En snabb metod för blodbehandlings att öka utbytet av plasmapeptidnivåer i Människoblod

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

RAPID blod behandlingsmetod kan användas i människor och ger högre peptidnivåer samt möjliggör en bedömning av den korrekta molekylära formen. Därför kommer denna metod vara ett värdefullt verktyg i peptid forskning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Forskning inom födointag reglering allt viktigare. Detta inkluderar ofta mätning av peptider som reglerar födointag. För korrekt bestämning av en peptid koncentration, bör det vara stabilt under blodbehandlingen. Detta är dock inte fallet för flera peptider som snabbt bryts ned av endogena peptidaser. Nyligen har vi utvecklat en blodbearbetningsmetod som utnyttjar R educed temperaturer, A cidification, P rotease inhibition, jag sotopic exogena kontroller och D ilution (RAPID) för användning i råttor. Här har vi etablerat denna teknik för användning på människor och undersökte återhämtning, molekylär form och cirkulerande koncentration av födointag reglerande hormoner. RAPID metoden förbättrats avsevärt återhämtningen för 125I-märkt somatostatin-28 (+ 39%), glukagonliknande peptid-1 (+ 35%), acyl ghrelin och glukagon (+ 32%), insulin och kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), leptin(+ 21%) och peptid YY 3-36 (+ 19%) jämfört med standardbehandling (EDTA-blod på is, p <0,001). Högprestandavätskekromatografi visade elueringen av endogent acyl ghrelin vid den förväntade positionen efter RAPID bearbetning, medan efter schablon bearbetning 62% av acyl ghrelin nedbröts vilket resulterar i en tidigare topp sannolikt representerar desacyl ghrelin. Efter en snabb behandling acyl / desacyl ghrelin förhållandet i blod hos normalviktiga personer var 1: 3, jämfört med 1:23 följande standardbehandling (p = 0,03). Också endogena kisspeptin nivåer var högre efter RAPID jämfört med standardbehandlingen (+ 99%, p = 0,02). RAPID blod behandlingsmetod kan användas på människor, ger högre peptidnivåer och möjliggör en bedömning av den korrekta molekylära formen.

Introduction

Mot bakgrund av den globala ökande förekomsten av fetma 1,2 bedrivs forskning inom födointag reglering allt viktigare. Medan hittills bara en peptid är känt att perifert produceras och centralt verkande för att stimulera födointag, nämligen ghrelin 3, under de senaste decennierna, har ett brett spektrum av peptider identifierats som minskar födointag, t.ex.. leptin, peptid YY (PYY) och även glukagonliknande peptid-1 (GLP-1) och insulin fyra, därför i studier som undersöker de reglerande mekanismerna för hunger och mättnad peptidnivåer ofta utvärderas och samtidigt antas att peptiden studerades är stabil och återvinnas vid höga utbyten under plasmabildningen. Men detta är mycket ofta inte fallet på grund av snabb endogen nedbrytning som visats tidigare för t ex. ghrelin som nedbrytes från acyl till desacyl ghrelin 5. Därför beskrev vi nyligen snabb metod för blod processjunga i råttor utnyttjar R educed temperaturer, A cidification, P rotease inhibition, jag sotopic exogena kontroller och D ilution 6. Denna metod förbättrade återhämtning för 11 av 12 peptider testade och tillåtna för bestämning av den korrekta cirkulerande molekylär form jämfört med standardblodbehandlings (EDTA-blod på is) 6. Denna metod har använts i flera efterföljande studier 7-12 för detektion av cirkulerande ghrelin liksom kortikotropin-frisättande faktor 13. Därför har metoden visat sig vara användbara för peptidforskning hos gnagare. Eftersom studier på gnagare är inte alltid att överföra till en annan art, metoden bör fastställas för användning i humanblod också.

Syftet med denna studie var att testa snabb metod för blodbehandling hos människor jämfört med standardblodbehandling, EDTA blod på is, som ofta rekommenderas 14 och ofta used i den kliniska liksom inställning forskning. Vi testade återvinning av ett urval av 125 I-märkta peptider som är involverade i regleringen av födointaget inklusive etablerade peptider samt nya kandidater nyligen föreslagits spela en roll i att livnära förordningen (effekter på födointag visas i tabell 1) efter bearbetning med båda metoderna. Hormoner har också valts för att representera peptider av olika längd och laddning (tabell 2). Dessutom för ghrelin vi undersökte den molekylära formen (s) efter standarden och snabb metod. Slutligen bedömde vi endogena ghrelin (acyl och desacyl ghrelin) samt kisspeptin nivåer, en peptid också nyligen föreslagits att spela en roll i regleringen av födointaget 15,16 efter RAPID eller standardbehandling. Dessutom undersökte vi också dessa peptidnivåer i en population av individer med ett brett spektrum av kroppsmasseindex (som sträcker sig från 10,2 till 67,6 kg / m 2) för att studera possible skillnader i samband med kroniskt förändrad kroppsvikt.

Bord 1

tabell 2

Diagnos, bedömning, och Plan:
studiedeltagarna
Alla deltagarna i studien var nyligen på sjukhus patienter (integration var inom två dagar för tillträde till sjukhuset) av divisionen av psykosomatisk medicin vid Charité-Universitätsmedizin Berlin och gav skriftligt informerat samtycke. För att undvika effekterna av kön endast kvinnliga patienter ingick. Totalt 42 försökspersoner deltog i denna studie och delades in i tre grupper: normal vikt (BMI 18,5-25 kg / m 2, n = 12), anorexia nervösa (BMI <17,5 kg / m 2, n = 15) och fetma (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). Anorektisk och överviktiga patienter vardiagnostiseras i enlighet med International Classification of Diseases-10 och på sjukhus för viktökning (anorexia nervosa) eller viktminskning (fetma), respektive. Alla normalviktiga patienter på sjukhus uteslutande på somatoforma symtom utan relevanta somatiska sjukdomar. Patienter med gastrointestinala somatoforma symtom eller en historia av gastrointestinal kirurgi uteslöts. Uteslutningskriterier omfattade också en ålder <18 år, aktuell graviditet och obehandlade psykossjukdomar. blodinsamling utfördes på dag 2 eller 3 efter sjukhus entré före mottagning av kostbehandling i syfte att öka eller minska kroppsvikten, respektive. Antropometriska parametrar bedömdes på samma dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollet godkändes av lokala etiska kommittén för mänskliga forsknings (protokollnummer EA1 / 114/10).

1. blodbehandlings

  1. Samla venöst blod från 7:00 till 08:00 efter en natts fasta från en underarm ven och process enligt standardförfarande eller RAPID metoden. Instruera de ämnen som inte utövar eller rök innan uttag blod.
  2. För standard bearbetning, samla blod i kylda EDTA-innehållande rör och centrifugera i 10 min vid 3000 xg under 10 min vid 4 ° C. Samla upp supernatanten och hålla vid -80 ° C tills ytterligare bearbetning genom radioimmunanalys.
  3. För snabb behandling omedelbart utspädd blod (inom en minut efter avlägsnande av blod) 01:10 i iskall buffert (pH 3,6) innehållande 0,1 M ammoniumacetat, 0,5 M NaCl och enzyminhibitorer (diprotin A, E-64-d, anti , leupeptin, kymostatin, 1 | ig / ml). Därefter centrifug inom 10 min vid 3000 xg under 10 min vid 4 ° C och supernatanten ossing en pipett i polypropenrör som beskrivs tidigare i råttor 6.
    1. Laddnings kromatografikolonner (360 mg, från 55 till 105 | j, m) med 100% acetonitril (hastighet 10 ml / min), i jämvikt med 0,1% trifluoracetat (TFA, hastighet 10 ml / min) och last med supernatanten vid en konstant hastighet av 1 ml / min med användning av en sprutpump.
    2. Därefter, tvätta patroner med 3 ml 0,1% TFA (hastighet 10 ml / min) och långsamt eluera med 2 ml 70% acetonitril innehållande 0,1% TFA (2 ml / min).
    3. Torra eluerade prover med vakuumcentrifugering och förvaras vid -80 ° C tills vidare bearbetning genom radioimmunoassay.
      OBS: Genomför alla steg i polypropylen (snabb behandling) och borosilikatglas (radioimmunoassay) rör som uppvisar betydligt lägre yta bindningsegenskaper och därmed minimera peptidförlust för de flesta av peptiderna studerades före 26.

2. Mätningar

OBS: Stegen i detta avsnitt bör utföras i ett laboratoriumcertifierad för arbete med radioaktivt material. Standard försiktighetsåtgärder för arbete med 125 jag bör vidtas.

  1. Återhämtning av radioaktivt märkta peptider
    1. Erhålla 125 I-radiomärkta humana peptider (t.ex.. Acyl-ghrelin, GLP-1, glukagon, insulin, kisspeptin, leptin, nesfatin-1, PYY 3-36 och somatostatin-28).
    2. Hålla peptider i pulverform tills experimentet, sedan nyligen utspädd i 0,1% ättiksyra (~ 100.000 cpm per ml).
    3. För standardblodbehandling, direkt efter avlägsnande av blod i kylda EDTA innehållande rör, överföra 1 ml blod i ett rör med 50 pl radiomärkning innehållande 3,000-6,000 cpm (räknade direkt innan försöket startar).
    4. För snabb behandling, överföring 1 ml blod EDTA innehållande blod i ett rör innehållande 9 ml RAPID buffert (för sammansättning se 1.3) och 500 pl radiomärkning innehåller 30,000-60,000 cpm. På grund av 1:10 utspädning är hållbar 10 gånger större volym av radiolabel för snabb behandling.
    5. Efteråt, processprover som beskrivs i steg 1,2 till 1.3.2.
    6. För återhämtningsförsök, inte torra prover genom vakuumcentrifugering och inte förvara vid -80 ° C. Istället bedöma återvinning av radioaktivt märkta peptider direkt efteråt med användning av en gammaräknare.
    7. Mät hela supernatanten i standardprover, medan i RAPID prover analyseras 1/10 av den totala volymen för att få jämförbarhet av mängden radiomärkning används. För mätning, överför supernatanten i rör passar in i gammaräknare och bedöma impulser per minut
    8. Som en 100% standard, använda två prover med 50 | il 125 I-radiomärkt peptid som inte genomgår behandling. Mät samtidigt med andra prover som beskrivs i 2.1.7.
    9. Utföra experimentet fem till sex gånger för varje peptid.
  2. Högupplösande vätskekromatografi av radiomärkt Ghrelin
    1. Återkalla blod i chilled EDTA innehållande rör och förflyttning 1 ml till rör innehållande 200 pl radiomärkt-acyl ghrelin innehållande 15,000-20,000 cpm (räknade direkt innan försöket startar).
    2. För snabb behandling, överföring 1 ml blod i ett rör innehållande 9 ml RAPID buffert (för sammansättning se 1.3) och 200 pl radiomärkt acyl ghrelin innehåller 15,000-20,000 cpm.
    3. Efteråt, processprover som beskrivs i steg 1,2 till 1.3.2.
    4. För ytterligare analys genom omvänd fas HPLC, direkt ladda prover på en stabil bindning C18-kolonn (2,1 mm x 50 mm, 1,8 | im) jämviktad i 17% acetonitril i vatten (båda kompletterade med 0,1% TFA).
    5. Efter 5 min jämvikt, använda en gradient från 17 till 40% acetonitril för att eluera provet i 40 min (flödeshastighet av 1 ml / min).
    6. Samla fraktioner om 1 ml per minut och analysera radioaktiviteten med användning av en gammaräknare.
    7. I ett separat experiment, belastning 200 pl radiomärkt acyl ghrelin innehåller 15,000-20,000cpm i kolonnen direkt och utför HPLC såsom beskrivits i steg 2.2.4 till 2.2.6.
  3. radioimmunoanalys
    1. För radioimmunoanalys, tina frusna supernatanterna (standard bearbetning) och vakuumtorkat pulver (snabbmetod) vid rumstemperatur.
    2. Omedelbart före radioimmunoanalys, återsuspendera torra RAPID prover i dubbeldestillerat H2O i enlighet med den ursprungliga volymen av plasma (500 pl).
    3. Bedöma kisspeptin och totalt (inklusive både desacyl och acyl ghrelin) samt acyl ghrelin som beskrivits tidigare 12,27 med användning av kommersiella radioimmunanalyser enligt tillverkarnas protokoll. Använd borsilikat rör som tillåter stabil pelletbildning.
      1. På dag ett, inkubera proverna med analysbuffert och primär antikropp (t.ex.. Anti-ghrelin) i utspädnings som tillhandahålls av tillverkaren för en period av 24 timmar.
      2. På dag två, tillsätt 125 I spår (t.ex. 125 I-ghrelin), vortex och inkubera under en tid av 24 h.
      3. På dag tre, tillfällningsmedlet, virvel och inkubera som rekommenderas av tillverkaren. Då, centrifugrör vid 3000 xg under 20 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanterna och räkna radioaktiviteten i pelletarna med användning av en gammaräknare
    4. Beräkna desacyl ghrelin som skillnaden mellan den totala minus acyl ghrelin. Bedöm acyl / desacyl ghrelin förhållandet genom att dividera acyl av desacyl ghrelin för varje enskilt prov.
    5. Process alla prover - om möjligt - i ett parti för att undvika interanalysvariation. Den intra-assay variation i detta experiment var <8% för kisspeptin, <7% för total och <9% för acyl ghrelin.

3. Statistisk analys

  1. Bestämma fördelningen av data med hjälp av Kolmogorov-Smirnov test. Uttrycka data som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM).
  2. Utvärdera skillnaderna mellan tvågrupper genom t-test. Bedöma skillnader mellan olika grupper av alla parvisa förfaranden med multipeljämförelse (Tukey post hoc test) eller tvåvägs ANOVA följt av Holm-Sidak metoden.
  3. Överväga p <0,05 signifikant och utföra analyser med hjälp av ett statistikprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RAPID blodbehandlings ökar utbytet av 125 I-radiomärkta peptider i mänskligt blod jämfört med standardblodbehandlings.
Efter standardblodbehandlings (EDTA-blod på is), var återvinningen av radiomärkta peptider ~ 60% i 9/9 peptider (som sträcker sig från 48 till 68%, Figur 1A - K). RAPID bearbetning förbättras utbytet i alla 125 I-märkta peptider, nämligen i somatostatin-28 (+ 39%, Figur 1A), glukagonliknande peptid-1 (+ 35%, Figur 1B), acyl ghrelin (n-oktanoyl ghrelin, + 32%, Figur 1C), glukagon (+ 32%, figur 1D), insulin (+ 29%, figur 1E), kisspeptin (+ 29%, figur 1F), nesfatin-1 (+ 28%, figur 1G), leptin (+ 21%, figur 1H) och peptid YY 3-36 (+ 19%, figur 1K) jämfört med standardbehandling (p <00,001). I dessa 9 peptider, var återhämtningen efter den snabba metoden ~ 90% (mellan 71-98%, Figur 1A - K).

Figur 1
Figur 1:. Återvinning av 125 I-märkta peptider i mänskligt blod efter Standard eller RAPID Blood Processing Radiomärkt peptid sattes till humanblod och behandlas i enlighet med standardförfarande (EDTA-blod på is) eller snabb metod (reducerade temperaturer, försurning, proteas inhibition, isotop exogena kontroller och spädning). Supernatanterna samlades upp och räknades med avseende på radioaktivitet. Varje kolumn representerar medelvärdet ± SEM av fem till sex försök. *** P <0,001 jämfört med standardbehandling. Klicka här för att tävlawa större version av denna siffra.

Efter snabb handläggning, Ghrelin eluerar vid den förväntade positionen.
Efter snabb behandling av människoblod, 125 I-märkt ghrelin elueras vid den förväntade positionen, medan efter standardförfarande en tidigare topp observerades mest sannolikt motsvarar desacyl ghrelin (Figur 2). Detta representerade en försämring 62% av peptiden.

figur 2
Figur 2:. Elueringsprofilen för 125I-märkt Acyl Ghrelin i Människoblod efter Standard eller RAPID Blood Processing Radiomärkt peptid sattes till humanblod och behandlas i enlighet med standardförfarande eller RAPID metoden. Efteråt ades supernatanten laddades på en högupplösande vätskekromatografi-kolonn. Eluatet var colkerat varje minut och räknades med avseende på radioaktivitet. Efter en snabb behandling större delen av peptiden elueras vid den förväntade tidpunkten, medan efter schablon bearbetning av en stor andel eluerade tidigare, troligen representerar desacyl ghrelin. Förkortning. Cpm, counts per minut klicka god här för att se en större version av denna siffra.

RAPID blodbehandlings Förbättrar Acyl / Desacyl Ghrelin Ratio och resulterar i ökade Endogenous kisspeptin blodnivåer jämfört med vanliga Processing.
Blod togs från anorektisk, normalviktiga och feta patienter och behandlas i enlighet med den standard eller påskyndat förfarande. Endogen ghrelin (totalt och acyl ghrelin) bedömdes genom radioimmunoanalys. Antropometriska och comorbidities / medicinering av studiegrupperna visas i tabellerna 3 och 4. Efter en snabb behandling acyl / desacyl ghrelin-förhållande i blod hos normalviktiga personer var 1: 3, jämfört med 01:23 följande standardblodbehandlings (p = 0,03, fig 3A). Liknande resultat observerades i enlighet med anorektisk (1: 3 vs. 1:19, p <0,001) och feta förhållanden (1: 3 vs 01:13; p = 0,04; figur 3A.). Inga skillnader observerades mellan de tre olika grupper för standard eller snabb behandling (figur 3A). Tvåvägs ANOVA indikerade ett betydande inflytande av bearbetningsmetod (F 1,64 = 15,3, p <0,001), medan kroppsvikt / metabola tillstånd hade ingen effekt (F 2,64 = 0,5, p = 0,62).

tabell 3

tp_upload / 53959 / 53959table4.jpg "/>

Cirkulerande endogena kisspeptin nivåerna var signifikant högre efter RAPID jämfört med standardbehandling i anorektisk (+ 60%, p = 0,02) och normalviktiga patienter (+ 99%, p = 0,02), medan skillnaden inte nådde signifikans under förhållanden med fetma ( 23%, p = 0,39; figur 3B). Inga signifikanta skillnader observerades mellan de tre olika BMI grupper (p> 0,05; figur 3B). Tvåvägs ANOVA indikerade ett betydande inflytande av bearbetningsmetod (F 1,74 = 10,8, p = 0,002), medan kroppsvikt / metabola tillstånd hade ingen effekt (F 2,74 = 0,5, p = 0,60).

Figur 3 Figur 3: Cirkulerande Acyl / Desacyl Ghrelin Ratio och cirkulerande kisspeptin nivåer under olika metaboliska förhållanden efter RAPID eller Standard blodbehandlings Blod togs från anorektisk, normalviktiga eller feta patienter efter en natts fasta och behandlas i enlighet med standardförfarande eller RAPID metoden.. Supernatanten uppsamlades och acyl samt totala ghrelin nivåer eller kisspeptin nivåer (B) bedöms av radioimmunanalys. Desacyl ghrelin erhölls genom att subtrahera acyl från total ghrelin. Förhållandet beräknades genom att dividera acyl med desacyl ghrelin (A). Gruppstorleken indikeras vid botten av kolumnerna. Data uttrycks som medelvärde ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 och *** p <0,001 vs. standardbehandling. Klicka här för att se en större version avdenna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi rapporterade tidigare att snabb metod för blodbehandling förbättrade återhämtning för 11/12 peptider jämfört med standardblodbehandlings hos råttor 6. I den aktuella studien har vi visat att denna metod lämpar sig också för användning på människor. Efter en snabb behandling, var återhämtningen för 9 av 9 125 I-märkta peptider testade förbättrats jämfört med standardblodbehandlings (EDTA-blod på is). Den observerade förbättringen varierade från 19 till 39%, vilket sannolikt kommer att vara relevant, särskilt under förhållanden när endast subtila skillnader förväntas som kan maskeras när utbytet av peptiden är låg.

Vi visade också att efter RAPID blodbehandlings ghrelin detekteras vid korrekt elueringspositionen efter HPLC indikerar den korrekta molekylära formen (acyl ghrelin), medan efter schablonblodbehandlings 2/3 nedbrytes till desacyl ghrelin. Eftersom acylgruppen är väsentlig för bindning till ghrelin receptor 28, de-acylering förväntas att kraftigt förändra den biologiska funktionen hos peptiden. Men även desacyl ghrelin erkänns alltmer som en biologiskt aktiv peptid 29. Intressant nog desacyl ghrelin föreslog att motverka effekterna av ghrelin som visats tidigare för födointaget 30 eller kolon motilitet 31. Detta belyser ytterligare betydelsen av att undersöka den korrekta molekylära formen.

När man studerar endogena nivåer av kisspeptin i normalviktiga patienter, visade vi kraftigt förhöjda nivåer (+ 99%) efter RAPID jämfört med standardblodbehandling. Dock ingen förbättring observer under förhållanden med fetma, vilket kan bero på den totala ökade kisspeptin nivåer (+ 50% hos överviktiga vs. Normal vikt). Mellan BMI grupper (anorexia nervosa, normal vikt och övervikt) i blod behandlas med antingen metod, observerades inga signifikanta skillnader observeras som kan bero på det faktum att endast fasta nivåer were bedömas. Skillnader kan vara uppenbart postprandialt, en hypotes som bör undersökas i framtida studier.

Kisspeptin har mätts tidigare i studier med enbart EDTA-rör på is 32 (i denna studie kallas standard behandling) eller genom tillsats av proteasinhibitorer 33. Baserat på föreliggande studie kylning av rören inte är tillräckligt för att förhindra peptidnedbrytning. Om försurning ensam eller enda proteashämmare är tillräckligt för att bevara kisspeptin bör undersökas i framtida studier.

På liknande sätt, ökar en snabb behandling också utbytet av endogent acyl ghrelin såsom indikeras av en kraftigt ökad acyl / desacyl ghrelin-förhållande (1: 3) jämfört med standardblodbehandlings (01:23). Denna upptäckt visar god överensstämmelse med studier på gnagare där vi rapporterade en acyl / desacyl ghrelin förhållandet 1: 5 efter snabb behandling innan (jämfört med 1:19 efter schablon bearbetning).De breda sortiment av acyl / desacyl ghrelin förhållande av 1:15 till 01:55 34,35 redovisas före var därför troligtvis på grund av en de-acylering beroende hög andel desacyl ghrelin. Såsom beskrivits ovan för kisspeptin ades inga förändringar av acyl / desacyl ghrelin förhållande observerats under olika villkor för kroniskt förändrad kroppsvikt (anorexia nervösa vs. Normal vikt vs. Fetma). Detta kan också bero på det faktum att endast fastenivåer av acyl / desacyl ghrelin bedömdes och den postprandiala reglering är viktigare. Å andra sidan indikerar också att trots den kroniskt förändrad kroppsvikt andelen acyl och desacyl ghrelin inte ändras under basala förhållanden och kan inte spela en viktig roll i de adaptiva förändringar som observerats under dessa förhållanden. Dock kommer framtida studier med standardiserad måltid protokoll och tillämpar snabb metod bidra till att ytterligare svara på denna fråga.

RAPID meThOD använder följande komponenter: Eftersom kemiska reaktioner beror främst på temperaturen 36 en minskning av temperatur med användning av en iskall lösning saktar ner nedbrytningen av peptiden. Nästa, också en minskning av pH (surgöring) minskar hastigheten av nedbrytningen 37. Vidare kan en minskning av pH minskar adsorptionen av peptider till andra ytor och därför minskar också risken för peptidförlust. De proteashämmare som används här valdes för att täcka ett brett spektrum av endogena peptidaser: (. Exempel cathepsin B / H) diprotin A som en hämmare av dipeptidylpeptidas IV, E-64-d som en hämmare för tiolproteaser, anti som en inhibitor för trypsin, papain och katepsin A / B, leupeptin som en inhibitor för trypsin, plasmin, papain och katepsin och kymostatin som en inhibitor för kymotrypsin, papain och katepsin B / G. Dessutom, isotop peptider är användbara för att bedöma en förbättring av återhämtning genom metoden. Slutligen, eftersom hastigheten of den enzymsubstratkomplexbildning beror på koncentrationen av enzymet (peptidas) och substratet (peptid hormon) 38 spädning av plasman minskar bildningshastigheten och därmed nedbrytning (en tiofaldig spädning reducerar hastigheten hundrafalt enligt Michaelis -Menten kinetik).

Trots fördelarna med den RAPID metod, bör flera begränsningar av metoden bekräftas också. Det mest kritiska steget av protokollet är tiden. Blodprov bör spädas i den snabba buffert omedelbart efter avlägsnande av blod som kan vara svårt i klinisk miljö. Vidare är metoden mer tidskrävande, kräver en högre grad av träning och är också dyrare än standard blodbehandlings. Även om det kan vara svårt att genomföra i klinisk rutin, kommer det att vara till hjälp för forskningsändamål, i synnerhet när endast subtila skillnader förväntas och därför ett högt utbyte av peptiden är önskvärd.

Även om snabb metod beskrivs och rekommenderas med alla dess komponenter (R educed temperaturer, A cidification, P rotease inhibition, jag sotopic exogena kontroller och D ilution) i detta dokument, kan framtida studier använder modifieringar av denna teknik. Användningen av isotop exogena kontroller kan inte vara obligatoriska och därför begränsas till pilotstudier för att bedöma vilka peptider visar den största förbättringen i tillfrisknandet med hjälp av snabb behandling. Dessutom också sammansättningen av proteashämmare cocktail kan ändras när andra peptider bedöms. Detta bör dock testas när en ny peptid mäts.

Sammanfattningsvis kan snabb metod för blodbehandlings användas för humanblod och kraftigt förbättrad återvinning av 9/9 peptider testade jämfört med standardblodbehandling. Eftersom det för vissa peptider endast en liten till måttlig förbättring av återhämtning observerades nödvändighetenav metoden kan behöva testas när en ny peptid analyseras. Dessutom tillåter snabb metod för detektering av den korrekta molekylära formen såsom visas för acyl ghrelin och också avsevärt ökar utbytet av endogena cirkulerande nivåer av peptider såsom kisspeptin jämfört med standardblodbehandlings. Därför bör denna metod vara ett användbart verktyg i humanstudier utvärdera cirkulerande peptidnivåer, t ex. de som är inblandade i regleringen av hunger och mättnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av den tyska Research Foundation STE 1765 / 3-1 (AS) och tyska ministeriet för utbildning och forskning 03IPT614A (CG). Vi tackar Reinhard Lommel och Petra Busse för deras utmärkta teknisk support samt Karin Johansson och Christina Hentzschel för hjälp med organisationen och genomförandet av antropometriska mätningar

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
SigmaStat 3.1 Systat Software, San Jose, CA, USA online download

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377, (9765), 557-567 (2011).
  2. James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263, (4), 336-352 (2008).
  3. Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14, (6), 480-488 (2012).
  4. Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37, (5), 625-633 (2013).
  5. Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50, (6), 1077-1080 (2004).
  6. Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150, (11), 5113-5118 (2009).
  7. Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31, (9), 1689-1696 (2010).
  8. Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
  9. Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23, (7), e294-e308 (2011).
  10. Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
  11. Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
  12. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306, (3), R164-R174 (2014).
  13. Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93, (3), 165-173 (2011).
  14. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45, (5), 565-576 (2007).
  15. Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22, (5), 253-257 (2011).
  16. De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147, (3), R53-R63 (2014).
  17. Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86, (12), 5992 (2001).
  18. Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11, (3), 419-421 (1957).
  19. Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92, (4), 810-817 (2010).
  20. Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20, (5), 405-410 (2004).
  21. Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
  22. Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282, (16), 1568-1575 (1999).
  23. Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
  24. Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349, (10), 941-948 (2003).
  25. Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42, (3), 329-334 (1988).
  26. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414, (1), 38-46 (2011).
  27. Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28, (4), 299-303 (2008).
  28. Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402, (6762), 656-660 (1999).
  29. Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18, (2), 138-149 (2012).
  30. Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
  31. Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22, (10), 1124-1131 (2011).
  32. Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88, (2), 914-919 (2003).
  33. Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9, (6), 2369-2373 (2015).
  34. Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279, (3), 909-913 (2000).
  35. Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21, (2), 159-161 (2003).
  36. Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34, (2), 107-112 (2001).
  37. Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14, (12), 1685-1690 (1997).
  38. White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics