Un método rápido para el procesamiento de sangre para aumentar el rendimiento de los niveles plasmáticos de péptido en la sangre humana

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

El método de transformación rápida de sangre se puede utilizar en los seres humanos y los rendimientos más altos niveles de péptidos, así como permite la evaluación de la forma molecular correcto. Por lo tanto, este método será una herramienta valiosa en la investigación de péptidos.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La investigación en el campo de la regulación de la ingesta de alimentos está ganando importancia. Esto a menudo incluye la medición de péptidos que regulan la ingesta de alimentos. Para la correcta determinación de la concentración de un péptido, debería ser estable durante el procesamiento de sangre. Sin embargo, este no es el caso para varios péptidos que se degradan rápidamente por peptidasas endógenas. Recientemente, hemos desarrollado un método de procesamiento de la sangre empleando temperaturas R relucida, cidification A, P rotease inhibición, que sotopic controles exógenos y ilution D (RAPID) para el uso en ratas. Aquí, hemos establecido esta técnica para el uso en seres humanos y se investigó la recuperación, forma molecular y haciendo circular la concentración de las hormonas reguladoras de consumo de alimentos. El método RAPID mejoró significativamente la recuperación de 125 somatostatina-28 (+ 39%) marcado con I, péptido similar al glucagón-1 (+ 35%), la grelina de acilo y glucagón (+ 32%), la insulina y kisspectina (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), la leptina(+ 21%) y el péptido YY 3-36 (+ 19%) en comparación con el procesamiento estándar (sangre con EDTA en hielo, p <0,001). cromatografía de líquidos de alto rendimiento mostró que la elución de la grelina acilo endógeno en la posición esperada después de un procesamiento rápido, mientras que después del procesamiento estándar 62% de la grelina acilo se degrada lo que resulta en un pico anterior probable que representa la grelina desacil. Después de un rápido procesamiento de la relación de la grelina acilo / desacil en la sangre de los sujetos de peso normal fue de 1: 3 en comparación con 01:23, tras su transformación estándar (p = 0,03). También los niveles endógenos Kisspeptina fueron mayores después de RAPID en comparación con el procesamiento estándar (+ 99%, p = 0,02). El método de procesamiento de sangre RAPID se puede utilizar en los seres humanos, produce niveles de péptido más altas y permite la evaluación de la forma molecular correcta.

Introduction

A la luz de la creciente prevalencia de la obesidad en todo el mundo 1,2, la investigación en el campo de la regulación de la ingesta de alimentos está ganando importancia. Mientras que se conoce hasta ahora sólo un péptido que se produce en la periferia y de acción central para estimular la ingesta de alimentos, a saber, la grelina 3, dentro de las últimas décadas, una amplia gama de péptidos se ha identificado que reducen la ingesta de alimentos, por ejemplo. la leptina, el péptido YY (PYY) y también péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) y la insulina 4, Por lo tanto, en los estudios que investigan los mecanismos de regulación de los niveles de hambre y de péptidos de saciedad a menudo se evalúa y, al mismo tiempo, se supone que el péptido estudiado es estable y se recuperó en altos rendimientos durante la formación de plasma. Sin embargo, muy a menudo esto no es el caso debido a la rápida descomposición endógena como se muestra antes de para, por ejemplo. grelina que se degrada de acilo a desacil grelina 5. Por lo tanto, hemos descrito recientemente el método rápido para elaboración de sangrecantar en ratas que emplean temperaturas R relucida, cidification A, P rotease inhibición, que sotopic controles exógenos y ilution D 6. Este método mejoró la recuperación para 11 de 12 péptidos ensayados y permitidos para la determinación de la forma molecular de circulación correcta en comparación con el procesamiento de sangre estándar (sangre EDTA en hielo) 6. Este método se ha utilizado en varios estudios posteriores 7-12 para la detección de circulación de la grelina, así como factor de 13 de liberación de corticotropina. Por lo tanto, el método ha demostrado ser útil para la investigación de péptidos en los roedores. Sin embargo, ya que los estudios de roedores no son siempre traducible a otra especie, el método debe ser establecido para el uso en la sangre humana también.

El objetivo del presente estudio fue probar el método rápido para el procesamiento de sangre en los seres humanos en comparación con el estándar de procesamiento de la sangre, la sangre EDTA sobre hielo, que es ampliamente recomendado y con frecuencia u 14sed en el ámbito clínico, así como la investigación. Hemos probado la recuperación de una selección de 125 péptidos marcados-I que participan en la regulación de la ingesta de alimentos incluyendo péptidos establecidos, así como nuevos candidatos recientemente propuesto para desempeñar un papel en la alimentación de regulación (efectos sobre la ingesta de alimentos se muestran en la Tabla 1) tras su procesamiento con ambos métodos. Las hormonas también fueron elegidos para representar péptidos de diferente longitud y carga (Tabla 2). Por otra parte, para la grelina se investigó la forma molecular (s) siguiendo el método estándar y rápida. Por último, se evaluó la grelina endógena (acilo y grelina desacil), así como los niveles de Kisspeptina, un péptido también sugerido recientemente que desempeñar un papel en la regulación de la ingesta de alimentos 15,16 tras un procesamiento rápido o estándar. Además, también se investigó estos niveles de péptidos en una población de sujetos con una amplia gama de índice de masa corporal (que va de 10.2-67.6 kg / m 2) para estudiar possibLe diferencias relacionadas con el peso corporal alterada crónicamente.

tabla 1

Tabla 2

Diagnóstico, evaluación, y el Plan:
Los participantes del estudio
Todos los participantes del estudio fueron pacientes recientemente hospitalizados (inclusión fue dentro de los dos días de ingreso en el hospital) de la División de Medicina Psicosomática en la Charité-Universidad de Berlín y dieron su consentimiento informado por escrito. Para evitar cualquier impacto de género sólo se incluyeron pacientes de sexo femenino. Un total de 42 sujetos participaron en este estudio y se dividieron en tres grupos: peso normal (IMC de 18,5-25 kg / m 2, n = 12), la anorexia nerviosa (IMC <17,5 kg / m 2, n = 15) y obesidad (IMC> 30 kg / m 2, n = 15). Anoréxica y los pacientes eran obesosdiagnosticados de acuerdo con la Clasificación Internacional de Enfermedades-10 y hospitalizados por el aumento de peso (anorexia nerviosa) o la reducción de peso (obesidad), respectivamente. Todos los pacientes con peso normal fueron hospitalizados exclusivamente debido a los síntomas somáticos sin trastornos somáticos relevantes. Se excluyeron los pacientes con síntomas gastrointestinales somatomorfos o con antecedentes de cirugía gastrointestinal. Los criterios de exclusión abarcaron también una edad <18 años, embarazo actual y las enfermedades psicóticas no tratados. La recogida de sangre se realizó el día 2 o 3 después de la admisión hospitalaria antes de recibir tratamiento dietético con el fin de aumentar o reducir el peso corporal, respectivamente. parámetros antropométricos fueron evaluados en el mismo día.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

El protocolo fue aprobado por el comité de ética local para la investigación humana (número de protocolo EA1 / 114/10).

Procesamiento 1. Sangre

  1. Recoger la sangre venosa 07:00-08 a.m. después del ayuno nocturno de una vena del antebrazo y el procedimiento de acuerdo con el procedimiento estándar o el método RAPID. Instruir a los sujetos que no ejercicio o fumar antes de la extracción de sangre.
  2. Para el procesamiento estándar, recoger la sangre en tubos que contenían EDTA y se centrifuga refrigerada a menos de 10 min a 3.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Se recoge el sobrenadante y mantener a -80 ° C hasta su posterior procesamiento por radioinmunoensayo.
  3. Para el procesamiento de RAPID, diluir inmediatamente sangre (a menos de 1 min después de la retirada de la sangre) 01:10 en tampón enfriado con hielo (pH 3,6) que contiene acetato de amonio 0,1 M, 0,5 M NaCl e inhibidores de enzimas (diprotina A, E-64-d, antipaína , leupeptina, quimostatina, 1 mg / ml). A continuación, se centrifuga dentro de 10 min a 3.000 xg durante 10 min a 4 ° C y recoger nos sobrenadanteing una pipeta en tubos de polipropileno como se detalla anteriormente en ratas 6.
    1. cartuchos de cromatografía de carga (360 mg, 55 a 105 micras) con 100% de acetonitrilo (tasa de 10 ml / min), se equilibran con 0,1% de trifluoroacetato (TFA, la tasa de 10 ml / min) y de la carga con el sobrenadante a una velocidad constante de 1 ml / min utilizando una bomba de jeringa.
    2. A partir de entonces, se lava con cartuchos de 3 ml 0,1% de TFA (tasa de 10 ml / min) y se eluye lentamente con 2 ml 70% de acetonitrilo que contiene 0,1% de TFA (2 ml / min).
    3. Secas muestras eluidas mediante centrifugación al vacío y se almacena a -80 ° C hasta su posterior procesamiento por radioinmunoensayo.
      NOTA: Llevar a cabo todos los pasos de polipropileno (procesamiento rápido) y borosilicato (radioinmunoensayo) tubos que presentan significativamente menor propiedades de unión a la superficie y por lo tanto minimizan la pérdida de péptido para la mayoría de los péptidos estudiados antes del 26.

2. Las mediciones

NOTA: Los pasos de esta sección debe realizarse en un laboratoriocertificada para trabajar con material radiactivo. Las precauciones estándar para el trabajo con 125I se deben tomar.

  1. La recuperación de péptidos radiomarcados
    1. Obtener 125 péptidos humanos I-radiomarcados (por ejemplo. Acil-grelina, GLP-1, el glucagón, la insulina, kisspectina, leptina, nesfatin-1, PYY 3-36 y la somatostatina-28).
    2. Mantenga péptidos en forma de polvo hasta que el experimento, a continuación, recién diluido en 0,1% de ácido acético (~ 100.000 cpm por ml).
    3. Para el procesamiento de sangre estándar, directamente después de la extracción de sangre en EDTA refrigerado que contiene tubos, de transferencia de 1 ml de sangre en un tubo con 50 l de radiomarcador que contiene 3.000-6.000 cpm (contados directamente antes del comienzo del experimento).
    4. Para un rápido procesamiento, transferencia de 1 ml de sangre de EDTA que contiene sangre en un tubo que contiene 9 ml de tampón RAPID (para la composición véase el punto 1.3) y 500 l marcador radiactivo que contiene 30.000-60.000 cpm. Debido a la utilización dilución 1:10 10 veces mayor volumen de radiolabel para un procesamiento rápido.
    5. Después, muestras de proceso como se describe en los pasos 1.2 a 1.3.2.
    6. Para los experimentos de recuperación, hacer muestras no secas por centrifugación al vacío y no almacenar a -80 ° C. En su lugar, evaluar la recuperación de los péptidos marcados radioactivamente directamente después usando un contador gamma.
    7. Mida todo el sobrenadante en las muestras testigos, mientras que en RAPID muestras analizan 1/10 del volumen total para obtener la comparabilidad de la cantidad de radiomarcador utilizado. Para la medición, se transfiere el sobrenadante en tubos que encajan en el contador gamma y evaluar las cuentas por minuto
    8. Como estándar 100%, utilice dos muestras con 50 l de péptido 125-I radiomarcado que no se someten al proceso. Mida al mismo tiempo con otras muestras como se describe en 2.1.7.
    9. Realizar el experimento de cinco a seis veces para cada péptido.
  2. Cromatografía Líquida de Alta radiomarcados de grelina
    1. Extraer sangre en cEDTA hilled que contiene los tubos y la transferencia de 1 ml a tubos que contenían 200 l grelina radiomarcado-acilo que contiene 15.000-20.000 cpm (contados directamente antes del comienzo del experimento).
    2. Para un rápido procesamiento, transferencia de 1 ml de sangre en un tubo que contiene 9 ml de tampón RAPID (para la composición véase el punto 1.3) y 200 l acil radiomarcado grelina que contiene 15.000-20.000 cpm.
    3. Después, muestras de proceso como se describe en los pasos 1.2 a 1.3.2.
    4. Para más análisis por HPLC de fase inversa, cargar directamente las muestras en una columna estable C18 Bond (2,1 mm x 50 mm, 1,8 micras) equilibrada en 17% de acetonitrilo en agua (ambos suplementado con 0,1% de TFA).
    5. Después de 5 min de equilibrado, usar un gradiente de 17-40% de acetonitrilo para eluir la muestra en 40 min (velocidad de 1 ml / min de flujo).
    6. Recoger fracciones de 1 ml por minuto y analizar la radiactividad usando un contador gamma.
    7. En un experimento separado, la carga de 200 l acilo radiomarcado grelina que contiene 15.000-20.000cpm en la columna directamente y llevar a cabo HPLC como se describe en los puntos 2.2.4 a 2.2.6.
  3. radioinmunoensayo
    1. Para radioinmunoensayo, descongelar sobrenadantes congelados (procesamiento estándar) y aspirar polvo seco (método rápido) a temperatura ambiente.
    2. Inmediatamente antes de radioinmunoensayo, volver a suspender las muestras de secado rápido en la doble H 2 O destilada de acuerdo con el volumen original del plasma (500 l).
    3. Evaluar kisspectina y total (incluyendo tanto desacil y la grelina de acilo), así como la grelina de acilo como se ha descrito antes usando radioinmunoensayos 12,27 comerciales de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Utilizar tubos de borosilicato que permiten la formación de gránulos estable.
      1. En el primer día, incubar las muestras con tampón de ensayo y el anticuerpo primario (por ejemplo. Anti-ghrelina) en la dilución proporcionado por el fabricante durante un período de 24 horas.
      2. En el segundo día, añadir el trazador 125I (por ejemplo, 125I-ghrelina), voRTEX e incubar durante un período de 24 horas.
      3. En el tercer día, añadir el reactivo precipitante, vórtice y se incuba según lo recomendado por el fabricante. Entonces, los tubos de centrífuga a 3.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Eliminar los sobrenadantes y contar la radiactividad en los gránulos usando un contador gamma
    4. Calcula desacil grelina como la diferencia del total de la grelina menos acilo. Evaluar la relación de grelina acilo / desacil dividiendo acilo por desacil grelina para cada muestra individual.
    5. Procesar todas las muestras - si es posible - en un solo lote para evitar la variabilidad inter-ensayo. La variabilidad intra-ensayo en el presente experimento fue <8% para kisspectina, <7% para el total y <9% de la grelina acilo.

3. Análisis estadístico

  1. Determinar la distribución de los datos mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Expresar los datos como media ± error estándar de la media (SEM).
  2. Evaluar las diferencias entre los dosgrupos de t-test. Evaluar las diferencias entre varios grupos de todos los procedimientos múltiples por pares de comparación (prueba de Tukey post hoc) o de dos vías ANOVA seguido por el método de Holm-Sidak.
  3. Considere p <0,05 significativo y realizar análisis utilizando un programa de estadísticas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Procesamiento de sangre rápido incrementa el rendimiento de 125 péptidos I-radiomarcados en la sangre humana en comparación con el procesamiento de sangre estándar.
Después del procesamiento de sangre estándar (sangre EDTA en hielo), la recuperación de péptidos radiomarcados fue de ~ 60% en 9/9 péptidos (que van desde 48 hasta 68%, la Figura 1A - K). Procesamiento rápido mejorado el rendimiento en todos los 125 péptidos marcados-I, es decir, en la somatostatina-28 (+ 39%, Figura 1 A), péptido similar al glucagón-1 (+ 35%, la Figura 1B), acilo grelina (n-octanoil grelina, + 32%, Figura 1C), el glucagón (+ 32%, Figura 1D), insulina (+ 29%, Figura 1E), kisspectina (+ 29%, Figura 1F), nesfatin-1 (+ 28%, Figura 1G), leptina (+ 21%, Figura 1H) y el péptido YY 3-36 (+ 19%, Figura 1K) en comparación con el procesamiento estándar (p <0001). En estos 9 péptidos, la recuperación después de que el método rápido fue ~ 90% (del 71-98%, Figura 1 A - K).

Figura 1
Figura 1:. La recuperación de 125 péptidos marcados-I en la sangre humana siguiente péptido estándar o rápida Sangre Procesamiento radiomarcados se añadió a la sangre humana y se procesa de acuerdo con el procedimiento estándar (sangre con EDTA en hielo) o el método RAPID (temperaturas reducidas, la acidificación, la proteasa inhibición, controles exógenos isotópicas y dilución). Los sobrenadantes se recogieron y se contaron para la radiactividad. Cada columna representa la media ± SEM de cinco a seis experimentos. *** P <0,001 frente de procesamiento estándar. Por favor, haga clic aquí para viewa versión más grande de esta figura.

Tras el procesamiento rápido, grelina eluye a la posición esperada.
Después de un procesamiento rápido de la sangre humana, 125 grelina marcado con I eluyó a la posición esperada, mientras que después del procedimiento estándar se observó más probable un pico anterior corresponde a desacil grelina (Figura 2). Esto representó una degradación de 62% del péptido.

Figura 2
Figura 2:. La elución del perfil de marcado con I125 Acil grelina en sangre humana siguiente péptido estándar o rápida Sangre Procesamiento radiomarcados se añadió a la sangre humana y se procesa de acuerdo con el procedimiento estándar o el método RAPID. Después, el sobrenadante se cargó en una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento. El eluato fue colcionado cada minuto y se contó la radiactividad. Después de un rápido procesamiento mayor parte del péptido eluido en el tiempo esperado, mientras que después de la norma procesar una gran proporción eluido anterior, más probable es que representa la grelina desacil. Abreviatura:. Cpm, cuentas por minuto Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Celeridad en la tramitación de la sangre mejora la relación y resulta en aumento de los niveles de grelina endógena Kisspeptina Acil / desacil En comparación con Processing Standard.
Se extrajo sangre a partir del peso anoréxica, lo normal y en obesos y se procesa de acuerdo con el procedimiento estándar o rápida. grelina endógena (grelina total y acilo) se evaluó mediante radioinmunoensayo. Antropométricas y comorbilidades / medicación de los grupos de estudio se muestran en las Tablas 3 y 4. Después de un rápido procesamiento la relación de la grelina acilo / desacil en la sangre de los sujetos de peso normal fue de 1: 3 en comparación con 1:23 después del procesamiento estándar de la sangre (p = 0,03; Figura 3A). Resultados similares se observaron bajo anoréxica (1: 3 vs 01:19, p <0,001) y las condiciones obesos (1: 3 vs 1:13; p = 0,04; Figura 3A.). No se observaron diferencias entre los tres grupos diferentes para el procesamiento estándar o rápida (Figura 3A). ANOVA de dos vías se indica un significativo fi influencia del método de procesamiento (F 1,64 = 15,3, p <0,001), mientras que el peso corporal / condición metabólica no tuvo ningún efecto (F 2,64 = 0,5, p = 0,62).

Tabla 3

tp_upload / 53959 / 53959table4.jpg "/>

Los niveles circulantes de Kisspeptina endógenos fueron significativamente mayores tras el rápido en comparación con el procesamiento estándar en anoréxica (+ 60%, p = 0,02) y sujetos de peso normal (+ 99%, p = 0,02), mientras que la diferencia no alcanzó significación en condiciones de obesidad ( 23%, p = 0,39; Figura 3B). No se observaron diferencias significativas entre los tres grupos de IMC diferentes (p> 0,05; Figura 3B). ANOVA de dos vías indicado un signi fi cativo en la influencia del método de procesamiento (F 1,74 = 10,8, p = 0,002), mientras que el peso corporal / condición metabólica no tuvo ningún efecto (F 2,74 = 0,5, p = 0,60).

figura 3 Figura 3: circulante Ratio Acil / desacil grelina y los niveles circulantes de Kisspeptina en diferentes condiciones metabólicas tras RAPID o Standard Sangre de procesamiento de sangre fue retirada de peso anoréxica, normal o sujetos obesos después del ayuno nocturno y se procesa de acuerdo con el procedimiento estándar o el método RAPID.. El sobrenadante se recogió y acilo, así como los niveles totales de grelina o kisspectina niveles (B) evaluado por radioinmunoensayo. Desacil grelina se obtuvo restando acilo de grelina total. La relación se calculó dividiendo acilo por desacil grelina (A). El tamaño del grupo se indica en la parte inferior de las columnas. Los datos se expresan como media ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 y *** p <0,001 vs. procesamiento estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hemos informado anteriormente que el método rápido para el procesamiento de la sangre mejoró la recuperación de 11/12 péptidos en comparación con el procesamiento de sangre estándar en ratas 6. En el presente estudio hemos demostrado que este método también es adecuado para el uso en seres humanos. Después de un rápido procesamiento, la recuperación de 9 de 9 125 péptidos marcados-I probado se mejoró en comparación con el procesamiento de sangre estándar (sangre con EDTA en hielo). La mejora observada osciló entre 19-39%, lo que es probable que sea relevante, especialmente en condiciones en que se esperen únicas diferencias sutiles que pueden ser enmascarados cuando el rendimiento del péptido es baja.

También demostramos que después se detecta RAPID grelina de procesamiento de sangre en la posición correcta después de la elución de HPLC que indica la forma molecular correcto (acil grelina), mientras que después del procesamiento de sangre estándar 2/3 se degradan hasta la desacil grelina. Dado que el grupo acilo es esencial para la unión al receptor de la grelina 28, dSe espera e-acilación para alterar en gran medida la función biológica del péptido. Sin embargo, también desacil grelina se reconoce cada vez más como un péptido biológicamente activo 29. Curiosamente, se sugirió desacil grelina para contrarrestar los efectos de la grelina como se muestra antes de la ingesta de alimentos 30 o la motilidad del colon 31. Esto pone de relieve la importancia de la investigación de la forma molecular correcto.

Al estudiar los niveles endógenos de kisspectina en sujetos de peso normal, hemos demostrado en gran medida el aumento de los niveles (+ 99%), tras el rápido en comparación con el procesamiento de sangre estándar. Sin embargo, no se observó mejoría en las condiciones de la obesidad, que pueden ser debido al aumento de los niveles generales de kisspectina (+ 50% en obesos vs. De peso normal). Entre los grupos de IMC (anorexia nerviosa, peso normal y la obesidad) en la sangre procesadas con, no se observaron diferencias significativas cualquiera de los métodos que puede ser debido al hecho de que sólo los niveles en ayunas were evaluó. Las diferencias podrían ser postprandially aparente, una hipótesis que debe ser investigado en estudios futuros.

Kisspeptina se ha medido antes de los estudios que utilizan sólo tubos de EDTA en hielo 32 (en el presente estudio se refiere a la transformación como estándar) o por la adición de inhibidores de la proteasa 33. Basado en el presente estudio el enfriamiento de los tubos no es suficiente para impedir la degradación del péptido. Si los inhibidores de la acidificación solo o sola proteasa son suficientes para preservar kisspectina debe ser investigado en estudios futuros.

Del mismo modo, el procesamiento de RAPID también aumenta el rendimiento de la grelina acilo endógeno como se indica por un gran aumento de la relación de acilo / desacil grelina (1: 3) en comparación con el procesamiento de sangre estándar (1:23). Este hallazgo muestra buena concordancia con los estudios con roedores, donde se informó de una relación de grelina acilo / desacil de 1: 5 después de un procesamiento rápido antes (en comparación con uno y diecinueve después del procesamiento estándar).Los amplios rangos de la relación de grelina / desacil acilo de 1:15-01:55 34,35 informado antes eran, por tanto, muy probablemente debido a una alta proporción de-acilación dependiente de la grelina desacil. Como se ha descrito anteriormente para kisspectina, no se observaron alteraciones de la relación de la grelina de acilo / desacil bajo diferentes condiciones de alterado crónicamente peso corporal (anorexia nervosa vs. Peso normal vs. Obesidad). Esto también puede ser debido al hecho de que sólo los niveles en ayunas de grelina de acilo / desacil se evaluaron y la regulación postprandial es más importante. Por otro lado, esto también indica que a pesar del peso corporal alterada crónicamente la proporción de acilo y la grelina desacil no se cambia en condiciones basales y puede no jugar un papel importante en los cambios de adaptación observadas en estas condiciones. Sin embargo, los futuros estudios que utilizan protocolos estandarizados de comidas y aplicando el método RAPID ayudarán a responder a esta pregunta más.

El RAPID míDTO utiliza los siguientes componentes: Como las reacciones químicas en su mayoría dependen de la temperatura 36 una reducción de la temperatura utilizando una solución enfriada con hielo ralentiza la degradación del péptido. A continuación, también una disminución en el pH (acidificación) disminuye la velocidad de la degradación 37. Por otra parte, una reducción en el pH disminuye la adsorción de péptidos a otras superficies y por lo tanto también reduce el riesgo de pérdida de péptidos. Los inhibidores de la proteasa utilizados aquí se eligieron con el fin de cubrir un amplio espectro de peptidasas endógenas: (. Por ejemplo catepsina B / H) diprotina A como un inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV, E-64-d como un inhibidor de tiol proteasas, antipaína como un inhibidor de la tripsina, papaína y catepsina a / B, leupeptina como un inhibidor para la tripsina, la plasmina, la papaína y catepsina y quimostatina como un inhibidor de quimotripsina, papaína y catepsina B / G. Por otra parte, los péptidos isotópicos son útiles para evaluar la mejora de la recuperación por el método. Por último, como la tasa of la formación del complejo enzima-sustrato depende de la concentración de la enzima (peptidasa) y el sustrato (hormona peptídica) 38 dilución del plasma reduce la velocidad de formación y por lo tanto la degradación (una dilución de diez veces reduce la tasa de cien veces de acuerdo con la ecuación de Michaelis cinética -Menten).

A pesar de las ventajas del método rápido, varias limitaciones del método deben ser reconocidos también. El paso más crítico del protocolo es el tiempo. Las muestras de sangre deben ser diluidos en el tampón RAPID inmediatamente después de la extracción de sangre que puede ser difícil en la práctica clínica. Por otra parte, el método es más lento, requiere un mayor nivel de formación y también es más caro que el procesamiento de sangre estándar. Aunque puede ser difícil de implementar en la rutina clínica, será útil con fines de investigación, especialmente cuando se espera que sólo diferencias sutiles y por lo tanto un alto rendimiento del péptido es deseable.

Aunque se describe y se recomienda con todos sus componentes el método rápido (temperaturas relucida R, A cidification, P rotease inhibición, que sotopic controles exógenos y D) ilution en el presente trabajo, los estudios futuros pueden usar modificaciones de esta técnica. El uso de controles exógenos isotópicos puede no ser obligatoria y por lo tanto restringido a los estudios piloto con el fin de evaluar qué péptidos muestran la mayor mejora en la recuperación utilizando un procesamiento rápido. Por otra parte, también la composición del cóctel inhibidor de la proteasa puede ser modificado cuando se evalúan otros péptidos. Sin embargo, esto debe ser puesta a prueba cuando se mide un nuevo péptido.

En resumen, el método rápido de procesamiento de sangre se puede utilizar para la sangre humana y mejora en gran medida la recuperación de 9/9 péptidos ensayados en comparación con el procesamiento de sangre estándar. Dado que para algunos péptidos sólo una pequeña a moderada mejora de la recuperación se observó, la necesidaddel método puede tener que ser probado cuando se analiza un nuevo péptido. Además, el método RAPID permite la detección de la forma molecular correcto como se muestra para la grelina acilo y también aumenta considerablemente el rendimiento de los niveles endógenos circulantes de péptidos tales como kisspectina en comparación con el procesamiento de sangre estándar. Por lo tanto, este método debe ser una herramienta útil en estudios en humanos que evalúan los niveles circulantes de péptidos, por ejemplo. los que participan en la regulación del hambre y la saciedad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana para la Investigación STE 1765 / 3-1 (AS) y el Ministerio alemán de Educación e Investigación 03IPT614A (CG). Agradecemos a Reinhard Lommel y Petra Buße por su excelente apoyo técnico, así como Karin Johansson y Christina Hentzschel para obtener ayuda con la organización y la ejecución de las medidas antropométricas

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
SigmaStat 3.1 Systat Software, San Jose, CA, USA online download

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377, (9765), 557-567 (2011).
  2. James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263, (4), 336-352 (2008).
  3. Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14, (6), 480-488 (2012).
  4. Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37, (5), 625-633 (2013).
  5. Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50, (6), 1077-1080 (2004).
  6. Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150, (11), 5113-5118 (2009).
  7. Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31, (9), 1689-1696 (2010).
  8. Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
  9. Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23, (7), e294-e308 (2011).
  10. Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
  11. Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
  12. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306, (3), R164-R174 (2014).
  13. Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93, (3), 165-173 (2011).
  14. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45, (5), 565-576 (2007).
  15. Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22, (5), 253-257 (2011).
  16. De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147, (3), R53-R63 (2014).
  17. Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86, (12), 5992 (2001).
  18. Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11, (3), 419-421 (1957).
  19. Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92, (4), 810-817 (2010).
  20. Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20, (5), 405-410 (2004).
  21. Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
  22. Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282, (16), 1568-1575 (1999).
  23. Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
  24. Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349, (10), 941-948 (2003).
  25. Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42, (3), 329-334 (1988).
  26. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414, (1), 38-46 (2011).
  27. Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28, (4), 299-303 (2008).
  28. Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402, (6762), 656-660 (1999).
  29. Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18, (2), 138-149 (2012).
  30. Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
  31. Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22, (10), 1124-1131 (2011).
  32. Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88, (2), 914-919 (2003).
  33. Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9, (6), 2369-2373 (2015).
  34. Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279, (3), 909-913 (2000).
  35. Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21, (2), 159-161 (2003).
  36. Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34, (2), 107-112 (2001).
  37. Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14, (12), 1685-1690 (1997).
  38. White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics