طريقة سريعة لمعالجة الدم إلى زيادة الغلة من مستويات البلازما الببتيد في الدم البشري

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يمكن استخدام طريقة معالجة الدم السريعة في البشر وينتج مستويات الببتيد أعلى وكذلك يسمح للتقييم من النموذج الجزيئي الصحيح. ولذلك، فإن هذه الطريقة أن يكون أداة قيمة في مجال البحوث الببتيد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

البحوث في مجال تنظيم تناول الطعام تكتسب أهمية. هذا غالبا ما تتضمن قياس الببتيدات التي تنظم تناول الطعام. لتحديد الصحيح من تركيز الببتيد، ويجب أن تكون مستقرة أثناء معالجة الدم. ولكن هذا ليس هو الحال لعدة الببتيدات التي تدهورت بسرعة عن طريق peptidases الذاتية. مؤخرا، قمنا بتطوير طريقة معالجة الدم توظيف R educed درجات الحرارة، وcidification، rotease P تثبيط، وأنا sotopic الضوابط الخارجية وD ilution (RAPID) لاستخدامها في الفئران. هنا، قمنا بإنشاء هذه التقنية لاستخدامها في البشر والتحقيق الانتعاش، شكل الجزيئي وتعميم تركيز الهرمونات التنظيمية تناول الطعام. تحسين طريقة سريعة بشكل ملحوظ في استرداد 125 السوماتوستاتين-28 (+ 39٪) المسمى أنا، مثل الجلوكاجون الببتيد-1 (+ 35٪)، جريلين أسيل والجلوكاجون (+ 32٪)، والانسولين وkisspeptin (+ 29٪ )، نستافين 1 (+ 28٪)، ليبتين(+ 21٪)، والببتيد YY 3-36 (+ 19٪) مقارنة مع المعالجة القياسية (الدم EDTA على الجليد، ف <0.001). أظهر عالية الأداء اللوني السائل شطف من جريلين أسيل الذاتية على الموقف المتوقع بعد معالجة سريعة، بينما بعد المعالجة القياسية وتدهور 62٪ من هرمون جريلين أسيل مما أدى إلى الذروة في وقت سابق من المحتمل تمثل desacyl جريلين. بعد المعالجة RAPID كانت نسبة هرمون جريلين أسيل / desacyl في الدم من الموضوعات الوزن الطبيعي 1: 3 مقارنة 1:23 بعد المعالجة القياسية = 0.03). كما كانت مستويات kisspeptin الذاتية أعلى بعد RAPID مقارنة مع المعالجة القياسية (+ 99٪، ع = 0.02). ويمكن استخدام طريقة معالجة الدم السريعة في البشر، وينتج مستويات الببتيد أعلى ويسمح للتقييم من النموذج الجزيئي الصحيح.

Introduction

في ظل الانتشار المتزايد في جميع أنحاء العالم من السمنة 1،2، والبحث في مجال تنظيم تناول الطعام تكتسب أهمية. بينما حتى الآن الببتيد واحد فقط هو معروف أن ينتج محيطيا ويتصرف مركزيا لتحفيز الاستهلاك الغذائي، وهي جريلين خلال العقود الماضية، تم التعرف على مجموعة واسعة من الببتيدات التي تقلل من تناول الطعام، على سبيل المثال. اللبتين، الببتيد YY (PYY) وأيضا الجلوكاجون مثل الببتيد-1 (GLP-1) والانسولين لذلك، في الدراسات التحقيق في الآليات التنظيمية للمستويات الجوع والببتيد الشبع وغالبا ما يتم تقييمها وفي نفس الوقت، فمن المفترض أن الببتيد درس مستقر وتعافى في عوائد عالية خلال تشكيل البلازما. ومع ذلك، في كثير من الأحيان ليست هذه هي القضية بسبب انهيار الذاتية السريع كما هو موضح من قبل لمثل. جريلين الذي تتحلل من أسيل لdesacyl جريلين 5. ولذلك، فإننا وصفها مؤخرا طريقة سريعة لتصنيع الدمالغناء في الفئران توظيف R educed درجات الحرارة، وcidification، rotease P تثبيط، وأنا sotopic الضوابط الخارجية وD ilution 6. تحسين هذه الطريقة لاسترداد 11 من 12 الببتيدات اختبارها وسمح لتحديد الصحيح شكل الجزيئي المتداولة مقارنة معالجة الدم العادي (EDTA الدم على الجليد) 6. وقد استخدم هذا الأسلوب في عدة دراسات لاحقة 7-12 للكشف عن تعميم جريلين فضلا عن الافراج عن القشرية عامل 13. ولذلك، أثبتت طريقة مفيدة للبحث الببتيد في القوارض. ومع ذلك، منذ الدراسات القوارض ليست دائما للترجمة إلى أنواع أخرى، وينبغي وضع طريقة لاستخدامها في دم الإنسان كذلك.

وكان الهدف من هذه الدراسة لاختبار طريقة سريعة لمعالجة الدم لدى البشر مقارنة معالجة الدم العادي، EDTA الدم على الجليد، والتي يوصى على نطاق واسع في كثير من الأحيان 14 و شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي في السريري وكذلك إعداد البحوث. اختبرنا استرداد مجموعة مختارة من 125 الببتيدات المسمى I-المشاركة في تنظيم تناول الطعام بما في ذلك الببتيدات الثابتة، وكذلك المرشحين الجدد اقترح مؤخرا للعب دور في تغذية تنظيم (تظهر على استهلاك المواد الغذائية في الجدول 1) المعالجة التالية مع كل الأساليب. وقد تم اختيار الهرمونات أيضا لتمثيل الببتيدات من مختلف طول وتهمة (الجدول 2). وعلاوة على ذلك، لهرمون جريلين نحن التحقيق في شكل الجزيئي (ق) وفقا للطريقة القياسية والسريعة. وأخيرا، قمنا بتقييم جريلين الذاتية (أسيل وجريلين desacyl) وكذلك مستويات kisspeptin، الببتيد كما اقترح مؤخرا أن تلعب دورا في تنظيم تناول الطعام 15،16 التالية معالجة سريعة أو معيار. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن التحقيق أيضا هذه المستويات الببتيد في عدد السكان من الموضوعات مع مجموعة واسعة من مؤشر كتلة الجسم (تتراوح 10،2-67،6 كجم / م 2) لدراسة possibالخلافات جنيه المتعلقة وزن الجسم تتغير بشكل مزمن.

الجدول 1

الجدول 2

التشخيص والتقييم، والخطة:
المشاركين في الدراسة
وجميع المشاركين في الدراسة المستشفى حديثا المرضى (كان إدراج خلال يومين من الدخول إلى المستشفى) من قسم الطب النفسي في شاريتيه-Universitätsmedizin برلين وأعطى موافقة خطية مستنيرة. لتجنب أي تأثير من الجنسين أدرجت فقط المريضات. وشارك ما مجموعه 42 مواضيع في هذه الدراسة وقسمت إلى ثلاث مجموعات: الوزن الطبيعي (مؤشر كتلة الجسم 18،5 حتي 25 كجم / م ن = 12)، فقدان الشهية العصبي (مؤشر كتلة الجسم <17.5 كغ / م ن = 15) والسمنة (مؤشر كتلة الجسم> 30 كجم / م ن = 15). كانت أنورإكسيك والمرضى يعانون من السمنة المفرطةتشخيص وفقا للتصنيف الدولي للأمراض-10 والمستشفى لزيادة الوزن (فقدان الشهية العصبي) أو تخفيض الوزن (السمنة)، على التوالي. نقلوا الى المستشفى جميع المرضى الوزن الطبيعي حصرا بسبب الأعراض الجسدية من دون اضطرابات جسدية ذات الصلة. تم استبعاد المرضى الذين يعانون من أعراض الجسدية الجهاز الهضمي أو تاريخ من جراحة الجهاز الهضمي. كما شملت معايير الاستبعاد عصر <18 عاما، والحمل الحالي والأمراض الذهانية غير المعالجة. تم إجراء جمع الدم في يوم 2 أو 3 بعد دخول المستشفى قبل تلقي العلاج الغذائي لزيادة أو خفض وزن الجسم، على التوالي. تم تقييم المعلمات الجسم البشري في نفس اليوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الاخلاق المحلية للبحث البشري (رقم بروتوكول EA1 / 114/10).

تجهيز 1. الدم

  1. جمع الدم الوريدي 7:00 حتي 8:00 بعد ليلة وضحاها بسرعة من الوريد الساعد والعملية وفقا للإجراءات القياسية أو طريقة سريعة. إرشاد العباد إلى عدم ممارسة أو الدخان قبل انسحاب الدم.
  2. لمعالجة القياسية، وجمع الدم في أنابيب تحتوي على EDTA المبردة وأجهزة الطرد المركزي في غضون 10 دقيقة في 3000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع طاف والحفاظ على -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة بواسطة المقايسة المناعية الشعاعية.
  3. لمعالجة سريعة، وتمييع الدم فورا (في حدود 1 دقيقة بعد انسحاب الدم) 01:10 في المخزن الجليد الباردة (درجة الحموضة 3.6) تحتوي على 0.1 M خلات الأمونيوم، و 0.5 M كلوريد الصوديوم والأنزيمات مثبطات (diprotin A، E-64-د، antipain ، leupeptin، chymostatin، 1 ميكروغرام / مل). ثم، الطرد المركزي في غضون 10 دقيقة في 3000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع طاف بناجي ماصة في أنابيب البولي بروبلين كما هو مفصل من قبل في الفئران 6.
    1. خراطيش تهمة اللوني (360 ملغ، 55-105 ميكرون) مع 100٪ الأسيتونتريل (معدل 10 مل / دقيقة)، تتوازن مع 0.1٪ trifluoroacetate (TFA، ومعدل 10 مل / دقيقة)، والحمل مع طاف بمعدل ثابت من 1 مل / دقيقة باستخدام مضخة الحقنة.
    2. بعد ذلك، ويغسل خراطيش مع 3 مل 0.1٪ TFA (معدل 10 مل / دقيقة) وأزل ببطء مع 2 مل 70٪ الأسيتونتريل تحتوي على 0.1٪ TFA (2 مل / دقيقة).
    3. عينات مزال الجافة باستخدام الطرد المركزي فراغ ومخزن في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة بواسطة المقايسة المناعية الشعاعية.
      ملاحظة: إجراء جميع الخطوات في البولي بروبلين (معالجة RAPID) والبورسليكات (المقايسة المناعية الشعاعية) الأنابيب التي تظهر أقل بكثير سطح خصائص ملزمة، وبالتالي تقليل الخسائر الببتيد لأكثر من الببتيدات درس قبل 26.

2. القياسات

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ خطوات في هذا القسم في المختبرمعتمد للعمل مع المواد المشعة. الاحتياطات القياسية للعمل مع 125 أنا ينبغي اتخاذها.

  1. انتعاش رديولبلد الببتيدات
    1. الحصول على 125 الببتيدات الإنسان I-رديولبلد (على سبيل المثال. أسيل-جريلين، GLP-1، الجلوكاجون والأنسولين، kisspeptin، اللبتين، نستافين 1، PYY 3-36 والسوماتوستاتين-28).
    2. حافظ على الببتيدات في شكل مسحوق حتى التجربة، ثم تمييع حديثا في 0.1٪ حامض الخليك (~ 100،000 نسخة في الدقيقة لكل مل).
    3. لمعالجة الدم العادي، مباشرة بعد انسحاب الدم الى EDTA المبردة التي تحتوي على أنابيب، نقل 1 مل من الدم في أنبوب مع 50 ميكرولتر من radiolabel تحتوي على 3،000-6،000 في الدقيقة (عد مباشرة قبل بدء التجربة).
    4. لمعالجة سريعة، نقل 1 مل دم EDTA تحتوي على الدم في أنبوب يحتوي على 9 مل العازلة RAPID (لتكوين رؤية 1.3) و 500 ميكرولتر radiolabel تحتوي على 30،000-60،000 التدوير. ارتفاع حجم نظرا لاستخدام 1:10 التخفيف 10 مرات من radiolabeلتر لمعالجة سريعة.
    5. بعد ذلك، وعينات العملية كما هو موضح في الخطوات 1.2 إلى 1.3.2.
    6. للتجارب الانتعاش، لا عينات يست جافة بواسطة الطرد المركزي فراغ وعدم تخزين في -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، تقييم الانتعاش من الببتيدات المسمى بالإشعاع مباشرة بعد ذلك باستخدام عداد غاما.
    7. قياس طاف كله في عينات قياسية، في حين RAPID عينات تحليل 1/10 من حجم التداول الكلي للحصول على المقارنة بين كمية radiolabel المستخدمة. لقياس، ونقل طاف في أنابيب المناسب في عداد غاما وتقييم التهم لكل دقيقة
    8. كمعيار 100٪، واستخدام اثنين من العينات مع 50 ميكرولتر من 125 الببتيد-I رديولبلد التي لا تخضع المعالجة. قياس في نفس الوقت مع عينات أخرى كما هو موضح في 2.1.7.
    9. إجراء تجربة 5-6 مرات لكل الببتيد.
  2. عالية الأداء اللوني السائل من رديولبلد الغريلين
    1. سحب الدم في جEDTA محاط بالتلال التي تحتوي على أنابيب ونقل 1 مل إلى أنابيب تحتوي على 200 ميكرولتر جريلين رديولبلد-أسيل تحتوي على 15،000-20،000 في الدقيقة (عد مباشرة قبل بدء التجربة).
    2. لمعالجة سريعة، نقل 1 ملليتر دم في أنبوب يحتوي على 9 مل العازلة RAPID (لتكوين رؤية 1.3) و 200 ميكرولتر أسيل رديولبلد جريلين تحتوي على 15،000-20،000 التدوير.
    3. بعد ذلك، وعينات العملية كما هو موضح في الخطوات 1.2 إلى 1.3.2.
    4. لمزيد من التحليل بواسطة عكس المرحلة HPLC، تحميل مباشرة عينات على مستقر العمود C18 السندات (2.1 ملم × 50 ملم، 1.8 ميكرون) معايرتها في 17٪ الأسيتونتريل في الماء (سواء تستكمل مع 0.1٪ TFA).
    5. بعد 5 دقائق موازنة، واستخدام التدرج 17-40٪ الأسيتونتريل إلى أزل العينة في 40 دقيقة (بمعدل 1 مل / دقيقة تدفق).
    6. جمع الكسور 1 مل كل دقيقة وتحليل النشاط الإشعاعي باستخدام عداد غاما.
    7. في تجربة منفصلة، ​​تحميل 200 ميكرولتر أسيل رديولبلد جريلين تحتوي على 15،000-20،000الاجتماع التحضيري للمؤتمر على العمود مباشرة وتنفيذ HPLC كما هو موضح في الخطوات 2.2.4 إلى 2.2.6.
  3. المقايسة المناعية الشعاعية
    1. لالمقايسة المناعية الشعاعية، ذوبان الجليد supernatants المجمدة (تجهيز قياسي) وفراغ مسحوق المجففة (طريقة سريعة) في درجة حرارة الغرفة.
    2. على الفور قبل المقايسة المناعية الشعاعية، اعادة تعليق عينات رابيد الجافة في ضعف H المقطر 2 O وفقا لحجم الأصلي للبلازما (500 ميكرولتر).
    3. تقييم kisspeptin ومجموع (بما في ذلك desacyl وجريلين أسيل) وكذلك هرمون جريلين أسيل كما هو موضح من قبل 12،27 باستخدام مقايسة مناعية شعاعية التجاري وفقا لبروتوكولات الصانعين. استخدام أنابيب البورسليكات التي تسمح تشكيل بيليه مستقر.
      1. في يوم واحد، واحتضان العينات مع العازلة فحص والأجسام المضادة الأولية (مثل مكافحة جريلين) في تخفيف المقدمة من قبل الشركة المصنعة لمدة 24 ساعة.
      2. في اليوم الثاني، إضافة 125 أنا التتبع (على سبيل المثال 125 I-جريلين)، فوrtex واحتضان لمدة 24 ساعة.
      3. في اليوم الثالث، إضافة عجل الكاشف، دوامة واحتضان على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. ثم، أنابيب الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة supernatants والاعتماد النشاط الإشعاعي في الكريات باستخدام عداد غاما
    4. حساب desacyl جريلين بالفرق من إجمالي جريلين ناقص أسيل. تقييم نسبة هرمون جريلين أسيل / desacyl بقسمة أسيل بواسطة desacyl جريلين عن كل عينة على حدة.
    5. معالجة جميع العينات - إن أمكن - في دفعة واحدة لتجنب التقلبات بين الفحص. كان التباين داخل فحص في التجربة الحالية <8٪ لkisspeptin، <7٪ للمجموع و<9٪ لهرمون جريلين أسيل.

3. التحليل الإحصائي

  1. تحديد توزيع البيانات باستخدام اختبار كولموغوروف-سميرنوف. التعبير عن البيانات كما يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).
  2. تقييم الاختلافات بين اثنينمجموعة من اختبار (ت). تقييم الفروق بين مجموعات متعددة من قبل جميع الإجراءات الزوج الحكيم متعددة المقارنة (توكي اللاحق اختبار) أو اتجاهين أنوفا تليها طريقة هولم-Sidak.
  3. تنظر ف <0.05 كبيرة وإجراء تحليلات باستخدام البرنامج الإحصائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تجهيز دم RAPID يزيد الغلة من 125 الببتيدات I-رديولبلد في الدم البشري مقارنة معالجة الدم العادي.
بعد المعالجة الدم العادي (EDTA الدم على الجليد)، وكان التعافي من الببتيدات رديولبلد ~ 60٪ في 9/9 الببتيدات (تتراوح 48-68٪، الشكل 1A - K). معالجة سريعة تحسن العائد في كل 125 الببتيدات وصفت لي، وبالتحديد في السوماتوستاتين-28 (+ 39٪، الشكل 1A)، مثل الجلوكاجون الببتيد-1 (+ 35٪، الشكل 1B)، أسيل جريلين (ن octanoyl جريلين، + 32٪، الشكل 1C)، الجلوكاجون (+ 32٪، 1D الشكل)، الانسولين (+ 29٪، الشكل 1E)، kisspeptin (+ 29٪، الشكل 1F)، نستافين 1 (+ 28٪، الشكل 1G)، ليبتين (+ 21٪، الشكل 1H) والببتيد YY 3-36 (+ 19٪، الشكل 1K) مقارنة مع المعالجة القياسية <0.001). في هذه الببتيدات 9، كان الانتعاش بعد طريقة سريعة ~ 90٪ (تتراوح 71-98٪، الشكل 1A - K).

الشكل 1
أضيف استرداد 125 الببتيدات وصفت أنا في الدم البشري التالية ستاندرد أو RAPID الدم معالجة رديولبلد الببتيد إلى دم الإنسان ومعالجتها وفقا للإجراءات القياسية (EDTA الدم على الجليد) أو طريقة سريعة (انخفاض درجات الحرارة، وتحمض، البروتيني: الشكل 1. تثبيط، والضوابط الخارجية النظائر وتمييع). وقد تم جمع supernatants وتحسب للنشاط الإشعاعي. يمثل كل عمود يعني ± SEM من 5-6 التجارب. *** ع <0.001 مقابل المعالجة القياسية. يرجى النقر هنا للتنافسوا نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد RAPID المعالجة، الغريلين Elutes في الموقف المتوقع.
بعد معالجة سريعة من الدم البشري، 125 جريلين المسمى I-مزال في موقف متوقع، بينما بعد الإجراء القياسي لوحظ ذروة سابقة على الأرجح الموافق desacyl جريلين (الشكل 2). وهذا يمثل تدهور 62٪ من الببتيد.

الشكل 2
تمت إضافة الملف شطف المسمى I-125 أسيل الغريلين في الدم البشري التالية ستاندرد أو RAPID الدم معالجة رديولبلد الببتيد إلى دم الإنسان ومعالجتها وفقا للإجراءات القياسية أو طريقة سريعة: الرقم 2. بعد ذلك، تم تحميل طاف على الأداء العالي العمود اللوني السائل. كانت شطافة العقيدlected كل دقيقة ويحسب بالنسبة النشاط الإشعاعي. بعد معالجة سريعة أكثر من الببتيد مزال في الوقت المتوقع، في حين بعد مستوى تجهيز نسبة كبيرة مزال في وقت سابق، على الأرجح تمثل جريلين desacyl. اختصار: الاجتماع التحضيري للمؤتمر، التهم لكل دقيقة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

RAPID معالجة الدم يحسن أسيل / Desacyl الغريلين نسبة والنتائج في زيادة مستويات الدم الذاتية Kisspeptin بالمقارنة مع المعالجة قياسي.
تم سحب الدم من فقدان الشهية والوزن الطبيعي والموضوعات السمنة ومعالجتها وفقا للإجراءات القياسية أو السريع. تم تقييم جريلين الذاتية (الكلي وأسيل جريلين) من خلال المقايسة المناعية الشعاعية. الجسم البشري وأمراض المصاحبة / وترد دواء من مجموعات الدراسة في الجدولين 3 و 4. بعد معالجة سريعة وكانت نسبة هرمون جريلين أسيل / desacyl في الدم من الموضوعات الوزن الطبيعي 1: 3 مقارنة 1:23 بعد المعالجة القياسية الدم = 0.03، الشكل 3A). ولوحظت نتائج مماثلة تحت أنورإكسيك (1: 3 مقابل 01:19 ص <0.001) والشروط يعانون من السمنة المفرطة (1: 3 ضد 1:13؛ ع = 0.04، الشكل 3A). لوحظ عدم وجود فروق بين المجموعات الثلاث المختلفة للمعالجة القياسية أو RAPID (الشكل 3A). وأشار اتجاهين ANOVA وغير قادر جوهري فاي في uence فل من طريقة معالجة (F 1،64 = 15.3، ف <0.001)، في حين أن وزن الجسم / حالة الأيض أي تأثير (F 2،64 = 0،5، ع = 0.62).

الجدول 3

tp_upload / 53959 / 53959table4.jpg "/>

كانت تعميم مستويات kisspeptin الذاتية أعلى بكثير التالية RAPID مقارنة مع المعالجة القياسية في أنورإكسيك (+ 60٪، ف = 0.02) والموضوعات الوزن الطبيعي (+ 99٪، ع = 0.02)، في حين أن الاختلاف لم يصل إلى مستوى مهم في ظل ظروف من السمنة ( 23٪، ف = 0.39؛ الشكل 3B). لوحظ عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين ثلاث مجموعات مختلفة BMI (P> 0.05، الشكل 3B). وأشار اتجاهين ANOVA وغير قادر فاي جوهري في uence فل من طريقة معالجة (F 1،74 = 10.8، ع = 0.002)، في حين أن وزن الجسم / حالة الأيض أي تأثير (F 2،74 = 0،5، ع = 0.60).

الشكل (3) الشكل (3): تداول نسبة أسيل / Desacyl الغريلين وتعميم مستويات Kisspeptin تحت ظروف أيضية مختلفة التالية RAPID أو سحب ستاندرد الدم تجهيز الدم من فقدان الشهية والوزن الطبيعي أو مواضيع السمنة بعد صيام ليلة وضحاها ومعالجتها وفقا للإجراءات القياسية أو طريقة سريعة. تم جمع طاف وأسيل وكذلك مجموع مستويات هرمون جريلين أو kisspeptin المستويات (ب) تقييم من قبل المقايسة المناعية الشعاعية. تم الحصول على Desacyl جريلين بطرح أسيل من إجمالي جريلين. تم احتساب النسبة بقسمة أسيل بواسطة desacyl جريلين (A). يشار إلى حجم المجموعة في الجزء السفلي من الأعمدة. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SEM. * ف <0.05، ** ف <0.01 و*** ع <0.001 مقابل. المعالجة القياسية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر منهذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ذكرنا من قبل أن طريقة سريعة لمعالجة الدم تحسين الانتعاش ل11/12 الببتيدات مقارنة معالجة الدم العادي في الفئران 6. في هذه الدراسة أظهرنا أن هذه الطريقة هي مناسبة أيضا لاستخدامها في البشر. وبعد معالجة سريعة، وتحسين الانتعاش لمدة 9 من 9 125 الببتيدات المسمى I-اختبار مقارنة معالجة الدم العادي (EDTA الدم على الجليد). تراوح تحسين وحظ 19-39٪ والتي من المرجح أن تكون ذات صلة، خصوصا في ظل الظروف حيث من المتوقع فقط الفروق الدقيقة التي يمكن أن ملثمين عندما العائد من الببتيد منخفض.

أظهرنا أيضا أنه بعد الكشف عن RAPID جريلين معالجة الدم في موقف شطف الصحيح بعد HPLC مما يدل على شكل الجزيئي الصحيح (أسيل جريلين)، بينما بعد المعالجة الدم العادي 2/3 تتدهور إلى desacyl جريلين. منذ مجموعة أسيل ضرورية للربط إلى مستقبلات جريلين 28، دومن المتوقع أن يغير كثيرا من وظيفة بيولوجية من الببتيد أسيلة ه. ومع ذلك، أيضا يتم الاعتراف desacyl جريلين على نحو متزايد مع الببتيد نشطة بيولوجيا 29. ومن المثير للاهتمام، واقترح desacyl جريلين لمواجهة آثار هرمون جريلين كما هو موضح من قبل لتناول الطعام 30 أو حركية القولون 31. هذا يسلط الضوء على أهمية التحقيق في شكل الجزيئي الصحيح.

عند دراسة المستويات الخفية kisspeptin في موضوعات الوزن العادية، وأظهرت زيادة كبيرة في مستويات (+ 99٪) بعد RAPID مقارنة معالجة الدم العادي. ومع ذلك، لم يلاحظ أي تحسن في ظل ظروف من السمنة، والتي قد تكون نتيجة لزيادة مستويات kisspeptin الشاملة (+ 50٪ في السمنة مقابل. الوزن الطبيعي). بين المجموعات مؤشر كتلة الجسم (فقدان الشهية العصبي، الوزن الطبيعي والسمنة) في الدم معالجتها مع أي من الطريقتين، لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية التي قد يكون راجعا إلى حقيقة أن مستويات فقط الصوم ورالبريد تقييم. قد تكون هناك اختلافات postprandially واضح، والفرضية التي يجب أن يتم التحقيق في الدراسات المستقبلية.

وقد تم قياس Kisspeptin قبل في الدراسات باستخدام أنابيب EDTA الوحيدة على الجليد 32 (في الدراسة المشار إليها المعالجة وفقا لمعايير) أو عن طريق إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني 33. وبناء على هذه الدراسة وتقشعر لها الأبدان من الأنابيب غير كافية لمنع تدهور الببتيد. سواء تحمض وحدها أو البروتيني واحد مثبطات تكفي للحفاظ على kisspeptin ينبغي التحقيق في الدراسات المستقبلية.

وبالمثل، يزيد أيضا معالجة سريعة العائد من جريلين أسيل الذاتية كما يتضح من زيادة كبيرة نسبة أسيل / desacyl جريلين (1: 3) مقارنة معالجة الدم العادي (01:23). وتبين هذه النتيجة التوافق جيدة مع دراسات القوارض حيث بلغنا نسبة هرمون جريلين أسيل / desacyl من 1: 5 بعد معالجة سريعة من قبل (مقارنة 1:19 بعد المعالجة القياسية).ومن ثم، فإن من المرجح ان نطاقات واسعة من أسيل / desacyl نسبة هرمون جريلين من 1:15 حتي 1:55 34،35 ذكرت من قبل بسبب وجود نسبة يعتمد دي أسيلة عالية من هرمون جريلين desacyl. كما هو موضح أعلاه لkisspeptin، لم يلاحظ أي تغيرات في نسبة هرمون جريلين أسيل / desacyl في ظل ظروف مختلفة من وزن الجسم غيرت المزمن (فقدان الشهية العصبي مقابل. الوزن الطبيعي مقابل. البدانة). قد يكون هذا أيضا يرجع ذلك إلى حقيقة أن مستويات فقط الصيام من أسيل / desacyl جريلين تم تقييم وتنظيم بعد الأكل هو أكثر أهمية. من ناحية أخرى وهذا يدل أيضا أنه على الرغم من وزن الجسم غيرت مزمن لا يتم تغيير نسبة أسيل وجريلين desacyl في ظل الظروف القاعدية وقد لا تلعب دورا هاما في التغيرات التكيفية لوحظ في ظل هذه الظروف. ومع ذلك، فإن الدراسات المستقبلية باستخدام بروتوكولات وجبة موحدة وتطبيق طريقة سريعة تساعد على زيادة الإجابة على هذا السؤال.

وRAPID لييستخدم ثود العناصر التالية: منذ التفاعلات الكيميائية يعتمد في الغالب على درجة حرارة 36 انخفاض درجة الحرارة باستخدام محلول الجليد الباردة يبطئ من تدهور الببتيد. بعد ذلك، أيضا انخفاضا في الرقم الهيدروجيني (الحموضة) يقلل من سرعة التدهور 37. وعلاوة على ذلك، انخفاض في درجة الحموضة تقلل من امتصاص الببتيدات على الأسطح الأخرى وبالتالي يقلل أيضا من خطر فقدان الببتيد. وقد تم اختيار مثبطات الأنزيم البروتيني المستخدمة هنا من أجل تغطية مجموعة واسعة من peptidases الذاتية: (على سبيل المثال كاتيبسين B / H) diprotin وكما المانع من dipeptidyl ببتيداز الرابع، E-64-د مثل مثبط للالبروتياز ثيول، antipain كما مثبط للالتربسين، غراء وكاثبسين A / B، leupeptin مثل مثبط لالتربسين، بلازمين، غراء وكاثبسين وchymostatin مثل مثبط لكيموتربسين، غراء وكاتيبسين B / G. وعلاوة على ذلك، الببتيدات النظائر هي مفيدة لتقييم وتحسين الانتعاش من خلال هذه الطريقة. وأخيرا، حيث وصل سعر سو يعتمد تشكيل انزيم الركيزة المعقدة على تركيز الانزيم (ببتيداز) والركيزة (هرمون الببتيد) 38 التخفيف من البلازما يقلل من معدل تكوين وبالتالي تدهور (أ التخفيف عشرة أضعاف يقلل من معدل مئة وفقا لميخائيل حركية -Menten).

وعلى الرغم من مزايا طريقة سريعة، وينبغي الاعتراف العديد من القيود الأسلوب أيضا. الخطوة الأكثر أهمية من البروتوكول هو الوقت. يجب تخفيف عينات الدم في المخزن المؤقت RAPID مباشرة بعد انسحاب الدم الذي قد يكون من الصعب في إعداد سريرية. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة أكثر استهلاكا للوقت، ويتطلب مستوى أعلى من التدريب وهو أيضا أكثر تكلفة من معالجة الدم العادي. على الرغم من أنه قد يكون من الصعب تنفيذها في روتين السريري، وسوف يكون من المفيد لأغراض البحث، وخصوصا عندما يتوقع الخلافات فقط خفية وبالتالي ارتفاع العائد من الببتيد أمر مرغوب فيه.

وعلى الرغم من وصف طريقة سريعة وأوصى بكل مكوناتها (R درجات الحرارة educed، A cidification، rotease P تثبيط، وأنا sotopic الضوابط الخارجية وD ilution) في هذه الورقة، قد تستخدم الدراسات المستقبلية إدخال تعديلات على هذه التقنية. استخدام الضوابط الخارجية النظائر قد لا يكون إلزاميا، وبالتالي يقتصر على الدراسات التجريبية من أجل تقييم والتي تظهر الببتيدات أكبر تحسن في استرداد باستخدام معالجة سريعة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن يتم تعديل تكوين الكوكتيل مثبط البروتياز عندما يتم تقييم الببتيدات الأخرى. ومع ذلك، ينبغي اختبار هذا عندما يتم قياس الببتيد الجديد.

وباختصار، فإن طريقة سريعة لمعالجة الدم يمكن أن تستخدم في دم الإنسان وإلى تحسن كبير في انتعاش 9/9 الببتيدات اختبار مقارنة معالجة الدم العادي. منذ لبعض الببتيدات فقط صغيرة إلى تحسن معتدل من الانتعاش لوحظ، وضرورةالأسلوب قد يكون لفحصها عند تحليل الببتيد الجديد. وعلاوة على ذلك، يسمح للطريقة سريعة للكشف عن شكل الجزيئي الصحيح كما هو مبين لهرمون جريلين أسيل وأيضا يزيد بشكل كبير العائد من مستويات تعميم الذاتية من الببتيدات مثل kisspeptin مقارنة معالجة الدم العادي. لذلك، يجب أن تكون هذه الطريقة أداة مفيدة في الدراسات الإنسانية تقييم تعميم مستويات الببتيد، على سبيل المثال. المتورطين في تنظيم الجوع والشبع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل STE مؤسسة الأبحاث الألمانية 1765 / 3-1 (ع) والوزارة الألمانية للتعليم والبحوث 03IPT614A (CG). نشكر راينهارد لوميل والبتراء BUSSE حصول على الدعم الفني الممتاز وكذلك كارين يوهانسون وكريستينا Hentzschel للمساعدة في تنظيم وتنفيذ القياسات البشرية

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
SigmaStat 3.1 Systat Software, San Jose, CA, USA online download

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377, (9765), 557-567 (2011).
  2. James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263, (4), 336-352 (2008).
  3. Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14, (6), 480-488 (2012).
  4. Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37, (5), 625-633 (2013).
  5. Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50, (6), 1077-1080 (2004).
  6. Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150, (11), 5113-5118 (2009).
  7. Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31, (9), 1689-1696 (2010).
  8. Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
  9. Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23, (7), e294-e308 (2011).
  10. Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
  11. Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
  12. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306, (3), R164-R174 (2014).
  13. Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93, (3), 165-173 (2011).
  14. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45, (5), 565-576 (2007).
  15. Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22, (5), 253-257 (2011).
  16. De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147, (3), R53-R63 (2014).
  17. Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86, (12), 5992 (2001).
  18. Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11, (3), 419-421 (1957).
  19. Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92, (4), 810-817 (2010).
  20. Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20, (5), 405-410 (2004).
  21. Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
  22. Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282, (16), 1568-1575 (1999).
  23. Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
  24. Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349, (10), 941-948 (2003).
  25. Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42, (3), 329-334 (1988).
  26. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414, (1), 38-46 (2011).
  27. Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28, (4), 299-303 (2008).
  28. Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402, (6762), 656-660 (1999).
  29. Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18, (2), 138-149 (2012).
  30. Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
  31. Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22, (10), 1124-1131 (2011).
  32. Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88, (2), 914-919 (2003).
  33. Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9, (6), 2369-2373 (2015).
  34. Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279, (3), 909-913 (2000).
  35. Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21, (2), 159-161 (2003).
  36. Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34, (2), 107-112 (2001).
  37. Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14, (12), 1685-1690 (1997).
  38. White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics