Neurodegenerative Erkrankungen im Tiermodell der chronischen Amyloid-beta-Oligomers Infusion wird durch Antikörper-Behandlung Angereichert mit osmotische Pumpen entgegen gewirkt

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sajadi, A., Provost, C., Pham, B., Brouillette, J. Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps. J. Vis. Exp. (114), e54215, doi:10.3791/54215 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rückgang der Hippocampus-abhängigen explizite Gedächtnis (Gedächtnis für Tatsachen und Ereignisse) ist eine der frühesten klinischen Symptom der Alzheimer-Krankheit (AD). Es ist bekannt, dass Synapse Verlust und die daraus resultierenden Neurodegeneration die besten Prädiktoren für Gedächtnisstörungen in AD sind. Neueste Studien haben die neurotoxische Rolle der löslichen Amyloid-beta-Oligomeren (Aβo) betont, die im menschlichen Gehirn etwa 10 bis 15 yr zu akkumulieren beginnen, bevor die klinischen Symptome hervor. Viele Berichte zeigen, dass lösliche Aβo mit Gedächtnisdefiziten in AD-Modellen und Menschen korrelieren. Die Aβo-induzierte Neurodegeneration in neuronalen und Hirnschnittkulturen beobachtet hat, eine größere Herausforderung in vielen Tiermodellen zu reproduzieren. Das Modell der wiederholten Aβo Infusionen hier gezeigten dieses Problem zu überwinden und für die Entwicklung neuer krankheitsmodifizierende Therapien adressieren zwei Schlüsselbereichen ermöglichen: Identifizierung von biologischen Markern frühen AD zu diagnostizieren und zu bestimmen, die molekulare Mechanismen Untermauerung Aβo-induzierten Gedächtnisdefiziten bei der Entstehung der Alzheimer Krankheit. Da lösliche Aβo Aggregat relativ schnell in unlösliche Aß-Fibrillen, die schlecht mit dem klinischen Zustand von Patienten, lösliche Aβo korrelieren werden frisch zubereitet und injiziert einmal pro Tag während der sechs Tage markierte Zelltod im Hippocampus produzieren. Wir haben speziell Kanüle Design für die gleichzeitige Infusionen von Aβo und kontinuierliche Infusion von Aβo Antikörper (6E10) im Hippocampus mit osmotischen Pumpen. Diese innovative in - vivo - Verfahren kann nun in präklinischen Studien verwendet werden , um die Effizienz der neuen AD - Therapien zu validieren , die die Ablagerung und Neurotoxizität von Aβo in Pre-Demenz - Patienten verhindern könnten.

Introduction

Es wurde vorgeschlagen , zunächst die Akkumulation von unlöslichen Aß - Spezies im Gehirn AD Pathogenese zentral war. 1,2 jedoch Amyloid - Plaques auch in einigen kognitiv normalen älteren erkannt werden. 3-7 Um die schlechte Korrelation , die zwischen Plaque - Ablagerungen und kognitive Defizite zu überwinden in AD, haben neueste Berichte über die Anwesenheit von toxischen löslichen Aβo am Beginn der Erkrankung, die mit dem klinischen Zustand der Patienten viel besser korreliert. 8-14 Da der Prozess von Aß Oligomerisierung sehr dynamisch ist, wurde vorgeschlagen , dass die Neurotoxizität durch verschiedene Aβo anstelle von nur einer bestimmten Art von Oligomer induziert wird. 14-16 Da viele Studien gezeigt haben , dass Aβo vor Synapse Dysfunktionen Synapse und neuronalem Verlust initiieren, 17-24 aktuellen Theorien zeigen , dass Aß-verwandte Behandlung wirksam sein könnte , in Anfang AD statt in späteren Stadien als bisher in klinischen Studien getestet.

Ein Kennzeichen Merkmal von AD Pathogenese ist die massive und weit verbreitete Zelltod in den späten Stadien der Erkrankung beobachtet, und die signifikante Synapse und neuronalen Verlust in lokalisierten Hirnregionen beobachtet, wenn Gedächtnisstörungen nachweisbar werden auf der klinischen Ebene. Der perforant Weg, der aus dem entorhinalen Cortex (EC) an die Gyrus dentatus (DG) vorsteht , ist deutlich am frühen Beginn der AD gestört. 25,26 Während des Prodromalstadien von AD bei leichten kognitiven Beeinträchtigung (MCI) Tod offensichtlich erhebliche Zelle wird wird in der EG sowie der synaptischen Verlust in der DG erkannt. 25,26

Obwohl ein großer Teil des Beweise für die toxische Wirkung von löslichen Aβo Anfang AD geortet hat, 14.08 Aβo-induzierte Neurodegeneration in neuronalen Kultur oder organotypischen Hirnschnittkultur beobachtet hat , eine größere Herausforderung gewesen in Tiermodellen zu reproduzieren. 27 Die meisten der transgenen AD Modelle überexprimierenden Aβ haben Amyloid - Plaques, Tau - Hyperphosphorylierung, synaptic - Mangel und Gedächtnisdefizite. 27 haben jedoch diese Modelle viel weniger erfolgreich in Tod Modellierungs Zelle im Hippocampus von AD - Patienten beobachtet. Um diese technischen Probleme zu überwinden entwickelten wir ein Modell, das auf intrazerebrale Infusionen von löslichen Aβo. Wir berichteten bereits , dass Hippocampus - Infusionen von löslichen Aβo induzieren allmähliche Verlust von Neuronen und Tau - Hyperphosphorylierung, zwei pathologischen Kennzeichen im Zusammenhang mit Gedächtnisabnahme in AD wiederholt. 28 Hier haben wir ein neues Verfahren zeigen speziell AD Therapien zu testen , mit Kanüle Design für die gleichzeitige Infusionen von Aβo und kontinuierliche Infusion von Aβo Antikörper (6E10) mit osmotischen Pumpen.

Osmotische Pumpen bieten eine einzigartige Möglichkeit , die Effizienz jeder Antikörper in vivo zu testen (oder anderer Verbindungen) gegen Aβo induzierte Neurodegeneration direkt an der Infusionsstelle von Aβo. So pumpt diese reprESENT ein komfortables Werkzeug eine solide Proof-of-concept in Bezug auf die Wirkungsmechanismen von potentiellen therapeutischen Mitteln in AD zu etablieren. Da die jüngsten Berichte in den frühen Stadien der AD die kritische Wirkung von löslichen Aβo weisen darauf hin, dass viele Behandlungen in Richtung Aβo gerichtet tatsächlich von akademischen und pharmazeutischen Laboratorien getestet. Dieses neuartige Tiermodell ermöglicht die synaptischen und neuronalen Verlust in der frühen AD beobachtet imitiert, und osmotische Pumpen kontinuierlich Behandlungsmittel an der Aβo Infusionsstelle speziell ziehen lassen. Die repetitiven Ausfälle von AD-Therapien in den letzten Jahren in milden getesteten Patienten zu moderieren als Forscher aufgefordert, Studien in der Vor-Demenz-Patienten zu beginnen, bevor Aβo beginnen reichlich zu akkumulieren und irreversible Hirnschäden erzeugen. In diesem Zusammenhang neue Verbindungen zu testen, die die Ablagerung und folglich die Neurotoxizität von Aβo verhindern könnten in vorklinischen Patienten von Interesse sein.

Protocol

Ethik Aussage: Das Tier - Protokoll für dieses Projekt erhielt die Genehmigung von der Animal Care Committee des Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care.

1. Katheter Vorbereitung vor der Stereotaktische Chirurgie

  1. Geschnitten PE50 - Katheter (6 cm in der Länge) , die Kanüle zu verbinden verwendet wird mit osmotischen Pumpen (siehe 1A). Füllen PE50-Katheter mit künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) und die Dichtung beide Enden der Katheter. Halten den Katheter bei 4 ° C bis zur Verwendung.

2. Cannula Implantierung von Stereotaxy

  1. Führen Sie die Operation unter sterilen Bedingungen. Sterilisieren alle chirurgischen Instrumenten und Materialien im Autoklaven. Reinigen Sie das Gerät und Stereotaxie den Arbeitsbereich gründlich, und mit einer 70% igen Ethanollösung desinfiziert. Tragen einer chirurgischen Maske, Haarhaube und sterile Handschuhe.
  2. Anästhesieren Ratten durch intraperitoneale Injektion (ip) mit einer Lösung von Ketamin und Xylazin (100 mg / kg und 10 mg / kg, jeweils). Bestätigen Anästhesie durch eine Bewegung nach einer sanften Zehe Prise zu überprüfen.
  3. Injizieren eines nicht-steroidale entzündungshemmende Arzneimittel (Meloxicam; 1 mg / kg) subkutan (sc) mit dem narkotisierten-Tier mindestens 30 min vor der Operation.
  4. Shave den Kopf des Tieres mit Klipper und desinfizieren Sie die Haut mit einer Lösung von Chlorhexidingluconat 2% und Isopropylalkohol 2% dreimal. Bewerben Veterinäraugensalbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
  5. Legen Sie das Tier auf einem stereotaktischen Rahmen mit den Ohr Bars. Fix eine Kanüle auf dem Haltearm des Stereotaxierahmen. Injizieren (sc) ein Lokalanästhetikum (Bupivacain (1,5 mg / kg) und Lidocain (1,5 mg / kg) auf der Oberseite des Kopfes. Anesthesia ist unterhält während des gesamten Verfahrens durch einen Nasenkegel, die 3% Isofluran platzieren. Die gesamte OP-Feld solltedrapiert ab, aber es war nicht hier getan, um besser die Technik demonstrieren.
  6. Einen Einschnitt von 3 cm auf der Oberseite des Kopfes mit einem Skalpell. Installieren 4 Klammern um den Einschnitt, den Schädel klar zu verlassen. Mit einer Schere Rundspitze, machen eine Tasche (2 x 2 cm 2) unter die Haut zwischen den Schulterblättern des Tieres.
  7. Kratzen Sie die Knochenhaut des Schädels mit einer Klinge. Wenden Sie auf dem Schädel, der eine Gazeauflage wenn Blutungen.
  8. Stellen Sie sicher, dass der Schädel ist flach und gut auf dem Stereotaxierahmen ausgerichtet sind. Um sicherzustellen, dass der Schädel ist flach, überprüfen Sie die Höhe, in der Bregma koordiniert und an der Lambda. Nehmen Sie die Koordinaten des Bregma, die als Bezugspunkt verwendet werden soll.
  9. Ausgehend von der Bregma, Berechnung der Koordinaten der beiden Führungskanüle , die bilateral in den Hippocampus implantiert werden (anteroposterioren: - 0,42 cm; mediolateral: ± 0,30 cm; dorsoventral: - 0,28 cm nach den Paxinos und Watson Rattenhirnatlas) 29 . Geben Sie bitte diePosition der Kanüle mit einem Marker.
  10. Bohren Sie ein Loch (0,5 mm) in den Schädel an der Implantationsstelle der beiden Kanüle. Bohren Sie zwei andere Löcher ca. 5 mm über und unter diesen Punkten Schrauben einzufügen, die Kanüle wird erstarren, wenn Zahnzement Anwendung.
  11. Schneiden einem Ende des Katheters zuvor mit aCSF mit einem Skalpell aufgefüllt, und es in dem Winkelarm der Kanüle ein. Befestigen Sie die erste Kanüle mit Zahnzement. Vermeiden Sie es, Zahnzement um die Position auf der zweiten Kanüle.
  12. Lassen Sie den Zahnzement trocken für 2 - 3 Minuten, dann entfernen Sie den Halter Arm aus der ersten Kanüle, und befestigen Sie die zweite Kanüle in ihm. Wiederholen Sie die Schritte 2.11 und 2.12. Setzen Sie Dummy-Kanüle auf beiden Führungskanüle. Sicherstellen, dass die Dummy-und Führungskanüle von der gleichen Länge sind Gewebeinfiltration zu verhindern, und um die Kanüle zu blockieren.
  13. Das freie Ende beider Katheter in die Tasche vorher zwischen den Schulterblättern des Tieres gemacht. Entfernen Sie die Klemmen und nähen die Haut mit einemNähfaden 4-0.
    HINWEIS: Die obere Führungskanüle muss zu den kommenden Aβo Infusionen zugänglich sein.
  14. Nehmen Sie das Tier aus dem Stereotaxierahmen und steckte es in seinen Käfig zurück. Während postoperative Erholung, legen Sie den Käfig auf einer Decke Heizwasser, bis das Tier aufwacht. Der Käfig sollte teilweise auf dem Pad sein, so kann die Ratte von der Hitze weg bewegen, wenn nötig. Überwachen Sie das Tier ständig, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt Brustlage zu halten.
  15. Rück Ratten zur Tierhaltung von der Operation zu erholen für 10 Tage unter strenger Überwachung.
    HINWEIS: Verwenden Sie kein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt. Meloxicam (1 mg / kg) wird an zwei Tagen einmal pro Tag gegeben Operation folgende Schmerzen zu behandeln.

