상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

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Neuroscience

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Summary

이 문서는 혈액 - 뇌 장벽을 통과 선택적 β-주름에 조밀 한 핵심 Aβ 플라크에있는 시트를 결합 메 톡시 X04을 사용하여 알츠하이머 병 마우스 모델에서 아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크를 시각화하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이는 전자 현미경을위한 면역 염색 처리 전에 플라크 - 함유 조직 절편의 예비 스크리닝 할 수있다.

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Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. È. Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J. Vis. Exp. (112), e54060, doi:10.3791/54060 (2016).

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Abstract

상세한 프로토콜은 이전에 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서 뇌 섹션 아밀로이드 Aβ 플라크를 식별하기 위해 여기에서 제공되는 미리 매립 면역 및 조직 처리 (구체적으로는 이온화 된 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (IBA1), 미세 아교 세포에 의해 발현되는 칼슘 결합 단백질) 전자 현미경 (EM). 메 톡시 X04은 고밀도 코어 Aβ 플라크에서 발견 된 β-주름 시트에 바인딩 선택적으로 혈액 - 뇌 장벽을 통과하고 형광 염료입니다. 메 톡시 X04과 동물의 주입 전에 희생 뇌 고정 미리 선별하고 시간 소모적 인 조작으로 추가 처리를 위해 플라크 함유 뇌 구간 선택을 허용한다. 섹션의 작은 분획에 존재하는 거의 플라크를 포함 할 수있는 특정 뇌 영역 또는 층 내의 초기 AD 병리를 연구 할 때 특히 유용하다. 콩고 레드, Thioflavin S, 및 Thiofl와 조직 섹션의 사후 처리AVIN의 T (또는 메 톡시 X04과)는 β-주름 시트 레이블을하지만, 여분의 염료를 제거하기 위해 에탄올 광범위한 청산이 필요하며 이러한 절차는 미세 보존과 호환되지 않습니다 수 있습니다. 또한 단지 올바른 위치에서 Aβ 플라크를 포함하는 작은 부분을 산출하기 위해, Aβ (및 IBA1 같은 다른 세포 마커) 관심있는 지역의 모든 뇌 부분에 대한 표시를 수행하는 비효율적 인 것입니다. 중요한 것은, Aβ 플라크는 전자 현미경으로 검사 할 영역의 정확한 식별 (일반적으로 몇 평방 밀리미터에 이르기까지)을 허용, EM을위한 조직 처리 후에도 볼 수 있습니다.

Introduction

아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크 형성은 알츠하이머 병 (AD)의 주요 신경 병리학 적 특징이다. 그러나 증거가 증가 질병 진행 1,2-에서 면역계의 중요한 역할을 시사한다. 특히, 전임상 및 임상 시험의 새로운 데이터는 AD 병리에 대한 기본 드라이버와 기여 면역 기능 장애를 설립했다. 이러한 연구 결과를 통해, 중추 및 말초 면역 세포는 AD 3으로 유망한 치료 목표를 등장했습니다. 다음 프로토콜은 아밀로이드 베타 플라크 증착 및 AD에서 소교 표현형 변화 사이의 관계에 대한 새로운 통찰력을 생성하는 빛과 전자 현미경 (EM)을 결합한다. 이 프로토콜은 형광 염료 메 톡시 X04의 생체 내 주입에 사용 AD의 마우스 모델에서 Aβ 플라크의 표시를 할 수 있습니다. 메 톡시 X04 쉽게 뇌 실질을 입력 혈액 - 뇌 장벽을 가로 질러 높은 β-와 주름진 시트를 결합 할 수있는 콩고 레드 유도체ffinity. 형광 염료이기 때문에, 두 개의 광자 현미경 4 Aβ 플라크 침착의 생체 내 검출을 위해 사용될 수있다. 일단 Aβ에 결합, 메 톡시 X04은 해리 또는 플라크에서 멀리 재배포, 그것은 시간이 지남에 따라 그 형광을 유지하지 않습니다. 일반적으로 뇌 역학 (5)의 비 침습성 영상화를 허용하는 주변으로 투여된다. 형광도 상관 사후는 Aβ 플라크 (6) 부근의 신경 세포의 죽음에 대한 조사를 포함하여, 분석을 허용 알데히드 고정 다음 남아있다.

Aβ을 나타내는 7 (APP 유전자 Lys670Asn / Met671Leu에서 이중 돌연변이를 coexpressing, 인간의 프레 PS1-A264E 변형 APP-PS1)이 프로토콜은 APP SWE / PS1A 246E 마우스에서 뇌 섹션을 선택 메 톡시 X04의 특성을 활용 특정 관심 영역 (해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare에 플라크) 소교 세포 기관 및 EM과 프로세스를 시각화)가 소교 마커 이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 1 (IBA1에 대한 면역 염색을 임베딩 사전하기 전에. 생쥐는 transcardial 관류를 통해 24 시간 이전에 뇌 고정에 메 톡시 X04 솔루션의 복강 내 주사 주어집니다. 코로나 뇌 섹션은 vibratome를 사용하여 얻을 수있다. 해마 CA1을 포함하는 섹션은 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare에서 Aβ 플라크의 존재에 대한 형광 현미경으로 상영된다. IBA1 면역 염색, 산화 오스뮴 후 고정하고, 플라스틱 수지 매립는 선택된 뇌 구역에서 수행된다. 이 프로토콜의 끝에서, 섹션은 초박 절편 및 미세 시험에 대한 준비가 더 미세 저하없이 보관할 수 있습니다. 중요한 것은, 플라크는 여전히 본 프로토콜로 인스턴스 IBA1를 들어, 다른 항체와 면역 염색 후 형광등된다. 그들은 어두운 t이 될한 산화 오스뮴 후 고정 다음 그 주변 neuropil는 독립적으로 정확하게 몇 평방 밀리미터 일반적으로 아래의 관심 영역을 식별하는 데 도움이 메 톡시 X04 염색의 투과형 전자 현미경으로 검사한다.

이 상호 접근은 미세 수준에서 조사하는 뇌의 특정 부분을 식별 할 수있는 효율적인 방법을 제공한다. 단지 조직 절편의 작은 분획에 존재하는 약간의 Aβ 플라크를 포함 할 수있는 특정 뇌 영역 또는 층 내의 초기 AD 병리를 연구 할 때 특히 유용하다. 특히,이 시간 동안, 단순히 적절한 위치에서 Aβ 플라크를 포함하는 작은 분획을 수득 몇몇 뇌 부분에 (예 IBA1 다른 세포 마커 및 이중 라벨링) Aβ에 대한 면역 염색을 사용하는 것이 비효율적 일 수있다. 메 톡시 X04 라이브 마우스 또한, 사출 희생 및 조직 처리 compromis을하지 않습니다하기 전에미세 구조 보존 전자. 이러한 고정 된 조직 섹션에 콩고 레드, Thioflavin S, Thioflavin T 또는 메 톡시 X04와 사후 염색 등의 다른 방법은 에탄올 염색 차별화, 삼투 스트레스의 원인과 미세 구조를 방해 8-11을 필요로한다. 콩고 레드는 알려진 발암 물질 (12)이다.

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Protocol

참고 : 대학 라발의 동물 관리위원회에 의해 관리로 모든 실험 승인 및 동물 관리 지침에 캐나다 문화원에 부합에서 기관 동물 윤리위원회의 지침에 따라 수행 하였다. 4 세 사이 21개월 APP-PS1 수컷 마우스를 사용 하였다. 음식과 물을 무료로 이용할와 25 °의 C -이 동물은 22에서 12 시간 명암주기에서 보관 하였다.

1. 메 톡시 - X04 솔루션 준비

  1. 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 45 % 프로필렌 글리콜 및 45 % 인산 나트륨 완충 용액 (100 mM의 인산 완충액에서 0.9 % NaCl을 함유하는 용액에 메 톡시 X04 용해 톡시 - X04 (9)의 5 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 , 산도 7.4).
    1. 마이크로 저울을 사용하여 메 톡시 X04 화합물 5 mg의 무게. 흄 후드에서 DMSO에 톡시 - X04 녹이고 투명한 녹색 용액이 얻어 질 때까지 교반한다. 이어서 프로필렌 글리콜 pH를 추가각 추가로 교반하면서 생리 식염수를 버퍼 osphate.
    2. 회 전자의 O / N 4 ° C에서 솔루션을 저어. 황색 녹색 에멀젼을 얻습니다. 용액을 저하없이 두 달 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.

2. 메 톡시 - X04 솔루션 주입

  1. 이전에 24 시간의 관류는 쥐의 무게와 27 ½ G 바늘을 이용하여 체중의 10 ㎎ / ㎏의 투여 량에서 각 마우스에게 메 톡시 X04의 복강 내 주사를 준다.

주입 된 쥐의 3 Transcardial 관류

  1. 관류 하루전, 인산염 완충 식염수 (PBS), 3.5 %의 아크롤레인, 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 (13)의 적절한 양을 준비하고 4 ° CO / N에이를 저장한다.
    참고 :이 솔루션은 관류 모두 면역 조직 화학 사전은-포함에 사용됩니다. 아크롤레인 작업 때 모두 부식성 및 독성이 같은 특수주의연구자 및 환경. 아크롤레인 플라스틱 부식성 때문에 또한 항상 아크롤레인 용액​​을 조제 적합한 유리를 사용한다.
  2. 관류 날, 25 ㎛의 입자 보존 거친 여과지를 사용하여 PFA 및 아크롤레인 필터.
  3. 재관류 동안 25 ㎖ / 분의 유속, PBS 15 ㎖, 아크롤레인 75 mL를 연속적으로 순환 마우스 PFA 150 ㎖을 제공하는 연동 펌프를 사용한다.
    주의하십시오. PFA 아크롤레인의 유해 가스를 피하기 위해 흄 후드 안쪽 엄격 관류를 수행한다.
    1. 펌프를 설정 PBS 용액에 한쪽 끝을 삽입, PBS로 (약 15 ml의 유지) 튜브를 작성하고 다른 쪽 끝으로 25 G 날개 혈액 수집 바늘을 해결합니다. 항상, 튜브 어떤 갇힌 공기 방울이 없는지 확인합니다.
    2. PBS로 채워진 튜브로 관류 펌프를 설정 한 후 아크롤레인 병에 직접 튜브를 놓습니다.
  4. 복강 27 ½ G 바늘을 사용하여 주입 나트륨 펜 토바 비탈의 체중 량의 90 ㎎ / ㎏로 한 번에 하나의 마우스 aesthetize. 꼬리 / 발가락 핀치에 대한 응답을 평가합니다. 마우스는 혐오, 고통스러운 자극에 응답하지 않는 경우에만 진행합니다.
  5. 작업 표면에 앞발과 hindpaws 테이핑으로 (위쪽면과 뒷면에 누워) 앙와위에서 마우스를 안전하고 조심스럽게 다른 장기에 손상을주지 않고 심장​​을 노출. 격막을 천공 한 후 신속하게 작동해야합니다.
    1. 흉곽에 꼬리를 시작 흉부 정중선을 따라 수술 용 가위로 피부를 통해 절개를 수행하고 쇄골에 주동이를 진행합니다.
    2. 복부 흉곽의 기본을 따라 두 개의 추가 횡 절개를합니다. 조심스럽게 이동하고 전체 흉강을 노출해야하고, 피부의 두 날개를 핀.
    3. 흉강을 노출 무딘 집게와 칼 모양의 과정을 잡고 날카로운 가위를 안정에스. 다이어프램과 흉곽을 통해 잘라 폐 천공되지 않도록주의하면서, 그리고 쇄골에 절개 주동이를 계속합니다. 격막을 천공 한 후 신속하게 작동해야합니다.
  6. 부드럽게 무딘 집게와 함께 심장 막 주머니를 찢어. , 무딘 집게로 꾸준한 마음을 잡고 우심방을 절감하고, PBS의 주입을 시작합니다. 즉시 좌심실로 혈액 수집 바늘을 삽입합니다.
  7. 다음 (150 ml의에 해당) 6 분 동안 PFA로 전환 (75 ml의에 해당) 3 분 동안 아크롤레인 다음 PBS와 마우스를 (튜브)에 관류. 튜브에 들어 거품을 방지하기 위해 솔루션을 전환하기 전에 펌프 흐름을 일시 중지해야합니다.
  8. 마우스를 목을 벨과 고정 뇌를 추출하고 4 ° C에서 적어도 2 시간 동안 4 % PFA를 포함하는 유리 병에 직접 배치합니다.
    1. 뇌를 추출하려면, 두개골을 노출 피부를 통해 절단 가위와 핀셋을 사용합니다. 조심스럽게 두개골 연산 휴식눈 사이에 엉, 그것의 작은 조각을 칩은 기본 뇌를 노출합니다.
    2. 조심스럽게 vibratome 절편에 대한 진행하기 전에 추가로 2 시간 동안 4 % PFA로 노출 된 뇌 및 사후 수정을 제거합니다.

Vibratome를 사용하여 4. 뇌 단면

  1. 냉장 PBS로 고정 된 뇌를 3 회 반복한다. 예리한 면도날을 사용하여 (이 영역은 조사가 아닌 경우) 후각 망울을 제거하고 (2)에 횡 뇌 컷 - 절차를 가속화하기 위해 동시에 절단 할 수 모두 거의 동일한 높이의 3 개.
  2. 수직 트레이에 고정 된 표본 판에 뇌 조직의 조각을 접착제. 매끄러운 절단면이 시편 판에 단단히 스틱과 절편 과정에서 빠질되지 않습니다 있는지 확인하십시오. 전체 뇌 표면이 완전히 침수 될 때까지 트레이에 충분한 PBS 솔루션을 추가합니다. 일을 유지하는 것이 중요합니다전자 뇌 조각과 다음 섹션은 완전히이 단계를 통해 PBS에 몰입.
  3. 상기 vibratome에 트레이를 배치 0.5 mm / 초, 90 Hz의 주파수의 단면, 50 μm의 두께 부분을 수득하기 위해 50 μm의 공급 두께로 절편 속도를 조절한다. 그런 미세한 붓을 사용하여 동결 방지제 용액 (40 % PBS, 30 % 에틸렌 글리콜, 30 % 글리세롤)를 함유하는 20 mL 유리 바이알에 섹션을 옮긴다. 더 사용할 때까지 -20 ° C에서 튜브를 저장합니다. 다음 단계에 설명 된대로 또는 즉시 검사를 위해 PBS에 섹션을 유지합니다.

메 톡시-X04-스테인드 플라크의 존재에 대한 5 절 심사

  1. 정위 마우스 뇌의 지원은 예를 들면 관심 영역을 포함하는 (14) 선택 뇌 부분, 본 실시 예에서 사용 된 해마 CA1 Atlas에서와. 충분히 동결 방지제 용액을 함유하는 24 웰 배양 플레이트 내의 웰에 각 부를 배치수 있도록하는 것은 마르지 섹션을 방지합니다.
  2. , 섹션을 건조 다음 절차를 사용하지 않도록 연속적으로 각 섹션을 검사 :
    1. 일회용 피펫과 현미경 슬라이드에 PBS의 방울을 추가하고 방울 섹션을 배치합니다.
    2. 메 톡시 X04 표지 Aβ 플라크를 포함하는 영역을 식별하기 위해 형광 현미경 섹션을 검사합니다.
      주 : 메 톡시 X04 쉽게 형광 자외선 (UV) 필터 (여기 340-380 나노 미터)을 이용하여 가시화 될 수있다.
  3. 구조적 영역에 직접 플라크의 존재를 연관시키기 위해 각 이미지는 두 필드의 동일한 영역을 표시해야하기 때문에, 현미경 스테이지를 이동하지 않고 시야 관심 (ROI)의 영역의 이미지뿐만 아니라 형광 모드에서 캡처 조직 섹션.
  4. 저장하고 동물의 수에 따라 촬영 한 이미지의 이름을 지정합니다. 또한 플레이트의 웰 번호와 사진의 분야 TA 기록시야. 예를 들어, 예 : 9978A1B; 동물 번호 : 9978; 그럼 번호 : A1; 이 필드 : 밝은. 이미징이 완료되면 다시 잘 지정에 섹션을 놓습니다.
    참고 : 결국, 조사 각 섹션에 대해,이 사진은 밝은 분야에서 하나 UV 분야에서 서로를 얻을 수있다.
  5. 웰의 수에 따라 이미지 J 동일한 ROI의 두 이미지 (시야에서 하나 UV 필드에서 다른)를 열고 MosaicJ 플러그인을 사용하여 상기 두 이미지의 에지를 정렬 및 정렬과 함께 이미지를 저장 그것을 온.
  6. 특정 동물의 수에 따라 별도의 폴더에 사진을 저장합니다. 식별 조직 절편에서 플라크 지역화, 두 가지 필드 (밝고 UV)의 전체 부분의 전체 뷰를 가지고 이미지를 결합한다.
  7. 스크리닝 처리 종료 후 면역 또는 추가 처리는 CA가 될 때까지 동결 방지제를 함유하는 24 웰 배양 플레이트에서 -20 ° C에서 조사 된 부분을 저장할아웃 rried.

6. IBA1에 대한 면역 염색을 중고-포함

참고 : RT에서 천천히 이동 로커에있는 플레이트에 배치하여 선택 자유롭게 부동 섹션에 IBA1에 대한 면역 염색을 수행합니다.

  1. 철저 약 1 ml의 PBS, 10 분 동안 지속되는 각각의 세척과 섹션 3 회 씻는다.
  2. 10 분 동안 PBS 용액에 0.3 % 과산화수소 내인성 퍼 옥시다아제 담금질. 이 단계는 백그라운드 염색을 방지하기 위해 중요하다 비특이적 퍼 옥시 다제 활성을 방지한다.
  3. 10 분 각각에 대해 PBS에 3 번 조직을 씻으십시오.
  4. 30 분 동안 PBS 용액에 0.1 % 소듐 보로 하이드 라이드의 섹션을 인큐베이션. 이 단계는 정착 단계에서 남아있는 알데히드를 줄이는 것이 중요하며, 아크롤레인 조직 정착에 사용되는 경우 특히 중요하다.
  5. 10 분마다 시간 동안 PBS 3 회에서 조직을 씻고 모든 거품을 제거해야합니다.
  6. 1 시간 동안 절을 차단합니다.다른 항체는 서로 다른 차단 시간 및 솔루션을 필요로 할 수있다. (; pH 7.4의 TBS) IBA1를 들어, 10 % 소 태아 혈청, 3 % 소 혈청 알부민 및 0.01 % 트리톤 X-100의 50 mM 트리스 - 완충 식염수를 함유하는 블록킹 완충액 제조​​.
    주 : 차단 단계는 상기 일차 항체의 비특이적 결합을 방지하기위한 것이다. 트리톤 X-100의 낮은 농도는 더 나은 염색 막 약간의 permeabilization을 허용하고, EM에서 조직의 대부분의 미세 기능을 보존 할 정도로 낮다.
  7. 4 ° CO / N에서 : 조직에서 차단 버퍼를 제거하고 차 항체 용액에 부화 (차단 버퍼 [1000 1] 희석 토끼 항 IBA1).
  8. 10 분 때마다 TBS에서 3 회 반복한다.
  9. 90 분 동안 0.05 M TBS에서 : 이차 항체 (비오틴에 접합 된 염소 항 - 토끼) [200 일]을 품어.
  10. 5 분마다 시간을 TBS에 5 회 반복한다.
  11. TBS에 아비딘 - 비오틴 복합체 용액 (: [100 (1), 아비딘 비오틴 [100 (1)]) 부화1 시간 동안 솔루션입니다.
  12. 5 분마다 시간을 TBS에 5 회 반복한다.
  13. 0.05 %의 디아 미노 벤지딘 (DAB), 8 분 동안 TBS 0.015 % 과산화수소와 IBA1 염색을 보여준다.
    주 : DAB 개발 타이밍 프로토콜 프로토콜에 따라 다를 수 있고 신속하게 광학 현미경 하에서 염색 된 부분을 검사하여 결정되어야한다.
    참고 : IBA1를 들어, 하나는 (대표 예를 들어 그림 2 참조) 분명 20 배에 IBA1 묻은 미세 아교 세포의 세포 기관과 프로세스를 시각화 할 수 있어야한다. 이 알려진 발암 물질로, DAB를 사용하여주의하십시오.
  14. 위에서 설명한대로 조심스럽게이 단계에서 섹션을 모니터링하여 이상 현상 마십시오. 5 분마다 시간 동안 냉장 PB 5 번 섹션을 세척하여 반응을 중지합니다.

전자 현미경 7. 처리

  1. 유리 병에 PBS에 1 % 산화 오스뮴 솔루션을 준비합니다. 사 산화 오스뮴은 감광성이고; g을 커버알루미늄 호일 아가씨 유리 병은 빛의 솔루션을 보호 할 수 있습니다.
    그것은 매우 위험한 화학 물질로 산화 오스뮴을 사용하여주의하십시오. 이것과 흄 후드 내에서 다음 단계를 수행하십시오.
  2. 섹션에서 PBS를 제거하고 평판 좋은 붓을 사용하여 확산. 마르지 섹션을 유지하기 위해 한 번에이 단계를 잘 하나를 수행합니다. 즉시 섹션에있는 주름을 영구적으로 될 것 같은, 산화 오스뮴을 추가 만 섹션을 깰 것이다 조직 포스트 오스뮴 고정을 평평하게하기 전에 부분을 평평하게해야합니다.
  3. 겹치지 섹션을 방지하기 위해 전달 피펫 동시에 산화 오스뮴 한 방울을 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 산화 오스뮴의 섹션을 담근다. 빛의 섹션을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 잘 커버.
    참고 :이 단계는 섹션 내에서 지질를 해결합니다. 조직은 오스뮴 후 고정 후 매우 어두운 표시됩니다.
  4. 섹션 오스뮴 테트에있는 동안xide은 20 g의 성분 A를 혼합하여 일회용 비이커에 플라스틱 수지를 제조 20 g 성분 B, 0.6 g 성분 C 0.4 g 성분 D. 상기 순서로 성분들을 함께 결합하고 또한 10 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 혼합 까지 균일 한 색이 얻어진다.
  5. 알루미늄 무게 요리로 준비된 혼합물을 전송합니다. 그들은 탈수 한 후 그들은 조직 절편을 받게됩니다.
  6. 35 %, 35 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %, 100 % 다음의 순서로 2 분 동안 에탄올 농도 증가의 섹션 탈수.
  7. 2 분 때마다 3 회, 잔류 에탄올을 제거 프로필렌 옥사이드의 섹션을 빠져들게합니다. 20 ㎖ 유리 병에 24 웰 배양 판에서 탈수 섹션을 제거합니다. 항상 플라스틱을 용해로 프로필렌 옥사이드로 작업 할 때 유리 병을 사용하고 유해 한,주의를 유지한다.
  8. 프로필렌 옥사이드 soluti에서 섹션을 전송하는 구부러진 유리 피펫 팁 또는 벌금 붓을 사용하여수지에과에하면 RT에 침투하기위한 O / N 두십시오. 프로필렌 옥사이드와 수지를 희석하지 않도록주의하십시오.
  9. 폴리 클로로 트리 플루오로 에틸렌 (PCTFE) filmsheets의 수지 부분을 포함 :
    1. PCTFE의 filmsheets에 섹션을 삽입하기 전에 15 분 - 10 60 ° C 오븐 - 50로 표본을 포함하는 알루미늄 무게 요리를 놓습니다.
    2. 섹션을 포함하는 경우, 하나의 알루미늄 한 번에 요리 무게와 함께 작동합니다. 미세 붓을 사용하여, 하나의 PCT​​FE 필름 시트 상 수지 박막 페인트.
    3. PCTFE 필름 시트에 접시 무게 알루미늄에서 한 번에 조직의 한 부분으로 이동합니다. 그것을 방해하지 않도록주의, 조직 주위에서 초과 수지를 제거합니다.
    4. PCTFE 필름 시트 접시 무게 하나에서 모든 섹션을 이동 한 후, 조직의 샌드위치를​​ 만드는 첫 번째 통해 두 번째 PCTFE 시트를 배치하고 2 시트 사이에 수지.
  10. (5)에서 3 일 동안 항온 수지를 중합5-60 °의 C.
  11. 소재는 지금 초박막 절편과 미세 검사, 자주 EM 핵심 시설에 의해 수행되는 전문 기술에 대한 준비가되어 있습니다. 미세 저하없이 실온에서 안전하게 PCTFE 필름 시트 사이의 샘플을 저장합니다.
    참고 초박 절편 및 전송 전자 현미경 검사를위한 후속 단계는 별도의 프로토콜 (13)에 설명되어있다.

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Representative Results

이 섹션은 프로토콜의 다른 중요한 단계에서 획득 할 수있는 결과를 나타낸다. 해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare : 특히 결과는 뇌 메 톡시 X04 스테인드 특정 지역에 플라크와 관심 층을 포함하는 섹션의 예를 보여줍니다. 플라크 및 해마의 라멜라 / 지방 조직은 연속 UV 밝은 필드 필터 (도 1)의 조합을 사용하여 가시화된다. 선택된 뇌 섹션 이후 면역 염색 및 Aβ 플라크의 트랙을 유지하면서 그들은 여전히 형광 다음 면역 염색 것을 고려, EM에 대한 처리 및 산화 오스뮴 및 포함 (그림 1) 치료 다음과 주변 neuropil보다 어둡게 될 수 있습니다. 이것은 로카에 기초하여, 전자 현미경으로 검사 한 영역을 (일반적으로 몇 밀리미터 제곱)를 식별 할 수 있도록플라크의 기. 또한, IBA1와 미세 아교 세포의 사전 내장 면역 염색을위한 개선 된 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 뇌 섹션 내의 뛰어난 소교 세포 기관, 크고 작은 처리 (도 2)의 시각화뿐만 아니라 항체의 침투를 산출한다. 따라서 그것은 미세 구조 레벨에서 소교 세포 기관 및 프로세스의 식별 및 Aβ 플라크 (도 3 및도 4)과의 상호 작용의 연구를 용이하게한다.

그림 1
그림 형광 염료 메 톡시 X04. AB의 전신 주입 후 광학 현미경을 사용하여 21 개월 APP-PS1 마우스에 Aβ 플라크 1. 시각화) 밝은 필드 및 형광 모드를 사용하여 하나의 해마 부분의 이중 영상. 지역 및 관심 층이 밝은 분야에서 시각화380 nm의 (B) - (A), 및 Aβ 플라크 순차 (340)의 범위에서의 UV 필터를 이용하여 지역화. CD) 이중 전에 다른 해마 단면 영상 (C) 후에는 (D)을 에탄올 산화 오스뮴, 탈수 후 고정이어서 IBA1 면역 염색 전 매립하고, 투과형 전자 현미경에 필요한 플라스틱 수지 내에 매립. 주목해야한다, (점선으로 둘러싸인) 플라크는 전자 현미경을위한 조직 처리에 따라 여전히 볼 수 있습니다. 조직 블록을 트리밍 할 때 플라크를 시각화하는 것은 높은 공간 해상도에서 이미지 영역의 정확한 선택을 할 수 있습니다. 스케일 바 = A와 B 300 μm의, C 및 D 150 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 바이올렛 빛 미세한 수준에서 IBA1 염색에 의해 21 개월 APP-PS1 마우스에서 미세 아교 세포 몸과 미세 공정의 sualization. 산화 오스뮴 포스트 고정 및 플라스틱 수지 삽입하기 전에 관찰 점선으로 둘러싸인)가 메 톡시 X04의 상호 형광 이미징에 의해 식별 Aβ 플라크 (과 연결할 때 IBA1 묻은 미세 아교 세포의 AB) 예를 들면 클러스터 분포를 나타내는. 산화 오스뮴 후 고정 및 플라스틱 수지 삽입 후 Aβ 플라크와 관련된 IBA1 묻은 미세 아교 세포의 CD) 예. 플라크 따라서 자신의 위치 추적을 허용, 오스뮴 후 고정 다음 자신의 주변 neuropil보다 어두운 될 수 있습니다. 스케일 바 = 250 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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이영 신경 돌기 그림 3. 듀얼 Aβ 플라크와 IBA1이-면역 염색 미세 구조 수준. A) 컴팩트 섬유 성 구조를 인식 고밀도 코어 Aβ 플라크의 예에서 6 개월 APP-PS1 마우스에서 (삽입을 참조 시각화) 및 협회 자식 작용의 미세 기능. B IBA1 묻은 소교 과정 (m의) 예, 바이올렛 색깔은) 근처 아밀로이드 예금을 포함하는 Aβ 플라크를 발견했다. (별표로 표시됨) 미토콘드리아 변화는 소교 프로세스 내에서 볼 수있다. 주목해야한다,이 사진은 항체 염색 강도의 침투가 최대이다 (그림의 오른쪽에, 흰색) 조직 수지 경계에 인수되었다. 스케일 바 = 2 A에 대한 μm의 1 μm의 B. 위해 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


조직 - 수지 국경에서 멀리 취득 IBA1 묻은 미세 아교 세포의 몸과 프로세스 (m)의 투과 전자 현미경. AD) 예 관찰로 6 개월 APP-PS1 마우스에 IBA1 - 면역 염색 미세 아교 세포의 그림 4. 추가 예 상기 항체의 우수한 침투력을 도시하고이 프로토콜을 이용하여 부 내의 깊은 염색 강도. BV = 혈관, D = 수지상에서 = 포함, S = 수지상 척추, t는 축삭 터미널을 =. 화살촉은 시냅스 갈라진 틈을 보여줍니다. 스케일 바 = 1 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜은 EM과 고밀도 코어 Aβ 플라크를 대상에 대한 상호 접근 방법을 설명합니다. 생체 내 주입에 톡시 - X04은 예를 들어, 해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare을 Aβ의 특정 지역 내 플라크와 관심의 층을 포함하는 뇌 부분을 신속하게 선택할 수 있습니다. 본 예에서, 메 톡시 X04 사전 심사는 소교 표현형은 고밀도 코어 Aβ 플라크의 존재 하에서 미세 수준에서 시냅스와 상호 작용하는 방법을 다른 연구 IBA1에 대한 면역 염색 미리 내장과 결합되었다.

미세 아교 세포는 주위에 엄청나게 반응이 염증 활성 및 긴 정상적인 뇌 기능 저해와 AD의 발전을 개선의 맥락에서 검토되고있다. 특히, 이들 세포는 CHR 선도, 그들의 광범위한 활성화 및 염증성 사이토 카인의 방출에 신경 변성 과정에 연루되었다onic 신경 염증, 정상 뇌의 중단은 15 항상성. 최근에는, 그러나, 이들 상주 면역 세포는 활발히 새로운 병원성 메카니즘 (16, 17)의 식별에 이르는, 건강한 뇌의 신경 회로를 개조 나타냈다. 시냅스에서 이들의 생리 학적 역할은 악화 된 시냅스 손실, 다양한 신경 퇴행성 조건 (18, 19)를 통해인지 기능 저하의 현재 최선의 병리학 적 상관 관계의 결과로, AD에 신경 염증 동안 조절 이상 될 수 있습니다.

이전 미리 매립 IBA1 염색법 (13)에 만들어진 변형 이제 미세 수준에서보다 뇌 부분에 걸쳐 항체의 침투뿐만 아니라 소교 세포 기관 미세 프로세스의 시각화를 허용한다. 전반적으로, 프로토콜은 미세 열화를 고려하여 상기 조직 절편의 플라스틱 수지 매립 할 때까지 마우스 관류에서 엄격하게 수행 될 필요어느 사이에 단계에서 발생하는 세포막, 세포 소기관, 세포 골격 요소의 무결성을 손상시킬 수 있습니다.

이 프로토콜은 전적으로 고밀도 코어 Aβ 플라크를 시각화 (섹션 6을 생략하여) 모든 면역 염색없이 수행 될 수 있지만, 그것은 또한 다른 항체가 이용 될 수 있으므로, Aβ 증착과 관련하여 AD의 발병 기전의 복잡한 메커니즘을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다 둘레 유래 대 식세포, 내인성 미세 아교 세포, 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 및 전구 세포,뿐만 아니라 많은 신경 서브 타입 등 다양한 종류의 세포에 집중한다.

메 톡시 X04의 생체 내 주입을 고려할 때,이 프로토콜은 사후 인간의 두뇌 샘플의 사용을 배제하는 고정 된 뇌 부분을 수행 할 수 없습니다. 또한, 반대로 수용성 및 불용성 Aβ의 형태, 바인딩 염료의 사용 레이블 Aβ에 대한 면역 염색에 β를-주름의메 톡시-X04과 같은 heet 단백질 구조는 다른 제한을 구성 조밀 한 핵심 플라크의 시각화 할 수 있습니다.

그럼에도 불구하고, 중요한 응용 프로그램은 중복 및 활동을 확대하고, AD 병리의 과정을 통해 플라크 항상성 및 신경 기능에 직접적인 영향을 미칠 수있는 미세 아교 세포 등 다양한 세포 유형의 역할을 연구 포함 할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methoxy-X04 Tocris Bioscience 4920 10 mg substrate per tablet
Propylene glycol Sigma Aldrich W294004 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-1 Caution: toxic
Sodium Chloride NaCl Sigma S9625
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876
Tris Hydrochloride Fisher BioReagents BP153500
Acrolein Sigma 110221 Caution: Toxic
Paraformaldehyde Granular Electron Microscopy Sciences 19210 Caution: Toxic
Filter paper Fisher 09-790-14F
Peristaltic Pump with Tubing ColeParmer cp.78023-00
Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G Becton Dickinson 367341
Extrafine Forceps F.S.T 11152-10 Tip shape: curved
Scissors F.S.T 14090-09 Tip shape: straight
Hartman Hemostats F.S.T 13003-10 Tip shape: curved
Surgical Scissors F.S.T 14004-16 Tip shape: straight
Micro Dissecting Scissors ROBOZ surgical store 5818
Glass scintillation vials Fisher Scientific 74515-20
Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S Leica Biosystems  14047235612
Vibratome blades Electron microscopy Sciences 71990
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
24-well Tissue Culture Plates Fisher Scientific 353047
Ethylene Glycol Fisher BioReagents BP230-4
Glycerol Fisher BioReagents BP229-4
Hydrogen Peroxide, 30% J.T.BAKER cat: 2186-01
Sodium borohydride Sigma 480886
Tris HCl Fisher BP153-500ML
Fetal bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F1051
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Thomas Scientific C001H24
Triton X-100 Sigma T8787
Anti IBA1, Rabbit  WAKO 019-19741
Goat Anti-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch 111066046
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) Vector Labs PK-6100
3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) Sigma D5905-50TAB Caution: toxic
Osmium tetroxide, 4% solution Electron Microscopy Sciences 19150 Caution: toxic
Durcupan™ ACM single component A Sigma 44611 Resin Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component B Sigma 44612 Hardener Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component C Sigma 44613 Plasticizer Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component D Sigma 44614 Accelerator Caution: Toxic
Ethanol LesAlcoolsdeComerce 151-01-15N
Propylene oxide Sigma 110205 Caution: corrosive
Aluminum weigh dishes Electron Microscopy Sciences 70048-01
ACLAR®–Fluoropolymer Films Electron Microscopy Sciences 50425
Oven/Incubator VWR

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References

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