分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

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Vjestica, A., Merlini, L., Dudin, O., Bendezu, F. O., Martin, S. G. Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle. J. Vis. Exp. (109), e53801, doi:10.3791/53801 (2016).

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Abstract

Introduction

2セル間の遺伝子交換が有性生殖で中央イベントですが、それは細胞の分化を促進する一連のイベントに依存して、相手の選択を可能にする、細胞 - 細胞融合を行い、ゲノムの安定性を維持します。したがって、性的ライフサイクルが発達スイッチに関する生物学的な質問の数を研究するためのモデル系としての地位を提示し、分裂酵母、これらの現象を研究するための性周期を探るなど 、外因性の刺激、形質膜融合、染色体分離、に対する応答はのメリットをもたらしますモデル系の強力な遺伝学、十分に確立された高スループットのアプローチと洗練された顕微鏡。分裂酵母でのセックスは、異なる交配型のP-細胞およびM-セル間の異イベントです。 2つの細胞型は、示差分泌P-の生産のためのものと、M-フェロモン、フェロモン受容体MAP3とMam2だけでなく、フェロモンプロテア含む遺伝子1,2の数を表しますSES Sxa1とSxa2。このような一般的に使用されるH90株とホモタリック株は、交配単一ゲノム内の型と細胞の両方のための遺伝情報を運ぶ(参考文献3に概説されている)有糸分裂のライフサイクルを通じて交配型スイッチングの複雑なパターンを受けます。まれまたは決して交配型を切り替えない異体性の分裂酵母の複数の分離株は、一般に、H + N(P型)と時間 -S(M型)株最も顕著に、4を使用しています。

分裂酵母では、性的なライフサイクルへの参入は厳しい栄養規制下にあります。窒素のみ飢餓分裂酵母細胞は分裂再生を逮捕し、交配相手の存在を知らせると(文献5に概説されている)性周期の更なるステップを促進するための拡散性フェロモンを生産します。窒素欠乏が発達スイッチとして機能し、電子を促進し、相手STE11の鍵転写調節因子を脱抑制するフェロモン受容体とフェロモン産生遺伝子6,7を含む特定の遺伝子を交配のXPRESSION。フェロモン受容体の関与は、さらにこのように、相手先との間に正のフィードバックにフェロモン産生を増加させる、STE11転写活性8-10を増強受容体結合タンパク質G-αおよび下流のMAPKシグナル伝達を活性化させます。フェロモンレベルは、細胞極性、のRhoファミリーのGTPaseのCdc42 11のマスター主催を調節することにより、異なる細胞偏光状態を誘導するために重要です。低フェロモン濃度に曝されると、アクティブCdc42のは、細胞周辺を探索動的パッチで可視化され、何の細胞増殖は、この段階で観察されません。増加したフェロモンレベルは、単一のゾーンと偏突起の成長へのCdc42活性の安定化を促進し、接触してパートナー細胞をもたらすシュムーを、と呼ばれます。続いて、2半数体交配パートナーは、二倍体接合体を形成するために融合します。最近の研究は目を明らかに交配によって誘導されるformin FUS1 12によって組み立てられている核融合のために必須の新規アクチン構造の電子的存在。この融合フォーカスは、タイプVミオシン依存性プロセスが集中し、したがって、細胞壁のリモデリングは、細胞溶解12なしで細胞膜との接触を可能にすることができ、細胞壁分解機構を位置決めします。細胞 - 細胞融合の際に、核が接触し、核合体を受けます。接合体(馬の尾の動き)の内側核の著名なダイニン依存往復運動は、その後減数分裂が続いている染色体ホモログ13,14のペアリングを促進します。最後に、減数分裂の4つの製品は、胞子形成中に個々の胞子にパッケージ化されています。

理由は、その複雑さと関連する多数の工程で、交配の詳細な監視が挑戦されています。二つの注目すべき困難が全体のプロセスはよく15時間以上を要すること、細胞が同期することが困難であるということです。これらのDifficultiesは、単一細胞の顕微鏡的アプローチによって回避されます。ここでは分裂酵母に性的なライフサイクルを調査するための一般的なプロトコルが提示されています。微調整では、このプロトコルは、プロセスのすべての異なる段階、すなわち遺伝子産物を交配の誘導、交配型スイッチング後の姉妹細胞間の細胞極性とペアリングと非姉妹パートナー、細胞 - 細胞融合、間の研究を可能にしますそして、融合後馬の尾の動き、減数分裂と胞子形成。この方法は、簡単かつ融合後の間に、時間前にわたってタンパク質を蛍光タグ付けされた可視化)を1にできます。 2)反対の接合型の細胞の挙動を識別する。 3)このようなshmooing、交配、融合または胞子形成効率などのパラメータを測定し、定量化します。

Protocol

分裂酵母有性生殖の顕微鏡分析

1.メディアの準備

  1. グルコース:を10g / L、KH 2 PO 4:1 G / L、NaClを0.1グラム/ L、 硫酸マグネシウム・7H 2 O 0.2グラム/最小胞子形成培地(MSL-N)15は、以下成分を混合することによって調製しますL.追加微量元素(10,000倍):100μL/ L、ビタミン(1,000倍):1ミリリットル/ L、および0.1 MのCaCl 2  ミリリットル/ L。室温(RT)で0.22μmの細孔サイズのフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。
    1. パントテン酸:1グラム/ L、ニコチン酸:10グラム/ L、イノシトール:10グラム/ L、ビオチン:10 mg / Lで、次のビタミン(1,000倍)の株式を使用してください。 4℃で0.22μmの細孔サイズのフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。
    2. ホウ酸:5グラム/ L、のMnSO 4:4グラム/ L、のZnSO 4・7H 2 O:4グラム/ L、のFeCl 2・6H 2 O:2グラム/ L以下の微量元素(10,000倍)の株式を使用してください、MoO 3を0.4グラム/ L、KI:1 G / L、のCuSO 4・5H 2 O:0.4グラム/ L、クエン酸:10グラム/ L。 4℃で0.22μmの細孔サイズのフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。
  2. アガロースの0.2グラムとMSL-Nの10ミリリットルを組み合わせることにより、MSL-Nアガロースを(アガロースパッド室を作るために使用される)2%を準備します。マイクロ遠心チューブ内のアガロース溶解し、アリコート0.5ミリリットルまで電子レンジで高出力で〜2分間溶融。室温で保管してください。
  3. 1g / L、ロイシン:0.225 G / L、アデニン:0.225 G / L、ウラシル:0.225 G / L SO 4(NH 4)2添加することにより、MSL-Nから窒素を最小胞子形成培地(MSL + N)を調製。 0.22μmの孔サイズのフィルターを用いてフィルター滅菌します。室温で保管してください。
    注:ロイシン、アデニン及びウラシル栄養要求性株の増殖を可能にするために、この培地に添加されます。使用する菌株は、(例えばhis3Δ)個別の栄養要求性を運ぶ場合は、追加のアミノ酸サプリメントが含まれるべきです。完全に原栄養株による作業は専用として、推奨されていることも注意してくださいこのような株は、高い接合効率を可能にします。
  4. 室の封止用の200ミリリットルVALAPを準備します。ビーカーにラノリン、ワセリン(または他のワセリン)、およびパラフィンの同等の重みを追加します。低温での熱混合物と完全にブレンドするまで、時折かき混ぜます。いくつかの小さなペトリ皿にミックスを分取。室温で保管してください。

交配実験のため2​​.培養分裂酵母株(図1)。

  1. 1日目、イブニング:
    MSL + Nの3ミリリットルを含む培養チューブに固体培地から新しく作製した株を接種します。約直径2.5cmの平底チューブを使用してください。適応培養容量で他の培養管またはフラスコを使用してください。 25℃、200 rpmで振盪しながら(O / N)で一晩インキュベートします。異体性の株を扱う場合は、別々に接種します。
    1. 文化は夕方に0.4から0.8の600 nmの(OD 600)で測定した光学密度を持っていることを確認するために、次の朝のメディアに細胞懸濁液を希釈します。
      注意:OD分裂酵母のための細胞濃度のプロキシとして600の測定値は、約0.1〜1.0の範囲で線形です。私たちの分光光度計のOD 600 = 0.1には、1mlあたり1.4×10 6細胞に相当します。このように、初期OD 600が読めば、この範囲外のサンプルは、信頼性の高い測定のために濃縮/希釈する必要があります。
  2. 2日目、イブニング:
    100 mlのフラスコ中で600 = 0.025のODまでMSL + N培地20mlに細胞を希釈します。 30℃、200 rpmでの株O / Nインキュベートします。
    注:野生型細胞培養物は、(15時間後)OD 600〜0.8翌朝に到達する必要があります。長い世代時間を有する株を扱う場合に応じて希釈を調整します。
  3. 3日目、午前:
    培養物がOD 600〜0.8の細胞密度を持っていることを確認するために、OD 600を測定ます。異体性の株を扱う場合は、パートナー細胞の等しい数を混ぜます。 1.5ミリリットル、1,000×gで、転送で細胞をペレット化チューブ。 MSL-N培地1ml中で細胞を3回洗浄します。 MSL-N培地3mlに細胞を再懸濁し、= 1.5 600 ODために細胞を希釈します。
    1. 直接イメージングのための細胞をマウント姉妹細胞間の交配を監視するには(プロトコル2.4節を参照してください)​​。交配型スイッチングは、窒素欠乏後に発生した有糸分裂の間に行われるにホモタリックH90株を、使用してください。アガロースパッド上の細胞の即時取り付けは細胞分裂の後、姉妹細胞が隣同士に残ることを保証します。
    2. 細胞極性(探索的ダイナミクスとshmooing)をモニタ30℃、イメージングのための従来の取り付け細胞に3-4時間、200rpmで細胞培養液1-3 mlでインキュベートします。これらの3-4時間以内に、最後の有糸分裂が起こっているでしょう。少数の細胞は、偏光を開始していますが、ほとんどは、ちょうど彼らの探求偏光ダイナミクスを開始します。
    3. 細胞 - 細胞融合を監視するには、30℃で、4-6時間のpri 200rpmで細胞培養液1-3 mlでインキュベートまたはイメージング用の取り付け細胞へ。
    4. 監視するために 融合後のイベントは、30°C、イメージングのための細胞を装着する前に8時間、200 rpmで細胞培養物1-3 mlでインキュベートします。
    5. (唯一の異体性の株に)特定のフェロモン濃度に対する応答を監視するには、30℃で細胞培養の3ミリリットルをインキュベート、200rpmで3-4時間のためのイメージングのための細胞をマウントする前に。
      1. (プロトコルセクション2.4.1を参照してください。以下)、95℃のヒートブロックからMSL-N含有マイクロチューブを外します。溶融MSL-Nアガロースで直接所望の濃度でP-因子またはM-要因を追加します。即時パッドの準備の前にボルテックスでよく混和します。
      2. セルがマウントした後、撮像前に25℃で15-30分間パッドをインキュベートします。 P因子とM因子フェロモンをメタノール中1mg / mlのストック溶液から使用しました。
        注:変異体での作業はインキュベーション時間は変更になる場合があります株場合。細胞の凝集は、液体メートルに延長されたインキュベーション後に発生する可能性がありますEDIAと、いくつかの変異株では特に強いかもしれません。凝集した細胞は、単層でアガロースパッド上にスポットし、したがって、オートフォーカス、画像が困難であることはできません。広範な細胞凝集は、(プロトコルのセクション2.3.1のように。)すぐに窒素欠く培地で洗浄および再懸濁した後、アガロースパッド上の細胞をマウントする場合には及び撮像前に30℃でそれらをインキュベートします。
  4. イメージングのための細胞をマウントします:
    1. 10〜15分間95℃のヒートブロックにアリコートを融解し、スペーサー( 図1B)によって分離された2枚のスライドガラスの間に200μLを添加することにより、MSL-Nをアガロースパッド16を準備ます。 〜0.5ミリメートルの厚さのスペーサーを使用してください。スペーサーを作るために、このような制限酵素で配信されるような段ボールの切り出しストリップを、使用しています。
    2. 、1分間千×gで100μlの細胞をペレット上清を除去し、残留2-4μlの培地中の細胞を再懸濁。それは遅らせるように新鮮な培地に再懸濁しないでください交配。
    3. 2-3分後、慎重にスペーサーとトップスライドガラスを削除します。いくつかの株を搭載する場合、細胞は、アガロースパッドを準備する前に濃縮調製。
    4. パッドへの細胞の1μlを添加して、ドロップがカバースリップで覆ってVALAPと封止前(〜1分)の乾燥を開始するまで待ちます。
    5. パッドは、25℃または室温でイメージングする前に少なくとも30分間座ってみましょう。
    6. 交配の様々な段階における細胞の混合物を得るために、MSL-N(2.3節を参照してください。)での洗浄後、直ちにパッドを作成し、18°CO / N(〜15時間)インキュベートします。このアプローチは、微弱な信号の高時間分解能やサンプルとの明確な交配段階で細胞を画像化するために有用です。

交配酵母細胞の3ライブセルイメージング

  1. 画像取得設定を調整します。
    注意:ここで紹介する画像取得の設定は、カスタマイズされたオリンパスIX-71から成るDeltaVisionプラットフォーム用に最適化されましたプランアポ60X / 1.42 NAまたはU-プランアポ100X / 1.4 NA対物レンズ、CoolSNAP HQ2カメラとインサイトSSI 7色の組合せ単位照明付き倒立顕微鏡。ハードウェアは、デジタルオートフォーカスを可能にsoftWoRxのv4.1.2によって制御されています。
    1. 長い時間をかけてZ-ドリフトは、ソフトウェアのオートフォーカスシステムの容量を上回ることができますので、オートフォーカス間隔が15分を超えないことを確認してください。ハードウェアベースのオートフォーカスシステムを使用している場合は、より大きな間隔を使用します。
    2. 撮像間隔を調整します。初めての蛍光標識タンパク質を扱う際の出発点として〜15時間、画像ごとに10分を取ります。この間隔は、大規模な漂白することなく、全体の交配プロセスの良好な概要を提供します。
      1. このような融合のような、より正確に時間イベントに5分間隔または短い付のイメージ。短い間隔は、低露光時間と少し漂白を可能にする強力な蛍光団を必要とします。 1分間の回避O / N顕微鏡下の間隔で画像化のための議定書の2.4.6項で説明するように、代わりにすべての交配段階の混合物を準備します。
    3. 画像露光時間を調整します。 50と300ミリ秒の間にテスト露光時間。 (典型的には100以上)識別可能な信号との時間点の多数を達成するように、信号対雑音比と退色のバランスを取ることを目指し。
    4. Z-切片を調整します。セクション5ミクロンをカバーするすべての0.3μmでは、良好な結像深さを提供しています。 ( - 総サンプル深度の単掃引取得光軸統合)OAIを使用することによって最小化することができるZ-切片がさらに増加の光損傷に注意してください。グッドオートフォーカスシステムは、多くのZ-セクションの必要性を低減し、強くお勧めします。
  2. 接合型特有の挙動を研究するためのヒント:
    1. 異体性の株について、H-使用して2つの細胞型を区別することができるように、H +細胞は、異なる蛍光団を表します。任意の遺伝的にコードされfluorophoを使用します我々はsfGFP、GFP 17の高速フォールディング変異体との良好な成功を収めているものの、内因性タンパク質の細胞質ゾルのバージョンまたは融合体として発現再び。内因性タンパク質は通常、相同組換え14によってそれらの内因性のゲノム遺伝子座でタグ付けされています。
    2. ホモタリック株について、それぞれ、例えば、PおよびM細胞における発現を駆動するMAP3mam2フェロモン受容体遺伝子のもののような接合型特異的プロモーターの制御下で、遺伝的にコードされ、細胞質ゾルの蛍光タンパク質を発現します。 MAP3mam2のプロモーターは、栄養成長の間に不活性であり、窒素飢餓18,19際に誘導されています。これらのプロモーターの制御下で、細胞質ゾルGFPまたはmCherryをの発現を駆動する構築物は、一般的に性生活サイクル12の正常な進行を妨げないゲノム遺伝子座( ura4、LEU1)に統合されています。
    他に1パートナー細胞からの蛍光シグナルの伝達として視覚化細胞融合の正確なタイミングを決定するために、(プロトコルのセクション3.2.2のように)交配型の特定の細胞質ゾルのフルオロフォアを使用してください。

交尾と融合効率の4.定量

  1. 直接MSL-N上記のステップ2.3.1のように、MSL-Nアガロースパッド上に洗い、撮像前に25℃で24時間( 図1A)に向けて出発した後、11,12にスポット細胞を交配し、融合効率を定量化するために。このプロトコルをホモタリック野生型株の交配効率を使用して〜60%と融合効率は99%に達します。変異株で観察されたこれらの値の減少は、端末表現型または遅延を反映するかどうかを試験するために、36時間のインキュベーション時間で実験を繰り返します。
  2. 接合効率を計算しますEquation1交配対から同定接合子、子嚢、および非融合細胞対を含みますお互いに対するそれらの位置と成長。
  3. 融合効率を算出しEquation2
    注:融合相手のペアは、研究中の変異体は胞子形成に影響を及ぼさないことが知られている場合には胞子を形成する能力によって同定されます。胞子形成を読み出しとして使用することができない場合、融合は、両方のパートナーにのみ嵌合相手で発現細胞質のマーカーの広がりを観察することによって決定されます。

Representative Results

窒素源を除去すると分裂酵母の成長と交配ダイナミクス
窒素飢餓が分裂酵母における有性生殖の開始のための前提条件であるように、野生型ホモタリックH90株を、 図1に概説たプロトコルに従って、窒素欠乏培地に窒素リッチからのシフト( 図2)上にモニターした。簡単に説明すると、細胞最終OD 600 = 1.5になるまで洗浄し、MSL-N液体培地に再懸濁し、回収し、MSL + N培地で対数期(OD 600 = 0.5)にO / Nを成長させました。細胞の2時間毎のアリコートは、カルコフロール染色および画像化した( 図2A - D)。

カルコフロア染色( 図2A)、窒素リッチ培地中で〜の細胞の21%がseptatingたことを明らかにした(nは> 300、 図2B)とディビで、平均セル長シオンは15.2±1.4μmでた(n = 50、 図2C)でした。非分裂細胞は、細胞の長さの広い分布(; N> 200、 図2D 8-14μm)を示しました。しかし、2時間MSL-N媒体への移行後、非分裂細胞の長さの分布の急激な変化は、細胞の60%以上が9ミクロン(n>は200、 図2D)よりも短いと、ありました。セル隔壁形成はまた、( 図2A、2Cは 、N = 50)9.8±0.8ミクロンの長さを短くで検出されました。 MSL-Nの時間が増加するにつれて、両方の非分裂及び分裂細胞の長さの更なる低減は、また、観察されました。実際、8時間後に培養液の中隔指数は2%未満に減少した(N> 300)と、細胞の85%以上が7ミクロン(n>は200、 図2D)よりも短い長さでそれらの細胞周期を逮捕しました。

細胞を4時間、液体MSL-Nへのシフト後に交配対を形成し始め培地(<1%、 図2A)。続いて、シフト後の交配対の数急速に増加し、8時間、細胞の10%が嵌合相手(N> 200、 図2B)を従事。

交配のダイナミクスを監視するには、6時間飢餓誘導後、細胞のアリコートはまた、イメージングのためのMSL-Nアガロースパッド上に搭載しました。細胞は、任意の明白な同期( 映画S1)することなく、その後の21時間で( 図2E、2F)shmooing、融合および胞子形成を施行しました。単層( 図2GおよびムービーS1)に密に配置されたとき、細胞の60%以上がパートナーを従事して接合効率は、所与の視野内の細胞の相対的な位置や密度に依存していました。

野生型異体性のH +およびH-分裂酵母菌株もと同じプロトコルに供しました窒素除去の時に一対一の比率におけるH +及びH -細胞を混合するN個の追加の工程。同様の飢餓と相手ダイナミクスが観察されたが、接合効率は( 図2G、映画S2)わずかに低かったです。

交配分裂酵母細胞における蛍光標識タンパク質のダイナミクスを監視します
ネイティブの座からMyo52-3GFPを発現する細胞を交配にタイプ-VミオシンMyo52(参考文献20)のダイナミクスを監視するには、指数関数的に成長したH-細胞は、H +細胞が同様にPからMyo52-tdTomato、ならびにサイトゾルGFPを発現して混合し、特定のMAP3プロモーターを-cell。細胞懸濁液を洗​​浄し、MSL-N培地中で希釈し、30℃以上、10分間隔でO / Nイメージング用MSL-Nアガロースのパッド上に事前取付け細胞に200 rpmで6時間インキュベートしました。

以前11,1を報告したように細胞表層全体で2 Myo52最初に形成されたダイナミックゾーン( 図3A、矢じりムービーS3)。 Myo52信号は、単に時間〜+ H-細胞内への細胞質ゾルGFPシグナルの伝達により可視化した融合事象、前の単焦点で( 図3A、矢印ムービーS3)を安定化させた( 図3AおよびムービーS3) 。 Myo52-tdTomato信号はまた、その拡張中に融合首で観察することができたが、接合体は胞子形成( 図3AおよびムービーS3)へ進むとして識別可能な信号は明らかではなかったです。

外部フェロモンに露出異体性の分裂酵母細胞の挙動を監視します
脱感作のためにP-率を低下させるSxa2プロテアーゼを欠く異体性のH-細胞は、容易に合成P-因子に応答します。 H- sxa2Δ株 、アクティブCdc42の11のマーカーとしてSCD2-GFPを発現するが、それに応じて説明されたプロトコルに、MSL + N培地中で増殖させました。細胞は、MSL-N培地で洗浄し、30℃以上で4時間インキュベートしました。 P因子のメタノールを含むMSL-Nアガロースパッド(データは示していない)を0.1μg/ mlの(低いフェロモン、 図3B)または1μgの/ mlの(高いフェロモン、 図3C)は、新たなスライド上で切断し、調製し、配置しました異なるフェロモン量を含むミニパッドを生成します。細胞懸濁液0.5μlを5分間隔でO / Nの画像化のため各ミニパッド上に取り付けました。

P-因子の高レベルは、このように一つの細胞極からシュムーの伸長を誘導する、単一SCD2ゾーンを安定化しつつ、公表された結果11との一致では、低P-因子レベルは、成長のないダイナミックSCD2ゾーン( 図3B、 映画S4)の形成を促進し(Figure 3C、 映画S5)。

図1
図1:長期イメージングのために分裂酵母のサンプルを調製するために分裂酵母性的ライフサイクルと(B)を監視するために使用されるプロトコルのプロトコルの概略図 (A)は概略の説明。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。

図2
図2:MSL-NメディアにMSL + Nから移行分裂酵母細胞の増殖と交配ダイナミクスは、カルコフロール染色細胞の(A)落射蛍光顕微鏡写真は、時間の表示期間のためのMSL-Nのメディアに移行しました。 (B)の割合septatingの(濃紺ライン、n個の時点あたり> 300)と交配(水色のライン、n個の時点あたり> 300)細胞は、時間の表示期間のためのMSL-Nのメディアに移行しました。 septating細胞の(C)の平均長さは、時間の表示期間(N =時点あたり50時間の時点のn = 20 8を除く)のためにMSL-Nのメディアに移行しました。 (D)非分裂細胞の長さの分布は(時点あたりnは> 200)時間の表示された期間のためのMSL-N培地にシフト。 (E)非融合(ダ ​​ークブルーライン)の平均分数、融合(水色の線)とH90野生型酵母の集団における細胞(黒線)を胞子形成は、時間の表示期間のためのMSL-Nのメディアに移行し、 (三つの異なるtimelapsesからn個の時点あたり> 900細胞)の時点6時間で寒天パッド上に取り付けられました。パートナーとの間には屈折細胞壁はDIC顕微鏡写真で見えなかったし、胞子細胞壁の形成がSPに得点するために使用されたときに細胞が融合したと考えられました細胞をorulating。交配細胞の(F)DIC顕微鏡写真は、時間の表示期間のためのMSL-Nのメディアに移行しました。 (G)嵌合H90のためのアガロースパッド上の細胞密度の関数としての効率(ダークブルードット)とh + / H-(水色ドット)細胞を24時間MSL-Nのメディアに移行しました。長期的なイメージングのための細胞の最適な密度は/ mm 2で約25,000個の細胞で達成されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図3:示された遺伝子型を有する細胞の蛍光タンパク質の動的ローカライズ分裂酵母の交尾中の (A)デコンボリューション単一z平面の落射蛍光顕微鏡写真は6時間、MSL-NのメディアにMSL + Nからシフトし、上に搭載しました示された時間のためのMSL-Nアガロースパッド。矢印は、動的Myo52-3GFPゾーンを示し、矢印は融合焦点にMyo52の局在を指摘しています。 (B)示された遺伝子型を有する細胞の(C)デコンボリューション単一z平面の落射蛍光顕微鏡写真(B)4時間MSL-NメディアにMSL + Nからシフト及び0.1μgの/ mlを含むMSL-Nアガロースミニパッド上に取り付けられましたまたは1μgの示された時間のためのP-ファクター/ mlの(C)。矢頭は、動的(B)または安定(C)SCD2-GFPゾーンを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

映画1
補足ムービー1: 野生型H90の分裂酵母CEのDICタイムラプス撮影の前に6時間、窒素飢餓たLLS。 (右クリックしてダウンロード)。

MOVIE2
補足ムービー2: 混合し、イメージングの前に6時間、窒素飢餓野生型のH +のDICタイムラプスとH-分裂酵母細胞。 (右クリックしてダウンロード)。

Movie3
"> 補足ムービー3: デコンボリューション単一z平面の落射蛍光およびP-細胞特異的MAP3プロモーター由来の天然の遺伝子座および細胞質GFPからMyo52-tdTomatoを発現している時間+細胞と混合ネイティブ座からMyo52-3GFPを発現しているH-細胞のDICのタイムラプス細胞は、30ºCで6時間、MSL-N培地中で増殖させた撮影の前に。H-細胞内への細胞質ゾルGFPの転送は、融合時間を定義します。 (右クリックしてダウンロード)。

Movie4
補足ムービー4: デコンボリューション単一z平面の落射蛍光およびH- sxa2細胞のexp DICのタイムラプスressing SCD2-GFPを0.1μg/ mLのP-因子で処理して、その天然のプロモーターから。細胞を、イメージングの前に30ºCで4時間MSL-N培地中で増殖させた。 (右クリックしてダウンロード)。

Movie5
補足ムービー5: デコンボリューション単一z平面の落射蛍光とを1μg/ mlのP-因子で処理して、その天然プロモーターからSCD2-GFPを発現H- sxa2細胞のDICのタイムラプス細胞は、30ºCで4時間MSL-N培地中で増殖させました撮影の前に。 (右クリックしてダウンロード)。

YSM995 H-重量
YSM1371 時間+重量
YSM 1396 H90重量
YSM2534 H- myo52-3GFP :: kanMX
YSM2730 H + myo52-tdTomato :: natMX
Pmap3:GFP ::はura4 + @ ura4locus
YSM2731 H- SCD2-GFP :: natMXsxa2Δ:: kanMX

表S1:本研究で用いた株。

Discussion

環境条件、特に栄養利用は、強く分裂酵母の生理機能に影響を与えます。窒素飢餓は、有性生殖へのコミットメントのために必要であると最初に分裂細胞周期の進行(参考文献21および図2)での印象的な変化をもたらします。指数関数的に増加する人口からの窒素除去の際に、部門のセルサイズは急速に( 図2C)減少し、細胞の大部分は、新たに生まれた指数関数的に増殖した細胞(参考文献21および図2D)の長さよりも短い有糸分裂の進行を逮捕します。反対の交配型の細胞が有糸分裂の進行を逮捕ように、彼らはパートナーを交配従事し、接合体と胞子形成( 図2B、2E、2F)を形成するために進んでください。野生型細胞の二次元単層の場合には、H90細胞の60以上%がパートナーと係合する、ほ ​​ぼすべての細胞融合( 図2Gを受けます図2G)に依存します。高い交配効率を得るためのプロトコルの最も重要な側面の一つは、細胞が全体に示す濃度範囲内に維持されることを保証することです。 図2に示すように、セルサイズと交配効率パラメータの監視は、その後、細胞を効率的に有性生殖を入力する簡単な制御を提供します。

我々は、(アミノ酸および窒素塩基の低くても金額が除外されている)メディア不足に任意の窒素源を交配するので、このような図2Eおよび2Gに提示されたもののような高交配効率が唯一の完全に原栄養株を用いて得られる、ということに注意してください。栄養要求株が使用されるが、細胞は、すべての回でのプロトコルに記載された細胞密度の範囲内に維持されることを保証するために、追加のケアを必要とすることができます。でも注意して、のみ下部交配効率が観察されます。交配効率はまた、嵌合プロセスの間に温度感受性突然変異対立遺伝子の使用を制限することができる高温で観察低い効率で、温度に影響されます。

ここで紹介する方法は、主に蛍光レポーターの長期的なイメージングのために使用されます。イメージングは​​、長い時間をかけて行われるため、分裂酵母の交配の成功イメージングは​​、利用可能な顕微鏡の設定に大きく依存しています。このため、オートフォーカスシステムに顕微鏡セットアップ、その感度及びアクセスの安定性が重要です。いずれかのソフトウェアベースまたは内蔵ハードウェアオートフォーカスシステムが可能です。また、スループットを増加させるために、マルチポイント獲得を可能にする自動ステージは、別の重要な品質です。

結像品質は、目的の蛍光体の特性によって制限されます。 Protocoに詳述液体MSL-N培地中で明確なインキュベーション時間リットルの2.3節は、フェロモンによって誘導される標識タンパク質の蛍光を最適化し、興味のある唯一の交配ステージを撮像することにより、不要な漂白を最小限に抑えることを目的としています。豊富なまたは高度に蛍光focalizedタグタンパク質が全体の性的ライフサイクル( 動画S3)の経過時点の何百もの取得を可能にしているが、他のタンパク質が原因で、光退色にこのような長い時間にわたってイメージに挑戦しています。画質は、選択されたフルオロフォア、一般的にGFP誘導体に依存します。私たちは繰り返し迅速な反応速度でひだsfGFP 17(superfolder GFP)は、強力なオートファジーは、迅速なタンパク質の代謝回転を誘発する可能性があるため、交配プロセスの間に優れた信号を提供することを観察しました。重要なことは、我々は、蛍光タンパク質の成熟17,22のために必要な酸素の可用性を監視しませんでした。したがって、mounteである細胞の後に発現されるタンパク質のレベルを定量化するために蛍光測定を使用することに慎重になることをお勧めしますスライド上にD、またはそのような実験を行うための代替酸素透過性のマイクロ流体デバイスを使用します。そのようなパッドは有性生殖のすべての段階での細胞の混合物を含むように加えて、アガロースパッド夜に細胞をスポットし、18ºCO / Nに保っは画像弱い記者に非常に有用でした。

分裂酵母の交配は同期示さず、細胞は容易に他の細胞は既に( 作品S1、S2)を胞子形成と一緒にshmooingを開始見ることができます。このような人口動態は、選択の方法、ここで説明した単一細胞の顕微鏡を作り、使用する古典的な、バルク生化学的手法を困難にします。すべての顕微鏡ベースのアプローチは、原理的には、ここで説明されたプロトコルを用いて調製した細胞に適用することができます。重要なことは、これらのアプローチは、このようなDudinや同僚12によって記述細胞-細胞融合のようなタイプ固有のダイナミクスを交配示すプロセスを監視することができます。非対称性、接合型記者を監視するには特に有用な( 図3A)でした。異体性の株で作業するときに、2つの交配型を区別することは容易にHおよびH +の細胞内のタンパク質にタグを付ける明確な蛍光団を使用することによって達成されます。しかし、これはホモタリック株のために現実的ではありません。 H90細胞の交配型を区別するために開発された手法は、接合型特異的プロモーターの制御下で、サイトゾル蛍光タンパク質を発現することです。具体的には、フェロモン受容体遺伝子のMAP3mam2のプロモーターはそれぞれPおよびM細胞におけるGFPまたはmCherryをタンパク質の発現を駆動するために使用しました。さらに、これらのマーカーは、他の1つのパートナー細胞からの蛍光シグナルの伝達として視覚化、細胞 - 細胞融合の正確なタイミングを可能にしました。

交尾フェロモンは酵母11に有性生殖の異なる段階を進行するために重要な決定因子であります23。分裂酵母における異なる細胞偏光状態への合成フェロモンリードの異なるレベル( 図3B、3Cおよび参考文献11)。プロトコルは、上記に含ま明確な外因性フェロモンレベルは細胞生理学にどのように影響するかを評価することができます。フェロモンプロテアーゼSxa2が急速P因子が低下するため、プロテアーゼが削除された異体性の変異株は、再現性のある結果を得るために使用しました。しかし、反対の接合型だけでなく、レベルも交配相手によって放出されるフェロモンの空間分布の細胞の混合物に重要である可能性が高いです。細胞応答にフェロモン空間分布の影響を分析すると、このような酵母24,25出芽に採用マイクロ流体デバイスなど、より洗練された環境の開発が必要になります。

要約すると、我々は分裂酵母の性的ライフサイクルの長期的な顕微鏡検査のための基本的な方法を提示します。このプロトコルのマイナー調整はresearを許可しますchの性的ライフサイクルの異なる段階における細胞応答に焦点を当てています。単一細胞生化学ツールおよびマイクロ流体デバイスと、このアプローチを組み合わせることで、さらに強力なモデル系として分裂酵母有性生殖を推進していきます。

Acknowledgments

AVはEMBO長期ポスドクフェローシップによってサポートされていました。マーティンラボでの研究は、SGMにERCの起動許可(GeometryCellCycle)とスイス国立科学財団の助成金(31003A_155944)によって運営されています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich G8270-10KG
KH2PO4 Sigma-Aldrich 1.05108.0050
NaCl Sigma-Aldrich 71381
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 63140
CaCl2 Sigma-Aldrich 12095
Pantothenate AppliChem A2088,0025
Nicotinic Acid AppliChem A0963,0100
Inositol AppliChem A1716,0100
Biotin AppliChem A0967,0250
Boric Acid Sigma-Aldrich B6768-1KG
MnSO4 AppliChem A1038,0250
ZnSO4•7H2 Sigma-Aldrich Z4750
FeCl2•6H2O AppliChem A3514,0250
Molybdenum oxide (VI) (MoO3) Sigma-Aldrich 69850
KI AppliChem A3872,0100
CuSO4•5H2O AppliChem A1034,0500
Citric Acid  AppliChem A2344,0500
Agarose Promega V3125
(NH4)2SO4  Merck 1.01217.1000
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-100G
Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% Sigma-Aldrich A9126-100G
Uracil  Sigma-Aldrich U0750
Lanolin Sigma-Aldrich L7387
Vaseline Reactolab 92045-74-4
Paraffin Reactolab 7005600

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References

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