Enquêtes sur le complexe Ga (III) de EOB-DTPA et son

Chemistry

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Summary

Une procédure pour l'isolement de EOB-DTPA et complexation ultérieure avec Ga naturel (III) et 68 Ga est présenté ici, ainsi que d' une analyse approfondie de tous les composés et les enquêtes sur l' efficacité de l' étiquetage, de la stabilité in vitro et l'octanol / eau coefficient du complexe radiomarqué de distribution.

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Greiser, J., Niksch, T., Weigand, W., Freesmeyer, M. Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue. J. Vis. Exp. (114), e54334, doi:10.3791/54334 (2016).

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Abstract

Nous démontrons une méthode pour l'isolement de EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris- (carboxyméthyl) -4- (éthoxybenzyl) d'acide -undecanedioic) de son Gd (III) et les protocoles de la préparation de sa non-radioactive, à savoir, Ga naturel (III), ainsi que radioactifs 68 complexes Ga roman. Le ligand, ainsi que la Ga (III) ont été caractérisés par résonance magnétique (RMN) , spectroscopie nucléaire, spectrométrie de masse et analyse élémentaire. 68 Ga a été obtenue par un procédé d'élution à partir d' un étalon / 68 Ga générateur 68 Ge. Des expériences visant à évaluer l'efficacité 68 Ga-étiquetage des EOB-DTPA à pH 3,8-4,0 ont été réalisées. Établi des techniques d'analyse de radio CCM (chromatographie sur couche mince) et HPLC radio (chromatographie en phase liquide à haute performance) ont été utilisés pour déterminer la pureté radiochimique du traceur. Comme une première enquête sur le caractère lipophile de 68 Ga Traceurs le n- octanol / distributio d'eaun coefficient de 68 espèces Ga présentes dans une solution à pH 7,4 a été déterminée par un procédé d'extraction. mesures in vitro de la stabilité du traceur dans divers milieux à pH physiologique ont été effectuées, révélant des taux de décomposition.

Introduction

L' acide Gadoxetic, un nom commun pour le complexe Gd (III) du ligand EOB-DTPA 1, est un agent de contraste fréquemment utilisé dans l' imagerie hépatobiliaire par résonance magnétique (IRM). 2,3 En raison de son absorption spécifique par les hépatocytes du foie et un pourcentage élevé de l' excrétion hépatobiliaire elle permet la localisation des lésions focales et des tumeurs hépatiques. 2-5 Cependant, certaines limites de la technique IRM (par exemple, la toxicité des agents de contraste, applicabilité limitée chez les patients souffrant de claustrophobie ou de métal implants) appel à un outil de diagnostic alternatif .

La tomographie par émission de positons (TEP) est une méthode d'imagerie moléculaire, dans lequel une petite quantité d'une substance radioactive (traceur) est administré, sur lequel sa distribution dans le corps est enregistré par un scanner TEP. 6 Le PET est un procédé dynamique qui permet une grande la résolution spatiale et temporelle des images ainsi que la quantification des résultats, sans avoir àtraiter les effets secondaires des agents de contraste IRM. La valeur informative de l'information métabolique obtenu peut être encore accrue par combinaison avec des données anatomiques reçues des méthodes d'imagerie supplémentaires, comme le plus souvent réalisé par imagerie hybride à la tomodensitométrie (CT) dans les scanners TEP / CT.

La structure chimique d'un traceur approprié pour le PET doit comprendre un isotope radioactif servant émetteur de positrons. Les positrons ont une durée de vie courte, car ils annihilent presque immédiatement avec les électrons des coquilles d'atomes de tissu environnant. Par annihilation deux photons gamma 511 keV avec sens inverse de circulation sont émis, qui sont enregistrés par le scanner PET. 7,8 Pour former un traceur, nucléides PET peuvent être liés de manière covalente à une molécule, comme cela est le cas dans 2-désoxy- 2- [18 F] fluoroglucose (FDG), le traceur de TEP les plus largement utilisés. 7 Toutefois, un nucléide peut également former des liaisons de coordination à un ou plusieurs des ligands (par exemple ,[68 Ga] -DOTATOC 9,10) ou être appliquée sous forme de sels minéraux dissous (par exemple, [18 F] fluorure de sodium 11). Au total, la structure du traceur est cruciale car elle détermine son comportement biodistribution, le métabolisme et l'excrétion.

Un nucléide PET approprié devrait combiner des caractéristiques favorables comme l'énergie de positons pratique et la disponibilité ainsi qu'une demi-vie adéquate pour l'enquête prévue. 68 Ga nucléide est devenue une force essentielle dans le domaine du PET au cours des deux dernières décennies. 12,13 Ceci est principalement dû à sa disponibilité à travers un système de générateur, ce qui permet l' étiquetage sur place indépendamment dans le voisinage d'un cyclotron. Dans un générateur, la mère nucléide 68 Ge est absorbée sur une colonne à partir de laquelle la fille nucléide 68 Ga est élue et ensuite marqué à un chélateur approprié. 6,14 Depuis le 68 Ga nucléide existe en tant que trivalent cation comme Gd (III) 10,13, chélateurs EOB-DTPA avec 68 Ga à la place donnerait un complexe avec la même charge globale négative que l' acide gadoxetic. Par conséquent, que 68 Ga traceur peut combiner une spécificité similaire du foie caractéristique avec l'aptitude à l' imagerie TEP. Bien que l' acide gadoxetic est acheté et administré sous forme de sel disodique, dans le contexte suivant nous allons nous référer à lui comme D.ieu [EOB-DTPA] et au complexe Ga non radioactif (III) comme Ga [EOB-DTPA], ou 68 Ga [ EOB-DTPA] dans le cas du composant radiomarqué pour des raisons de commodité.

Pour évaluer leur applicabilité comme traceurs pour le PET, les complexes métalliques radioactifs doivent être examinées en détail dans in vitro, in vivo ou ex vivo des expériences en premier. Pour déterminer l'aptitude à un problème médical respectif, diverses caractéristiques de traçage comme le comportement de biodistribution et le profil de jeu, la stabilité, la spécificité d'organe et cellule ou tissue absorption doivent être étudiées. En raison de leur caractère non invasif, des déterminations in vitro sont souvent effectuées avant les expériences in vivo. Il est généralement admis que DTPA et ses dérivés sont des qualités limitées comme chélateurs pour 68 Ga en raison de ces complexes dépourvus d' inertie cinétique, ce qui entraîne une décomposition rapide comparable lorsqu'il est administré in vivo. 14-20 Ceci est principalement causé par apo- transferrine agissant en tant que concurrent pour 68 Ga dans le plasma. Néanmoins, nous avons étudié ce nouveau traceur concernant son application possible dans l' imagerie hépatobiliaire, dans lequel des informations de diagnostic peut être fourni en quelques minutes après l'injection 3,4,21-23, ce qui ne nécessite pas nécessairement la stabilité du traceur à long terme. A cet effet , nous avons isolé EOB-DTPA à partir d' acide gadoxetic et initialement réalisé la complexation avec Ga naturel (III), qui existe en tant que mélange de deux isotopes stables, 69 Ga et 71 68 Ga. Nous avons utilisé des méthodes établies et évalué simultanément leur aptitude à déterminer l'efficacité de 68 Galabeling de EOB-DTPA et d'enquêter sur la lipophilie de la nouvelle 68 Ga traceur et sa stabilité dans différents médias.

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Protocol

1. Préparation de EOB-DTPA et Ga [EOB-DTPA]

Attention: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (MSDS) des solvants organiques, les acides et alcalins utilisés avant utilisation. Effectuez toutes les étapes dans une hotte et utiliser l'équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire).

  1. L' isolement de EOB-DTPA à partir d' acide gadoxetic
    1. Mettez 3 ml de 0,25 M solution injectable gadoxetic acide dans un ballon. Ajouter 500 mg (5,6 mmol) d'acide oxalique à la solution agitée.
    2. Après agitation pendant 1 heure, on filtre la suspension à travers un élément fritte en utilisant une pression réduite. Laver le résidu à trois reprises avec 3 ml d'eau, respectivement.
    3. Combinez les filtrats aqueux et équiper la solution avec une électrode de pH. Ajouter l'acide chlorhydrique 12 M au filtrat jusqu'à ce que le pH est environ -0,1.
    4. On élimine le solvant sous vide pour obtenir un résidu incolore. Stocker sous gaz inerte.
    5. Laver le résidu à fond (au moins troisfois) avec de l'acétate d'éthyle pour éliminer l'excès d'acide oxalique. Sécher le résidu sous vide.
    6. Redissoudre le résidu dans 2 ml d'eau à température ambiante, puis refroidir la solution dans un bain de glace. Sans enlever le bain de glace, ajouter 0,5 M d'hydroxyde de sodium aqueux à une solution goutte à goutte jusqu'à la formation d'un solide incolore, on observe gluante.
    7. Retirer l'eau par décantation. On lave les solides deux fois de plus avec 1 ml d'eau froide. Sécher le solide sous vide pour obtenir la première fraction du produit.
    8. Isoler une seconde fraction de produit à partir des fractions combinées de l' eau décantée par Chromatographie sur colonne (silice, méthanol / eau 4/1). 24 On élimine le solvant sous vide.
    9. Si le solide ainsi obtenu est blanc pur, on redissout dans 1 ml d'eau, ajouter 10 ml d'éthanol et ensuite 10 ml d'éther diéthylique pour précipiter le produit. Filtrer à travers un fritte en utilisant une pression réduite et sèche sous vide.
    10. Combinerles deux fractions solides de EOB-DTPA et effectuer RMN spectroscopique, 25 spectrométrie de masse 26 et élémentaires 27 analyses.
  2. Synthèse de Ga [EOB-DTPA]
    ATTENTION: Magasin solide Ga (III) le chlorure sous une atmosphère inerte sèche, car au contact de l'air, l'humidité ou la graisse décomposition a lieu, ce qui entraîne des vapeurs corrosives et formation d'impuretés jaunes, brunes ou noires.
    1. Préparer une solution de 0,11 M en dissolvant 1,94 g (11,0 mmol) de Ga (III) chlorure dans 100 ml d'eau. Diluer 1 ml d'une solution aqueuse d'ammoniac à 25% avec 4 ml d'eau.
    2. Dissoudre 80 mg (0,15 mmol) de EOB-DTPA dans un ballon dans 10 ml d'eau. Si nécessaire, chauffer le solvant pour obtenir une dissolution complète.
    3. Ajouter 1,4 ml (0,15 mmol) de la Ga (III) solution de chlorure de stock. Equiper le flacon d'un agitateur et électrode de pH. Ajouter goutte à goutte aqueuse diluée de la solution d'ammoniaque jusqu'à ce que le pH de la solution est d'environ 4,1. Agiter à room température pendant 30 min.
    4. On élimine le solvant sous vide. Placer le résidu dans un flacon, équipé d'une tête de distillation avec un col central et parallèle côté. Équiper le col central avec un doigt de refroidissement et le col latéral avec une sortie de pompe à vide,
    5. Chauffer le résidu sous pression réduite (125 ° C, 0,6 mbar). Retirez régulièrement sublimées chlorure d'ammonium (visible comme revêtement blanc de la surface du verre) du doigt de refroidissement et toujours à la tête, ainsi que des parties supérieures du ballon avec un chiffon légèrement humide. Poursuivre le processus jusqu'à ce qu'il n'y a pas de formation visible de nouveau sublimé.
    6. Pour éliminer les traces finales de chlorure d'ammonium laver le résidu trois fois avec 0,5 ml de méthanol chaud, respectivement. Sécher le résidu incolore sous vide. Effectuer RMN spectroscopique, 25 masse spectrométrique 26 et élémentaires 27 analyses.

2. Procédure générale d'étiquetage

ATTENTION: Tous les exexperiences y compris le contact direct ou indirect avec des substances radioactives doivent être effectuées par du personnel qualifié seulement. S'il vous plaît utiliser l'équipement de protection approprié. Collecter les déchets radioactifs séparément et stocker et éliminer conformément aux réglementations en vigueur.

  1. L' élution du générateur
    Note: A 40 mCi 68 Ge / 68 Ga générateur avec le nucléide mère lié sous forme d' oxyde de silice dodécyl-3,4,5-trihydroxybenzoate a été utilisé. Elution et la purification peuvent être effectués manuellement ou, comme cela a été le cas dans cette procédure, comme un processus automatisé combinée à l'aide d'une pompe péristaltique et l'unité de distribution.
    1. Préparer des solutions de 5,5 M, 1,0 M et de l'acide chlorhydrique 0,05 M. Préparer une solution de 5,0 M de chlorure de sodium contenant 25 pi de 5,5 M d'acide chlorhydrique par ml. Préparer une solution tampon à pH 4,6 en combinant 4,1 g d'acétate de sodium, 1 ml de HCl (30%) et 2,5 ml d'acide acétique glacial et en diluant le mélange avec de l'eau jusqu'à 50 ml.
    2. precondition le PS-H + cartouche en le rinçant lentement avec 1 ml de 1,0 M d' acide chlorhydrique, puis 5 ml d'eau.
    3. Éluer la colonne de silice du générateur avec 4 ml de 0,05 M de HCl. 12 Charger le 68Ga éluat sur ​​le PS-H + cartouche.
    4. Rincer la cartouche avec 5 ml d'eau et ensuite sécher avec 5 ml d'air. Éluer le 68 Ga à partir de la cartouche avec 1 ml de 5,0 M acidifie une solution de chlorure de sodium. 28
  2. Étiquetage des EOB-DTPA avec 68 Ga
    1. Dissoudre 1 mg (1,9 umol) de EOB-DTPA dans 1 ml d'eau. De cette solution prendre 100 pi (0,19 pmol) et les diluer avec 9,9 ml d'eau pour préparer un 19 uM (10 pg / ml) de solution mère de EOB-DTPA.
    2. Retirer 50 ul (équivalant à 22-29 MBq) de la solution contenant 68 Ga et mis dans un flacon. Ajouter 50 pi (0,5 ug) d'une solution mère 19 mM de EOB-DTPA et 300 pi of tampon pour élever le pH à 4,0. Agiter brièvement et incuber la solution à la température ambiante pendant 5 min. Retirer une aliquote de 1-5 ul et mis à HPLC ou analyse par CCM.
    3. Effectuer une analyse HPLC radio sur une phase inversée (RP) C18 colonne 29 Utiliser la phase mobile suivante:. A - eau / acide trifluoroacétique (99,9% / 0,1%), B - acide acétonitrile / trifluoroacétique (99,9% / 0,1%), gradient : 06 min 80% A → 0% de A (0,5 ml / min), 610 min 0% de A (0,5 ml / min).
    4. Déterminer les intensités de pic des signaux radio HPLC comme aire sous la courbe. Calculez le rendement de marquage que la pureté radiochimique (RCP) du traceur comme suit:
      RCP = Une Ga-EOB-DTPA / (A Ga + A Ga-EOB-DTPA) ∙ 100%
      Une Ga-EOB-DTPA: aire sous la courbe de 68 Ga [EOB-DTPA]
      A Ga: aire sous la courbe de droits 68 Ga

3. Étiquetage efficacité

  1. Exécuter les procédures d'étiquetage décrired dans la section 2. Utiliser une gamme cohérente de départ activité de 68 Ga éluat, par exemple, 22-29 MBq (40-140 ul, en fonction de la fraîcheur de l'éluat).
  2. Ajouter la quantité requise de solution tampon pour ajuster le pH à 3,8-4,0 (40-190 ul, en fonction du volume de 68 Ga éluat). Ajouter la quantité requise de solution de ligand stock (10-70 pi d'une solution 19 mM).
  3. Ajouter les quantités requises d'eau pour régler le volume global de chaque sonde de marquage à 1,75 ml. Bien mélanger et laisser l'échantillon reposer pendant 5 min à température ambiante. Effectuer une analyse HPLC comme décrit dans la section 2 pour déterminer le rendement de l'étiquetage.
  4. Exécuter les procédures d'étiquetage avec des quantités de ligand entre 0,1 pg et 0,7 pg par pas de 0,1 pg. Effectuer des expériences en triple pour chaque concentration de ligand. Calculer le rendement moyen et l'écart type.

4. Stabilité in vitro

  1. p généralrocédure et préparations
    1. Dissoudre un comprimé de tampon phosphate salin (PBS) dans 200 ml d'eau déminéralisée pour préparer une solution mère de PBS avec une concentration de phosphate de 10 mM.
    2. Effectuer l' étiquetage des 22-29 MBq 68 Ga avec 0,5 pi de EOB-DTPA solution mère, comme décrit dans la section 2. En fonction du volume des 68 Ga éluat, ajuster la quantité de tampon, tel que décrit dans la section 3. Retirer les échantillons de solution d'étiquetage contenant 6-12 MBq de traceur pour effectuer des mesures de stabilité.
    3. Effectuer une analyse par CCM de radio sur gel de silice 80 mm des plaques d'aluminium revêtues en utilisant du citrate de sodium 0,1 M comme éluant aqueux et d' analyser les plaques avec un scanner de radioactivité CCM. 30 Déterminer les intensités des signaux TLC comme aire sous la courbe. Calculer le RCP du traceur comme suit:
      RCP = Une Ga-EOB-DTPA / (A Ga-free + A Ga-EOB-DTPA + A Ga-colloïdal) ∙ 100%
      Une Ga-EOB-DTPA: aire sous la courbe de 68 Ga [EOB-DTPA]
      Une Ga-libre: aire sous la courbe de droits 68 Ga
      Une Ga-colloïdal: aire sous la courbe de 68 Ga colloïdales
    4. Calculer RCP t / RCP 0 pour chaque point de temps. Tracer la RCP ainsi normalisée par rapport à la différence de temps depuis le point de départ t = 0 min.
      RCP t = RCP de 68 Ga [EOB-DTPA] au moment t.
      RCP 0 = RCP de 68 Ga [EOB-DTPA] à t = 0 min.
  2. La stabilité dans une solution saline tamponnée au phosphate (A)
    1. Pour 65 pi de solution d'étiquetage ajouter 150 pi de PBS solution mère et 60 pi de solution d'hydroxyde de sodium (0,1 M) pour élever le pH à 7,4. Bien mélanger.
    2. Retirer une aliquote de 1-5 pi pour effectuer une analyse TLC ( «point de départ»). stocker immédiatement la solution dans un incubateur à 37 ° C et retirer aliquotes pour effectuer une analyse TLC à représenterative points de temps de plus de 3 heures.
  3. Stabilité à l' excès de apo -transferrin dans du PBS (B)
    1. Pour 120 pi de solution d'étiquetage ajouter 50 pi de PBS solution mère et 430 pi de solution d'hydroxyde de sodium (0,1 M) pour élever le pH à 7,4. Ajouter 40 ul d'une solution d'apo -transferrin (25 mg / ml). Bien mélanger.
    2. Retirer une aliquote de 1-5 pi pour effectuer une analyse TLC ( «point de départ»). stocker immédiatement la solution dans un incubateur à 37 ° C et retirer aliquotes pour effectuer une analyse TLC à des moments représentatifs de plus de 3 heures.
  4. Stabilité dans le sérum humain (C)
    1. 500 pi de sérum humain, ajouter 25 pi de solution de marquage et de 45 ul d'une solution d'hydroxyde de sodium (0,1 M) pour élever le pH à 7,4. Bien mélanger.
    2. Retirer une aliquote de 1-5 pi pour effectuer une analyse TLC ( «point de départ»). stocker immédiatement la solution dans un incubator à 37 ° C et retirer aliquotes d'effectuer une analyse TLC à des moments représentatifs de plus de 3 heures.

5. Détermination du coefficient de distribution LogD

  1. Exécuter les procédures d'étiquetage décrites à la section 2. 50 pi de solution d'étiquetage ajouter 20 pi de PBS solution mère et 170 pi de solution d'hydroxyde de sodium (0,1 M) pour élever le pH à 7,4.
  2. Retirer 200 pi de cette solution et le mettre dans un V-flacon en plastique. Ajouter 200 pi de octanol. Fermez le flacon et vortex pendant 2 min. Ensuite, centrifuger l'échantillon à 1 600 g pendant 5 min.
  3. Retirer triplicats de 40 ul de la phase n octanol et la phase aqueuse chacun et les mettre dans V-flacons séparés. Veillez à ne pas mélanger les couches.
  4. Mesurer l'activité de chaque échantillon dans un compteur gamma à puits pendant 30 sec. Pour chaque échantillon , répéter immédiatement la mesure deux fois et calculer la moyenne de celle - ci l' activité Ᾱ t t, W1, Ᾱ t, W2 et Ᾱ t, W3 (activités dans les échantillons aqueux) et Ᾱ t, O1,t, O2,t, O3 (activités en octanol) ainsi que le respectif temps t de leur détermination.
  5. Définir le point de la mesure du dernier échantillon t 0 fois. Déterminer et la liste en min At en calculant t = tt 0. Effectuer la correction de désintégration de Ᾱ t, en utilisant la formule suivante:
    0 = Ᾱ t · 2 (At / 68 min).
  6. Calculer Ᾱ 0, W comme la moyenne des Ᾱ 0, W1,0, 0W2 et W3 ainsi que Ᾱ 0, O comme la moyenne des Ᾱ 0, O1,0, O2 et Ᾱ 0, O3. Calculer logD en utilisant la formule suivante:
    logD = log [(Ᾱ (0 Ᾱ, W · 33 ug)].
  7. Effectuer toute l'expérience en triple et calculer la moyenne logD ainsi que son écart-type.

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Representative Results

Le ligand EOB-DTPA et du Ga non radioactif (III) ont été analysés par 1 H et 13 C {1 H} spectroscopie RMN, spectrométrie de masse et analyse élémentaire. Les résultats figurant au tableau 1 et représentés sur les figures 1-6 vérifier la pureté des substances.

Elution du générateur Ga 68 Ge / 68 a abouti à des solutions de 400-600 MBq 68 Ga. Les résultats de la procédure d'étiquetage décrites dans la formation du traceur désiré 68 Ga [EOB-DTPA], indiqués comme HPLC radio de pointe présentant un temps de rétention de 2,8 min (figure 7). La comparaison avec le temps de rétention de l'étalon de Ga [EOB-DTPA] dans le détecteur UV-vis à 220 nm (2,7 min, figure 8) confirme l' étiquetage réussi. 68 Ga est non coordonnée détecté comme pic de la radio à 2,1 min (Figure7). L'efficacité 68Ga-étiquetage des EO BDTPA a été étudiée par la détermination du rendement de marquage en fonction de la concentration de ligand par HPLC (figure 9). Les rendements ont été déterminés en triple exemplaire et les écarts-types ont été calculés.

En fonction du pH et de la concentration des anions présents en solution, non coordonnés ou non marqué 68 Ga peut exister dans diverses espèces, par exemple, gallates ou hydroxyde insoluble. 31 Le terme généralisé "libre 68 Ga" 32 est utilisé pour tous étiquetés non espèces en solution , sauf que l'hydroxyde, qui est généralement appelée "colloïdale 68Ga". Dans les conditions d'analyse décrites, 68 Ga libre se déplace avec le front de solvant (Rf = 1,0) sur une plaque de CCM. Colloïdal 68 Ga ne peut pas être détectée par HPLC, tandis que sur une plaque de CCM , il semble que l' activitéà l'origine (Rf = 0). Un chromatogramme représentatif d'une plaque de CCM analysée par un scanner de radioactivité CCM est représenté sur la figure 10. Le traceur présente un comportement de rétention différents, selon que l'échantillon de solution de marquage (pH 3,8 à 4,0, Rf = 0,3) ou un échantillon d'physiologique pH (Rf = 0,5) a été analysé.

Afin d' étudier la stabilité du traceur marqué par 68 Ga fraîchement [EOB-DTPA] a été ajouté à des échantillons de pH physiologique, contenant dilué du PBS (phosphate 5,5 mM de concentration, A), l' excès de apo- transferrine (1,6 mg / ml dans du PBS dilué avec une concentration en phosphate de 0,8 mM, B) et du sérum humain (C), respectivement. Au fil du temps, la pureté radiochimique (RCP t) du traceur dans les échantillons a été déterminée par CCM. Le pourcentage de traceur intact a été calculé comme le rapport de t à RCPles points respectifs de temps et RCP 0 au point de départ (tableau 2). Cela était nécessaire en raison des solutions d'étiquetage contenant des traceurs différents RCP 0 (93-96%). Ainsi que le pourcentage normalisé du traceur intact est représenté en fonction du temps sur la figure 11.

Pour la détermination de logd échantillons aqueux de traceur dans une solution de PBS diluée ont été préparées. Les échantillons ont été mélangés avec le n - octanol, et par la suite centrifugées aliquotes ont été retirées afin de déterminer la concentration d'activité dans les deux phases. Les valeurs d'activité et le calcul ultérieur de logD de ceux - ci sont représentés dans le tableau 3. La valeur moyenne logD est de 3,54 ± 0,08.

Figure 1
Figure 1. Spectre 1 H-RMN EOB-DTPA. < / strong> Le spectre a été enregistré dans D 2 O à 400,1 MHz. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. 13 C {1 H} RMN spectre des EOB-DTPA. Le spectre a été enregistré dans D 2 O à 100,6 MHz. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. MS de EOB-DTPA (ionisation par électrospray (ESI), le méthanol, le mode négatif).54334fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. 1 spectre H-RMN de Ga [EOB-DTPA]. Le spectre a été enregistré dans D 2 O à 400,1 MHz. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. 13 C {1 H} RMN spectre de Ga [EOB-DTPA]. Le spectre a été enregistré dans D 2 O à 100,6 MHz. S'il vous plaît cliquez sur son e pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. MS de Ga [EOB-DTPA] (ESI, le méthanol, le mode négatif), avec une représentation détaillée du motif isotopique du pic moléculaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7 représentant chromatogramme HPLC d'un échantillon de 68 Ga [EOB-DTPA] contenant dans des parties non coordonnés 68 Ga, telle qu'enregistrée par le détecteur de radioactivité. L' absence de coordination 68 Ga présente un temps de rétention de 2,1 min, alors que le traceur est détecté à 2,8 min .target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8. Représentant HPLC chromatogramme de la substance standard Ga [EOB-DTPA], tel que détecté dans le canal UV-vis à 220 nm. Le temps de rétention de la norme froide est de 2,7 min. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9. Représentation de 68 Ga efficacité du marquage EOB-DTPA. Le rendement de marquage déterminé par HPLC est représentée graphiquement en fonction de la concentration de EOB-DTPA (activité de 22 à 29 MBq de départ, pH 3,8 à 40,0, 5 min, RT). L'écart type est représenté par des barres d'erreur. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10
Figure 10. Chromatogramme représentatif CCM révèle différentes 68 espèces Ga. Un échantillon de 68 Ga [EOB-DTPA] dans du PBS dilué (concentration en phosphate 5,5 mM, pH = 7,4) a été analysé après 110 minutes d'incubation. Exemple de répartition colloïdale 68 Ga (Rf = 0), 68 Ga [EOB-DTPA] (Rf = 0,5) et une connexion 68 Ga (Rf = 1,0) sur une plaque de CCM 70 mm , tel que détecté par un scanner de radioactivité TLC présenté. Les chiffres sont la pourriture corrigée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.

Figure 11
Figure 11. Déterminations de stabilité de 68 Ga [EOB-DTPA] dans différents médias. La décroissance corrigée, le pourcentage normalisé du traceur intact , tel que déterminé par TLC, est représenté en fonction du temps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

Tableau 1
Tableau 1. Résultats de RMN spectroscopique, MS et analyses élémentaires effectuées pour EOB-DTPA et Ga [EOB-DTPA]. Relative intensités des pics MS sont données en%, l' affectation à des pics sont donnés entre crochets. Les valeurs CHN élémentaires étaient calculated C 23 H 33 N 3 O 11 · H 2 O (EOB-DTPA) et (NH4) 0,75 H 1,25 [C 23 H 28 GaN 3 O 11] · 2H 2 O (Ga [EOB-DTPA]).

Tableau 2
Tableau 2. Stabilité de la détermination 68Ga [EOB-DTPA] dans différents milieux. Le PCR de 68 Ga [EOB-DTPA] dans les milieux A, B et C a été déterminée par Chromatographie sur couche mince à des points de temps donnés. La composition des échantillons est donnée sous forme de pourcentages en% de traceur / gratuit 68 Ga / colloïdales 68 Ga. Le pourcentage de traceur intact est normalisé comme le rapport du RCP t / RCP 0. RCP 0 est le RCP respectif du traceur à t = 0 min.


. Tableau 3. Détermination de la désintégration corrigé logD valeurs a 0, X trois aliquotes (x = 1, 2, 3) sont retirés de chaque phase (W: aqueuse, O: n -octanol) d'un échantillon. Toutes les activités sont donnés en cpm. LogD est calculé comme décrit dans la section 5 du protocole. L'expérience a été répétée deux fois.

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Discussion

EOB-DTPA est accessible par une synthèse multi-étape 33 , mais peut tout aussi bien être isolé disponibles agents de contraste contenant de l' acide gadoxetic. A cet effet, le Gd (III), l'ion central peut être précipité avec un excès d'acide oxalique. Après élimination de Gd (III), l'oxalate et l'acide oxalique le ligand peut être isolé par précipitation dans l'eau froide à un pH de 1,5. Toutefois, afin d'améliorer la Chromatographie du filtrat sur une colonne de rendement peut être effectuée à la place ou en tant que procédure de suivi. L' autre méthode donne le ligand analytiquement pur avec des rendements totaux de 70% (figures 1 à 3, tableau 1).

Nous avons constaté que , dans le but d'isoler Ga [EOB-DTPA] ajustement du pH avec une solution d'ammoniac est avantageuse par rapport à l'utilisation de l' hydroxyde de sodium, comme le chlorure d' ammonium sous-produits peut être éliminé du résidu très hydrophile par sublimation. Dans les conditions mentionnées ci-dessus se déroule ce processus lentl y. Étant donné que des quantités non négligeables de chlorure étaient encore détectables au bout de cinq jours, le reste du sel a été lavé avec du méthanol. Bien que ce travail-up procédure entraîne une perte partielle de Ga [EOB-DTPA], le produit a été obtenu dans la pureté analytique avec un rendement global de 46% (figures 4-6, tableau 1). Pour l'isolement des deux EOB-DTPA et son Ga (III), l'utilisation de la chromatographie en phase inverse doit être considérée comme une autre méthode de purification, d'autant plus que la décomposition du gel de silice est probable lors de l'utilisation de solvants très polaires.

Le processus d'étiquetage des EOB-DTPA a nécessité l'utilisation de haute pureté des solvants, des produits chimiques et de l' équipement sans métal pour éviter la présence d'ions métalliques concurrents, en raison de 68 Ga étant présents en quantités nanomolaires (2 MBq de 68 Ga dans un échantillon de 1,75 ml égale à une concentration de nucléides de 0,14 nM). Étiquetage des EOB-DTPA à 68 Ga se produit à un pH de 3,8-4,0 dans les cinq minutesUtes à la température ambiante. Les recherches sur l'efficacité 68 Ga-étiquetage exigent la détermination du rendement de marquage tout en conservant les conditions de réaction pH, la température et le temps de réaction ainsi que le démarrage de l' activité 68 Ga constante ou dans une gamme justifiable. Pour chaque point de données (ie, la concentration de ligand) l'expérience doit être effectuée au moins trois fois pour fournir un niveau de confiance raisonnable, étant donné que les concentrations des deux ligand et 68 Ga sont très faibles et le rendement de l' étiquetage donc sensible à même de légères déviations de la les conditions de réaction. Par exemple, comme les 68 Ga éluat âges, des aliquotes de l' augmentation du volume doivent être retirés pour fournir une activité de départ constante, ce qui nécessite un volume croissant de la mémoire tampon. En outre, le vieillissement des résultats éluat à l' augmentation des concentrations du produit de désintégration 68 Zn, qui lui - même peut agir comme un concurrent pour 68 Ga, ainsi affecter négativement Labeling efficacité. étiquetage 13,34,35 pratiquement quantitative de 22 à 29 MBq 68 Ga est réalisée dans les conditions précitées avec des quantités EOB-DTPA ≥ 0,7 ug (figure 9), avec des teneurs de 68 Ga libre ≤ 2% et environ 5 % des colloïdal 68 Ga présents dans les échantillons.

Bien que HPLC fourni séparation de base supérieure de droits 68 Ga et 68 Ga [EOB-DTPA], il ne convient pas à détecter colloïdale 68 Ga. Nous avons donc choisi CCM pour déterminer la RCP pendant les mesures de stabilité, dans lequel la quantification de la transferrine ou lié à une protéine 68 Ga était nécessaire. Nous avons trouvé la séparation de base acceptable à cet effet (Figure 10); Cependant, l'utilisation d'exclusion de taille de chromatographie ou de filtration pour éliminer les méthodes 15,36 fractions colloïdales, suivie par une analyse par HPLC, peuvent être considérées comme des alternatives. Le complexe 68 Ga présente une forte retention sur des plaques de CCM (Rf = 0,3) si l'échantillon est prélevé directement à partir d'une solution d'étiquetage par rapport à des échantillons à un pH physiologique (Rf = 0,5). Nous suggérons cette observation pourrait être expliquée par différents états de protonation du complexe.

Dans la détermination de la stabilité in vitro de 68 traceurs Ga sont habituellement effectuées dans du PBS 15,17 ou systèmes tampons alternatifs mimant le pH physiologique 37, ainsi que dans des solutions contenant apo - transferrine 37, qui est le principal concurrent 68 Ga dans le sang ou dans 15,17 sérique humaine. Dans nos expériences, l'addition d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M à la PBS a été nécessaire d'ajuster le pH des échantillons à 7,4. On ne pouvait pas affirmer que la concentration en phosphate influe sur la vitesse de dégradation, étant donné que des expériences de stabilité dans des solutions de différentes concentrations de phosphate (0,8 mM et 5,5 mM (A)) a abouti à la non-reproduRésultats CIBLE. Cependant, nous avons trouvé qu'une solution B, contenant apo -transferrin (1,6 mg / ml, ce qui est à portée de la teneur normale en plasma 38) et de phosphate 0,8 mM (sang humain présente habituellement un niveau de phosphate de 0,8-1,5 mM 39,40 ), provoque la décomposition à une vitesse comparable à celle observée dans le sérum humain (C). Dans les solutions AC, après 185 minutes , le contenu du colloïdal 68 Ga a augmenté d'environ 24%, tandis que le contenu de droits 68 Ga a augmenté de 11% dans la solution A, 17% dans la solution B et 27% dans la solution C (tableau 2 ). Le fait que 68 Ga formé par la décomposition traceur est principalement présent sous forme libre 68 Ga par opposition à colloïdale ou lié à une protéine Ga 68 en B et C pourrait être dû à la saturation de la transferrine ou le taux de liaison de la transferrine comparativement lente. (figure 11) de 68 Ga [EOB-DTPA] est comparable à celui des traceurs présentant des chélateurs de DTPA dérivés similaires. Habituellement 15,16,18, des informations sur l'artère précoce et la phase de perfusion veineuse du foie sont acquise en effectuant les examens par IRM dans les 3 premières minutes après l' administration de 4,21 Gd [EOB-DTPA], tandis que la présence d'hépatocytes est détectée dans la phase retardée de 20 minutes 3,4,23 jusqu'à plusieurs heures 21,22 après l' injection. Après 20 minutes dans le sérum humain 93% de 68 Ga [EOB-DTPA] restent intacts. Expectedly, le rapport signal-bruit en ce moment - là se serait détériorée en raison de quantités croissantes de 68 Ga-transferrine, qui est présent dans le plasma et les tissus exprimant des récepteurs de la transferrine, ainsi que la gratuité 68 Ga gallate. 41,42

Pour prédire une distribution tissulaire de traceurs n- octanol / eau coefficients logP ou de distribution des coefficients logd peuvent être déterminées en rapport des concentrations d'activité dans les deux phases. Par définition, le paramètre logD ne distingue pas entre les multiples espèces présentes dans un milieu, ce qui le rend approprié pour nos expériences, en raison de la possibilité de différents états de protonation du traceur, ainsi que sa décomposition dans la phase aqueuse. Pour déterminer logD par extraction du milieu aqueux est habituellement tamponnée avec du PBS afin de reproduire les conditions de sang. 17,43-45 Pour des raisons mentionnées ci - dessus nous avons utilisé après dilution PBS, présentant une concentration en phosphate de 0,8 mM et à un pH physiologique. Après l' extraction avec du n -octanol et centrifugation, l'enlèvement de plusieurs parties aliquotes de la même phase permet des imprécisions provoquées par pipetage à réduire. En raison des très faibles concentrations d'activité dans octanol il faut être prudent pour éviter la contamination croisée avec la phase aqueuse et pour assurer le transfert quantitative dans un flacon séparé. distribcoefficients de ution déterminés par cette procédure sont reproductibles, et alors qu'ils permettent une estimation approximative de la lipophilie, une comparaison directe à un logP de D.ieu [EOB-DTPA] est pas possible. En raison de la spécificité de D.ieu [EOB-DTPA] résultant pas principalement de lipophilie mais son absorption hépatobiliaire expériences supplémentaires dans des sujets ou des cellules vivantes seraient nécessaires pour fournir des informations plus complètes sur la biodistribution, ainsi que la stabilité in vivo de 68 Ga [EOB DTPA]. Au total, une application en tant qu'agent d'imagerie pour la perfusion et de la phase hépatobiliaire précoce est imaginable.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
primovist Bayer - 0.25 M
gallium(III) chloride Sigma-Aldrich Co. 450898
water (deionized) - - tap water deionizing equipment by Auma-Tec GmbH
hydrochloric acid 12 M VWR 20252.29
sodium hydroxide Polskie Odczynniki Chemiczne S.A. 810925429
oxalic acid Sigma-Aldrich Co. 75688
ethyl acetate Brenntag GmbH 10010447
silica gel Merck KGaA 1.10832.9025 Geduran Si 60 0.063-0.2 mm
TLC silica gel 60 F254 Merck KGaA 1.16834.0001
methanol VWR 20903.55
ethanol Brenntag GmbH 10018366
eiethylether VWR 23807.468 stored over KOH plates
ammonia solution (25%) VWR 1133.1
pH electrode VWR 662-1657
stirring and heating unit Heidolph 505-20000-00
pump Ilmvac GmbH 322002
frit - custom design
NMR spectrometer Bruker Coorporation - Ultra Shield 400
mass spectrometer Thermo Fisher Scientific Inc. -
elemental analyser Hekatech GmbH Analysentechnik - EuroVector EA 3000 CHNS
deuterated water D2O euriso-top D214 99.90% D
Material/Equipment required for labeling procedures
68Ge/68Ga generator ITG Isotope Technologies Garching GmbH A150
pump and dispenser system Scintomics GmbH - Variosystem
hydrochloric acid 30% (suprapur) Merck KGaA 1.00318.1000
water (ultrapur) Merck KGaA 1.01262.1000
sodium chloride (suprapur) Merck KGaA 1.06406.0500
sodium acetate (suprapur) Merck KGaA 1.06264.0050
glacial acetic acid (suprapur) Merck KGaA 1.00066.0250
sodium citrate dihydrate VEB Laborchemie Apolda 10782 >98.5%
PS-H+ Cartridge (S) Macherey-Nagel 731867 Chromafix
apo-Transferrin Sigma-Aldrich Co. T2036
PBS buffer (tablets) Sigma-Aldrich Co. 79382
human serum Sigma-Aldrich Co. H4522 from human male AB plasma
flasks, columns, etc. custom design
pH electrode Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG 765-Set
binary pump (HPLC) Hewlett-Packard G1312A (HP 1100)
UV Vis detector (HPLC) Hewlett-Packard G1315A (HP 1100)
radioactive detector (HPLC) EGRC Berthold
HPLC C-18-PFP column Advanced Chromatography Technologies Ltd. ACE-1110-1503/A100528
HPLC glass vials GTG Glastechnik Graefenroda GmbH 8004-HP-H/i3µ
pipette Eppendorf -
plastic vials Sarstedt AG & Co. 6542.007
plastic vials Greiner Bio-One International GmbH 717201
activimeter MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH - Isomed 2010
tweezers custom design
incubator Heraeus Instruments GmbH 51008815
vortex mixer Fisons - Whirlimixer
centrifuge Heraeus Instruments GmbH 75003360
gamma well counter MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH - Isomed 2100
water for chromatography Merck KGaA 1.15333.2500
acetonitrile for chromatography Merck KGaA 1.00030.2500
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 91707
TLC radioactivity scanner raytest Isotopenmessgeräte GmbH B00003875 equipped with beta plastic detector

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