Correlativa Luz e Microscopia Eletrônica para estudar interações Microglial com placas de beta-amilóide

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Neuroscience

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Summary

Este artigo descreve um protocolo para a visualização de placas amilóides de Ap em modelos de rato da doença de Alzheimer utilizando metoxi-X04, que atravessa a barreira sangue-cérebro e selectivamente se liga a p-pregueadas folhas encontradas no núcleo denso placas de Ap. Ele permite pré-triagem de secções de tecido contendo placas antes de imunocoloração e processamento para microscopia eletrônica.

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Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. È. Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J. Vis. Exp. (112), e54060, doi:10.3791/54060 (2016).

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Abstract

Um protocolo detalhado é fornecido aqui para identificar placas amilóides de Ap em secções do cérebro a partir de modelos de rato da doença de Alzheimer antes de pré-incorporação de imunocoloração (especificamente para ionizado molécula de ligação ao cálcio do adaptador 1 (IBA1), uma proteína de ligação de cálcio expresso pela microglia) e processamento do tecido para microscopia eletrônica (EM). Metoxi-X04 é um corante fluorescente que atravessa a barreira sangue-cérebro e selectivamente se liga a folhas p pregueada encontradas no núcleo denso placas de Ap. Injeção dos animais com metoxi-X04 antes do sacrifício e fixação do cérebro permite pré-triagem e seleção das seções do cérebro contendo placas para posterior processamento com manipulações demorados. Isto é particularmente útil quando se estuda patologia AD início dentro de regiões específicas do cérebro ou camadas que podem conter muito poucas placas, presentes em apenas uma pequena fração das seções. processamento pós-mortem de secções de tecido com Vermelho do Congo, Tioflavina S e Thioflavin T (ou mesmo com metoxi-X04) pode rotular folhas beta-pregueada, mas requer extensa clareira com etanol para remover o excesso de corante e esses procedimentos são incompatíveis com a preservação ultra-estrutural. Além disso, seria ineficiente para realizar etiquetagem para Ap (e outros marcadores celulares, tais como IBA1) em todas as secções do cérebro a partir das regiões de interesse, apenas para se obter uma fracção contendo pequenas placas de Ap no local certo. Importante, placas de Ap ainda são visíveis após o processamento do tecido para a EM, permitindo uma identificação precisa das áreas (geralmente para baixo a alguns milímetros quadrados) para examinar ao microscópio eletrônico.

Introduction

Ap a formação de placa amilóide é a principal característica neuropatológica da doença de Alzheimer (AD). No entanto evidência crescente sugere funções importantes do sistema imunitário em 1,2 a progressão da doença. Em particular, os novos dados de estudos pré-clínicos e clínicos estabelecidos disfunção imunológica como piloto principal e contribuinte para a patologia. Com estes resultados, as células imunes centrais e periféricas surgiram como alvos terapêuticos promissores para 3 AD. O protocolo a seguir combina microscopia óptica e eletrônica (EM) para gerar novos insights sobre a relação entre a deposição de placas de Ap e alterações fenotípicas microgliais em AD. Este protocolo permite a rotulagem de placas de Ap em modelos do rato de AD usando na injeção vivo do corante fluorescente metoxi-X04. Metoxi-X04 é um derivado de Vermelho do Congo que pode facilmente atravessar a barreira sangue-cérebro para entrar no parênquima cerebral e ligar folhas β-pregueadas com um elevadoffinity. Uma vez que o corante fluorescente é, ele pode ser utilizado para a detecção in vivo de deposição de placas de Ap com microscopia de dois fotões 4. Uma vez ligado ao Aâ, metoxi-X04 não se dissociam ou redistribuir longe de placas, e que mantém a sua fluorescência ao longo do tempo. É geralmente administrada perifericamente para permitir a imagem não invasiva de dinâmica cerebral 5. A fluorescência também permanece seguinte fixação aldeído, permitindo análises correlativa post-mortem, incluindo a investigação de morte neuronal na vizinhança de Ap placas 6.

Este protocolo tira proveito das propriedades de metoxi-X04 para selecionar seções do cérebro de APP SWE / PS1A 246e ratos (APP-PS1; coexpress� uma mutação dupla na gene APP Lys670Asn / Met671Leu, ea variante presenilina PS1-A264E humana) 7, que exibem Ap placas em regiões específicas de interesse (CA1 do hipocampo, radiatum estratos, e lacunosum-moleculare) Antes da pré-incorporação de imunocoloração com o marcador de microglia ionizado molécula de adaptador se liga a cálcio 1 (IBA1) para visualizar os corpos celulares microgliais e processos com EM. Os ratinhos são dadas injecção intraperitoneal de solução de metoxi-X04, 24 horas antes da fixação do cérebro através de perfusão transcardial. secções cerebrais coronais são obtidos utilizando um vibratome. As secções que contêm a CA1 do hipocampo são rastreadas sob um microscópio fluorescente para a presença de placas de Ap em estratos radiatum e lacunosum-moleculare. Imunocoloração para IBA1, tetróxido de ósmio pós-fixação e inclusão em resina plástica são, então, realizada nas seções selecionadas do cérebro. No final deste protocolo, as seções podem ser arquivados sem mais degradação ultra-estrutural, pronto para corte ultrafinos e exame ultra-estrutural. Importante, as placas ainda são fluorescentes após imunocoloração com anticorpos diferentes, por exemplo IBA1 como no presente protocolo. Eles se tornam mais escuras than sua neurópilo envolvente seguinte tetróxido de ósmio pós-fixação, independentemente da coloração metoxi-X04, que ajuda a identificar com precisão as regiões de interesse, geralmente para baixo a alguns milímetros quadrados, a ser examinado com o microscópio eletrônico de transmissão.

Esta abordagem correlativa oferece uma maneira eficiente para identificar as secções específicas do cérebro para examinar a nível ultra-estrutural. Isto é particularmente útil quando se estuda patologia AD cedo, dentro das regiões ou camadas específicas do cérebro que só pode conter algumas placas de Ap, presentes em apenas uma pequena fração dos cortes de tecido. Durante estes tempos em especial, seria ineficiente para usar imunocoloração para Ap (e etiquetagem dupla para outros marcadores celulares, tais como IBA1) em várias secções do cérebro simplesmente para se obter uma pequena fracção que contém placas de Ap no local certo. Além disso, a injecção de ratos ao vivo com metoxi-X04 antes do sacrifício e processamento de tecidos não compromisE é a preservação ultra-estrutural. Métodos alternativos, tais como coloração post mortem com vermelho do Congo, Tioflavina S, tioflavina T ou metoxi-X04 em secções de tecido fixadas requerem diferenciação coloração em etanol, o que faz com 8-11 stress osmótico e interrompe a ultra-estrutura. Vermelho do Congo é também um conhecido cancerígeno humano 12.

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Protocol

Nota: Todos os experimentos foram aprovados e realizados sob as orientações do comitê de ética animal Institucional, em conformidade com a Canadian Council on Animal Care diretrizes administrado pelo Comitê de Cuidados Animais da Université Laval. Foram utilizados ratos macho APP-PS1 entre 4 e 21 meses de idade. Estes animais foram alojados sob um ciclo de luz-escuro de 12 h a 22-25 ° C, com livre acesso a comida e água.

1. Metoxi-X04 Preparação de Soluções

  1. Prepara-se uma solução de 5 mg / ml de metoxi-X04 9 dissolvendo metoxi-X04 em uma solução contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), 45% de propileno glicol e 45% de fosfato de sódio salino (NaCl a 0,9% em tampão de fosfato 100 mM , pH 7,4).
    1. Usando uma microbalança, Pesar 5 mg do composto metoxi-X04. De acordo com um exaustor, dissolve-se o metoxi-X04 em DMSO e agita-se até se obter uma solução esverdeada clara. Sucessivamente adicionar propilenoglicol e pHosphate tampão de solução salina com agitação após cada adição.
    2. Agita-se a solução a 4 ° C num rotor O / N. Obter uma emulsão verde amarelado. A solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até dois meses, sem degradação.

2. Metoxi-X04 Injecção Solução

  1. 24 h antes da perfusão, pesar os ratinhos e atribuir a cada ratinho uma injecção intraperitoneal de metoxi-X04 a uma dose de 10 mg / kg de peso do corpo, utilizando uma agulha de 27 G ½.

3. transcardial Perfusão do camundongos injetados

  1. No dia antes da perfusão, preparar volumes apropriados de tampão fosfato salino (PBS), 3,5% de acroleína, e soluções de 4% de paraformaldeído (PFA) 13 e armazená-las a 4 ° CO / N.
    Nota: Estas soluções serão utilizadas tanto para a perfusão e a incorporação de pré-imuno-histoquímica. Tome especial cuidado quando se trabalha com acroleína, como é corrosivo e tóxico para ambospesquisadores e meio ambiente. Além disso, uma vez que a acroleína é corrosivo para o plástico, sempre utilizar material de vidro adequado para preparar soluções de acroleína.
  2. No dia da perfusão, filtrar o PFA e acroleína, utilizando papel de filtro vulgar de retenção de partículas de 25 um.
  3. Durante a perfusão, utilizar uma bomba peristáltica para fornecer 15 ml de PBS, 75 ml de acroleína, e 150 mL de PFA, sucessivamente, para a circulação do rato, a uma taxa de fluxo de 25 ml / min.
    Tenha cuidado. Realização de perfusão estritamente dentro de um exaustor para evitar fumos nocivos da PFA e acroleína.
    1. Para configurar a bomba, insira uma extremidade na solução PBS, encher o tubo (segurando cerca de 15 ml) com PBS e fixar um alado agulha de recolha de sangue 25 G para a outra extremidade. Em todos os momentos, garantir que a tubulação está livre de quaisquer bolhas de ar aprisionadas.
    2. Colocar o tubo directamente na garrafa de acroleína após ajustar a bomba de perfusão com o tubo cheio com PBS.
  4. Aaesthetize um rato de cada vez com 90 mg / kg de peso corporal dose de pentobarbital de sódio injectado intraperitonealmente utilizando uma agulha de 27 G ½. Avaliar as respostas para pitadas cauda / tep. Prossiga apenas se o rato não responde a tais aversivas, estímulos dolorosos.
  5. Garantir o mouse na posição supina (deitada de costas, com o rosto para cima) gravando as patas dianteiras e patas posteriores à superfície de trabalho e expor cuidadosamente o coração, sem causar danos a outros órgãos. Certifique-se de trabalhar rapidamente após a perfuração do diafragma.
    1. Realizar uma incisão através da pele com uma tesoura cirúrgica ao longo da linha média torácica começando caudal para a caixa torácica e proceder rostral à clavícula.
    2. Faça duas incisões laterais adicionais ao longo da base da caixa torácica ventral. Suavemente mover e fixar as duas abas de pele, certificando-se de expor toda a cavidade torácica.
    3. Segure o apêndice xifóide com uma pinça sem corte para expor a cavidade torácica e estabilize a tesoura pointeds. Corte através do diafragma e da caixa torácica, tomando cuidado para evitar atingir os pulmões, e continuar a rostral incisão para as clavículas. Certifique-se de trabalhar rapidamente após a perfuração do diafragma.
  6. Gentilmente rasgar o saco pericárdio com uma pinça sem corte. Segure o coração estável com uma pinça sem corte, corte o átrio direito, e começar a infusão de PBS. Imediatamente insira a agulha de recolha de sangue para o ventrículo esquerdo.
  7. Perfundir o rato com PBS (no tubo) seguido de acroleína durante 3 min (correspondendo a 75 ml), em seguida mudar para PFA durante 6 min (correspondendo a 150 ml). Certifique-se de fazer uma pausa no fluxo da bomba antes da solução de comutação para evitar bolhas de entrar no tubo.
  8. Decapitar o rato e extrair o cérebro fixo e colocá-la directamente para um frasco de vidro contendo PFA a 4% durante pelo menos 2 horas a 4 ° C.
    1. Para extrair o cérebro, utilizar tesouras e pinças para cortar através da pele para expor o crânio. Cuidadosamente quebrar o op crânioPT entre os olhos, e chip fora pequenos pedaços do mesmo para expor o cérebro subjacente.
    2. Retire cuidadosamente o cérebro e pós expostos corrigi-lo com PFA 4% para mais 2 horas antes de prosseguir para vibratome seccionamento.

4. Seccionamento cérebro usando um Vibratome

  1. Lavar o cérebro fixo 3 vezes com PBS arrefecido. Usando uma lâmina de barbear afiada, remover o bolbo olfactivo (a menos que esta região está sob investigação) e cortar transversalmente o cérebro em 2 - 3 pedaços de aproximadamente a mesma altura, todos os quais podem ser seccionados em simultâneo, a fim de acelerar o processo.
  2. Cole as peças de tecido cerebral verticalmente sobre a placa de amostra fixada na bandeja. Certifique-se de que a superfície de corte lisa adere firmemente à placa de amostra e não ficar desalojado durante o processo de corte. Adicionar solução PBS o suficiente na bandeja até a superfície do cérebro inteiro está completamente submerso. É importante manter the peças de cérebro e secções subsequentes totalmente imersa em PBS ao longo deste passo.
  3. Coloque a bandeja na vibratome, ajustar a velocidade de corte a 0,5 mm / seg, a frequência de corte de 90 Hz, e a espessura de alimentação a 50 um, a fim de se obter 50 mm de espessura. Em seguida, transferir as secções em frascos de vidro de 20 ml contendo solução de crioprotector (40% de PBS, 30% de etileno-glicol e 30% de glicerol) utilizando um pincel fino. Armazenar os tubos a -20 ° C até à sua utilização. Alternativamente, manter as secções em PBS para o rastreio imediato tal como descrito nas etapas seguintes.

5. Secção de triagem para a presença de placas Metoxi-X04-manchadas

  1. Com o auxílio de um cérebro de rato atlas estereotáxico 14, secções do cérebro seleccione contendo a região de interesse, por exemplo, o hipocampo CA1 como usado no presente exemplo. Colocar cada secção em um poço numa placa de cultura de 24 poços contendo a solução de agente crioprotector suficientede modo a evitar que as secções de secagem para fora.
  2. Examine cada seção sucessivamente, para evitar a secagem das secções, utilizando o seguinte procedimento:
    1. Adicionar uma gota de PBS para uma lâmina de microscópio com uma pipeta descartável, e colocar a seção sobre a gota.
    2. Examinar a secção sob um microscópio de fluorescência para identificar regiões que contêm placas de Ap metoxi-X04 rotulados.
      Nota: metoxi-X04 pode ser facilmente visualizadas utilizando um filtro de fluorescência de raios ultravioleta (UV) (excitação 340-380 nm).
  3. Capturar imagens de regiões de interesse (ROI) no campo luminoso, bem como em modo de fluorescência sem mover a platina do microscópio, uma vez que cada imagem deve mostrar a mesma região em ambos os domínios, a fim de correlacionar a presença das placas directamente à região estrutural de a secção de tecido.
  4. Salve e nomeie as imagens tiradas de acordo com o número de animais. Também gravar o número poço na placa e no campo das imagens de TAken. Por exemplo, Ex: 9978A1B; número de animais: 9978; Bem número: A1; Campo: Bright. Coloca a secção de volta no bem o seu designado uma vez que a imagem é concluída.
    Nota: No final, para cada secção examinados, duas imagens são obtidas, uma em campo brilhante e uma outra no campo UV.
  5. Abra as duas imagens do mesmo ROI (um em campo claro e outro no campo UV) em Imagem J, e usando o plugin MosaicJ, alinhar as bordas das duas imagens e guardar a imagem alinhada e combinados de acordo com o número bem ele veio de.
  6. Salvar a imagem em uma pasta separada com o número do animal particular. Combine as imagens para identificar e localizar as placas na secção de tecido, e ter uma visão completa de toda a secção nos dois campos diferentes (brilhantes e UV).
  7. Após o processo de triagem é completada, armazenar as secções examinadas a -20 ° C em uma placa de cultura de 24 poços contendo crioprotector até imunocoloração ou processamento posterior é cArried fora.

6. Pré-incorporação imunocoloração para IBA1

Nota: Execute a marcação para IBA1 em seções livremente flutuantes selecionados, colocando a placa em uma cadeira de balanço movendo-se lentamente à temperatura ambiente.

  1. Lavar exaustivamente as secções 3 vezes com aproximadamente 1 mL de PBS, de cada lavagem com duração de 10 min.
  2. Extingue-se as peroxidases endógenas com 0,3% de peróxido de hidrogénio em solução de PBS durante 10 min. Este passo evita a actividade da peroxidase não-específica, o que é importante para evitar a coloração de fundo.
  3. Lavar o tecido em PBS 3 vezes durante 10 minutos cada.
  4. Incubam-se as secções em 0,1% de borohidreto de sódio em solução de PBS durante 30 min. Esta etapa é importante para reduzir quaisquer aldeídos remanescentes do passo de fixação, e é especialmente importante se a acroleína é usado na fixação do tecido.
  5. Lave o tecido em PBS 3 vezes durante 10 minutos de cada vez e certifique-se de remover todas as bolhas.
  6. Bloquear as secções durante 1 h.Diferentes anticorpos podem requerer diferentes tempos e soluções de bloqueio. Para IBA1, preparar tampão contendo 10% de soro fetal de bovino, 3% de albumina de soro de bovino, e 0,01% de Triton X-100 em 50 mM Tris-salino tamponado de bloqueio (TBS, pH 7,4).
    Nota: O passo de bloqueamento é para evitar a ligação não específica do anticorpo primário. A baixa concentração de Triton X-100 permite ligeira permeabilização de membranas para melhor coloração e é baixo o suficiente para preservar a maioria das características ultra-estruturais de tecido sob EM.
  7. Remover o tampão de bloqueio a partir do tecido, e incubar em solução de anticorpos primários (anticorpo de coelho anti-IBA1, diluiu-se [1: 1000] em tampão de bloqueio) a 4 ° CO / N.
  8. Lavar 3 vezes em TBS durante 10 min de cada vez.
  9. Incubar em anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com biotina) [1: 200] em TBS 0,05 M durante 90 min.
  10. Lavar com TBS 5 vezes durante 5 min cada vez.
  11. Incubar em solução de complexo avidina-biotina (Avidina [1: 100], Biotina [1: 100]) em TBSsolução durante 1 h.
  12. Lavar com TBS 5 vezes durante 5 min cada vez.
  13. Revelar a coloração IBA1 com 0,05% de diaminobenzidina (DAB) e 0,015% de peróxido de hidrogénio em TBS durante 8 min.
    Nota: O tempo de desenvolvimento pode variar de DAB protocolo de protocolo e deve ser determinada pelo exame rapidamente as secções coradas sob um microscópio de luz.
    Nota: Para IBA1, um deve ser capaz de visualizar claramente os corpos celulares e processos dos microglia manchado de IBA1 em 20X (veja a Figura 2, por exemplo representativo). Seja cauteloso usando DAB, como é um conhecido agente cancerígeno.
  14. Evitar o excesso de desenvolvimento através da monitorização cuidadosa das seções (como descrito acima) durante esta etapa. Parar a reacção por lavagem das secções em PB refrigeradas 5 vezes, durante 5 min de cada vez.

7. Processamento de Microscopia Eletrônica

  1. Preparar a solução de tetróxido de ósmio a 1% em PBS num frasco de vidro. Tetróxido de ósmio é fotossensível; cobrir o gfrasco moça com folha de alumínio para proteger a solução da luz.
    Seja cautelosa, utilizando tetróxido de ósmio, como é uma substância química muito perigosos. Executar esta e as seguintes etapas dentro de um exaustor.
  2. Remover o PBS das seções e espalhá-los plana usando um pincel fino. Execute esta etapa um poço de cada vez para manter as seções de secar. Certifique-se de achatar as secções imediatamente antes da adição de tetróxido de ósmio, como quaisquer dobras nas seções irá tornar-se permanente e tentando alisar o tecido pós ósmio fixação só vai quebrar as seções.
  3. Mergulhar as secções em tetróxido de ósmio durante 30 min à temperatura ambiente, adicionando uma gota de tetróxido de ósmio de uma vez com uma pipeta de transferência, para evitar que as secções de dobragem. Cobrir o poço com uma folha de alumínio para proteger as seções da luz.
    Nota: Esta etapa corrige os lípidos dentro das seções. O tecido vai aparecer muito escuro depois de ósmio pós-fixação.
  4. Enquanto que as secções estão em tetro de ósmiohidróxido O, preparar a resina de plástico numa proveta descartável através da mistura de 20 g de componente A e 20 g de componente B, 0,6 g de componente C, e 0,4 g de componente D. Combinar os componentes juntos na ordem acima e misturá-los bem utilizando uma pipeta de 10 ml serológica até se obter uma cor uniforme.
  5. Transfira a mistura preparados para pratos de alumínio de pesagem. Eles receberão as secções de tecido depois de terem sido desidratadas.
  6. Desidratar as secções em concentrações crescentes de etanol, durante 2 minutos na seguinte ordem: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
  7. Para remover o etanol residual, imergir as secções de óxido de propileno de 3 vezes durante 2 min de cada vez. Remover os desidratados secções da placa de cultura de 24 poços em 20 ml de frascos de vidro. Sempre utilizar frascos de vidro quando se trabalha com óxido de propileno, uma vez que se dissolve de plástico, e manter cautela, uma vez que é perigoso.
  8. Use uma ponta de pipeta de vidro dobrada ou um pincel fino para transferir as seções de soluti óxido de propilenona na resina e deixar O / N para a infiltração à TA. Tenha cuidado para não diluir a resina com óxido de propileno.
  9. Incorporar a secção com a resina de poli-cloro-tri-f luoro-etileno (PCTFE) filmsheets:
    1. Colocar os pratos de pesagem de alumínio contendo as amostras em um 50 - 60 ° C forno por 10 - 15 min antes da incorporação das secções em filmsheets PCTFE.
    2. Ao incorporar secções, trabalhar com um prato de pesagem de alumínio de cada vez. Usando um pincel fino, pinte uma fina camada de resina na folha de filme de uma PCTFE.
    3. Mover uma seção de tecido de cada vez a partir da pesagem de alumínio prato para a folha de filme PCTFE. Retire o excesso de resina de todo o tecido, tomando cuidado para não perturbá-la.
    4. Depois de mover todas as secções de um prato de pesagem para a folha de película PCTFE, colocar uma segunda folha PCTFE através da primeira, a criação de um sanduíche de tecido e resina em entre 2 folhas.
  10. Polimerizar a resina em uma incubadora durante 3 dias a 55-60 ° C.
  11. O material está pronto para corte ultrafinos e exame ultra-estrutural, técnicas especializadas, que são muitas vezes realizados por instalações nucleares do EM. Armazene as amostras entre folhas de filme PCTFE com segurança em RT sem degradação ultra-estrutural.
    Nota: Os passos subsequentes para ultrafino seccionamento e transmissão exame de microscopia eletrônica são explicadas em um protocolo separado 13.

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Representative Results

Esta secção ilustra os resultados que podem ser obtidos em diferentes etapas críticas do protocolo. Em particular, os resultados mostram exemplos de seções do cérebro contendo metoxi-X04 placas manchado na região específica e camadas de interesse: o CA1 do hipocampo, radiatum estratos, e lacunosum-moleculare. As placas e organização regional / lamelar do hipocampo são sucessivamente visualizadas utilizando uma combinação de filtros UV e de campo brilhante (Figura 1). As seções selecionadas do cérebro são posteriormente histoquímica e processadas para EM, mantendo o controle de suas placas de Ap, considerando que eles ainda são fluorescentes seguinte imunocoloração, e tornar-se mais escuro que o neurópilo circundante após o tratamento com tetróxido de ósmio e incorporação (Figura 1). Isso permite identificar as áreas (geralmente alguns milímetros quadrados) para examinar ao microscópio eletrônico baseado no locação de placas. Além disso, um protocolo melhorado para o pré-incorporação imunocoloração da microglia com IBA1 é descrito aqui. Este protocolo produz uma visualização excepcional de corpos celulares microgliais, grandes e pequenos processos (Figura 2), bem como a penetração dos anticorpos dentro das secções do cérebro. Isso facilita, assim, a identificação dos corpos celulares microgliais e processos ao nível ultra-estrutural, e o estudo das suas interacções com placas de Ap (Figuras 3 e 4).

figura 1
Figura 1. Visualização de Ap em placas de 21 meses de idade Ratos APP-PS1 usando Microscopia de luz, a seguir à injecção sistémica de o corante fluorescente Metoxi-X04. AB) de uma imagem de dupla secção do hipocampo utilizando modos de campo brilhante e fluorescência. As regiões e camadas de interesse são visualizados sob campo luminoso(A), e as placas de Ap sucessivamente localizada usando um filtro de UV na faixa de 340-380 nm (B). CD) de imagem dupla de uma outra secção do hipocampo antes (C) e depois (D), pré-incorporação de imunocoloração para IBA1, seguido por pós-fixação com tetróxido de ósmio, a desidratação em etanol, e a incorporação de uma resina de plástico, como requerido para a microscopia electrónica de transmissão. Para ser notado, a placa (cercada por uma linha pontilhada) é ainda visível no processamento de tecidos para microscopia eletrônica. Visualizando as placas ao aparar os blocos de tecido permite uma seleção precisa das áreas de imagem em alta resolução espacial. Barras de escala = 300 mm para A e B, de 150 mm para C e D. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Vi sualização de microglia corpo celular e Processos Belas em 21 meses de idade Mice APP-PS1 por IBA1 coloração ao microscópio Luz Nível. AB) Exemplos de microglia IBA1-manchado mostrando uma distribuição de cluster quando eles associam com placas de Ap (identificadas por imagens de fluorescência correlativo metoxi-X04; cercados por uma linha pontilhada), como observado antes de tetróxido de ósmio pós-fixação e resina plástica incorporação. CD) Exemplos de microglia IBA1-manchado associada com placas de Ap depois de tetróxido de ósmio pós-fixação e inclusão em resina plástica. Note-se que as placas se tornam mais escuras do que a sua neurópilo envolvente seguinte de ósmio pós-fixação, permitindo assim o acompanhamento da sua localização. Barra de escala = 250 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Visualização dupla de placas de Ap e IBA1-imunocoloração em ratos APP-PS1 6 meses de idade no nível ultra-estrutural. A) Exemplo de núcleo de placa de Ap densa reconhecido pela sua estrutura fibrilar compacto (ver caixa) e associação com neurites distróficos com características ultra-estruturais de autofagia. B) Exemplo de processo microglial IBA1-manchado (m; colorido em violeta) encontrados nas proximidades da placa de Ap que contém depósitos amilóides. alterações mitocondriais (mostrados por asteriscos) também pode ser vista no âmbito do processo da microglia. Para ser notado, esta imagem foi adquirida na fronteira do tecido-resina (branca, à direita da foto), onde a penetração de anticorpos e intensidade da coloração é máxima. Barras de escala = 2 mm para A, 1 mm para B. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 4. Exemplos adicionais de Microglia IBA1-histoquímica em 6 meses de idade Mice APP-PS1 como observado com Microscopia Eletrônica de Transmissão. AD) Exemplos de corpo IBA1 manchadas de células microgliais e processos (m) adquiriu mais longe da fronteira com o tecido-resina , mostrando uma excelente penetração dos anticorpos e intensidade de coloração mais profundamente no interior da secção utilizando este protocolo. bv = vaso sanguíneo, d = dendrite, in = inclusão, s = espinha dendrítica, t = terminal axonal. As setas mostram fendas sinápticas. Barras de escala = 1 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo explica uma abordagem correlativa para a segmentação do núcleo denso placas de Ap com EM. Metoxi-X04 na injeção vivo permite uma rápida seleção de seções do cérebro que contêm placas de Ap em determinadas regiões e camadas de interesse, por exemplo, a CA1 do hipocampo, radiatum estratos, e lacunosum-moleculare. No presente exemplo, metoxi-X04 pré-rastreio foi combinada com pré-incorporação de imunocoloração para IBA1 para estudar como diferentes fenótipos microgliais interagir com sinapses ao nível ultra-estrutural na presença de núcleo denso placas de Ap.

Microglia são extremamente sensível ao seu ambiente e a sua actividade inflamatória tem sido estudado no contexto de prejudicar a função cerebral normal e melhorar a progressão da doença de Alzheimer. Em particular, estas células foram implicados em processos neurodegenerativos, devido à sua grande activação e libertação de citocinas pro-inflamatórias, conduzindo a chrneuroinflamação ONIC, e rompimento do normal do cérebro homeostase 15. Nos últimos anos, no entanto, também foram exibidas estas células imunitárias residentes para remodelar activamente circuitos neuronais no cérebro saudável, que conduz à identificação de novos mecanismos patogénicos 16,17. Suas funções fisiológicas no sinapses podem tornar-se desregulado durante a neuroinflamação na DA, resultando em perda sináptica exacerbada, atualmente o melhor correlato patológico de declínio cognitivo em várias doenças neurodegenerativas 18,19.

As modificações introduzidas ao método de coloração IBA1 pré-incorporação anterior 13 agora permitir uma melhor penetração dos anticorpos através das secções do cérebro, bem como a visualização de corpos celulares microgliais e de finos processos no nível ultra-estrutural. Em geral, o protocolo deve ser realizada de forma rigorosa a partir de perfusão rato até que a incorporação de resina plástica das secções de tecido, considerando que a degradação ultraestruturalocorrendo em qualquer passo intermediário pode comprometer a integridade de membranas celulares, organelos, elementos do citoesqueleto, etc.

Este protocolo poderia ser realizado sem qualquer imunocoloração (omitindo a secção 6) para visualizar apenas núcleo denso placas de Ap, mas também fornece uma ferramenta poderosa para o estudo dos mecanismos complexos de patogénese em relação à deposição de Ap, tal como anticorpos diferentes podem ser usadas para concentrar em diferentes tipos de células, incluindo macrófagos perifericamente-derivados, a microglia endógena, os astrócitos, oligodendrócitos e os seus progenitores, bem como muitos subtipos neuronais.

Considerando a injecção in vivo de metoxi-X04, este protocolo não pode ser realizada em secções de cérebro fixos, o que impede a sua utilização com amostras de cérebro humano post-mortem. Além disso, contrariamente s para imunocoloração contra a Ap que rotula formas solúveis e insolúveis de Ap, a utilização de corantes de ligação a p-pregueadasestruturas de proteínas Heet, tais como metoxi-X04 só permite a visualização de placas núcleo denso, o que constitui outra limitação.

No entanto, as aplicações importantes poderiam incluir estudar os papéis da microglia e outros tipos de células, que se sobrepõem e aumentar a sua actividade, e poderia ter efeitos directos na homeostase da placa e a função neuronal ao longo da patologia da DA.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methoxy-X04 Tocris Bioscience 4920 10 mg substrate per tablet
Propylene glycol Sigma Aldrich W294004 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-1 Caution: toxic
Sodium Chloride NaCl Sigma S9625
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876
Tris Hydrochloride Fisher BioReagents BP153500
Acrolein Sigma 110221 Caution: Toxic
Paraformaldehyde Granular Electron Microscopy Sciences 19210 Caution: Toxic
Filter paper Fisher 09-790-14F
Peristaltic Pump with Tubing ColeParmer cp.78023-00
Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G Becton Dickinson 367341
Extrafine Forceps F.S.T 11152-10 Tip shape: curved
Scissors F.S.T 14090-09 Tip shape: straight
Hartman Hemostats F.S.T 13003-10 Tip shape: curved
Surgical Scissors F.S.T 14004-16 Tip shape: straight
Micro Dissecting Scissors ROBOZ surgical store 5818
Glass scintillation vials Fisher Scientific 74515-20
Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S Leica Biosystems  14047235612
Vibratome blades Electron microscopy Sciences 71990
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
24-well Tissue Culture Plates Fisher Scientific 353047
Ethylene Glycol Fisher BioReagents BP230-4
Glycerol Fisher BioReagents BP229-4
Hydrogen Peroxide, 30% J.T.BAKER cat: 2186-01
Sodium borohydride Sigma 480886
Tris HCl Fisher BP153-500ML
Fetal bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F1051
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Thomas Scientific C001H24
Triton X-100 Sigma T8787
Anti IBA1, Rabbit  WAKO 019-19741
Goat Anti-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch 111066046
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) Vector Labs PK-6100
3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) Sigma D5905-50TAB Caution: toxic
Osmium tetroxide, 4% solution Electron Microscopy Sciences 19150 Caution: toxic
Durcupan™ ACM single component A Sigma 44611 Resin Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component B Sigma 44612 Hardener Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component C Sigma 44613 Plasticizer Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component D Sigma 44614 Accelerator Caution: Toxic
Ethanol LesAlcoolsdeComerce 151-01-15N
Propylene oxide Sigma 110205 Caution: corrosive
Aluminum weigh dishes Electron Microscopy Sciences 70048-01
ACLAR®–Fluoropolymer Films Electron Microscopy Sciences 50425
Oven/Incubator VWR

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References

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