En Face Detection van stikstofoxide en superoxide in endotheellaag van Intact slagaders

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

In dit artikel beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige manier aangepast met de fluorescentie kleurstof diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) en dihydroethidium (DHE) voor en face gelijktijdige detectie en visualisatie van intracellulaire stikstofoxide (NO) en superoxide anion (O 2 .- ) respectievelijk in vers geïsoleerde intacte aorta's van een obesitas muismodel.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries. J. Vis. Exp. (108), e53718, doi:10.3791/53718 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Endotheel afgeleide stikstofoxide (NO) geproduceerd met endotheliale NO-synthase (eNOS) is een van de belangrijkste vasoprotective moleculen in cardiovasculaire fysiologie. Disfunctioneel eNOS zoals ontkoppeling van eNOS leidt tot afname NO biobeschikbaarheid en toename van superoxide anion (O 2 .-) productie, en op zijn beurt stimuleert hart- en vaatziekten. Daarom geschikte meting van NO en O 2 .- niveaus in de endotheelcellen cruciaal voor onderzoek op hart- en vaatziekten en complicaties. Vanwege de uiterst labiele aard van NO en O 2 .-, is moeilijk te meten NO en O 2 .- direct in een bloedvat. Talrijke werkwijzen zijn ontwikkeld voor het meten en NO O 2 .- productie. Het is echter ook ongevoelig of niet-specifieke of technisch veeleisend en vereist speciale apparatuur. Hier beschrijven we een aanpassingvan de fluorescentie kleurstof werkwijze voor het gezicht en gelijktijdige detectie en visualisatie van intracellulaire NO en O 2 .- via de cel permeabele diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) en dihydroethidium (DHE), respectievelijk in intacte aorta van een obesitas muismodel opgewekt door hoog-vet dieet geeft. Wij konden aantonen verminderde intracellulaire NO en verbeterde O 2 .- niveaus in de vers geïsoleerde intacte aorta van obesitas muis in vergelijking met de controle lean muis. We tonen aan dat deze werkwijze een gemakkelijke techniek voor directe detectie en visualisatie van NO en O 2 .- in de intacte bloedvaten en kan wijd voor onderzoek endotheel (dys) functie onder (fysio) pathologie.

Introduction

De vasculaire endotheelcellen houden vasculaire functionele en structurele integriteit door het vrijgeven van vasoactieve factoren 1. Onder deze factoren, endotheel- afgeleide stikstofoxide (NO) geproduceerd uit L-arginine via endotheliale NO-synthase (eNOS) is de belangrijkste en gekenmerkt factor bij cardiovasculaire fysiologie 2. NO veroorzaakt relaxatie van glad spierweefsel en remt de celproliferatie remt plaatjesaggregatie en ontstekingscellen adhesie en infiltratie in de subendothele ruimte derhalve bescherming tegen vaatziekten ontwikkeling 3. Onder vele fysiologische en pathologische aandoeningen, zoals vergrijzing, hypertensie, diabetes, hyperlipidemie, etc., endotheeldisfunctie gekenmerkt door verminderde NO biobeschikbaarheid en verhoogde O 2 .- productie aanwezig en bevordert de pathogenese van atherosclerose 2. Studies van de afgelopen jaren laten zien dat ontkoppeling van eNOS is eenbelangrijk mechanisme voor de endotheliale dysfunctie, waarbij het ​​enzym eNOS genereert O 2 .- plaats van NO, onder de verschillende bovengenoemde voorwaarden 1,4. Daarom analyse van endotheelfunctie name endotheliale NO productie en O 2 .- generatie cruciaal voor experimenteel onderzoek op hart- en vaatziekten en complicaties.

Er zijn talrijke methodologische benaderingen die zijn ontwikkeld voor het analyseren en meten NO productie in biologische monsters. Door de zeer labiele aard van NO die gemakkelijk wordt geoxideerd tot NO 2 - en NO 3 - met een halfwaardetijd van 3 tot 6 seconden is moeilijk direct te meten NO. Derhalve bepaling van NO 2 - / NO 3 - in de vloeistofmonsters werd gebruikt als een index van NO werd vrijgemaakt uit cellen of weefsels 5. Hoewel de procedure is relatief eenvoudig, de werkwijze is echter eaSily beïnvloed door de hoge achtergrond van de stabiele NO 2 - / NO 3 - in de oplossing. Omdat NO stimuleert oplosbaar guanylaatcyclase aan cyclisch guanosine monofosfaat (cGMP) 6 te produceren, heeft het cellulaire cGMP niveau ook is vastgesteld dat NO vrijkomen 7 schatten. Ook dit is een indirecte schatting en is derhalve niet specifiek, aangezien sommige endotheel-afgeleide factoren zoals C-type natriuretisch peptide (CNP) ook zou kunnen vergroten cGMP via activering van guanylaatcyclase deeltjesvormig 8. NO wordt geproduceerd uit L-arginine met vorming van L-citrulline als bijproduct 9, meting van L-citrulline productie wordt daarom ook gebruikt als een indirecte methode om NO productie schatten. De belangrijkste nadelen van deze methode zijn dat het radioactief is en het niet bioactieve NO te meten, omdat NEE Vrijgegeven kon snel worden geïnactiveerd door O 2 .-; Bovendien kan L-citrulline worden teruggevoerd naar L-arginine 10. Andere chemische werkwijzen zoals chemiluminescentie detectie 11, elektronspinresonantie 12 of elektrochemische porphyrinic NO sensor 13 worden gebruikt door verschillende onderzoekers. Deze methoden zijn meestal niet gemakkelijk in operationele, het opsporen van procedures en vereisen speciale apparatuur. Het is ook te vermelden dat veel studies orgaanbad experimenten toe te passen met geïsoleerde bloedvaten, met of zonder het endotheel om endotheelfunctie beoordelen en indirect meet-endotheel afgeleide NO gemedieerde vasculaire relaxaties. Deze werkwijze, hoewel meestal vlakbij fysiologische situatie, maar strikt wil zeggen niet geen functie meten, in plaats beoordeelt endotheel gemedieerde vasomotorische respons in het algemeen dat netto effect van eNOS functie tijdens de productie van andere endothelium afgeleide relaxerende factoren en endotheelafhankelijke verdragsluitende factoren, productie van O 2 .-, alsmede de respons van gladde spiercellendeze factoren. Een specifieke analyse van eNOS functie of NO productie is meestal nodig 3.

Vele onderzoeksgroepen waaronder ons hebben de afgelopen jaren gebruikt de fluorescentie kleurstof methode om intracellulaire productie van NO 14-19 detecteren. In deze werkwijze wordt de cel permeabele fluorescentie-indicator diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) werd gebruikt om vrije en NO NOS functie meten in levende cellen en weefsels in vitro of ex vivo. Het principe is dat in de levende cellen, DAF-2DA wordt gedeacetyleerd door intracellulaire esterase aan niet-fluorescerende 4,5- diaminofluorescein (DAF-2), die vervolgens werd omgezet in 2 DAF-triazool (DAF-2T) fluorescerende door reactie met NO . De fluorescentie van DAF-2T kan worden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop of fluorescentie confocale microscoop 14. De intracellulaire fluorescentie-intensiteit dekt dus de intracellulaire NO productie in de cellen of het endotheel in een intacte bloed vessel. Gecombineerd met een specifieke fluorescentie kleurstof zoals dihydroethidium (DHE), kan men tegelijkertijd beoordelen intracellulaire NO en O 2 .- opwekking in de cellen of in bloedvaten 14. Evenzo DHE is een cel-permeabele stof die wordt geoxideerd door O 2 .- in de cellen, en het product vervolgens oxidatieve intercalaten met nucleïnezuren om een helderrode kleur detecteerbaar kwantitatief fluorescentiemicroscoop of fluorescentie confocale microscoop uitstoten. DHE is een zeer specifieke kleurstof voor detectie van O 2 .- uit biologische monsters, zoals gedetecteerd wezen superoxide radicalen, goed vastgehouden door cellen, en kunnen zelfs milde fixatie 20 tolereren. Een van de voordelen van deze fluorescentie kleurstof methode is dat het detecteert en visualiseert NO en / of O 2 .- en face direct aan de intacte endotheliale laag van een levend bloedvat.

In deze krant,beschrijven we deze fluorescentie kleurstof methode om NO te detecteren en O 2 .- die we hebben aangepast voor en gezichtsherkenning van NO en O 2 .- in intacte aorta's van een obesitas muismodel geïnduceerd door vetrijk dieet (HFD) voeding. We laten zien dat deze methode met succes en betrouwbaar kunnen meten NO en O 2 .- niveaus en eNOS (dys) functie te evalueren in de endotheliale laag van vers geïsoleerde intact muis aorta's in obesitas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal werk werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Veterinair Bureau van Fribourg, Zwitserland. Het protocol volgt de richtlijnen voor verzorging van dieren en experimenten bij onze instelling.

1. Bereiding van een set-up voor de incubatie van geïsoleerde slagaders

  1. Construct een orgaanbad systeem dat tot 37 ° C worden verwarmd en belucht met 95% O2 en 5% CO2 uit een koolstof gastank.
  2. Bereid zoveel Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer indien nodig de concentratie van de volgende samenstelling: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCI, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2PO 4, 25 mM NaHCO 3, 0,026 mM EDTA en 11,1 mM D-glucose).
  3. Houd de voorraad buffer op ijs en beluchten van de buffer met 95% O2 en 5% CO2.
  4. Schakel het orgaanbad systeem, de temperatuur bij 37 ° C, voeg 5 ml van de kant-en-klare buffer elke kameren houden beluchten de buffer met 95% O2 en 5% CO2.
  5. Was de kamers een keer met Krebs-Ringer buffer gedurende 30 min.
  6. Voeg 5 ml Krebs-Ringer buffer aan elke kamer en hebben betrekking op de kamer om verdamping te voorkomen.

2. Isolatie van Mouse aorta

  1. Injecteer pentobarbital die intraperitoneaal wordt opgelost in 0,9% NaCl bij een concentratie van 150 mg / kg om de muizen te offeren.
  2. Leg de muis achterover op een chirurgische boord.
  3. Spray de vacht van de borstkas met 70% ethanol behoeve van sanering en vocht.
  4. Open borstholte door het snijden van rond de rib naar het hart en de longen bloot te leggen, en verwijder de longen.
  5. Verwijder het bloed in de borstholte voorzichtig met een tissue.
  6. Pak het hart voorzichtig met een pincet en verwijder de thoracale aorta door het snijden van de perivasculaire vetweefsel tussen de aorta en de wervelkolom met chirurgische schaar.
  7. Onmiddellijk dompel de groe weefsels in ijskoude (4 ° C) Krebs-Ringer buffer.
  8. Verwijder het hart en de aortaboog onder een dissectie microscoop en houd de thoracale aorta segment in de buffer.
  9. Ontleden de aorta vrij van het naleven perivasculaire weefsel onder een microscoop met chirurgische schaar en pincet.
  10. Pak de eindrand van de aorta met een forceps, en weg te spoelen het bloed in het vasculaire lumen door zachtjes spoelen Krebs-Ringer buffer met een 26 G x 1 / 2" spuit.
  11. Snijd de schoongemaakte aorta ringen tot 3 mm lang segmenten.
    Opmerking: Let op deze stap om endotheliale laag niet beschadigen.

3. DHE en DAF-2DA kleuring

  1. Breng de gereinigde aortische segmenten met een tang om de kamers orgaanbad gevuld met Krebs-Ringer buffer bij 37 ° C belucht met 95% O2 en 5% CO2.
    Opmerking: Raak alleen de adventitia kant van de aorta ringen met een tang en niet de b niet klemmenLood schepen.
  2. Equilibreren de slagaders in het orgaanbad kamer gedurende 30 minuten.
  3. acetylcholine (ACh) toevoegen orgaanbad de eindconcentratie 1 uM, en incubeer de aders 10 min.
  4. Bereid 1 ml DHE / DAF-2DA oplossing (5 uM van elke kleurstof, verdund van 1000 x voorraad) met voorverwarmd Krebs-Ringer buffer in 1,5 ml microcentrifugebuis. Wikkel de microcentrifugebuis met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen.
  5. Na stimulatie, overdracht van de aortaringen van orgaanbad de DHE / DAF-2DA oplossing in een microcentrifuge buis bij 37 ° C belucht met 95% O2 en 5% CO2 en incubeer de aorta ringen voor 30 min.
    Let op: Vanaf deze stap, houd de aorta altijd in het donker.
  6. Breng de aorta ringen naar een nieuwe microcentrifugebuis met Krebs-Ringer buffer voor het wassen en herhaal het wassen drie keer binnen 1 min.
  7. Breng de aortaringen tot 4% paraformaldehyde oplossing bevestiging voor 30min.
  8. Bereid 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oplossing (300 nM verdund van 1000 x voorraad) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Tegenkleuring de aorta voor 3 minuten.
  9. Breng de aorta nieuwe microcentrifugebuis met PBS buffer voor het wassen gedurende 1 min. Herhaal het wassen driemaal.
    Opmerking: Let niet op de aorta ringen klemmen of schade aan het endotheel laag.

4. En Face Montage

  1. Voeg een druppel montage medium op de dia.
  2. Snijd de aorta ringen lengterichting met microchirurgische scharen onder de microscoop, maken het opgerolde aorta vlak en monteer het eigen gezicht op de montage medium met het endotheel naar beneden op het glaasje. Niet heen en weer bewegen van de aorta.
  3. Bedek de dia met dekglas en sluit de dia met nagellak.
  4. Na drogen aan de lucht onder lichte bescherming, gebruik maken van de dia's voor het afbeelden van directly binnen enkele uren of bewaar ze bij -20 ° C voor de volgende paar dagen.

5. Confocale Microscopische Beeldvorming

  1. Gebruik een confocale microscoop om de fluorescentiesignalen te detecteren. Schakel de machine en de beeldvormende instellingen zoals vergroting, scansnelheid, resolutie, Z-stack optimaliseren.
    1. Voor dit protocol, gebruik maken van een 200 Hz scansnelheid, resolutie van 1024 × 1024 pixels en Z-stapgrootte van 0,25 micrometer. Excite fluorescentie van DAF-2DA met 488 nm argon laser en op te sporen bij 515 nm, terwijl fluorescentie prikkelen van DHE bij 514 nm en op te sporen bij 605 nm emissie.
  2. Gebruik 10X vergrotingen om zich te concentreren op het monster totdat de DAPI signaal is duidelijk met ultraviolette stralen, en dan is de doelstelling aan te passen aan 40X vergrotingen.
  3. Om het bereik van endotheliale laag door aanpassing Z-positie op het bedieningspaneel. De signalen van DAPI gekleurde kernen ovale of ronde stippen in de endotheliale laag.
  4. Scannen vanuit de top(Endotheellaag op het lumen grens) van het monster door de volledige dikte van endotheliale signalen en beelden. Minstens 3 verschillende gebieden voor het scannen van elk monster.

6. beeldanalyse

  1. Gebruik software om de data gescand door confocale microscoop te openen. Kies drie opeenvolgende beelden per veld voor analyse en ten minste 3 verschillende gebieden per monster te evalueren. Exporteer de gekozen foto's en opslaan als JPEG-bestanden.
  2. Kwantificeren van de beelden van DAF-2DA, DHE en DAPI kleuring met beeldbewerkingssoftware. Voor de afbeelding van DAPI kleuring, kiest u 'Plugins' → 'Analyze' → 'Cell Counter' om het aantal DAPI positieve kern tellen.
    1. Voor de beelden van DAF-2DA en DHE kleuring, kies 'Analyze' → 'Measure' om de intensiteit van de signalen te analyseren, en neem de 'Mean' waarde als de relatieve intensiteit van het signaal. Heden dan de resultaten als de verhouding van DAF-2DA naarDAPI positieve kernen of ratio van DHE te DAPI. Voor elk monster, neem dan de gemiddelde waarde van elk beeld en in het veld.
  3. Verdeel het resultaat van elk monster met het gemiddelde van de controlegroep de veelvoudverandering krijgen. Statistische analyse werd uitgevoerd met ongepaarde Student t-test of ANOVA met Dunnett of Bonferroni post-test. Geven data als gemiddelde ± SEM. Beschouw verschillen in gemiddelde waarden significant bij p <0,05 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Obesitas is een belangrijke risicofactor voor ischemische coronaire hartziekten en wordt geassocieerd met een verminderde endotheliale NO biologische beschikbaarheid, een kenmerk van atherosclerotische vaatziekte 21. eNOS ontkoppeld is aangetoond dat een belangrijk mechanisme van endotheeldisfunctie onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden zoals vergrijzing 22, atherosclerose, obesitas en 14. Daarom hier vergelijken we de slanke en obese muizen aan de vertegenwoordiger resultaat van NO en O 2 .- niveaus in de aorta te laten zien.

Vanaf de leeftijd van 7 weken werden de mannelijke muizen (C57BL / 6J) vrije toegang krijgen gedurende 14 weken de tijd om ofwel een normale chow (NC; energie-inhoud: 10,6% vet, 27,6% eiwit en 57% koolhydraten, vezels 4,8% ) of een vetrijk dieet (HFD, energie-inhoud: 55% vet, 21% eiwit en 24% koolhydraten). Na 14 weken van de HFD-muizen warenopgeofferd en thoracale aorta's werden ontleed en ontdaan van hechtende weefsels. Voordat DAF-2DA en DHE kleuring stap de eNOS remmer LN G-nitroarginine methylester (L-NAME) (1 mM) werd aan het bad toegevoegd kamer 1 uur tot 14 eNOS activiteit blokkeren. De representatieve confocale fluorescentie resultaten zijn weergegeven in figuur 1. De blauwe kleur van de bovenkant is de kern van endotheelcellen gekleurd door DAPI. In het middenpaneel, de groene kleur is het fluorescentiesignaal van DAF-2T omgezet van de niet-fluorescerende DAF-2 door NO, wat betekent dat wanneer de intensiteit van de groene signaal groter is, meer NO in de cellen. Ook de rode kleur in de sokkel van het fluorescentiesignaal van DHE geoxideerd door O 2 .-, zodat het monster dat meer rode kleur meer O 2 .- in de cellen.

Confocale fluorescentiemicroscopie onthuld dalingd NO productie (DAF-2DA kleuring) en verhoogde L-NAME-gevoelige O 2 .- generatie (DHE kleuring) in de aorta endotheliale laag van de muizen gevoed HFD in vergelijking met die van de muizen gevoed NC (figuur 1) 14, wat suggereert eNOS-ontkoppeling in obesitas. De signalen werden gekwantificeerd en gepresenteerd in de staafdiagrammen 14.

Figuur 1
Figuur 1. eNOS-ontkoppeling in obesitas. Confocale microscopische en gezichtsherkenning van NO en O 2 .- door DAF-2DA en DHE kleuring, respectievelijk. n = 5; *** p <0,005 versus NC; ††† p <0,005 vs HFD-groep. Schaal bar = 0,1 mm. (De gegevens waren uit referentie 14) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detectie van NO of O 2 .- met fluorescerende kleurstoffen werd veelvuldig bij vele studies in gekweekte endotheliale cellen en in weefsels cryosecties 23. Hier uitgebreid we deze methode om intacte levende bloedvaten, dat wil zeggen, en gezichtsherkenning van NO en O 2 .- niveaus in de endotheliale laag met DAF-2DA en DHE, respectievelijk, die effectief is, relatief eenvoudig en intuïtief. In vergelijking met de werkwijze in vasculaire vriescoupes vertoont deze werkwijze minder achtergrond en is kwantitatief, aangezien elastische vezels in de media van een slagader met name de aorta in de cryosecties geven sterke autofluorescentie signalen die kunnen interfereren met de specifieke NO of O 2. - gegenereerd in endotheelcellen. Bovendien kunnen specifieke O 2 .- generatie van NADPH oxidase of andere enzymen in de mediale gladde spiercellen ook interfererende signalen in endotheelcellen in de vaatwand sectie, die het nadeel van de werkwijze met vasculaire cryosecties vertegenwoordigt. In tegenstelling, het gezicht en kleuringsmethode signalen detecteert specifiek de endotheliale laag van een segment intact bloedvat en geeft daardoor nauwkeuriger analyse. Een cryostaat machine voor cryosectie voorbereiding is ook een dure investering. Vergeleken met andere biochemische methoden, de belangrijkste beperking van deze methode is minder kwantitatief, maar het is een goede keuze voor relatieve vergelijking tussen monsters. Bovendien kan de eis van een confocale microscoop die duur ook een beperking van deze methode. Multi-orgaankamersamenstel systeem is geschikt en indien dit niet in het laboratorium, kan men een systeem met waterbad en pijpen die verbonden zijn aan een koolstofatoom gastank met regelgeving moeilijkheden vast te stellen, zodat de bloedvaten in de buizen bewaard bij 37 ° C en belucht met 95% O2 en 5% CO

Er zijn een aantal kritische stappen die men moet letten. Zorg ervoor dat de perivasculaire weefsel wordt schoongemaakt voor eenvoudige montage. De bloedstolsels in het vasculaire lumen moet worden weggespoeld, omdat kunstmatige signalen kunnen veroorzaken en interfereren met de fluorescentiesignalen. Gedurende de hele procedure van bereiding bloedvat, incubatie, wassen, snijden en monteren, moet men zeer voorzichtig de endotheliale laag van de bloedvaten niet kan schaden. Laat je niet door het bloedvat droog tijdens de hele procedure van de voorbereiding. DHE en DAF-2DA zijn beide fluorescerende probes, dus vanaf de kleuring stap de aorta moet altijd worden beschermd tegen blootstelling aan licht. Voordat de fixatiestap de endotheelcellen van aorta moeten leven zijn, zodat de aorta altijd in de Krebs-Ringer buffer belucht met 95% O2 en 5% CO2 bewaard. Beelden van de monsters moet zo spoedig mogelijk worden genomen na de bereiding. de fluorescerennce signaal zwakker binnen enkele dagen worden ook de bescherming van fixeermiddel, waarbij de nauwkeurigheid van het resultaat kunnen beïnvloeden. De methode kan niet van toepassing voor bloedvaten met een te dikke vaatwand.

Deze werkwijze maakt gelijktijdige verbeelding van NO en O 2 .- productie in de endotheliale laag van intacte bloedvaten, als de twee kleurstoffen samen om de bloedvaten toegevoegd. Men kan ook deze methode gebruiken om de farmacologische effecten van drugs op NO en O 2 .- productie in vitro in geïsoleerde bloedvaten te evalueren. Hiertoe wordt de gereinigde aorta gewoonlijk gesneden in twee delen, één voor controle en een ander is behandelingsdruk, en het geneesmiddel dienen aan de incubatiebuffer toegevoegd bij evenwicht voor DAF-2DA en DHE kleuring stap. Het is bijzonder nuttig, wanneer deze werkwijze samen met andere methode, bijvoorbeeld met een analyse van vasomotorische responsen van geïsoleerde bloed vessels een fysiologische functie van endotheliale cellen kan worden bevestigd. Deze methode wordt ook geschikt voor de analyse van eventuele endotheel (dys) functie in intacte bloedvaten van de ziekte-modellen en de onderliggende mechanismen zijn.

Samengevat, presenteerden we een eenvoudig protocol om gelijktijdig NO en O 2 .- productie op te sporen in endotheliale laag van intacte bloedvaten met een fluorescentie confocale microscoop. We laten zien hoe deze methode met succes gewerkt in obesitas muismodel. Deze methode is een nuttige techniek bij het ​​onderzoek van endotheliale NO en O 2 .- productie onder vele vasculaire aandoeningen en vaatziekten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dihydroethidium (DHE) Invitrogen D 1168 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) Calbiochem 251505 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D 1306 dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium Vector labor. (reactolab) H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) Sigma-aldrich N5751
Pentobarbital Sigma-aldrich P3636
Multi-Myograph System  Danish Myo Technology A/S Model 610M
Microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope  Leica  DM6000 
Image processing software National Institute of Health (NIH) Image J 
Surgical scissors  S&T AG SDC-11
Microsurgical scissors  F.S.T 15000-01
Forceps S&T AG JF-5
Coverslip round diameter 15 mm VWR 631-1579
Tips 1 ml VWR RFL-1200c 
Tips 200 μl VWR 613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml Eppendorf  30120086
Acetylcholine chloride Sigma-aldrich A-6625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
  2. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33, (7), 829-837 (2012).
  3. Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4, (1), 53-65 (2006).
  4. Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302, (5), 481-495 (2012).
  5. Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126, (1), 131-138 (1982).
  6. Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (13), 5159-5162 (1989).
  7. Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261, (2), 598-603 (1991).
  8. Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24, (10), 1021-1026 (2003).
  9. Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333, (6174), 664-666 (1988).
  10. Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, (21), 8612-8616 (1990).
  11. Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65, (13), 1794-1799 (1993).
  12. Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270, (1), 304-307 (1995).
  13. Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
  14. Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13, (1), 113 (2014).
  15. Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427, (2), 263-266 (1998).
  16. Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88, (2), 14-22 (2001).
  17. Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, (9), 1483-1487 (2001).
  18. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120, (20), 4229-4237 (2012).
  19. Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97, (10), 1063-1069 (2005).
  20. Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105, (14), 1656-1662 (2002).
  21. Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13, (Suppl 2), 58-68 (2012).
  22. Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11, (6), 1005-1016 (2012).
  23. Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112, (17), 2677-2685 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics