Um método rápido para processamento de sangue para aumentar o rendimento dos níveis plasmáticos de peptídeos no sangue humano

Immunology and Infection

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Summary

O método de transformação rápida de sangue pode ser usado em seres humanos e produz níveis mais elevados de péptidos, bem como permite a avaliação da forma molecular correcto. Portanto, este método vai ser uma ferramenta valiosa na investigação peptídeo.

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Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

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Abstract

A investigação no domínio da regulação da ingestão de alimentos está a ganhar importância. Isso muitas vezes inclui a medição de péptidos que regulam a ingestão de alimentos. Para a determinação correcta da concentração de um péptido, que deve ser estável durante o processamento do sangue. No entanto, este não é o caso de vários péptidos que são rapidamente degradadas por peptidases endógenas. Recentemente, foi desenvolvido um método de processamento de sangue empregando temperaturas R educed, A cidification, P rotease inibição, eu sotopic controles exógenas e D ilution (RAPID) para o uso em ratos. Aqui, nós estabelecemos esta técnica para o uso em humanos e investigados recuperação, forma molecular e circulando concentração de hormônios reguladores ingestão de alimentos. O método rápido melhorou significativamente a recuperação de 125 a somatostatina-28 (+ 39%) marcado com I, glucagon-like peptide-1 (+ 35%), grelina acilo e glucagon (+ 32%), a insulina e kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), a leptina(+ 21%) e péptido YY 3-36 (+ 19%) em comparação com o processamento padrão (sangue com EDTA em gelo, p <0,001). cromatografia líquida de alta eficiência mostrou a eluição de grelina acil endógena na posição esperada após o processamento rápido, ao passo que após o processamento padrão de 62% da grelina acil foram degradados, resultando em um pico mais cedo provavelmente representando desacil grelina. Após o processamento RAPID a razão grelina acil / desacil no sangue de indivíduos com peso normal foi de 1: 3 em comparação com 01:23 seguimento de um tratamento padrão (p = 0,03). Também os níveis endógenos kisspeptin foram superiores após RAPID em comparação com o processamento padrão (+ 99%, p = 0,02). O método de transformação rápida de sangue pode ser usado em seres humanos, produz níveis mais elevados de péptidos e permite a avaliação da forma molecular correcto.

Introduction

À luz da crescente prevalência de obesidade em todo o mundo 1,2, a pesquisa no campo da regulação da ingestão de alimentos está a ganhar importância. Embora até agora apenas um péptido é conhecido que está perifericamente produzido e actuando centralmente para estimular a ingestão de alimentos, ou seja, a grelina 3, dentro das últimas décadas, uma ampla variedade de péptidos foi identificado e reduzir a ingestão de alimentos, por exemplo. leptina, péptido YY (PYY) e também glucagon-like peptide-1 (GLP-1) e insulina 4, portanto, em estudos investigando os mecanismos de regulação dos níveis de fome e de péptidos saciedade são frequentemente avaliada e, ao mesmo tempo, é assumido que o péptido estudado seja estável e recuperados em rendimentos elevados durante a formação do plasma. No entanto, muitas vezes não é este o caso, devido à rápida desagregação endógena como mostrado anteriormente por ex. grelina que é degradada a partir de acilo para desacil grelina 5. Por isso, recentemente descreveu o método rápido para proces sanguecantar em ratos empregando temperaturas R educed, A cidification, P rotease inibição, eu sotopic controles exógenas e D ilution 6. Este método melhorou a recuperação para 11 dos 12 péptidos testados e permitidos para a determinação da forma molecular circulando correcta em relação ao padrão de processamento de sangue (sangue com EDTA em gelo) 6. Este método tem sido utilizado em vários estudos subsequentes 7-12 para a detecção de grelina de circulação, bem como o factor de libertação da corticotropina 13. Por isso, o método tem-se revelado útil para a pesquisa de péptidos em roedores. No entanto, uma vez que estudos com roedores não são sempre traduzível a outra espécie animal, o método deve ser estabelecida para o uso no sangue humano bem.

O objetivo do presente estudo foi testar o método rápido para processamento de sangue em seres humanos em comparação com o processamento de sangue padrão, o sangue EDTA em gelo, que é amplamente recomendada 14 e frequentemente used no, bem como ambiente de pesquisa clínica. Testamos a recuperação de uma selecção de 125 péptidos I-rotulados envolvidas na regulação da ingestão de alimentos, incluindo péptidos estabelecidos, bem como novos candidatos recentemente sugerido para desempenhar um papel na alimentação de regulação (efeitos sobre o consumo de alimentos são mostrados na Tabela 1) após tratamento com ambos os métodos. As hormonas também foram escolhidos para representar péptidos de comprimento e carga (Tabela 2) diferente. Além disso, para a grelina foi investigada a forma (s) molecular seguindo o método padrão e RAPID. Por fim, avaliamos grelina endógena (acil e grelina desacil), bem como os níveis de kisspeptin, um peptídeo também sugeriu recentemente a desempenhar um papel na regulação da ingestão de alimentos 15,16 seguinte processamento rápido ou padrão. Além disso, também foi investigado estes níveis de péptido numa população de indivíduos com uma vasta gama de índice de massa corporal (variando 10,2-67,6 kg / m 2) para estudar podiferenças le relacionados ao peso corporal cronicamente alterado.

tabela 1

mesa 2

Diagnóstico, Avaliação e plano:
Os participantes do estudo
Todos os participantes do estudo foram pacientes recentemente hospitalizados (inclusão estava dentro de dois dias de admissão ao hospital) da Divisão de Medicina Psicossomática na Charité-Universitätsmedizin Berlim e deu consentimento informado por escrito. Para evitar qualquer impacto do gênero só foram incluídos pacientes do sexo feminino. Um total de 42 sujeitos participaram neste estudo e foram divididos em três grupos: peso normal (IMC 18,5-25 kg / m 2, n = 12), anorexia nervosa (IMC <17,5 kg / m 2, n = 15) e obesidade (IMC> 30 kg / m 2, n = 15). Anoréxica e pacientes obesos eramdiagnosticados de acordo com a Classificação Internacional de Doenças-10 e hospitalizado por ganho de peso (anorexia nervosa) ou redução do peso (obesidade), respectivamente. Todos os pacientes com peso normal foram hospitalizados exclusivamente devido a sintomas somatoformes sem perturbações somáticas relevantes. Foram excluídos pacientes com sintomas somatoformes gastrointestinais ou história de cirurgia gastrointestinal. Os critérios de exclusão também engloba uma idade <18 anos, gravidez atual e doenças psicóticas não tratados. A colheita de sangue foi efectuada no dia 2 ou 3 após a admissão hospitalar antes de receber o tratamento dietético, a fim de aumentar ou reduzir o peso corporal, respectivamente. parâmetros antropométricos foram avaliados no mesmo dia.

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Protocol

O protocolo foi aprovado pelo comitê de ética local para a investigação humana (número de protocolo EA1 / 114/10).

Processamento 1. Sangue

  1. Coletar sangue venoso 07:00-8h00 após jejum nocturno de uma veia do antebraço e do processo de acordo com o procedimento padrão ou o método RAPID. Instrua os assuntos a não exercer ou fumar antes da retirada de sangue.
  2. Para o processamento padrão, recolher o sangue em tubos contendo EDTA e centrífuga refrigerada dentro de 10 min a 3000 xg durante 10 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante e guardar a -80 ° C até processamento adicional por meio de radioimunoensaio.
  3. Para o processamento rápido, dilui-se imediatamente o sangue (dentro de 1 minuto após a retirada do sangue) a 1:10 em tampão arrefecido com gelo (pH 3,6) contendo acetato de amónio 0,1 M, NaCl 0,5 M e inibidores de enzimas (diprotina A, E-64-d, antipaína , leupeptina, quimostatina, 1 ug / ml). Em seguida, centrifugação dentro de 10 min a 3000 xg durante 10 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante nósing uma pipeta em tubos de polipropileno como descrito antes em ratos 6.
    1. cartuchos de cromatografia de carga (360 mg, 55-105 um) com 100% de acetonitrilo (taxa de 10 ml / min), equilibrar-se com 0,1% de trifluoroacetato (TFA, taxa de 10 mL / min) e o sobrenadante com carga, a uma taxa constante de 1 ml / min utilizando uma bomba de seringa.
    2. Em seguida, lavar com cartuchos de 3 mL de TFA 0,1% (taxa de 10 ml / min) e, lentamente, eluir com 2 ml de acetonitrilo a 70% contendo 0,1% de TFA (2 ml / min).
    3. As amostras eluidas utilizando a centrifugação a seco a vácuo e armazenar a -80 ° C até processamento adicional por meio de radioimunoensaio.
      NOTA: Realizar todas as etapas em polipropileno (processamento RAPID) e borosilicato (radioimunoensaio) tubos que apresentam significativamente menor propriedades de ligação de superfície e, assim, minimizar a perda de peptídeo para a maioria dos peptídeos estudados antes de 26.

2. medições

NOTA: As etapas nesta seção devem ser realizados em um laboratóriocertificada para o trabalho com material radioativo. As precauções padrão para o trabalho com 125 I devem ser tomadas.

  1. Recuperação de péptidos radiomarcados
    1. Obter I-125 radiomarcadas péptidos humanos (por exemplo. Acil-grelina, o GLP-1, glucagon, insulina, kisspeptin, leptina, nesfatin-1, PYY 3-36 e somatostatina-28).
    2. Manter péptidos em forma de pó até a experiência, depois acabado de diluir em 0,1% de ácido acético (~ 100.000 cpm por ml).
    3. Para o processamento de sangue padrão, diretamente após a retirada de sangue para EDTA refrigerados contendo tubos, de transferência de 1 ml de sangue para um tubo com 50 ul de marcador radioactivo contendo 3,000-6,000 cpm (contados diretamente antes do experimento começa).
    4. Para o processamento rápido, transferência de 1 ml de sangue de EDTA contendo sangue para um tubo contendo 9 ml de tampão RAPID (para a composição ver 1.3) e 500 ul marcador radioactivo contendo 30,000-60,000 cpm. Devido ao uso 1:10 10 vezes maior volume de radiolabel para o processamento rápido.
    5. Em seguida, amostras do processo, tal como descrito nas etapas 1.2 a 1.3.2.
    6. Para os experimentos de recuperação, faça amostras não secas por centrifugação a vácuo e não armazenar a -80 ° C. Em vez disso, avaliar a recuperação dos péptidos marcados radioactivamente directamente depois utilizando um contador gama.
    7. Medir todo o sobrenadante em amostras padrão, enquanto que no RAPID analisar amostras de 1/10 do volume total para se obter a comparabilidade da quantidade de radiomarcador utilizado. Para a medição, transferir o sobrenadante em tubos de montagem para o contador gama e avaliar as contagens por minuto
    8. Como um padrão de 100%, utilizar duas amostras com 50 ul de 125 I-péptido radiomarcado que não sofrem processamento. Medida ao mesmo tempo com outras amostras, tal como descrito em 2.1.7.
    9. Realiza a experiência de cinco a seis vezes para cada péptido.
  2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Radiolabeled Grelina
    1. Retirar sangue no cEDTA hilled contendo tubos e transferência de 1 ml para tubos contendo 200 ul grelina radiomarcado-acil contendo 15.000-20.000 cpm (contados diretamente antes do experimento começa).
    2. Para o processamento rápido, transferência de 1 ml de sangue para um tubo contendo 9 ml de tampão RAPID (para a composição ver 1.3) e 200 ul acil radiomarcado grelina contendo 15.000-20.000 cpm.
    3. Em seguida, amostras do processo, tal como descrito nas etapas 1.2 a 1.3.2.
    4. Para análise posterior por HPLC de fase reversa, carregar directamente numa coluna de amostras estáveis ​​ligação C18 (2,1 mm x 50 mm, 1,8 um) equilibrada em 17% de acetonitrilo em água (ambos suplementados com 0,1% de TFA).
    5. Após 5 minutos de equilíbrio, usar um gradiente de 17-40% de acetonitrilo a eluir a amostra em 40 min (taxa de 1 ml / min de fluxo).
    6. Recolher fracções de 1 ml por minuto e analisar a radioactividade utilizando um contador gama.
    7. Em uma experiência separada, a carga 200 mL acil radiomarcado grelina contendo 15.000-20.000cpm sobre a coluna directamente e realizar HPLC, como descrito nos passos 2.2.4 a 2.2.6.
  3. radioimunoensaio
    1. Para radioimunoensaio, descongelar sobrenadantes congelados (Processing Standard) e aspirador de pó seco (método rápido) à temperatura ambiente.
    2. Imediatamente antes de radioimunoensaio, re-suspender as amostras RAPID secos em dobro H2O destilada de acordo com o volume original de plasma (500 mL).
    3. Avaliar kisspeptin e total (incluindo tanto desacil e grelina de acilo), bem como a grelina acilo como descrito antes utilizando radioimunoensaios 12,27 comerciais de acordo com os protocolos dos fabricantes. Utilize tubos de borossilicato que permitem a formação de sedimento estável.
      1. No dia um, incubar as amostras com tampão de ensaio e o anticorpo primário (por ex. Anti-grelina) na diluição fornecida pelo fabricante durante um período de 24 h.
      2. No dia dois, adicionar o marcador 125I (por exemplo, 125I-grelina), VORTEX e incubar durante um período de 24 h.
      3. No terceiro dia, adicionar o reagente de precipitação, vortex e incubar, tal como recomendado pelo fabricante. Em seguida, os tubos de centrifugação a 3000 xg durante 20 min a 4 ° C. Remove-se os sobrenadantes e contar a radioactividade nos peletes usando um contador gama
    4. Calcule desacil grelina como a diferença de um total de grelina menos acilo. Avaliar a relação de grelina acil / desacil pela divisão de acilo por desacil grelina para cada amostra individual.
    5. Processar todas as amostras - se possível - em um lote de evitar a variabilidade inter-ensaio. A variabilidade intra-ensaio no presente experimento foi <8% para kisspeptin, <7% para o total e <9% para a grelina acilo.

3. Análise Estatística

  1. Determinar a distribuição dos dados, utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov. Expresso de dados como média ± erro padrão da média (SEM).
  2. Avaliar as diferenças entre doisgrupos pelo teste t. Avaliar as diferenças entre vários grupos de todos os procedimentos múltiplos de pares de comparação (teste de Tukey post hoc) ou two-way ANOVA seguido pelo método de Holm-Sidak.
  3. Considere p <0,05 significativo e realizar análises utilizando um programa de estatísticas.

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Representative Results

Processamento de sangue RAPID aumenta o rendimento de 125 peptídeos I-radiomarcados no sangue humano em relação ao processamento de sangue padrão.
Após o processamento padrão de sangue (sangue com EDTA em gelo), a recuperação dos péptidos radiomarcados foi de ~ 60% em 9/9 péptidos (variando 48-68%, Figura 1A - K). Um rápido processamento melhorado o rendimento em todos os 125 péptidos I-rotulados, nomeadamente na somatostatina-28 (+ 39%, Figura 1A), glucagon-like peptide-1 (+ 35%, Figura 1B), acilo grelina (N-octanoil grelina, + 32%, Figura 1C), o glucagon (+ 32%, Figura 1E), insulina (+ 29%, Figura 1E), kisspeptin (+ 29%, Figura 1F), nesfatin-1 (+ 28%, Figura 1G), leptina (+ 21%, Figura 1H) e péptido YY 3-36 (+ 19%, Figura 1K) em comparação com o processamento padrão (p <00,001). Nestes péptidos 9, a recuperação após o método rápido foi de ~ 90% (variando 71-98%, Figura 1A - K).

figura 1
Figura 1:. Recuperação de 125 péptidos I-rotulados no sangue humano na sequência de péptidos ou rápida de processamento de sangue marcado radioactivamente foi adicionado a sangue humano e processado de acordo com o procedimento padrão (sangue com EDTA em gelo) ou o método rápido (temperaturas reduzidas, de acidificação, de protease inibição, controles exógenos isotópicos e diluição). Os sobrenadantes foram recolhidos e contados para radioactividade. Cada coluna representa a média ± SEM de cinco a seis experimentos. *** P <0,001 vs. processamento padrão. Por favor clique aqui para viewa versão maior desta figura.

Seguindo RAPID Processing, grelina elui na posição esperada.
Depois de um rápido processamento de sangue humano, a grelina 125 I-marcado eluiu na posição esperada, enquanto após o procedimento padrão foi observado um pico mais provável anterior correspondente ao desacil grelina (Figura 2). Isto representou uma degradação de 62% do peptídeo.

Figura 2
Figura 2:. A eluição do perfil de 125I-marcado Acilo grelina no sangue humano na sequência de péptidos ou rápida de processamento de sangue marcado radioactivamente foi adicionado a sangue humano e processado de acordo com o procedimento padrão ou o método rápido. Em seguida, o sobrenadante foi carregado numa coluna de cromatografia líquida de alta eficiência. O eluato foi colcionado a cada minuto e contadas para a radioactividade. Após um processamento rápido a maior parte do péptido eluído no tempo esperado, embora, após processamento padrão uma grande proporção eluída anterior, muito provavelmente representando grelina desacil. Abreviatura:. Cpm, contagens por minuto por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Processamento de Sangue RAPID melhora a relação e resulta em aumento dos níveis sanguíneos endógena kisspeptin grelina Acil / desacil comparação com Processing Standard.
O sangue foi retirado do peso anoréxica, normal e obesos e processados ​​de acordo com o procedimento padrão ou RAPID. grelina endógena (grelina total e acilo) foi avaliada por radioimunoensaio. Antropométricas e comorbidades / medicação dos grupos de estudo são mostrados nas Tabelas 3 e 4. Após o processamento RAPID a razão grelina acilo / desacil no sangue de indivíduos com peso normal foi de 1: 3 em comparação com 01:23 de processamento seguinte padrão de sangue (p = 0,03; Figura 3A). Resultados semelhantes foram observados sob anoréxica (1: 3 v 1:19, p <0,001) e as condições de obesos (1: 3 vs 01:13; p = 0,04; Figura 3A.). Não foram observadas diferenças entre os três grupos diferentes para o processamento padrão ou RAPID (Figura 3A). ANOVA indicou uma significante fi in fl uência do método de processamento (F 1,64 = 15,3, p <0,001), enquanto a condição de peso corporal / metabólica não teve efeito (F 2,64 = 0,5, p = 0,62).

tabela 3

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Os níveis circulantes kisspeptin endógenos foram significativamente mais elevada após RAPID em comparação com o processamento padrão em anoréxica (+ 60%, p = 0,02) e em indivíduos com peso normal (+ 99%, p = 0,02), enquanto que a diferença não atingiu significância sob condições de obesidade ( 23%, p = 0,39; Figura 3B). Não foram observadas diferenças significativas entre os três grupos de IMC diferentes (p> 0,05; Figura 3B). ANOVA de duas vias indicada uma signi fi cativo em fl uência do método de processamento (F 1,74 = 10,8; p = 0,002), enquanto que a condição de peso corporal / metabólica não teve nenhum efeito (F 2,74 = 0,5, P = 0,60).

Figura 3 Figura 3: Circulação Rácio Acil / desacil grelina e níveis circulantes de kisspeptin sob diferentes condições metabólicas seguinte RAPID ou Standard Sangue de processamento de sangue foi retirado do peso anoréxica, normal ou indivíduos obesos após um jejum nocturno e processados ​​de acordo com o procedimento padrão ou o método RAPID.. O sobrenadante foi recolhido e acilo, bem como os níveis totais de grelina ou kisspeptin níveis (B) avaliada por radioimunoensaio. Desacil grelina foi obtido por subtracção de acilo de grelina total. A relação foi calculada por divisão de acilo por desacil grelina (A). O tamanho do grupo é indicado na parte inferior das colunas. Os dados são expressos como média ± SEM. * P <0,05, ** P <0,01 e *** p <0,001 vs. processamento padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maioresta figura.

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Discussion

Nós relatado anteriormente que o método rápido para processamento de sangue melhorou a recuperação para 11/12 peptídeos em comparação com o processamento de sangue padrão em ratos 6. No presente estudo demonstrámos que este método é também adequado para a utilização em seres humanos. Na sequência de um tratamento rápido, a recuperação para 9 de 9 125 peptídeos I-rotulados testado foi melhorado em comparação com o processamento de sangue padrão (sangue EDTA em gelo). A melhoria observada variou 19-39%, o que é provável que seja relevante, especialmente sob condições em que apenas as diferenças subtis são esperados, que pode ser mascarado quando o rendimento do péptido é baixo.

Nós também mostrou que, após RAPID grelina de processamento de sangue é detectado na posição correcta após eluição de HPLC indicando a forma molecular correcto (acilo grelina), enquanto que após o processamento de sangue padrão de 2/3 são degradados para desacil grelina. Uma vez que o grupo acilo é essencial para a ligação ao receptor de grelina 28, de-acilação é esperado para alterar significativamente a função biológica do péptido. No entanto, também desacil grelina é cada vez mais reconhecido como um peptídeo biologicamente ativo 29. Curiosamente, desacil grelina foi sugerido para contrariar os efeitos de grelina como mostrado anteriormente para a ingestão de alimentos 30 ou 31 de motilidade do cólon. Isso destaca ainda mais a importância de se investigar a forma molecular correcto.

Quando se estuda os níveis endógenos de kisspeptin em indivíduos com peso normal, que mostrou aumento nos níveis (+ 99%), seguindo RAPID comparado ao processamento de sangue padrão. No entanto, nenhuma melhoria foi observada em condições de obesidade, que pode ser devido ao aumento dos níveis kisspeptin globais (+ 50% em obesos vs. Peso normal). Entre grupos de IMC (anorexia nervosa, peso normal e obesidade) no sangue processados ​​com qualquer método, não foram observadas diferenças significativas que podem ser devido ao fato de que os níveis única em jejum were avaliada. As diferenças podem ser pós-prandial aparente, uma hipótese que deve ser investigado em estudos futuros.

Kisspeptina foi medido antes em estudos que utilizaram apenas tubos de EDTA em gelo de 32 (no presente estudo que se refere ao processamento de série) ou pela adição de inibidores da protease 33. Com base no presente estudo, o arrefecimento dos tubos não é suficiente para evitar a degradação do péptido. Se os inibidores de acidificação sozinho ou protease única são suficientes para preservar kisspeptin deve ser investigado em estudos futuros.

Da mesma forma, o processamento rápido também aumenta o rendimento da grelina acilo endógeno, tal como indicado por uma muito maior proporção de acilo / desacil grelina (1: 3) em comparação com o processamento de sangue padrão (01:23). Esta descoberta mostra boa concordância com os estudos de roedores em que relatou uma razão de grelina acil / desacil de 1: 5 a seguir um tratamento rápido antes (em comparação com 01:19 depois do processamento standard).Os amplos intervalos de a relação de grelina / desacil acilo de 1:15 - 1:55 34,35 relatados antes foram, por conseguinte, muito provavelmente devido a uma elevada proporção de-dependente de acilação da grelina desacil. Como descrito acima para kisspeptin, sem alterações no rácio de grelina acilo / desacil foram observadas sob diferentes condições de peso corporal cronicamente alteradas (anorexia nervosa vs. Peso normal vs. A obesidade). Isto também pode ser devido ao facto de só níveis em jejum de acilo / desacil grelina foram avaliadas e a regulação pós-prandial é mais importante. Por outro lado, isto também indica que, apesar do peso corporal cronicamente alteradas a proporção de acilo e grelina desacil não é alterada em condições basais e não pode desempenhar um papel importante nas alterações adaptativas observados sob estas condições. No entanto, estudos futuros utilizando protocolos refeição padronizada e aplicando o método RAPID vai ajudar a responder melhor esta questão.

O RAPID meTHOD utiliza os seguintes componentes: Uma vez que as reacções químicas dependem principalmente da temperatura de 36 a redução da temperatura por meio de uma solução gelada retarda a degradação do péptido. Em seguida, também uma diminuição do pH (acidificação) diminui a velocidade da degradação 37. Além disso, uma redução do pH reduz a adsorção de péptidos a outras superfícies e, por conseguinte, também reduz o risco de perda de péptido. Os inibidores da protease utilizados aqui foram escolhidos de modo a cobrir um largo espectro de peptidases endógenas: (. Por exemplo, a catepsina B / H) diprotina A, tal como um inibidor de dipeptidil-peptidase IV, E-64-d como um inibidor de proteases de tiol, antipaína quanto um inibidor de tripsina, papaína e catepsina a / B, leupeptina como inibidor de tripsina, a plasmina, a papaina e a catepsina e quimostatina como um inibidor de quimotripsina, papaina e catepsina B / L. Além disso, os péptidos isotópicas são úteis a fim de avaliar a melhoria da recuperação pelo método. Por fim, como a taxa de of a formação do complexo enzima-substrato depende da concentração da enzima (peptidase) e o substrato (hormona peptídica) 38 de diluição do plasma, reduz a taxa de formação e, por conseguinte, a degradação (uma diluição de dez vezes reduz a taxa de cem vezes de acordo com a equação de Michaelis cinética -Menten).

Apesar das vantagens do método rápido, várias limitações do método devem ser reconhecidos como bem. A etapa mais crítica do protocolo é o tempo. As amostras de sangue devem ser diluídas no tampão RAPID imediatamente após a retirada de sangue, que pode ser difícil na prática clínica. Além disso, o método é mais demorado, requer um nível mais elevado de formação e também é mais caro do que o processamento de sangue padrão. Embora possa ser difícil de implementar na rotina clínica, ele irá ser útil para fins de investigação, especialmente quando apenas diferenças subtis são esperados e, por conseguinte, um elevado rendimento do péptido é desejável.

Embora o método RAPID é descrito e recomendado com todos os seus componentes (R temperaturas educed, A cidification, P rotease inibição, eu sotopic controles exógenas e D ilution) no presente trabalho, estudos futuros podem usar modificações desta técnica. O uso de controles exógenos isotópicos pode não ser obrigatório e, portanto, restrita a estudos-piloto, a fim de avaliar quais peptídeos mostram a maior melhoria na recuperação usando o processamento rápido. Além disso, também a composição da mistura de inibidores de protease pode ser modificado quando outros péptidos são avaliadas. No entanto, isto deve ser testado quando um novo péptido é medida.

Em resumo, o método rápido de processamento de sangue podem ser utilizados para o sangue humano e melhorou grandemente a recuperação de 9/9 péptidos testados em comparação com o processamento de sangue padrão. Uma vez que para alguns peptídeos apenas uma pequena a moderada melhora da recuperação foi observada, a necessidadedo método pode ter que ser testados quando um novo péptido é analisado. Além disso, o método rápido permite a detecção da forma molecular correcta, como mostrado para a grelina acilo e também aumenta consideravelmente o rendimento de níveis circulantes de péptidos endógenos, tais como kisspeptin em comparação com o processamento de sangue padrão. Portanto, esse método deve ser uma ferramenta útil em estudos em humanos avaliando níveis de peptídeo circulante, por exemplo. aqueles que estão envolvidos na regulação da fome e saciedade.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa STE 1765 / 3-1 (AS) e do Ministério Alemão de Educação e Pesquisa 03IPT614A (CG). Agradecemos Reinhard Lommel e Petra Busse por sua excelente suporte técnico, bem como Karin Johansson e Christina Hentzschel para obter ajuda com a organização e execução de medidas antropométricas

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
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