उत्पन्न किया गया है। ड्रोसोफिला में, GFP-aequorin जीन मस्तिष्क के भीतर लक्षित अभिव्यक्ति और इमेजिंग के लिए अनुमति Gal4 / यूएएस द्विआधारी अभिव्यक्ति प्रणाली के नियंत्रण में रखा गया है। इस विधि को बाद में पता लगाने में सक्षम होना दिखाया गया है दोनों सीए आवक 2 + -transients और सीए 2 भीतरी दुकानों से -released। सबसे महत्वपूर्ण बात यह सतत रिकॉर्डिंग, मस्तिष्क के भीतर अधिक से अधिक गहराई में इमेजिंग में एक अधिक से अधिक अवधि के लिए अनुमति देता है, और (8.3 मिसे तक) उच्च अस्थायी प्रस्तावों पर रिकॉर्डिंग। यहाँ हम रिकॉर्ड और सीए मशरूम शरीर के भीतर 2 + -activity, मक्खी के मस्तिष्क में सीखने और स्मृति के लिए केंद्रीय एक संरचना का विश्लेषण करने के लिए bioluminescent इमेजिंग प्रयोग करने के लिए बुनियादी तरीका मौजूद है।

Introduction

मौलिक patterning और मस्तिष्क और उसके असतत संरचनाओं के भीतर गतिविधि का कार्य लंबे समय से तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र के भीतर गहन अध्ययन का क्षेत्र रहा है। शायद इस मुद्दे के समाधान के लिए किया जाता जल्द से जल्द सफल दृष्टिकोण से कुछ बिजली की गतिविधि में परिवर्तन का सीधा शारीरिक माप थे - करने के लिए अतिरिक्त क्षमताओं लाया है (गतिविधि के लिए प्रॉक्सी के रूप में) वोल्टेज, पीएच या कैल्शियम की सांद्रता में परिवर्तन का जीना इमेजिंग अनुमति है, जो हालांकि वैकल्पिक तरीकों neuronal गतिविधि 1 का अध्ययन। इमेजिंग तकनीक इस तरह कम invasiveness और पूरे मस्तिष्क संरचना के भीतर गतिविधि पर नजर रखने के लिए क्षमता के रूप में लाभ की एक विस्तृत सरणी ले। इसके अलावा फल सहित विनयशील आनुवंशिकी के साथ पशुओं में ड्रोसोफिला, ऐसे Cameleon, GCaMPs और दूसरों के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों के विकास के लिए उड़ान भरने एक एकल न्यूरॉन्स, neuronal आबादी और पूरे मस्तिष्क की निगरानी करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति दी हैसंरचनाओं। अधिक परंपरागत फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग तरीकों (calmodulin के लिए जुड़े हुए सीएफपी और YFP) (calmodulin के लिए जुड़े हुए GFP) या झल्लाहट GCaMPs का उपयोग करते समय अच्छा स्थानिक और लौकिक संकल्प प्रदान उपयोगी तकनीकों साबित हुई है, प्रकाश उत्तेजना की अंतर्निहित प्रक्रिया अपने प्रयोगात्मक पर कुछ सीमाएं engenders अनुप्रयोगों। कारण फलस्वरूप imaged किया जा सकता है कि संरचनाओं की गहराई की सीमा जो अनिवार्यत: उत्पादित कर रहे हैं प्रकाश उत्तेजना, autofluorescence, तस्वीर विरंजन, और phototoxicity की प्रकृति, करने के लिए, रिकॉर्डिंग की अवधि के साथ ही रिकॉर्डिंग के वास्तविक समय निरंतरता। दूसरे शब्दों में, रिकॉर्डिंग अक्सर इन अवांछित दुष्प्रभावों से बचने के लिए बीच-बीच में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।

क्योंकि इन चुनौतियों का, कैल्शियम इमेजिंग के अतिरिक्त वैकल्पिक तरीकों विकसित किया गया है। सबसे होनहार तरीकों में से एक कैल्शियम बाध्यकारी के बाद एक enzymatic प्रतिक्रिया के माध्यम से उत्पादित प्रकाश पर निर्भर करता है जो bioluminescent इमेजिंग है। Bioluminescenटी इमेजिंग पारंपरिक कैल्शियम इमेजिंग के रूप में ही कठिनाइयों का अनुभव नहीं है फलस्वरूप प्रकाश उत्तेजना की आवश्यकता होती है और नहीं है। bioluminescent संवाददाता Aequorin - Aequorea विक्टोरिया से अलग λ (GFP भी isolated- गया था जिसमें से एक ही जेलीफ़िश अपने तीन एफई हाथ संरचनाओं के माध्यम से कैल्शियम बांधता है और इसकी सहायक कारक coelenterazine के ऑक्सीकरण और नीले प्रकाश की रिहाई के लिए अग्रणी, एक गठनात्मक बदलाव आए = 469 एनएम) 2,3। Aequorin यह बहुत छोटी सी पृष्ठभूमि शोर पैदा करता है और intracellular कैल्शियम बफरिंग प्रणाली 4 के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है क्योंकि कैल्शियम यात्रियों की निगरानी के लिए आदर्श बनाता है, जो कैल्शियम (कश्मीर = 10 माइक्रोन) के लिए एक बहुत कम संबंध है। Aequorin पहले Xenopus अंडे 5 उत्पादित प्रकाश में तंत्रिका शामिल करने की प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है neuronal गतिविधि के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए उपयोग करने के लिए भी मंद है। इस चुनौती, फिलिप br एंड संबोधित करने के प्रयास में# 251; पाश्चर इंस्टीट्यूट में जाने और उनके सहयोगियों जेलीफ़िश 4 भीतर देशी राज्य नकल उतार GFP fusing और जीन aequorin एक आनुवंशिक निर्माण बनाया। इस संलयन जीन उत्पाद GFP के लिए गैर-radiatively ऊर्जा स्थानान्तरण जो coelenterazine, के ऑक्सीकरण के लिए अग्रणी एक गठनात्मक परिवर्तन होता है जो aequorin के तीन एफई हाथ संरचनाओं, के माध्यम से फिर से कैल्शियम बांधता है। बजाय aequorin से नीली बत्ती की GFP से हरे रंग का प्रकाश (λ = 509 एनएम) की विज्ञप्ति में यह ऊर्जा हस्तांतरण परिणाम है। GFP और aequorin के विलय भी अकेले 4 aequorin से 19-65 बार उज्जवल संलयन प्रोटीन का उत्पादन प्रकाश में मदद करने के लिए अधिक से अधिक प्रोटीन स्थिरता प्रदान करता है। मस्तिष्क के भीतर एक bioluminescent दृष्टिकोण का प्रयोग लगातार रिकार्डिंग की अवधि और दर्ज किया जा सकता है कि मस्तिष्क के भीतर संरचनाओं की संख्या के मामले में दोनों कैल्शियम इमेजिंग की वर्तमान प्रयोगात्मक आवेदन फैलता है। मोटे तौर पर पिछले काम के संदर्भ में यह है कि दोनों वैश्विक और अधिक से अधिक इसका मतलबमस्तिष्क के regionalized "गतिविधि" की विविधता (कैल्शियम यात्रियों की प्रॉक्सी के माध्यम से) पर नजर रखी जा सकती है। इससे भी महत्वपूर्ण गतिविधि को आसानी से मस्तिष्क में बेसल समारोह की पूरी समझ का पीछा करने के लिए उधार देता है जो एक वास्तविक समय और सतत आधार में, लंबे समय तक के लिए नजर रखी जा सकती है।

पिछले कुछ वर्षों में, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों द्विआधारी अभिव्यक्ति प्रणाली के नियंत्रण में GFP-aequorin (Gal4 / यूएएस GFP-aequorin) 5,6 व्यक्त ट्रांसजेनिक मक्खियों को विकसित किया है। हम प्रत्यक्ष निकोटिनिक आवेदन 9 से acetylcholine रिसेप्टर उत्तेजना के बाद मशरूम निकायों में सीए 2 -activity नियमन ऐसी खुशबू 7.8 के रूप में प्राकृतिक उत्तेजनाओं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अध्ययन सेलुलर घटकों द्वारा उत्पादित रिकार्ड गतिविधि के लिए GFP-aequorin bioluminescence का इस्तेमाल किया है। इसके अलावा, हम भी लंबी अवधि की तरह पहले से संबोधित किया जा करने में सक्षम नहीं किया गया है कि प्रयोगात्मक सवाल, के एक नंबर का पता करने के लिए GFP-aequorin का इस्तेमाल किया हैसहज कैल्शियम यात्रियों और गहरा मस्तिष्क संरचना 10 के दृश्य की इमेजिंग। हाल ही में, हम स्तनधारी एटीपी रिसेप्टर P2X 2 11 प्रक्षेपण न्यूरॉन्स में एक केशन चैनल, (पीएन) को व्यक्त करने के Gal4 / यूएएस प्रणाली का इस्तेमाल किया और (MB247-LexA मशरूम निकायों में GFP aequorin व्यक्त करने के लिए LexA सिस्टम का इस्तेमाल किया है, 13XLexAop2-IVS-G5A-बीपी) (बी फीफर, Janelia फार्म, यूएसए) के सौजन्य से एक। यह हमें इस तरह के एक गंध उत्तेजना के जवाब के रूप में अधिक प्राकृतिक परिस्थितियों, नकल उतार, बारी में मशरूम निकायों (पीएन के एक बहाव के लक्ष्य) को सक्रिय करता है जो एटीपी के आवेदन के द्वारा पीएन सक्रिय करने के लिए अनुमति दी गई है। कुल मिलाकर यह P2X 2 संयोजन तकनीक और GFP-aequorin प्रयोगात्मक संभावनाओं का विस्तार। मोटे तौर पर यह अलग उत्तेजनाओं और अव्यवस्थाएं गतिविधि के बेसल patterning को बदल सकते हैं के बारे में कैसे नए अध्ययन की शुरुआत, बेहतर मस्तिष्क में गतिविधि के पैटर्न को समझने का अवसर प्रदान करता है।

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Protocol

नमूने के 1. तैयारी

  1. समाधान की तैयारी और सेट अप
    1. मानक भोजन माध्यम पर 24 डिग्री सेल्सियस पर सभी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लाइनों को बनाए रखें। रियर और शीशी में कम घनत्व में उन्हें रखने के लिए मानकीकृत आकार और मक्खियों का वजन उत्पन्न करने के लिए।
      1. एक शीशी में 10 पुरुषों के साथ 10 कुंवारी महिलाओं जोड़ें, उन्हें दोस्त हैं और एक ताजा शीशी के लिए हर 2 दिन उन्हें हस्तांतरण। मक्खियों eclose शुरू करते हैं जब फिर 10 दिन बाद, हर दिन मक्खियों फसल। मक्खियों की उम्र का एक सटीक रिकॉर्ड रखें और उन्हें अच्छी हालत में रखने के लिए।
      2. 3 दिन में, महिलाओं से पुरुषों को अलग किया और महिलाओं शीशी प्रति 20 मक्खियों रखने के लिए। 4 या 5 दिन की उम्र में मक्खियों रिकॉर्ड।
    2. निम्नलिखित सांद्रता के साथ घंटी समाधान तैयार: 130 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी CaCl 2, 5 मिमी HEPES, और 36 मिमी सुक्रोज और ठीक 7.3 करने के लिए समाधान के पीएच को समायोजित। 25 μ का छिड़काव समाधान तैयार; घंटी समाधान में एम निकोटीन और 100 मिमी KCl।
    3. एक तिरछा करने के लिए (टिप के अंत से लगभग 35 डिग्री) एक रेजर ब्लेड आकार टिप का उपयोग और टिप से 1 आधा सेंटीमीटर से परे अतिरिक्त आधार निकालें: 1000 μl विंदुक टिप तैयार करें।
    4. गर्मी के दौरान नमूना के भंडारण के लिए बॉक्स (23 सेमी x 17 सेमी x 8.5 सेमी) तैयार करें। उनकी तैयारी पूरी कर ली है के रूप में पर नमूने जगह के लिए एक छोटा सा रैक तंत्र नीचे [नमूना सुखाना को रोकने के लिए] तल में पानी के साथ संतृप्त दो स्पंज (12 सेमी x 8 सेमी एक्स 3 सेमी) रखें।
    5. वे GFP-aequorin की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए एक Gal4 लाइन के यूएएस GFP-aequorin के कम से कम एक प्रति और एक प्रति शामिल है, ताकि मक्खियों नमूने तैयार। OK107 Gal4 लाइन (मुख्य रूप से मशरूम शरीर में एक लाइन ड्राइविंग अभिव्यक्ति) इस तैयारी में यूएएस GFP-aequorin के साथ पार कर जाता है।
      नोट: बॉक्स के अंदर निविड़ अंधकार होना चाहिए और बाहर गर्मी के दौरान coelenterazine की गिरावट को रोकने के लिए बॉक्स में प्रवेश करने से प्रकाश ब्लॉक चाहिए।
  2. प्रस्तुत करने कानमूनों की aration
    1. बर्फ एक कांच की शीशी को स्थानांतरित द्वारा ड्रोसोफिला anesthetize और विंदुक टिप में स्थिति के लिए ठंडा पेट्री डिश के लिए ले जाया जा रहा से पहले दो मिनट के लिए बर्फ पर रहते हैं। विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे बर्फ पर 100 मिलीलीटर पेट्री डिश में थोड़ा घटा फिल्टर पेपर पर विंदुक युक्तियाँ तैयार करें।
    2. धीरे संदंश जगह के साथ विंदुक टिप के अंदर उड़।
    3. धीरे धक्का और सिर टिप के किनारे पिछले पूरी तरह से है और पृष्ठीय क्षेत्र आंशिक रूप से टिप आकार देने (चित्रा 2 बी) के दौरान हटा दिया अनुभाग द्वारा अवगत कराया है कि इस तरह की मक्खी संरेखित एक ब्रश का उपयोग करना।
    4. दंत गोंद के दो घटकों के एक छोटे से (लगभग 3-4 μl) भागों का मिश्रण। Pipet टिप किनारे करने के लिए और चारों ओर वापस नीचे सिर और गर्दन के सामने चारों ओर ध्यान से गोंद लागू करें और - सिर का ताज से परहेज। 2 मिनट के लिए गोंद शुष्क करते हैं।
    5. रिकार्डिंग कक्ष (चित्रा 2 डी) और जनरल में छेद के माध्यम से चिपके मक्खी के साथ जगह विंदुक टिपtly जगह में सुरक्षित करने के लिए दबाएँ।
    6. सिलिकॉन गोंद (लगभग 3-4 μl) के दो घटक गठबंधन। चैम्बर और विंदुक टिप मिलने घंटी समाधान के रिसाव को रोकने के लिए जहां बढ़त के साथ चैम्बर के फ्लैट की ओर गोंद लागू करें। 2 मिनट के लिए गोंद शुष्क करते हैं।
  3. विच्छेदन
    1. छिड़काव चैनल, लघु किनारे पर टेप प्रत्यय और चैम्बर के पीछे करने के लिए विस्तार।
    2. फ्लोरोसेंट लैंप पर माइक्रोस्कोप बारी के तहत विच्छेदन ब्लॉक पर मक्खी के साथ चैम्बर रखें। चेंबर में घंटी समाधान की pipet 1 मिलीलीटर।
    3. छल्ली को दूर करने के लिए ठीक सर्जिकल चाकू का प्रयोग करें। Antennal क्षेत्र के लिए सिर के पीछे से समानांतर चीरों बनाओ। तब तो पिछले चीरों को जोड़ने एंटीना के ऊपर एक सीधा सा चीरा बनाने आंख की बढ़त के साथ काटा। सिर के पीछे में है कि करने के लिए एक अंतिम चीरा समानांतर बनाओ। छल्ली (चित्रा -2) को हटाने के लिए ठीक तेज संदंश का प्रयोग करें।
    4. धीरे एक काबू करने के लिए ठीक तेज संदंश का प्रयोग करेंमस्तिष्क और [fluorescing] मशरूम शरीर स्पष्ट रूप से कल्पना की है, जब तक दूर श्वसन ऊतक उजागर स्पष्ट घ।
    5. ध्यान से समझ और coelenterazine के पारगमन के लिए अनुमति देने के लिए मस्तिष्क को कवर neuroepithelial ऊतक चुटकी अति तीव्र संदंश का प्रयोग करें।
      नोट: वैकल्पिक papain neuroepithelia 9 permeabilize के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    6. एक pipet का प्रयोग, अंधेरे बॉक्स में विच्छेदन और जगह नमूना से किसी भी मलबे को हटाने के लिए घंटी समाधान के साथ दो बार धोने से बाहर।
    7. चेंबर में 5 माइक्रोन लोबान-coelenterazine युक्त घंटी समाधान की pipet 1 मिलीलीटर। 2 घंटे की एक न्यूनतम के लिए आरटी पर coelenterazine साथ ऊष्मायन बॉक्स को बंद करें और अनुमति देते हैं।

2. इमेजिंग

  1. सेट अप
    1. रिकॉर्डिंग प्रणाली शुरू: 25 डिग्री सेल्सियस के लिए माइक्रोस्कोप, कम्प्यूटर, कैमरा और जल निकासी व्यवस्था और सेट के कमरे पर पर्यावरण नियंत्रण की बारी है।
    2. ओपन मापन और कंप्यूटर पर ऑटोमेशन एक्सप्लोरर कार्यक्रम। पर क्लिक करें “ उपकरणों और इंटरफेस एनआई मोशन उपकरण ", पर फिर डबल क्लिक करें" "और अंत में ठीक क्लिक करें" पीसीआई-7334 "और चुनें" डिवाइस को प्रारंभ "।
    3. फोटॉन इमेजर खोलें। नया फ़ोल्डर और नाम पहली रिकॉर्डिंग फ़ाइल बनाएँ। सिस्टम में कार्य करेंगे पहले कैमरे -80 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाना चाहिए।
    4. सेट अप छिड़काव प्रणाली - जलाशयों को KCl, निकोटीन, और घंटी समाधान जोड़ने और 2 मिलीग्राम / मिनट पर इसलिए प्रत्येक समाधान निर्वहन समायोजित। प्रयोग शुरू करने से पहले घंटी समाधान के साथ धो लें।
  2. नमूना तैयार
    1. जगह इमेजिंग 5X बढ़ाई खुर्दबीन के नीचे पहाड़ पर ब्लॉक पकवान माउंट और पंचर के माध्यम से चैनल में छिड़काव ट्यूब डालने।
    2. फ्लोरोसेंट मोड पर सेट माइक्रोस्कोप तो केंद्र और ध्यान में मशरूम निकायों (एमबीएस) लाने के लिए। 20X और फिर से केंद्र और ध्यान केंद्रित करने को समायोजित करें।
    3. टिप इतना है कि जल निकासी पूल पर स्थिति जल निकासी तंत्र, बस abov जल निकासी अलग धकेलना की ऊंचाई को समायोजितई पूल, और पर्याप्त जल निकासी सुनिश्चित करने के लिए 30 सेकंड के लिए घंटी समाधान चलाते हैं।
    4. प्रकाश से तंत्र को सील करने के लिए ढाल नीचे खींच। फोटोन इमेजर में स्वचालित प्रणाली का उपयोग करते हुए ध्यान केंद्रित करने के लिए ठीक समायोजन करने और एमबीएस के एक संदर्भ के फ्लोरोसेंट छवि ले।
  3. रिकॉर्डिंग
    1. वांछित रिकॉर्डिंग गति (50 मिसे से ऊपर 1 सेकंड या उससे अधिक के लिए) के लिए फोटॉन गति को समायोजित करें। चुनें फोटोन मोड और खुले शटर। लॉग प्रविष्टियों में रिकार्ड जीनोटाइप, लिंग, उम्र, और नमूना संख्या। रॉय के बक्से पर क्लिक करके और नियंत्रण जबकि पकड़े खींचकर स्थिति आरओआई calyx और सेल निकायों (सीसीबी) से अधिक बक्से और औसत दर्जे का पालियों समायोजित करें।
    2. (वांछित के रूप में) के बारे में 5 से 10 मिनट के लिए रिकार्ड आधारभूत।
    3. 1 मिनट के लिए निकोटीन लागू करें। लॉग में प्रारंभ / बंद ध्यान दें। 5 मिनट के लिए घंटी समाधान के साथ धो लें।
    4. वसूली के लिए 5 मिनट रुको और KCl लॉग प्रविष्टि और टाइमर तैयार करते हैं।
    5. 1 मिनट के लिए KCl लागू करें। लॉग में प्रारंभ / बंद ध्यान दें। 1 मिनट के लिए घंटी समाधान के साथ धो लें।
    6. स्विचफ्लोरोसेंट मोड के लिए, अंतिम फ्लोरोसेंट छवि लेते हैं, और घंटी समाधान बंद कर देते हैं।
    7. प्रेस "बंद करो"। संवाद बॉक्स सिस्टम बंद करने के लिए कहेगा। "नहीं" रिकॉर्डिंग जारी रखने के लिए चयन करें।
    8. ओपन ढाल, चाल जल निकासी व्यवस्था, 5X करने के लिए स्विच लेंस उद्देश्य, छिड़काव ट्यूब निकालें। मंच से नमूना / रिकॉर्डिंग पकवान हटाने rinsing और पानी के साथ दो बार लेंस पोंछते द्वारा 20X लेंस को साफ।
    9. अगले रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए प्रोग्राम विंडो के शीर्ष पर सफेद खेलने बटन दबाएँ।

3. विश्लेषण और वीडियो निर्माण

  1. फोटोन मूल्यों को निकालने
    1. फोटोन विश्लेषण कार्यक्रम खोलें (जैसे, फोटॉन दर्शक) और खुला पहला नमूना स्प्रेडशीट फ़ाइल।
    2. प्रदर्शन नियंत्रण टैब का चयन करें। नियंत्रण धारण करते हुए क्षेत्र पर क्लिक करके आरओआई का चयन करें। GFP के प्रबुद्ध सीसीबी और औसत दर्जे का पालियों धरना हित के क्षेत्रों के आकार, अभिविन्यास और आकार को समायोजित करें।
    3. एक अतिरिक्त जोड़ेंऔर क्लिक करके "आरओआई को परिभाषित करें" क्लिक करने और नए लागत पर लाभ बनाने के लिए स्क्रीन पर खींचकर अल रॉय।
    4. फोटोन वीडियो खेलने के लिए "फिल्म" टैब का चयन करें। वांछित के रूप में "सेकंड चौड़ाई" और "सेकंड कदम" समायोजित करें। रॉय के स्थान के रूप में आवश्यक मरम्मत करना।
    5. GFP प्रतिदीप्ति, निकोटीन प्रतिक्रिया और KCl प्रतिक्रिया के प्रतिनिधि स्क्रीन शॉट्स का चयन करें। बाद में विश्लेषण और तुलना के लिए एक प्रस्तुति स्लाइड में फसल स्क्रीनशॉट और पेस्ट छवि।
    6. "सेकंड चौड़ाई" और सेकंड में रिकॉर्डिंग गति "सेकंड कदम" दोनों को समायोजित करें। प्रोत्साहन दीक्षा से पहले और सिर्फ प्रतिक्रिया अंत के बाद ब्रैकेट क्षेत्र के लिए शीर्ष पैनल पर ग्रे मार्करों ले जाकर विश्लेषण की लंबाई का चयन करें।
    7. "> खेल" और प्रेस "<< REW" प्रेस "खेलते हुए विचारों को निलंबित करें" का चयन करें। "दर चार्ट गणना" और वांछित और रेखा रंग रॉय के रंग से मेल की इकाइयों के रूप में समायोजित टैब का चयन करें।
    8. विश्लेषण समाप्त हो गया है, प्रेस "निर्यात दर डेटा गणना"। संयुक्त रिकॉर्डिंग सीसीबी और हर तरफ से ब्याज की औसत दर्जे का पालि क्षेत्र का चयन स्क्रीन शॉट्स। प्रतिक्रिया छवियों के साथ एक स्लाइड में फसल स्क्रीनशॉट और पेस्ट छवि। इस स्लाइड बाद में अंतिम विश्लेषण में इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. उदाहरण विश्लेषण: विस्तृत निकाले फोटोन डेटा के विश्लेषण के लिए एक विधि
    1. "दर निर्यात गणना" फ़ोल्डर में स्प्रेडशीट फ़ाइलें खोलें।
    2. कोशिकाओं घंटे और मिनट में समय प्रदर्शित करने के लिए प्रथम स्तंभ लेबल समय reformat।
    3. नमूने के लिए इसी स्लाइड संदर्भ। समय और दो प्रतिनिधि ROIs के लिए कॉलम को छोड़कर सभी मूल्यों को निकालें।
    4. निकोटीन उत्तेजना शुरू करने का समय निर्धारित करते हैं - मुख्य में लॉग प्रविष्टि फ़ाइल में उपलब्ध शुरू करने या उजागर मूल्य के लिए पूर्व अतिरिक्त डेटा हटाने फ़ोल्डरसो।
    5. सीसीबी और औसत दर्जे का पालि और मार्क / उजागर दोनों के लिए उच्चतम / शिखर मूल्य का पता लगाएं।
    6. दोनों के लिए प्रतिक्रिया शुरू और अंत समय निर्धारितसमय बिंदु का उपयोग कर एक अनुमान बनाने के द्वारा सीसीबी और औसत दर्जे का पालि स्लाइड पर प्रतिक्रिया रेखांकन और इन बातों से निकटता में मूल्यों में परिवर्तन से वास्तविक मूल्य का चयन इसी। सीसीबी और औसत दर्जे का पालियों दोनों में इन बिंदुओं के बीच इस क्षेत्र को हाइलाइट करें। वैकल्पिक रूप से, 9 एक मैक्रो का उपयोग करें।
    7. एक नए स्प्रेडशीट पर एक प्रयोगात्मक समूह के सभी नमूनों का मिश्रण।
    8. पंक्ति मूल्य निर्धारण से शिखर पर पंक्ति में प्रत्येक सीसीबी शिखर मूल्य के लिए है। कि नमूना डेटा को recopied किया जाना चाहिए जहां अनुमानित पंक्ति मूल्य निर्धारित करने के लिए उच्चतम पंक्ति मूल्य से कम मूल्यों घटाना। सभी चोटी के मूल्यों गठबंधन कर रहे हैं की जाँच करें।
    9. चादर दो बार कॉपी और औसत दर्जे का पालि कॉलम या केवल सीसीबी या औसत दर्जे का पालि मूल्यों के पन्नों बनाने सीसीबी कॉलम या तो हटा दें।
    10. सभी सीसीबी प्रतिक्रियाएं समाप्त हो गया है के बाद डेटा निकालें। चार पंक्तियों कुल फोटॉनों रिस्पांस लम्बाई (अवधि), शिखर आयाम, और प्रतिक्रिया विलंबता लेबल बनाएँ। कॉपी और मूल के नीचे फिर से इस पेस्ट।
    11. प्रतिक्रिया के दौरान कुल फोटॉनों निर्धारित करने के लिए योग समारोह का प्रयोग करें। प्रतिक्रिया की लंबाई निर्धारित करने के लिए भरोसा समारोह का प्रयोग करें। कॉपी और शिखर आयाम मूल्य निर्धारित करने के लिए उच्चतम मूल्य सेल लिंक। गिनती समारोह का प्रयोग करें - प्रतिक्रिया के शुरू करने के निकोटीन के छिड़काव की शुरुआत से चयन - प्रतिक्रिया विलंबता निर्धारित करने के लिए।
    12. सेकंड में गति रिकॉर्डिंग से (सभी शिखर आयाम को छोड़कर) गुणा जोड़ने समारोह का उपयोग करके और कॉपी मूल्यों।
    13. इसलिए (पूर्व .: चित्रा 5 ब, सी, डी) अगर वांछित बार / बॉक्स रेखांकन, इस तरह कुल फोटॉनों, शिखर आयाम, और उत्तर की लंबाई के रूप में गणना मापदंडों के लिए बनाया जा सकता है।
    14. कच्चे डेटा फोटॉन प्रतिक्रिया के बाद कॉलम में, औसत समारोह का उपयोग हर समय बिंदु के लिए कच्चे डेटा अंक औसत। मतलब (SEM) के मानक त्रुटि का निर्धारण एक स्तंभ के साथ वांछित पालन करें, एक समय बिंदु पर औसतन फोटोन मूल्यों से प्रत्येक के लिए हैं।
    15. एक औसत प्रतिक्रिया प्रोफाइल के निर्माण के लिए औसत स्तंभ का उपयोग करेंसीसीबी नमूना समूह के लिए ई [ग्राफ]। इस एक्स-अक्ष मूल्यों के रूप में समय निर्दिष्ट स्तंभ और y अक्ष के रूप में औसत फोटोन मूल्यों का स्तंभ का चयन करें और अंत में scatterplot ग्राफ निर्माण उपकरण का चयन करने के लिए।
    16. औसत दर्जे का पालियों से डेटा के साथ इस विश्लेषण प्रक्रिया को दोहराएँ।
  3. वीडियो के लिए चित्र बनाने
    1. ओपन फोटोन दर्शक।
    2. प्रदर्शन चयन नियंत्रण टैब। का चयन करें, हटाने और / या इसे कम करने के लिए नियंत्रण धारण करते हुए रॉय पर क्लिक करें।
    3. "सेकंड चौड़ाई" प्रत्येक फ्रेम की सामग्री का निर्धारण करने के लिए वांछित के रूप में (संचय समय) को संशोधित करें।
    4. प्रत्येक फ्रेम के ओवरलैप परिभाषित करने के लिए "सेकंड कदम" संशोधित करें।
    5. प्रेस "<< REW" फिर "खेलते हुए निर्यात नजारे" "खेल>" का चयन करें। वीडियो के लिए छवियों को .png फ़ाइलों की एक श्रृंखला के रूप में "दृश्य निर्यात" फ़ोल्डर को निर्यात किया जाएगा।
  4. वीडियो ग के लिए एक विधि: वर्चुअल डब का उपयोग वीडियो बनाने के लिएविस्तृत reation
    1. छवियों वाले दृश्य निर्यात फ़ोल्डर में "resultats" नाम का एक नया फ़ोल्डर बनाएँ।
    2. छवियों के फ़ोल्डर में स्क्रिप्ट (renommer.VBS) लाओ।
    3. Renommer.VBS पर डबल क्लिक करें चलाने के लिए।
    4. छवियों को स्वचालित रूप संख्यानुसार का नाम और "resultats" फ़ोल्डर में कॉपी किया जायेगा।
    5. ओपन VirtualDub.exe।
    6. खुला वीडियो फ़ाइल का चयन करें - (बाद में छवियों को स्वचालित रूप से लोड होगा) पहली छवि का चयन करें।
    7. चुनें वीडियो - वांछित के रूप में चयन फ्रेम दर को समायोजित।
    8. चुनें वीडियो - चुनें संपीड़न त्रिज्या से Cinepak कोडेक का चयन करें।
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Representative Results

aequorin को GFP के संलयन हमें माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 ए, 4 ए, 6A, 6E) पर फ्लोरोसेंट मोड में GFP की उत्तेजना के माध्यम से पहले bioluminescent इमेजिंग के लिए ब्याज की हमारे क्षेत्र कल्पना करने के लिए अनुमति देता है। मशरूम शव को प्रोत्साहित करने के लिए सरल तरीके से एक आइनोंट्रॉपिक निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स की सक्रियता के माध्यम से होता है। Acetylcholine इस रिसेप्टर की अंतर्जात ligand है हालांकि हम निकोटीन मशरूम शरीर में अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रतिक्रियाओं पैदा करता है कि मिल गया है। वे विशेष रूप से निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं और इस प्रकार निकोटीन का उपयोग करके हम कहीं और मस्तिष्क में व्यक्त मुस्कारिनिक acetylcholine रिसेप्टर्स के सक्रियण से बच सकते हैं क्योंकि इस हिस्से में है। इसके अलावा, निकोटीन acetylcholine से अधिक स्थिर है, और इस तरह बेहतर और अधिक विश्वसनीय प्रोत्साहन नियंत्रण की अनुमति देता है। एक ठेठ प्रतिक्रिया (चित्रा 4 देखें calyx, सेल निकायों (सीसीबी) और औसत दर्जे का पालियों (माले) दोनों के तेजी से सक्रियण के साथ शुरूलेबल छवि के लिए एक)। आम तौर पर सीसीबी प्रतिक्रिया अब तक रहता है और प्रतिक्रिया के अनुक्रमिक पैनलों के रूप में दिखाया पालियों की तुलना में एक अधिक से अधिक bioluminescent प्रतिक्रिया दर्शाती है (चित्रा -3 सी-एच)। चित्रा 4 बी 100 मिसे के एक अस्थायी समाधान पर दर्ज फोटॉनों की एक 10 सेकंड संचय (10 से पता चलता है 25 माइक्रोन के निकोटीन की एक 1 मिनट के छिड़काव के लिए एक प्रतिक्रिया के चोटी के दौरान हर्ट्ज)। हमें हमारे नमूना की व्यवहार्यता पुष्टि करने के लिए अनुमति देता है जो 100 मिमी KCl की एक 1 मिनट छिड़काव के एक दूसरे उत्तेजना शुरू की है 10 मिनट (आंकड़े 4C, ई) की एक वार्शआउट और वसूली की अवधि के बाद। मात्रात्मक प्रतिक्रियाओं फोटोन दर्शकों में विश्लेषण के दौरान रॉय के चयन करके विश्लेषण किया जा सकता है। फोटोन दर्शकों में विश्लेषण चल रहा है उन मूल्यों के दोनों समय (चित्रा 4D और ई) से अधिक चयनित आरओआई में उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या प्रदर्शित रेखांकन के साथ ही निर्यात स्प्रेडशीट पैदा करता है। चित्रा 4D एक examp हैLe Roi 2 [ग्रीन] में उत्सर्जित फोटॉनों की साजिश रचने फोटोन दर्शक (सही सीसीबी) और रॉय 4 [नीला] (सही औसत दर्जे का पालियों) द्वारा उत्पादित रेखांकन की। चित्रा 4E में प्रतिनिधित्व KCl प्रतिक्रिया के लिए इसी तरह के डेटा। निर्यात डेटा प्रतिक्रिया (चित्रा 5 ए) की वक्र को फिर से संगठित करने के साथ ही इस तरह की अवधि, शिखर आयाम, और कुल प्रतिक्रिया (चित्रा 5 ब-डी) के रूप में विभिन्न मापदंडों के बारे में अतिरिक्त डेटा निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हाल ही में हम एक और अधिक प्राकृतिक प्रतिक्रिया जानने की एक विधि तैयार कर लिया है Gal4 यूएएस और LexA सिस्टम का उपयोग कर। संक्षेप में, एटीपी-गेटेड P2X 2 केशन चैनल (पीएन) प्रक्षेपण न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है और GFP-aequorin (जीए) मशरूम निकायों में व्यक्त किया जाता है - पीएन का लक्ष्य; यह हमें चुनिंदा पीएन बदले में, मशरूम शरीर में प्रतिक्रिया (चित्रा 6) का उत्पादन कर सकते हैं जो एटीपी की हालांकि आवेदन, उत्तेजित करने के लिए अनुमति देता है।

आकृति 1 नदी के ऊपर सक्रियण अनुक्रम के साथ Bioluminescent रिपोर्टर (GFP aequorin) GFP की। (ए) योजनाबद्ध और aequorin संलयन जीन की चित्रा 1. लक्षण। सीए 2 के उच्च स्तर के जवाब में aequorin द्वारा नीले प्रकाश उत्सर्जन (बी) मॉडल। सीए के उच्च स्तर के जवाब में GFP aequorin द्वारा हरी प्रकाश उत्सर्जन (सी) मॉडल 2+। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. प्रायोगिक pipet टिप में तैनात हैं। (ए) मक्खी की स्थापना की। (बी) पर्याप्त gluing तकनीक का एक उदाहरण सिर को स्थिर और मक्खी शरीर और pipet टिप के बीच इस क्षेत्र को सील। (सी) सिर कैप्सूल को खोलने के लिए विच्छेदन के योजनाबद्ध। (डी) डाला छिड़काव ट्यूब के साथ ब्लॉक के आयोजन पर 1 मिलीलीटर चैम्बर। कुल चैम्बर आयाम: लंबाई: 7.4 सेमी, चौड़ाई: 2.7 सेमी, ऊंचाई: 0.55 सेमी। भीतरी कक्ष आयाम: लंबाई: 1.7 सेमी, चौड़ाई: 1.4 सेमी, ऊंचाई: 0.35 सेमी, और चैम्बर छेद की त्रिज्या: 0.1 सेमी। एमबीएस में GFP सकारात्मक संकेत दिखा उड़ सिर (ई) देखें: छल्ली को हटाने के बाद OK107-संचालित GFP-aequorin से निकाली गई प्रतिदीप्ति के साथ कम मंद प्रकाश। फोटोन कैमरा और छिड़काव प्रणाली के साथ (एफ) माइक्रोस्कोप। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
मशरूम निकायों में 25 माइक्रोन के निकोटीन के लिए चित्रा 3. प्रतिनिधि प्रतिक्रिया। (ए) के प्रतिदीप्त छविGA2 में मशरूम निकायों में GFP aequorin अभिव्यक्ति / +; OK107 / + नियंत्रण मक्खी मस्तिष्क (पैमाने बार = 50 माइक्रोन)। (बी) मशरूम निकायों में पीक bioluminescent प्रतिक्रिया। उत्तेजना से पहले (सी)। प्रतिक्रिया की (डी) प्रारंभ। (ई) पीक प्रतिक्रिया। (एफ) सीसीबी प्रतिक्रिया जारी रखा। (G) गिरने सीसीबी प्रतिक्रिया। (एच) प्रतिक्रिया का अंत (बिहार: पैमाने बार = 33 माइक्रोन)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
नमूना रिकॉर्डिंग की चित्रा 4. प्रतिनिधि विश्लेषण (ए) GA2 की मशरूम शरीर की फ्लोरोसेंट छवि / +;। OK107 / + नियंत्रण रॉय सीसीबी और औसत दर्जे का पालियों से अधिक चयनित (पैमाने बीए चार के साथ उड़आर = 50 माइक्रोन)। (बी), 25 माइक्रोन के निकोटीन के लिए bioluminescent प्रतिक्रिया के 10 सेकंड के संचय - 100 मिसे में दर्ज फोटॉन प्रतिक्रिया। (सी) 100 मिसे में दर्ज 100 मिमी KCl के लिए bioluminescent प्रतिक्रिया के 10 सेकंड के संचय। क्रमशः सही सीसीबी को कवर रॉय 2 और 4 के भीतर निकोटीन प्रतिक्रिया के दौरान उत्सर्जित फोटॉनों और औसत दर्जे का पालियों की दर्ज की गई संख्या (डी) ग्राफ़। रॉय 2 और 4 क्रमश: सही सीसीबी और औसत दर्जे का पालियों को कवर भीतर KCl प्रतिक्रिया के दौरान उत्सर्जित फोटॉनों की दर्ज की गई संख्या (ई) ग्राफ़। सही शाफ़्ट रॉय के भीतर फोटॉनों से मेल खाती है, जबकि डी और ई में छोड़ दिया, वाई अक्ष, देखने के लिए पूरे क्षेत्र के भीतर फोटॉनों की कुल संख्या से मेल खाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"चित्रा नमूना रिकॉर्डिंग की चित्रा 5. प्रतिनिधि मापदंडों का विश्लेषण GA2 / + में मशरूम शरीर के निकोटिनिक सक्रियण के लिए bioluminescent प्रतिक्रिया के प्रतिनिधि एक्सेल विश्लेषण;। OK107 / + नियंत्रण मक्खी। सीसीबी और औसत दर्जे का पालियों में समय के साथ (ए) फोटॉन प्रतिक्रिया। सीसीबी और औसत दर्जे का पालियों में प्रतिक्रियाओं का (बी) अवधि। (सी) सीसीबी और औसत दर्जे का पालियों भीतर प्रतिक्रिया के दौरान सबसे अधिक फोटॉन मूल्य (अधिकतम आयाम)। (डी) सीसीबी और पूरे प्रतिक्रिया की औसत दर्जे पालियों में कुल फोटॉनों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
Thr पीएन की उत्तेजना के बाद मशरूम निकायों में चित्रा 6. दो अलग प्रतिक्रियाough एटीपी और P2X 2। मशरूम निकायों में पीएन और GFP-aequorin (GH146 / + में P2X 2 व्यक्त नमूना 1 मक्खी; P2X 2 / MB247-Lexa, 13XLexAop2-IVS-G5A-बीपी (विज्ञापन) (ए) रॉय (पैमाने के साथ मशरूम निकायों के फ्लोरोसेंट छवि। बार = 50 माइक्रोन) मुख्य रूप से औसत दर्जे का पालियों में मनाया 500 माइक्रोन एटीपी के साथ प्रेरित P2X 2 से पीएन, की सक्रियता के बाद मशरूम निकायों में शिखर प्रतिक्रिया की। (बी) Bioluminescent छवि। (सी) शिखर KCl प्रतिक्रिया की Bioluminescent छवि। (डी प्रतिक्रिया भर में रॉय के क्षेत्रों के भीतर फोटान उत्सर्जन का) समय बेशक, नमूना मशरूम निकायों में पीएन और GFP-aequorin (GH146 / + में P2X 2 व्यक्त 2 मक्खी;। P2X 2 / MB247-Lexa, 13XLexAop2-IVS-G5A-बीपी (एह )। (ई) रॉय (पैमाने बार = 50 माइक्रोन) के साथ फ्लोरोसेंट छवि। (एफ) एक के बाद मशरूम निकायों में प्रेरित प्रतिक्रिया की Bioluminescent की छविP2X 2 से पीएन के ctivation पालियों और सीसीबी दोनों में, 1 मिमी एटीपी के साथ प्रेरित किया। (जी) शिखर KCl प्रतिक्रिया की Bioluminescent छवि। प्रतिक्रिया भर में रॉय के क्षेत्रों के भीतर फोटान उत्सर्जन, (एच) समय बेशक। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Cabrero एट अल में सूचना के रूप में यहाँ प्रस्तुत हाल ही में विकसित bioluminescent आधारित GFP-aequorin दृष्टिकोण जैसे गुर्दे ताराकार कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं के अन्य प्रकार में, के रूप में अच्छी तरह से अगर वांछित के रूप में, अलग न्यूरॉन्स में सीए 2 -activity की विवो कार्यात्मक रिकॉर्डिंग में अनुमति देता है। 2013 5।

संशोधन, मुसीबत शूटिंग, अतिरिक्त घटक है, और महत्वपूर्ण कदम

ड्रोसोफिला पशुपालन

GFP-aequorin ट्रांस्जीन (pG5A) 4 तीन स्वतंत्र transformant लाइनों 6 बनाने के लिए pUAST वेक्टर में डाला गया था। सभी लाइनों उनकी bioluminescence के लिए परीक्षण किया गया है, और सभी में विवो सीए 2 -activity 6 के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम थे। हालांकि अधिक हाल के प्रयोगों तीसरे गुणसूत्र पर डाला GA2 लाइन GA1 लाइन डाला ओ तुलना में अधिक मजबूत संकेत उत्पन्न ने बताया है किएन दूसरे गुणसूत्र। इधर, प्रतिनिधि परिणाम एमबी विशेष लाइन OK107 के साथ पार कर-GA2 यूएएस का उपयोग करके प्राप्त किया गया। इसके अलावा, हाल ही में बी फीफर 20XUAS नियामक तत्व (20X-G5A -2) के नियंत्रण में रखा एक GFP-aequorin निर्माण उत्पन्न किया है और इस निर्माण हमारी प्रयोगशाला में मान्य किया गया है। संक्षेप में, यह इसलिए और अधिक कुशल और आगे इस तरह दीर्घवृत्ताभ-शरीर के रूप में मस्तिष्क के गहरे ढांचे में सीए 2 -activity पर नजर रखने के लिए उपयोगी होना चाहिए जो हमारी मानक GA2, की तुलना में मजबूत एक बहुत मजबूत संकेत देता है। इसके अतिरिक्त, यह भी न्यूरॉन्स की या अक्षतंतु टर्मिनल (synaptic संपर्कों) में कम मात्रा इमेजिंग के लिए उपयोगी हो सकता है।

इमेजिंग के लिए तैयारी

मक्खी बर्फ स्थिति और चिपकाने के दौरान anesthetized किया जाना चाहिए, यद्यपि यह बर्फ पर समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। मक्खियों ठंडा पेट्री डिश के लिए ले जाया जा रहा से पहले एक कांच की शीशी को हस्तांतरित और 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिएविंदुक टिप में स्थिति के लिए। हम संज्ञाहरण की विस्तारित समय अवधि के नमूने की व्यवहार्यता को कम करता है और प्रतिक्रिया attenuate सकता है कि देखा है। बेहतर, हम 5-10 मिनट के नीचे बर्फ संज्ञाहरण का समय रहते हैं।

टेप और gluing महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। यह विच्छेदन और इमेजिंग के लिए जगह में उड़ सिर को सुरक्षित करने के साथ ही pipet टिप में और / या रिकार्डिंग कक्ष के बाहर घंटी समाधान के रिसाव को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। चिकित्सकीय गोंद (और एक हद तक कम सिलिकॉन गोंद के लिए) चिपचिपा हो जाते हैं और बाद में जैसे ही दोनों घटकों के संयुक्त रहे हैं के रूप में सुखाने के लिए शुरू हो जाएगा। इसलिए यह कमजोर संबंध और गोंद के clumping से बचने के लिए शीघ्रता से गोंद लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ मामलों में हम घंटी समाधान के साथ संपर्क में, मक्खी और उसकी प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं, जो घंटी समाधान में दूषित पदार्थों को जारी कर सकता है, जब टेप और गोंद की है कि वैकल्पिक किस्में देखा है, विशेष रूप से प्रयोगों टी समर्पित लिए इतनावह अलग odors का उपयोग कर, घ्राण प्रणाली का अध्ययन करते हैं। (हम उपयोग विशिष्ट किस्मों के लिए सामग्री देखें) सामग्री प्रतिस्थापन नतीजतन, अगर यहाँ सावधानी बरतें।

Coelenterazine के कई अलग अलग रूपों में इस तरह के प्रकाश उत्सर्जन की गति, सीए 2 -affinity (संवेदनशीलता), या प्रकाश उत्सर्जन 12 की तीव्रता के रूप में अपनी गतिविधि का अनुकूलन करने के क्रम में विकसित किया गया है। लोबान-coelenterazine कम आधा जीवन के साथ एक तेजी से और उच्च प्रकाश उत्सर्जन में परिणाम (भी ज-coelenterazine नाम) है, जबकि उदाहरण के लिए, देशी coelenterazine, कई घंटे के रूप में लंबे समय तक इमेजिंग के इस प्रकार अधिक उपयुक्त है, और अधिक स्थिर है। Coelenterazine के विभिन्न रूपों के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिए सामग्री सूची में वेब पते को देखते हैं।

इमेजिंग

Bioluminescence संकेतों एक इलेक्ट्रॉन गुणक सीसीडी कैमरा के साथ नजर रखी जा सकती है एक खुर्दबीन पर फिट (ईएम सीसीडी, -80 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा)। इस सेटअप ख चाहिएएक तंग अंधेरे बॉक्स के अंदर रखे और किसी भी अवांछित (परिवेश) प्रकाश संक्रमण से बचने के लिए। इस पांडुलिपि में वर्णित सेटअप 400 x 400 माइक्रोन (512 x 512 पिक्सल) के दृश्य के एक क्षेत्र को अनुमति देने के एक 20X विसर्जन उद्देश्य लेंस का उपयोग करता है। शोर अनुपात करने के लिए सिग्नल में सुधार करने के लिए, डेटा एक 0.100 सेकंड एकीकरण के समय (10 हर्ट्ज) के साथ हासिल किया गया है, और 2 एक्स 2 binning इस्तेमाल किया गया था (1 पिक्सेल = 1.2 x 1.2 माइक्रोन)। डेटा प्राप्त और स्टोर करने के लिए, प्रत्येक का पता चला फोटोन सौंपा गया था एक्स, वाई-निर्देशांक और एक समय बिंदु। 500 और 600 एनएम तरंगदैर्ध्य के बीच, ईएम सीसीडी कैमरा (सामग्री सूची में सटीक विवरण देखें) 96% की एक क्वांटम दक्षता है।

इन विवो कार्यात्मक ब्रेन इमेजिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण मानकों में से एक अस्थायी समाधान है। अब, प्रतिदीप्ति आधारित सीए 2 -imaging ऐसे GCaMP के रूप में तकनीक और Cameleon के बहुमत के बारे में 4 हर्ट्ज (250 मिसे / फ्रेम) की एक अस्थायी समाधान प्रदान करता है। हाल ही में, bioluminescence आधारित GFP-aequorin साथ हम रईस करने में सक्षम हैऊपर 100 मिसे / EMCCD कैमरा के साथ फ्रेम और यहां तक कि इलेक्ट्रॉन गुणक ICDD कैमरा 10 के साथ 120 फ्रेम / सेकंड (8.3 मिसे / फ्रेम) तक के लिए ई अधिग्रहण का समय है। इस अस्थायी समाधान पर electrophysiological तकनीकों के बारे में (1 मिसे की रेंज में) कि दृष्टिकोण। उच्च अस्थायी समाधान synaptic प्रसारण और प्रोत्साहन प्रेरित गतिविधि के लिए समर्पित की पढ़ाई के लिए जानकारीपूर्ण और महत्वपूर्ण दोनों है, वहीं सीए अभी तक आवश्यक धीमी 2 + -kinetics बढ़ाया भी उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स के भीतर इंट्रासेल्युलर सीए 2 -stores से सीए 2 रिलीज होता है (एक समीक्षा के लिए: Berridge एट अल, 2003 13।)। व्युत्क्रमानुपाती, वे आम तौर पर सेंसर से एक बेहतर सीए 2 -affinity पता लगाया जा करने की आवश्यकता होती है, जबकि इस उत्तरार्द्ध प्रकार के लिए, एक धीमी अस्थायी समाधान है, अभी भी स्वीकार्य है। इस आवश्यकता को घ्राण RECEPT के अक्षतंतु टर्मिनल पर इंट्रासेल्युलर सीए 2 -stores की रिहाई का पता लगाने के लिए GFP-Aequorin के साथ हासिल किया गया हैओआरएस न्यूरॉन्स 7.8। वैकल्पिक रूप से, वांछित प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है, धीमी अधिग्रहण के समय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लंबे हे / एन रिकॉर्डिंग में, हम कारण एकत्र डेटा बिंदुओं की बड़ी संख्या (Minocci एट अल।, 2013) के लिए एक 2 सेकंड एकीकरण बार इस्तेमाल किया है। संक्षेप में, bioluminescence के साथ एक व्यावहारिक सुविधा अस्थायी समाधान आसानी से वांछित प्रयोगात्मक शर्तों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।

वैकल्पिक कक्षों (मक्खी सेटअप) प्रयोग के उद्देश्यों की सुविधा के लिए विकसित किया गया है। उदाहरण के लिए, प्राकृतिक गंध उत्तेजना के आधार पर अध्ययन के लिए, एंटीना इसलिए ए Fiala 14 द्वारा विकसित एक तरह एक दृष्टिकोण (हम मुर्मू एट अल। 2010 के लिए एक समान दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया) सबसे उपयुक्त है, मुक्त रखा जाना चाहिए। संक्षेप में, इस दृष्टिकोण में, मक्खी एक छोटा सा छेद युक्त एक प्लास्टिक कवर पर्ची से चिपके है जो गर्दन, पर एक minutien पिन पर (चिपके) सीमित है। एक सील कर बनाई गई हैमक्खी के सिर के ऊपर चारों ओर। इसके बाद, घंटी की एक बूंद के सिर पर जमा किया जाता है, और सिर कैप्सूल विच्छेदित है। ऐसे में, एंटीना मुक्त रखा और odors भावना के लिए उपलब्ध हैं। इसी तरह, लंबे समय तक रिकॉर्डिंग के लिए, मक्खी की जरूरत दिनों 10 के हे / एन या भी जोड़ी के रूप में संभव के रूप में बाधा के रूप में मुक्त रखा जाना करने के लिए, और कुछ मामलों में (उदाहरण के लिए तंग आ गया: एक 5% ग्लूकोज में भिगो एक केशिका कागज के साथ समाधान)। इन परिस्थितियों में Fiala का दृष्टिकोण भी नीले pipet टिप (स्नॉर्कलिंग विधि) में दृष्टिकोण की तुलना में अधिक उपयुक्त है।

सभी दवा आवेदनों बाहर से एक 6 रास्ता बहु वाल्व गुरुत्वाकर्षण छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर नियंत्रित किया जा सकता है। प्रवाह से पहले 2 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह के लिए प्रत्येक रिकॉर्डिंग सत्र के लिए calibrated बड़ा छिड़काव नियामकों का उपयोग कर नियंत्रित किया जा सकता है। ड्रेनेज तंत्र एक सतत प्रवाह की अनुमति के क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से रिकार्डिंग कक्ष से / मिनट 2 मिलीलीटर की दर से तरल निकालता है।

मेंकारण दवा और / या उपयोग करने के लिए दवा की मात्रा की महंगी कीमत के लिए कुछ शर्तों, एक यौगिकों की ही छोटी मात्रा में लागू करना चाहते हैं। इस प्रकार, यह सीधे स्नान में बजाय छिड़काव प्रणाली के माध्यम से इसे लागू करने के लिए आवश्यक है। इस मामले में शटर प्रकाश संक्रमण से बचने के लिए इस प्रक्रिया के दौरान बंद कर दिया जाना चाहिए।

विश्लेषण के तरीकों

प्रति सेकंड प्रति सेकंड प्रति मायने रखता है या मायने रखता है दोनों के विश्लेषण के लिए हमारे समूह द्वारा इस्तेमाल किया गया है समन्वय। प्रति सेकंड की गिनती के शायद सबसे अच्छा प्रति सेकंड मायने रखता है, जबकि पूरे ढांचे में उज्ज्वल प्रतिक्रिया के लिए अनुकूल है और (आरओआई के आकार के लिए प्रतिक्रियाओं का एक सामान्य बनाने का प्रतिनिधित्व करता है) के समन्वय के प्रति कोशिकाओं की छोटी आबादी के लिए सबसे उपयुक्त और सटीक है। उन दोनों को आसानी से विश्लेषण सॉफ्टवेयर में चुना जा सकता है।

Bioluminescence दृष्टिकोण का उपयोग करने का मुख्य लाभ में से एक हासिल कर लिया और संग्रहीत डेटा (एक्स, वाई, टी मापदंडों का कर रहे हैं कि जिस तरह से हैप्रत्येक) फोटॉनों उत्सर्जित। दरअसल, (आम तौर पर एक झगड़ा प्रारूप में) एक अधिग्रहीत पूर्ण छवि के रूप में मानक मोड का इस्तेमाल किसी अन्य इमेजिंग तकनीक, इस प्रणाली के साथ, हम एक के दौरान प्रकाश से सक्रिय कर दिया गया है, जो केवल पिक्सेल निर्देशांक भंडारण के द्वारा ही प्रासंगिक और महत्वपूर्ण संकेत प्राप्त कर लेता है, जबकि (अधिग्रहण के समय या अस्थायी समाधान से मेल खाती है) समय की पूर्व निश्चित अवधि। नतीजतन, डेटा के भंडारण के भंडारण के लिए एक पूर्ण छवि की तुलना में वास्तव में 'प्रकाश' है, और फलस्वरूप, यह आसान डेटा का विश्लेषण करने के लिए बनाता है। डेटा विश्लेषण के लिए, हम के रूप में वांछित संचय समय की स्थापना की अनुमति देता है जो एक से संबंधित सॉफ्टवेयर (फोटोन दर्शक), का उपयोग करें। खांसने डेटा पेश करने के लिए एक लक्ष्य में वांछित के रूप में फिर संकेतों की एक छवि के प्रदर्शन को समायोजित किया जा सकता है। समानांतर में परिणाम उनके अधिग्रहण के समय से ही संकल्प समय में मात्रा निर्धारित कर रहे हैं।

महत्व और bioluminescent इमेजिंग के जैविक अनुप्रयोगों

Bioluminescent कैल्शियम इमेजिंग ऊपर उल्लेख फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग तकनीक के लिए तीन प्रमुख लाभ प्रदान करता है: (1) मस्तिष्क की एक गहरी क्षेत्रों imaged किया जा सकता है, (2) इमेजिंग हे / एन के रूप में कई घंटे के रूप में और यहां तक ​​कि कुछ में अब durations के लिए लगातार हो सकता है दो दिनों के लिए मामलों, और (3) हाल ही में, एक उच्च अस्थायी समाधान के साथ, 120 फ्रेम / सेकंड (8.3 मिसे) तक। bioluminescent दृष्टिकोण के मुख्य सीमा फलस्वरूप हमें सक्रिय संरचनाओं या न्यूरॉन्स की सटीक गहराई (जेड-योजना) निर्धारित करने के लिए अनुमति नहीं है जो कोंफोकल रोशनी, के साथ अपनी असंगति के कारण है।

bioluminescent इमेजिंग, गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों की इमेजिंग का पहला लाभ यह है कि पहले से कोई पूर्व के साथ दीर्घवृत्ताभ शरीर (ईबी), मस्तिष्क के मध्य में स्थित एक गहरी संरचना के भीतर एक उच्च पोटेशियम प्रेरित कैल्शियम प्रतिक्रिया की इमेजिंग द्वारा 2007 में प्रदर्शन किया गया electrophysiological या कार्यात्मक रिपोर्टों 6 एक -receptors की एक अवरोधक) का आवेदन निम्न eb में सहज सीए 2 -activity की रिकॉर्डिंग (है :। डायपर एट अल, लेख) प्रस्तुत की।

दूसरा लाभ, अब और निरंतर समय रिकॉर्डिंग, हमारी प्रयोगशाला से कई अध्ययनों में शोषण किया गया है। गंध उत्तेजना पिछले अध्ययनों 11,15,16 में मस्तिष्क न्यूरॉन्स की गतिविधियों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। लंबी अवधि के इमेजिंग का उपयोग करना, तथापि, हमारी प्रयोगशाला odors के लिए घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स के भीतर कैनेटीक्स में पहले से unreported परिवर्तन को दिखाने के लिए सक्षम हो गया है। मुर्मू एट अल द्वारा पहला अध्ययन। (2010) कम गंध उत्तेजनाओं (1-3 सेकंड) समान कैनेटीक्स और आयाम में एक उदारवादी अंतर का प्रदर्शन किया है, जबकि एक लंबी गंध प्रोत्साहन (5 सेकंड) एक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक बहुत बड़ा आयाम वजह से पता चला है कि कैनेटीक्स / संरचना में परिवर्तनintracellular कैल्शियम स्टोर करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था जो प्रतिक्रिया की Ure। एक अध्ययन के बाद पता चला है 5 मिनट के अंतराल पर 1 सेकंड गंध दालों के 5 लगातार आवेदन पत्र एक अनुकूलन प्रक्रिया का सुझाव, प्रतिक्रिया के प्रगतिशील क्षीणन का नेतृत्व करने के लिए 5 सेकंड के लिए प्रोत्साहन की लंबाई बढ़ाने, उनके कैल्शियम प्रतिक्रिया बदलाव नहीं किया है, जबकि कि। इसके अलावा इस अनुकूलन घटना पहले से पहचान कैल्शियम दुकानों 8 की GABAergic विनियमन द्वारा शुरू किया जा दिखाई दिया। महत्वपूर्ण बात यह आंकड़े भी इस प्रयोगात्मक हालत में, GFP aequorin के सीए 2 -sensor का पता लगाने और intracellular सीए 2 -stores से रिहा कैल्शियम का पालन कर सकते हैं, कि साबित होता है। हमारी प्रयोगशाला से एक अतिरिक्त अद्वितीय अध्ययन मशरूम शव 10 में बेसल (सहज) मस्तिष्क में पूरे neuronal और glial आबादी में गतिविधि के रूप में अच्छी तरह के रूप में गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए bioluminescent इमेजिंग हे / एन इस्तेमाल किया। ये रिकॉर्डिंग चींटी में आश्चर्य की बात सहज गतिविधि का पता चलाennal mechanosensory और मोटर केंद्र (AMMC) और antennal पालि। इसके अलावा, glia में अप्रत्याशित सेल स्वायत्त गतिविधि रात भर में होने वाली। मशरूम शरीर के भीतर अध्ययन दोनों कबरा गतिविधि और दो ​​विशिष्ट चोटियों, लघु और एक पहचान जिसका घटना 10 साल की उम्र के साथ बदल लंबा है।

हमारी प्रयोगशाला में सबसे हाल के एक अध्ययन में, हम स्मृति में फंसा माध्यमिक संकेतन अणुओं के हेरफेर के प्रभाव की जांच करने के लिए bioluminescent इमेजिंग का इस्तेमाल किया है, और कैसे वे मशरूम निकायों 9 के भीतर कैल्शियम प्रतिक्रिया को प्रभावित। मूर्ख और शलजम अधिक से अधिक 30 साल पहले की पहचान की गई है और शिविर के स्तर को विनियमित करने के लिए जाना जाता है, हालांकि वास्तव में, सेलुलर और शारीरिक तंत्र पर और विशेष रूप से सीए 2 -response पर उनके vivo प्रभाव अभी भी काफी हद तक अनजान रहते हैं। GFP-aequorin दृष्टिकोण के साथ, हम एक साथ calyx दोनों रिकॉर्ड करने में सक्षम (वृक्ष के समान स्ट्रक्चरल किया गया हैते) और सेल निकायों, साथ ही पालियों के स्तर पर axonal अनुमानों, और इस तरह हमें के स्तर पर और इस बेहद जटिल संरचना के विभिन्न डिब्बों में प्रतिक्रिया की गतिज सहसंबंधी करने की इजाजत दी।

सबसे हाल ही में आवेदन हम mimics ब्याज की संरचना करने के लिए प्रेस्य्नाप्तिक कृत्रिम रूप से सक्रिय करने neuronal आबादी के माध्यम से एक स्वाभाविक प्रतिक्रिया विकसित कर रहे हैं। ऐसा करने के लिए हम प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन में P2X 2 रिसेप्टर, एटीपी के लिए उत्तरदायी है, जो एक ligand-gated कटियन चैनल, एक्सप्रेस और बाद synaptic न्यूरोनल आबादी में GFP aequorin व्यक्त करते हैं। अलग neuronal आबादी में इन दोनों तत्वों का अलगाव दो अलग-अलग अभिव्यक्ति सिस्टम की आवश्यकता है। यह अंत करने के एक LexA GFP-aequorin बनाया गया है, जिसमें निर्माण। हम मशरूम शरीर में यूएएस P2X 2 के साथ Gal4-GH146 का उपयोग कर पीएन और GFP-aequorin के एक सबसेट में P2X 2 व्यक्त की है कि इस प्रणाली के साथ हमारे प्रारंभिक प्रयोगों मेंLexA-13X GFP-aequorin के साथ संयुक्त LexA MB247 लाइन का उपयोग कर। हम सफलतापूर्वक पीएन में P2X 2 रिसेप्टर (चित्रा 6) के लिए 1 मिमी एटीपी की stimulations के साथ मशरूम शरीर में कैल्शियम की प्रतिक्रियाएं दर्ज की गई है।

अंत में, bioluminescence GFP-aequorin दृष्टिकोण अन्य सीए 2 -indicators सीए अनुरूप 2+ -activity, प्रेरित प्रोत्साहन रिकॉर्डिंग में उपयोगी साबित हो गया है। लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, यह भी मस्तिष्क के भीतर सहज सीए का पता लगाने के लिए 2 + -activity परमिट। यह दृष्टिकोण मस्तिष्क के भीतर शारीरिक घटना है और गतिविधि पैटर्न के बारे में हमारी समझ की गहराई में वृद्धि कर सकते हैं कि लंबी अवधि के प्रयोगों और पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के लिए भविष्य की संभावनाओं को खोलता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich S3014
CaCl2 Merck 1023911000
HEPES Sigma-Aldrich 7365-45-9
KCl prolabo 26 764.298 normapur
MgCl2 prolabo 25 108.295 normapur
sucrose Sigma-Aldrich S0389
Nicotine Sigma-Aldrich N3876
ATP Sigma-Aldrich A2383 Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazine Prolume, nanolight  Cat #301 Coelenterazine h http://www.prolume.com/
dental glue 3M ESPE™ 46954 Protemp IV
silicon glue 3M ESPE™ 36958 Express 2 Regular Body Quick
tape 3M Scotch 122s 3M Scotch Magic Tape
pipette tips Corning Incorporated 4868 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage) hand made
incubation box hand made
forceps (No. 5) Fine Science Tools 11252-00 Micro-dissecting forceps
curved forceps Sigma-Aldrich F4142 Micro-dissecting forceps
glue applicator  hand made 
knife Fine Science Tools 10316-14 5 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera  Andor DU-897E-CS0-#BV iXon (cooled to -80 °C)
Microscope Nikon Eclipse-E800
immersion objective lens Nikon 20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence Leica MZ Fl III leica dissection scope and florescent lamp
tight dark box Science Wares Custom built by Science Wares
peristaltic pump  Gilson Minipuls 2
tubing Fisher Scientific depends on thickness Tygon R3603, St-Gobain
perfusion system Warner 64-0135  (VC-66CS) Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulators Leventon 201108 Dosi-flow 3
measurement and automation explorer Sciences Wares & National Instruments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager  Science Wares & National Instruments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewer Science Wares & National Instuments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel Microsoft N/A software https://www.microsoft.com
virtual dub open access  N/A software http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2 Martin et al., 2007, Ref. 1  N/A No stocks {currently} publicly available 
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP   B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.  (STOCK #1117340) pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2 Lima and Misenboeck, Ref. 11  N/A No stocks {currently} publicly available 
OK107 Bloomington stock center 854 http://flystocks.bio.indiana.edu/

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References

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