3. osmotische Pumpe-Installation

  1. Einen Tag vor der Installation füllen osmotische Pumpen mit 6E10-Antikörper (1 mg / ml; 100 & mgr; l) und Kontroll-IgG1Antikörper (1 mg / ml; 100 ul) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter sterilen Zustand. Halten die Pumpen in sterilem destilliertem Wasser bei 37 ° C über Nacht Pumpen zu aktivieren.
  2. Anästhesieren Ratten mit Isofluran 3% osmotischen Pumpen zu installieren (0,5 & mgr; l / h für 7 Tage). Rasur zwischen den Schulterblättern und desinfizieren Sie die Haut mit einer Lösung von Chlorhexidingluconat 2% und Isopropylalkohol 2%. Einen Einschnitt von 2 cm mit einem Skalpell zwischen den Schulterblättern, die PE50-Katheter in die Führungskanüle verbunden zu lokalisieren.
  3. Schneiden Sie das Ende der PE50-Katheter enthalten, Zahnzement mit einem Skalpell. Schließen Sie die osmotischen Pumpen an die PE50-Katheter, und fügen Sie einige Zahnzement an der Pumpe und Katheter-Übergang, um die Verbindung zu sichern.
  4. Stich in die Haut fest mit einem Nahtfaden 4-0. Legen Sie das Tier wieder in seinem Käfig auf einem Heizwasser-Pad. Beobachten Sie das Tier wake schnell von einer Isofluran-Narkose bis (ca. 5 min).
    HINWEIS: Die Operation dauert approximately 5 bis 10 min.

4. Aβo Infusions in Awake und sich frei bewegenden Ratten

  1. Bereiten Sie die Aβo Lösung (0,2 ug / ul) , wie zuvor berichtet. 28,30 Aβo zulassen dynamisch und spontan für 1 Stunde bei Raumtemperatur vor der Infusion zu aggregieren.
  2. Legen Sie zwei 10 ul Spritzen auf einer Infusionspumpe. Füllen Sie die Spritzen mit 5 ul sterilem destilliertem Wasser. Geschnitten, um zwei PE50-Katheter bis etwa 60 cm in der Länge mit einem Skalpell. Füllen Sie die beiden Katheter mit sterilem destilliertem Wasser unter Verwendung von 1 ml Spritzen und 21G-Nadeln.
  3. Halten Sie die 1 ml Spritzen an einem Ende des Katheters und das andere Ende an die Hamilton-Spritzen. Entfernen Sie die 1 ml Spritzen und prüfen Sie, dass sich keine Luftblasen in den Katheter ist.
  4. Legen Sie innere Kanüle am Ende des PE50-Katheter. Mit einer sterilen destilliertem Wasser füllen die innere Kanüle mit PE50-Katheter bis auf Hamilton Spritzen to1 & mgr; l. Machen Sie eine Luftblase durch pulling die Kolben bis zu 2 & mgr; l zurück.
  5. Mischen Sie die Aβo Lösung durch Auf- und Abpipettieren eine Spitze von mindestens Einhaltung verwenden. Vermeiden Sie Blasen während des Mischens bilden. Füllen Sie sowohl interne Kanüle mit 1,5 ul Aβo Lösung, die durch die Kolben bis zu 3,5 ul zurückziehen.
  6. Machen Sie Linien mit einem Marker vor und nach der Luftblase in beiden Katheter durchgeführt. Dies dient als Kontrollpunkt der laufenden Infusion. Zur Infusion bringen den Käfig in der Nähe der Infusionspumpe und seine Abdeckung zu entfernen.
  7. Legen Sie die Ratte in einem kuschel und fest schaben den Arm des kuscheln um den Hals den Kopf der Ratte zu immobilisieren. Entfernen Sie Dummy-Kanüle aus den beiden Führungskanüle. Legen Sie die innere Kanüle zuvor in der Führungskanüle vorbereitet. Sicherzustellen, dass sie vollständig eingeführt sind und gut befestigt an der Basis der Führungskanüle.
  8. Lassen Sie Ratte aus dem kuscheln und steckte es wieder in seinen Käfig Streit Stress zu begrenzen. Genau überwachen, um sicherzustellen, dass die Katheter nicht verdrehen togetsie und die Infusion richtig gemacht wird.
  9. Schalten Sie die Infusionspumpe. Injizieren 1 ul Aβo Lösung bei einer Rate von 0,1 ul / min (10 min). Während der Infusion überprüfen, dass der Spritzenkolben bewegt sich von 3,5 & mgr; l bis 2,5 & mgr; l, und dass die Luftblase in beiden PE50 Katheter kontinuierlich bewegen.
  10. Lassen Sie die innere Kanüle an Ort und Stelle für weitere 5 Minuten nach der Infusion eine effiziente Diffusion von Aβo Lösung zu ermöglichen. Bringen Sie die Ratte wieder in den kuscheln inneren Kanüle zu entfernen und mit einer Kappe bedeckt Führungskanüle Rückfluß der injizierten Lösung zu verhindern. Verwenden Sie Dummy-Kanüle, die kurz vor dem Winkel Arm der Kanüle zu stoppen. Bringen Sie das Tier in seinem Käfig.
  11. Wiederholen Sie Aβo Infusion einmal pro Tag mehr als 6 aufeinander folgenden Tagen. Euthanize das Tier durch Enthauptung.

Representative Results

Die neurotoxische Wirkung von Aβo wurde in Long-Evans-Ratten untersucht durch eine Kanüle Implantieren in die DG des Hippocampus. Soluble Aβo täglich über sechs aufeinanderfolgende Tage injiziert. Wir verwendeten speziell Kanüle entwerfen zur gleichzeitigen Infusionen von Aβo und kontinuierliche Infusion von 6E10 oder Kontroll - IgG1 - Antikörper in dem Hippocampus unter Verwendung von osmotischen Pumpen (1A). Für die Immunhistochemie wurden Ratten anästhesiert, perfundiert transkardial mit 0,9% NaCl und Gehirn in 4% Paraformaldehyd-Lösung für 48 Stunden und 15% Saccharose-Lösung für 24 Stunden eingetaucht. Frei schwebenden koronalen Abschnitte (40 um) wurden mit 0,3% H 2 O 2 für 30 min behandelt, für 1 Stunde in 1% Ziegenserum blockiert und über Nacht bei 4 ° C mit einem anti-pan-Aß - Antikörper inkubiert. Die Schnitte wurden mit 70% iger Ameisensäure für 3 Minuten behandelt, bevor sie den Antikörper anwenden. Der Nachweis wurde mit der ABC-Komplex und ein 0 durchgeführt.05% 3,3-Diaminobenzidin-Lösung. Die Schnitte wurden auf mit Gelatine beschichteten Glasobjektträger aufgebracht, luftgetrocknet 2 Stunden, dehydriert (30, 70, 95 und 100% Alkohol), inkubiert in Toluol 5 min und abgedeckt. Für Kresylviolett-Färbung wurden die Schnitte 10 min in einer 0,5% Cresylviolett Lösung inkubiert, inkubiert 1 min in einer 0,5% igen Essigsäurelösung entfärbt (70, 95 und 100% Alkohol), eingetaucht in Toluol 5 min, und bedeckt mit Deckglas.

Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen die Ablagerung von Aβo in der DG in der Nähe der Infusionsstelle, und Zelltod mit dieser Akkumulation verbunden. Wir fanden , dass das Niveau Aβo im wesentlichen durch 6E10 - Antikörper - Behandlung (Abbildung 1B) verringert wurde. Markierte Neurodegeneration wurde in der Nähe der Injektionsstelle Aβo beobachtet, und wurde von 6E10 - Antikörper - Behandlung (1B) gedämpft. Diese Ergebnisse sind konsistent mit Aβo Akkumulation, die wir in der DG beobachtetnach wiederholten Aβo Infusionen bei Mäusen. 28 Abbau der Amyloid - Ablagerung durch Immuntherapie mit 6E10 Antikörper ist hier mit einem anderen Bericht in Linie gezeigt in einem Modell transgenen AD Maus. 31

Abbildung 1
Abbildung 1. Foto des Tier mit Bilaterale Cannula Während Aβo Infusion Eine Lösung von Aβo. (0,2 ug / ul; 1 ul) (für 6 Tage einmal täglich) in wach und sich frei bewegenden Ratten injiziert mit PE50 Katheter innere Kanüle verbunden in Führungskanüle eingesetzt. Die Behandlung mit Kontrolle (CTL) IgG1 oder 6E10 - Antikörper wurde direkt an der Stelle der Aβo Infusion mit osmotischen Pumpen liegt subkutan zwischen den Schulterblättern des Tieres. Infundiert Bitte klicken Sie hier um eine größere Version zu sehen thFigur.

Figur 2
Abbildung 2. Neuronale Verlust induziert durch Aβo Abscheidung wird Abgeschwächte von 6E10 - Antikörper - Behandlung A, Aβo (0,2 ug / ul; 1 & mgr; l). Wurde einmal täglich während sechs aufeinanderfolgenden Tagen injiziert und behandelt mit Ctl (IgG1) oder 6E10 - Antikörper bei der Infusionsstelle mit osmotischen Pumpen. B, Vertreter Ansammlung von Aβo in der DG auf einem Abschnitt unmittelbar neben Kanüleneinführvorrichtung und repräsentative Färbung mit Cresylviolett zeigt Zellverlust. Maßstabsbalken: 50 & mgr; m (n = 4) Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Es gibt wichtige Schritte in diesem Protokoll, die besondere Aufmerksamkeit erforderlich. Wenn die Kanüle Implantation vermeiden Zahnzement setzen, wenn es zu flüssig ist, das Loch der zweiten Kanüle zu verhindern, zu blockieren. Es ist wichtig, Zahnzement am freien Ende des P50-Katheter an der Pumpe angebracht zu platzieren Reizung und eine mögliche Entzündungsreaktion zu verhindern. Der Tag der stereotaktischen Chirurgie, verwenden dummy Kanüle, die die gleiche Länge wie Führungskanüle sind blockierende Kanüle zu vermeiden. Jedoch nach der Installation von Pumpen verwenden kürzere dummy Kanüle, dass der Winkelschenkel der Kanüle zu stoppen, bevor die richtige Infusion der Lösung von der Pumpe zu den Hippocampus zu ermöglichen. Überwachen Sie eng Aβo Infusionen und stellen Sie sicher, dass die Luftblase im Katheter durchgeführt wird kontinuierlich während der Infusionen zu bewegen. Achten Sie immer darauf, dass die Injektion von Kanüle vollständig in die Führungskanüle während Infusionen eingesetzt ist.

Wenn das Problem ist während des Aß-Infusion Begegnung, Stellen Sie sicher, dass die innere Kanüle nicht blockiert wird. Wenn dies der Fall ist, spülen Sie steriles destilliertes Wasser durch die innere Kanüle. Wenn die Führungskanüle behindert wird, drehen Sie die innere Kanüle in die Führungskanüle. bewegen sonst wird die innere Kanüle nach oben und unten. Contention im kuscheln kann für Ratten, vor allem am ersten Tag stressig sein. Um die Belastung des Tieres zu verringern, empfehlen wir, zu manipulieren und zu gewöhnen Ratten an den kuscheln vor dem stereotaxische Chirurgie.

Viele Vorteile lassen sich auf diese neue und flexible in vivo Ansatz zurückgeführt werden. Tatsächlich injiziert die Art der Aβo genau vor der Infusion steuern werden, und verschiedene Arten von Aß - Präparate (zB synthetische vs brain-derived Aß - Lösungen) können injiziert werden , um ihre Neurotoxizität in vivo zu untersuchen. Dieses Modell kann auch Mechanismen verwendet werden , durch die Niedrig- und ol mit hohem Molekulargewicht verschiedene Aß - Spezies (zB Monomere, zu untersuchen ,igomers kann Protofibrillen) induzieren neurotoxischen Wirkungen in vivo und wie Behandlungen wie Immuntherapie könnte ihre schädliche Wirkung im Gehirn entgegenzuwirken. Da die Infusionen in wach, führen Sie sind frei bewegenden Tieren gibt es keine verwirrende Effekte zwischen Anästhetika und der Aβo Lösung auf Signalwege, wie in früheren Studien gezeigt. 32,33 Aufgüsse in der Tier frei bewegenden Verhaltenstests sind auch kompatibel mit allen Zeit vor und nach den Infusionen.

Infusionen von Aβo und Pumpenanlage kann in der Tier unterschiedlichen Alters durchgeführt werden, um die Auswirkungen von Aβo und Behandlungen während des Alterns zu bestimmen. Da Neurodegeneration in Nähe der Infusionsstelle stattfindet, kann Synapse und neuronalem Verlust in verschiedenen Gehirnregionen und lokalisierten induziert werden. Die Sicherheiten Infusion von Aβo und Kontrolle (Fahrzeug oder Gerangel Aß) ermöglicht es innerhalb des gleichen Tieres für jede Änderung zu steuern. Im Gegensatz dazu Sol Aβo oder Kontrolleutions können bilateral in den rechten und linken Hippokampus, beispielsweise eingespritzt werden, wenn die Tiere in Behavioral Aufgaben zu testen. Die Infusion von Aβo und Behandlung kann gleichzeitig durchgeführt werden oder alternativ Pumpen können nach Aβo Infusion installiert werden, um zu beurteilen, ob die Behandlung nach Aß Ablagerung wirksam ist. Das gleiche hier beschriebene Protokoll kann auch verwendet werden, wenn intracerebroventricular Infusionen von Aβo tun. Die Wirkung von Aβo auf intrazelluläre Signalwege innerhalb eines angemessen kurzen Zeitraums vor und nach der neuronalen Verlust ausgewertet werden. Die Dosis und die Anzahl der Aß Infusionen können auch eine mehr oder weniger starke Aß Pathogenität zu erhalten, eingestellt werden.

Obwohl sehr vielseitig, hat diese Technik einige Einschränkungen. Kanüle Implantation erzeugt eine mechanische Zerstörung des Gewebes und neuroinflammation in den ersten Tagen nach der Operation. Somit ist es wesentlich, mindestens eine Woche nach der Operation zu warten, bevor Aβo infu Ausgangssion, und geeignete Kontrollen (Injektion von Fahrzeug oder inaktiv Gerangel Aß) hinzuzufügen, diese Ereignisse zu berücksichtigen. Auch wird nur ein kleines Volumen Aβo kann infundiert werden Diffusion der Lösung zu begrenzen.

Die osmotischen Pumpen stellen eine bequeme und einzigartige Bereitstellungsmethode für die präklinische Validierung von Agenten entwickelt Aß-induzierte Neurodegeneration zu verhindern. Da die Immuntherapie mit dem 6E10 Antikörper , der vorher verwendeten wir als Proof-of-Concept den 6E10 - Antikörper 31 gezeigt wurde , Aß Ansammlung im Gehirn zu verringern unsere neue In - vivo - Ansatz zu validieren. Die verwendete osmotischer Pumpen in diesem Modell könnte nun verwendet werden, um neue krankheitsmodifizierende Therapien zu entwickeln, die die Ablagerung und Neurotoxizität von Aβo in präklinischen AD-Patienten verhindern könnte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) Harvard Apparatus 59-7316
PE 50 Catheter thin wall Plastics one C232CT
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) Bioniche 1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) Bimeda 8XYL004C
Meloxicam (5 mg/ml) Norbrook 215670I01
Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% Carefusion 260100C
Lidocaine Hydrochloride Alveda Pharma 0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride Hospira 1559
ophthalmic ointment Baussh and Lomb inc. 2125706
stereotaxic frame Stoelting 51600
stereotaxic cannula holder arm Harvard Apparatus 72-4837
Drill Dremel 8050-N/18
Guide Cannula Plastics one 326OPG/spc
Injection Cannula Plastics one C315I/spc
Dummy Cannula Plastics one C315DC/spc
Suture thread coated vicryl rapide 4-0 Ethicon VR2297
Dental Acrylic Cement Harvard Apparatus 72-6906
Screws JI Morris Company P0090CE125
6E10 antibody (mouse IgG1 isotype)  BioLegend 803003
Mouse IgG1 isotype control antibody Abcam AB18447
Alzet osmotic pumps model 1007D Durect corporation 290
Isoflurane Baxter CA2L9100
Amyloid-beta 1-42  rPeptide A-1163-1
Hamilton syringe (10 µl) Fisher Scientique 14815279
Infusion Syringe Pump CMA 402 Harvard Apparatus CMA8003110
Syringe 1 ml BD 309659
Needle 21 G Terumo NN-2125R
Snuggle Lomir Biomedical RTS04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
  2. Selkoe, D. J. Toward a comprehensive theory for Alzheimer's disease. Hypothesis: Alzheimer's disease is caused by the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein. Ann. N.Y. Acad. Sci. 924, 17-25 (2000).
  3. Terry, R. D., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30, 572-580 (1991).
  4. Giannakopoulos, P., et al. Tangle and neuron numbers, but not amyloid load, predict cognitive status in Alzheimer's disease. Neurology. 60, 1495-1500 (2003).
  5. Price, J. L., Morris, J. C. Tangles and plaques in nondemented aging and "preclinical" Alzheimer's disease. Ann. Neurol. 45, 358-368 (1999).
  6. Reiman, E. M., et al. Fibrillar amyloid-beta burden in cognitively normal people at 3 levels of genetic risk for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6820-6825 (2009).
  7. Aizenstein, H. J., et al. Frequent amyloid deposition without significant cognitive impairment among the elderly. Arch. Neurol. 65, 1509-1517 (2008).
  8. Mc Donald, J. M., et al. The presence of sodium dodecyl sulphate-stable Abeta dimers is strongly associated with Alzheimer-type dementia. Brain. 133, 1328-1341 (2010).
  9. Tomic, J. L., Pensalfini, A., Head, E., Glabe, C. G. Soluble fibrillar oligomer levels are elevated in Alzheimer's disease brain and correlate with cognitive dysfunction. Neurobiol. Dis. 35, 352-358 (2009).
  10. Naslund, J., et al. Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline. JAMA. 283, 1571-1577 (2000).
  11. Hardy, J. Amyloid double trouble. Nat. Genet. 38, 11-12 (2006).
  12. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
  13. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 101-112 (2007).
  14. McLean, C. A., et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer's disease. Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999).
  15. Hepler, R. W., et al. Solution state characterization of amyloid beta-derived diffusible ligands. Biochemistry. 45, 15157-15167 (2006).
  16. Martins, I. C., et al. Lipids revert inert Abeta amyloid fibrils to neurotoxic protofibrils that affect learning in mice. EMBO J. 27, 224-233 (2008).
  17. Lesne, S., et al. A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature. 440, 352-357 (2006).
  18. Hung, L. W., et al. Amyloid-beta peptide (Abeta) neurotoxicity is modulated by the rate of peptide aggregation: Abeta dimers and trimers correlate with neurotoxicity. J. Neurosci. 28, 11950-11958 (2008).
  19. Ono, K., Condron, M. M., Teplow, D. B. Structure-neurotoxicity relationships of amyloid beta-protein oligomers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 14745-14750 (2009).
  20. Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448-6453 (1998).
  21. Shankar, G. M., et al. Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory. Nat. Med. 14, 837-842 (2008).
  22. Shankar, G. M., et al. Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway. J. Neurosci. 27, 2866-2875 (2007).
  23. Cleary, J. P., et al. Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat. Neurosci. 8, 79-84 (2005).
  24. Townsend, M., Shankar, G. M., Mehta, T., Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers. J. Physiol. 572, 477-492 (2006).
  25. Gomez-Isla, T., et al. Profound loss of layer II entorhinal cortex neurons occurs in very mild Alzheimer's disease. J. Neurosci. 16, 4491-4500 (1996).
  26. DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5, 417-421 (1996).
  27. Brouillette, J. The Effects of Soluble Abeta Oligomers on Neurodegeneration in Alzheimer's Disease. Curr. Pharm. Des. 20, 2506-2519 (2014).
  28. Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-beta1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. J. Neurosci. 32, 7852-7861 (2012).
  29. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Academic Press. New York. Fourth edition (1998).
  30. Broersen, K., et al. A standardized and biocompatible preparation of aggregate-free amyloid beta peptide for biophysical and biological studies of Alzheimer's disease. PEDS. 24, 743-750 (2011).
  31. Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 4501-4506 (2009).
  32. Papon, M. A., Whittington, R. A., El-Khoury, N. B., Planel, E. Alzheimer's disease and anesthesia. Front. Neurosci. 4, 272 (2011).
  33. Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics