तैयारी और Lipophilic डॉक्सोरूबिसिन समर्थक दवा micelles की विशेषता

Bioengineering

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Summary

तैयारी और lipophilic डॉक्सोरूबिसिन समर्थक दवा के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल लोड 1,2-distearoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine- एन - [अमीनो (पॉलीथीन ग्लाइकोल) -2000] (डीएसपीई-खूंटी) micelles वर्णन किया गया है।

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Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

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Abstract

Introduction

रसायन चिकित्सा आमतौर पर कैंसर के विभिन्न रूपों के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है। अधिकांश, नहीं तो सब, रसायन चिकित्सा दवाओं विषाक्त दुष्प्रभाव जो इस तरह के मतली और दस्त के रूप में प्रबंधनीय नाबालिग की स्थिति, से अधिक की धमकी दे जीवन की स्थितियों के लिए भिन्न हो सकते हैं, लोगों की है। क्योंकि अधिकांश विरोधी दवाओं विषाक्त कर रहे हैं, सामान्य ऊतकों को इन दवाओं के गैर चयनात्मक जोखिम अनिवार्य रूप से विषाक्तता का कारण बनता है। इसलिए, वहाँ एक चिकित्सकीय दृष्टिकोण है कि चुनिंदा कैंसर की कोशिकाओं को दवाओं में वितरित कर सकते हैं के लिए एक बड़ी जरूरत है। विरोधी दवाओं के प्रशासन के साथ एक और चुनौती उनके गरीब पानी घुलनशीलता है। आमतौर पर, solubilizing एजेंट इन खराब घुलनशील दवाओं को तैयार करने की जरूरत है। हालांकि, इस तरह डाइमिथाइल sulfoxide के रूप में सबसे solubilizing एजेंटों, (DMSO), Cremophor ईएल, और 80 Polysorbate (बीच 80) इसलिए जिगर और गुर्दे की विषाक्तता, hemolysis, तीव्र अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं और परिधीय न्यूरोपैथीस का कारण बन सकता है। 1, सुरक्षित और biocompatible योगों के लिए आवश्यक हैं गरीबों के नैदानिक ​​इस्तेमालLy घुलनशील विरोधी दवाओं। Nanocarriers ऊपर चुनौतियों को संबोधित करने के लिए दवा वितरण प्रणाली वादा कर रहे हैं। ये nanocarriers liposomes, 2 नैनोकणों, 3 micelles, 4-7 बहुलक दवा conjugates, 8 और अकार्बनिक सामग्री शामिल है। 9 कई nanomedicine उत्पादों (जैसे, Doxil, Abraxane, और Genexol) नियामक एजेंसियों द्वारा अनुमोदित किया गया है कैंसर रोगियों का इलाज करने के लिए। 10

Polymeric micelles नैनो पैमाने पर दवा वितरण वाहक, जो सफलतापूर्वक विरोधी दवाओं के वितरण के लिए इस्तेमाल किया गया वादा कर रहे हैं। 4-7,11,12 ठेठ बहुलक micelles एक आत्म विधानसभा की प्रक्रिया के माध्यम से amphiphilic पॉलिमर से तैयार किया जाता है। कोर-खोल संरचित बहुलक micelles एक हाइड्रोफिलिक खोल और एक हाइड्रोफोबिक कोर में शामिल हैं। हाइड्रोफिलिक खोल sterically micelles को स्थिर है और रक्त प्रवाह में अपने परिचालन को लम्बा खींच कर सकते हैं। हाइड्रोफोबिक कोर प्रभावी ढंग से encapsulate कर सकते हैं हाइड्रोफोबिक घआसनों। micelles (आम तौर पर कम से कम 200 एनएम) और लंबे समय से प्रचलन गुण के छोटे आकार की वजह से, बहुलक micelles ट्यूमर बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (EPR) प्रभाव (निष्क्रिय ट्यूमर को निशाना) के माध्यम से लक्षित कर प्राप्त करने के लिए माना जाता है।

ड्रग लोडिंग स्थिरता ट्यूमर को निशाना micelles की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है। इष्टतम ट्यूमर लक्ष्य-निर्धारण को प्राप्त करने के लिए, micelles ट्यूमर साइट तक पहुँचने से पहले कम से कम दवा रिसाव होना चाहिए, फिर भी जल्दी से कैंसर की कोशिकाओं में प्रवेश करने के बाद दवा जारी। इसके अलावा, निर्माण स्थिरता भी उत्पाद विकास के लिए एक अनिवार्य आवश्यकता है, क्योंकि निर्माण स्थिरता उत्पाद विकास की व्यवहार्यता, साथ ही विकसित उत्पादों की शेल्फ जीवन को निर्धारित करता है। हाल ही में, प्रसव के वाहक में दवाओं की लोडिंग में सुधार के लिए काफी प्रयास किया गया है। Lipophilic समर्थक दवा दृष्टिकोण एक रणनीति है जो लिपिड नैनोकणों और emulsions में दवा लोड हो रहा है सुधार करने के लिए पता लगाया गया है conj है। 13,14दवाओं के साथ लिपिड के ugation काफी उनके lipophilicity में सुधार लाने और nanocarriers की lipophilic घटकों में लोड हो रहा है और प्रतिधारण वृद्धि कर सकते हैं।

यहाँ, हम lipophilic डॉक्सोरूबिसिन समर्थक दवा भरी हुई micelles तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। सबसे पहले, lipophilic समर्थक दवा डॉक्सोरूबिसिन के लिए संश्लेषण प्रक्रिया में वर्णित है। फिर, एक फिल्म के फैलाव विधि के साथ micelles पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश किया है। इस विधि को सफलतापूर्वक हमारे पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है। 5 डीएसपीई खूंटी micelles तैयारी क्योंकि इसे सफलतापूर्वक मिसेल दवा वितरण के लिए इस्तेमाल किया गया है के लिए वाहक सामग्री के रूप में चयनित किया गया था। 15,16 अंत में, हम कई इन विट्रो मिसेल को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया assays का वर्णन योगों और विरोधी गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए।

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Protocol

1. DOX-पीए के संश्लेषण

  1. डॉक्सोरूबिसिन की 390 मिलीग्राम और पामिटिक एसिड hydrazide की 243 मिलीग्राम वजन, और एक दौर नीचे कुप्पी के लिए स्थानांतरण।
  2. एक गिलास सिरिंज के साथ कुप्पी के लिए निर्जल मेथनॉल के 150 मिलीलीटर जोड़ें। एक विंदुक के साथ trifluoroacetic एसिड (टीएफए) के 39 μl जोड़ें। एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग करना, अंधेरे में आरटी पर 18 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण हलचल।
    नोट: प्रतिक्रिया सामग्री की मात्रा को बढ़ाया जा सकता है या नीचे DOX-पीए के विभिन्न मात्रा में प्राप्त करने के लिए। अभिकारकों के अनुपात से उसी अनुपात में बनाए रखा जाना चाहिए। 78 1,170 मिलीग्राम मिलीग्राम की सीमा में DOX मात्रा का उपयोग प्रतिक्रियाओं एक नियमित रूप से रसायन विज्ञान प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है।
  3. DOX-पीए की शुद्धि एक सिलिका जेल स्तंभ का उपयोग कर। 17
    1. एक रोटरी बाष्पीकरण के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण में विलायक निकालें। सिलिका जेल के 3 जी जोड़ने के बाद मिश्रण की मात्रा लगभग 20 मिलीलीटर के लिए कम है। रोटरी वाष्पीकरण जारी शुष्क पाउडर उपज के लिए और टी अनुमति देने के लिएवह सिलिका जेल पर उत्पादों की सोखना। एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम के अंतर्गत नमूना रखें बाद शुष्क पाउडर का गठन कर रहे हैं।
    2. पैक सिलिका जेल की 50 ग्राम एक स्तंभ एक विलायक के रूप में क्लोराइड का उपयोग करने में। ध्यान से सिलिका जेल स्तंभ को adsorbed उत्पाद युक्त नमूना जोड़ें।
    3. क्लोराइड और मेथनॉल का एक मिश्रण के साथ स्तंभ Elute, जबकि धीरे-धीरे मेथनॉल का प्रतिशत बढ़ रही है, जिससे विलायक polarity (तालिका 1) बढ़ रही है।
    4. टेस्ट ट्यूब में eluent के भागों (25 मिलीग्राम / ट्यूब) लीजिए और पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) द्वारा प्रगति की निगरानी।
    5. युक्त शुद्ध DOX-पीए सभी अंशों का मिश्रण है और जब तक शुष्क पाउडर का गठन किया है एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर विलायक हटा दें। इसके अलावा एक वैक्यूम हे / एन के तहत उत्पाद सूखी।
  4. DOX-पीए टीएलसी द्वारा का विश्लेषण।
    1. टीएलसी प्लेट की एक 4 सेमी एक्स 8 सेमी खंड कट। टीएलसी खोलना केशिकाओं के साथ थाली के नीचे से स्पॉट नमूना समाधान 0.5 सेमी से मुलाकात का उपयोगविलायक के रूप में hanol।
    2. टीएलसी थाली एक विकासशील चैम्बर क्लोराइड और मेथनॉल का एक मिश्रण युक्त में रखें (3/1, वी / वी)। विलायक की गहराई सिर्फ 0.5 सेमी से कम होना चाहिए।
    3. विकासशील कक्ष से थाली निकालें जब विलायक सामने थाली के शीर्ष तक पहुँचता है। एक पेंसिल के साथ विलायक सामने के स्थान चिह्नित और प्लेट सूखे के लिए अनुमति देते हैं। टीएलसी थाली आदेश नमूने कल्पना करने में संतृप्त आयोडीन वाष्प युक्त एक धुंधला कक्ष में रखें।
  5. 1 एच परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (1 एच एनएमआर) के साथ DOX-पीए का विश्लेषण। 18
    1. मिथाइल sulfoxide-डी 6 (DMSO) के 1 मिलीलीटर में DOX-पीए के 15 मिलीग्राम भंग और एक एनएमआर ट्यूब में नमूना हस्तांतरण।
    2. एनएमआर साधन का चुंबक में एनएमआर ट्यूब डालें। प्रोटॉन स्पेक्ट्रम उपाय, एक विलायक के रूप में DMSO का चयन। चुंबक से एनएमआर ट्यूब निकालें। एनएमआर परिणाम 18 का विश्लेषण।

2। फिल्म फैलाव विधि द्वारा DOX-पीए micelles की तैयारी

  1. डीएसपीई खूंटी (40 मिलीग्राम) और DOX-PA (4 मिलीग्राम) एक 10 मिलीलीटर कांच की शीशी में मेथनॉल के 2 मिलीलीटर के साथ भंग।
  2. एक वैक्यूम शीशी में एक पतली फिल्म रूपों तक एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर के तहत जैविक विलायक निकालें।
    नोट: वैकल्पिक, कार्बनिक सॉल्वैंट्स अक्रिय गैस के तहत (जैसे, आर्गन या नाइट्रोजन गैस) एक फिल्म के रूप में और एक निर्वात desiccator में शीशी रखने के आगे अवशिष्ट विलायक को दूर करने के लिए लुप्त हो जाना।
  3. स्थानांतरण कांच की शीशी को Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (7.4 पीएच, DPBS) के 2 मिलीलीटर।
  4. आरटी पर 3 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में शीशी की जगह micelles उत्पन्न करते हैं।
    नोट: अल्ट्रासोनिक शक्ति अल्ट्रासोनिक स्नान के विभिन्न मॉडलों के बीच बदलता है। एक इकाई है जो पतली बहुलक / दवा फिल्म को तितर-बितर करने के लिए पर्याप्त अल्ट्रासोनिक बिजली उत्पन्न कर सकते हैं का चयन करें। अल्ट्रासोनिक इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल स्नान के बिजली उत्पादन 110 डब्ल्यू है
  5. लघु अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर micelles रखें और -20 डिग्री सेल्सियस के लिए लंबे समय तकअवधि के भंडारण।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, micelles भी फ्रीज सूखे और उपयोग करने से पहले पानी के साथ पुनर्गठन हो सकता है। आमतौर पर, कोई cryoprotectant या lyoprotectant इस निर्माण के लिए आवश्यक है।

3. DOX-पीए micelles की विशेषता

  1. Micelles और नशीली दवाओं के encapsulation दक्षता में DOX-पीए एकाग्रता का निर्धारण
    1. 1 माइक्रोग्राम / एमएल, 5 माइक्रोग्राम / एमएल, 20 माइक्रोग्राम / एमएल, 50 माइक्रोग्राम / एमएल और 100 माइक्रोग्राम / एमएल: भंग DOX-पीए DMSO में पिछले चरणों पाँच अलग अलग सांद्रता के DOX-पीए समाधान तैयार करने में संश्लेषित। 490 एनएम पर एक यूवी तुलना स्पेक्ट्रोमीटर के साथ DOX-पीए समाधान के अवशोषण को मापने। एक मानक DOX-पीए दवा सांद्रता और 490 एनएम पर उनके इसी अवशोषण के आधार पर की अवस्था उत्पन्न करता है।
    2. DMSO के 500 μl के साथ दवा भरी हुई मिसेल के 25 μl पतला। एक यूवी तुलना स्पेक्ट्रोमीटर के साथ 490 एनएम पर अवशोषण को मापने। 3.1.1 में उत्पन्न मानक की अवस्था के साथ दवा सांद्रता की गणना।
    3. निम्न समीकरण का उपयोग encapsulation दक्षता की गणना:
      ड्रग एन्कैप्सुलेशन क्षमता (%) = (micelles में दवाओं की राशि) / (जोड़ा दवा की मात्रा) × 100%
  2. गतिशील प्रकाश बिखरने के साथ कण आकार की विशेषता (DLS)
    1. 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम डीएसपीई खूंटी एकाग्रता के लिए DPBS (7.4 पीएच) के साथ micelles पतला। जेड औसत आकार और polydispersity सूचकांक (PDI) प्राप्त करने के लिए एक कण आकार विश्लेषक के साथ एक 2 मिलीलीटर नमूना विश्लेषण।
  3. इन विट्रो विरोधी गतिविधि का मूल्यांकन
    नोट: उचित बाँझ तकनीक का प्रयोग करें और एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर कार्य करते हैं।
    1. (जैसे, T25) युक्त ड्यू-145 मानव प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को एक सेल संस्कृति कुप्पी से सेल संस्कृति के माध्यम से निकालें और DPBS के 2 मिलीलीटर (7.4 पीएच) के साथ कोशिकाओं कुल्ला।
    2. महाप्राण DPBS, trypsin समाधान (0.25%) के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. 10 मीटर जोड़ेसेल संस्कृति के माध्यम से एल (RPMI 1640 + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम + 1% एंटीबायोटिक antimycotic), जब कोशिकाओं का सबसे कुप्पी से अलग कर रहे हैं। एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर कोशिकाओं कोशिकाओं स्थानांतरण।
    4. सेल संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीलीटर के साथ सेल गोली पुनः निलंबित और एक hemocytometer साथ सेल नंबर की गिनती के लिए एक नमूना हटा दें। 50,000 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व के लिए सेल संस्कृति के माध्यम से कोशिकाओं पतला। पतला-सेल निलंबन एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में जोड़ें (100 μl / अच्छी तरह से)। एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) 18 घंटे के लिए सेल लगाव की अनुमति है।
    5. 0.1 माइक्रोन की अंतिम दवा सांद्रता प्राप्त करने के लिए, 0.5 सुक्ष्ममापी, 2 माइक्रोन, 5 सुक्ष्ममापी, और 10 माइक्रोन के क्रमश DOX डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) समाधान और सेल संस्कृति के माध्यम से DOX-पीए DMSO समाधान पतला। 0.5% करने के लिए सब से ऊपर के नमूनों में अंतिम DMSO एकाग्रता रखें। पतला सेल संस्कृति के माध्यम से DOX-पीए मिसेल अंतिम दवा सह प्राप्त करने के लिए0.1 माइक्रोन की ncentrations, 0.5 सुक्ष्ममापी, 2 माइक्रोन, 5 सुक्ष्ममापी, और 10 माइक्रोन के पक्ष में था। खाली सेल संस्कृति के माध्यम से एक नियंत्रण का प्रयोग करें।
    6. इनक्यूबेटर से 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली निकालें और अलग उपचार एजेंट (प्रत्येक समूह के लिए एन = 4) कदम 3.3.5 में तैयार युक्त मध्यम के 100 μl के साथ सेल संस्कृति के माध्यम से जगह। (2 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ) एक अतिरिक्त 72 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
    7. मध्यम Aspirate और 100 3- (4,5-डाइमिथाइल-thiazol-2-YL) के 0.5 मिलीग्राम / एमएल युक्त मध्यम के μl -2,5-diphenyl tetrazolium ब्रोमाइड (MTT) जोड़ें।
    8. अतिरिक्त 2 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं। ध्यान से मध्यम हटाने और formazan क्रिस्टल भंग करने के लिए DMSO के 100 μl जोड़ें।
    9. 570 एनएम के तरंग दैर्ध्य और 670 एनएम के संदर्भ तरंग दैर्ध्य में microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर साथ absorbance के उपाय।
    10. निम्न समीकरण का उपयोग सेल व्यवहार्यता की गणना:
      (एक परीक्षण / नियंत्रण) × 100%
      नोट: विभिन्न समूहों के बीच सेल व्यवहार्यता की तुलना विचरण (एनोवा) सांख्यिकीय परीक्षण के लिए एक तरह से विश्लेषण का उपयोग। सेल व्यवहार्यता बनाम दवा एकाग्रता डेटा के आधार पर आईसी 50 की गणना।

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Representative Results

चित्रा 1 DOX-पीए के संश्लेषण योजना से पता चलता है। DOX-पीए एक पीएच के प्रति संवेदनशील hydrazone बांड के माध्यम से डॉक्सोरूबिसिन साथ पामिटिक एसिड के विकार से संश्लेषित किया गया था। पामिटिक एसिड hydrazide की एक मामूली अतिरिक्त प्रतिक्रिया के पूरा होने की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह प्रतिक्रिया विधि एक बहुत ही उच्च क्षमता है और केवल डॉक्सोरूबिसिन की एक छोटी राशि एक 18 घंटा प्रतिक्रिया (चित्रा 2) के बाद बनी रही। उपज लगभग 88% थी। प्रतिक्रिया के अंत में, DOX-पीए एक सिलिका जेल स्तंभ का उपयोग कर शुद्ध और एक शुद्ध लाल ठोस उत्पाद प्राप्त करने के लिए सूख गया था। DOX-पीए टीएलसी, जो शुद्ध DOX-पीए (चित्रा 2) के लिए एक ही स्थान से पता चला है के साथ विश्लेषण किया गया था। चित्रा 3 DOX-पीए का 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम से पता चलता है। दोनों डॉक्सोरूबिसिन और पामिटिक एसिड से विशेषता एनएमआर चोटियों मनाया गया, जो आगे विकार प्रतिक्रिया की सफलता की पुष्टि की।

में चित्रा 4 में दिखाया गया है। दवा के बिना खाली डीएसपीई खूंटी micelles एक पारदर्शी तरल के रूप में दिखाई देते हैं। DOX-पीए डीएसपीई खूंटी micelles एक लाल तरल के रूप में दिखाई देते हैं; लाल रंग DOX-पीए micelles में लोड की वजह से है। कण आकार विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 5 में दिखाया जाता है। खाली डीएसपीई खूंटी micelles के लिए जेड औसत मतलब कण आकार का था 17.0 ± 0.5 एनएम (PDI = 0.034 ± 0.019)। DOX-पीए की लोडिंग थोड़ा मिसेल कण आकार में वृद्धि हुई; DOX-पीए डीएसपीई खूंटी micelles के लिए जेड औसत मतलब कण आकार 25.7 ± 1.6 एनएम (PDI = 0.407 ± 0.035) था।

मिसेल तैयार करने में DOX-पीए एकाग्रता 490 एनएम पर अवशोषण के आधार पर निर्धारित किया गया था। डीएसपीई खूंटी DOX-पीए एकाग्रता के विश्लेषण में हस्तक्षेप नहीं करता है इस तरंग दैर्ध्य में नगण्य अवशोषण है, इस प्रकार। मिसेल तैयार करने में DOX-पीए एकाग्रता था1.99 ± 0.11 मिलीग्राम / एमएल और नशीली दवाओं के लदान क्षमता 99.3 ± 5.7% थी। उच्च दक्षता encapsulation DOX-पीए, जो micelles के हाइड्रोफोबिक कोर में इसकी अवधारण को बढ़ाता की lipophilic सुविधा के कारण है। सूत्रीकरण उत्कृष्ट स्थिरता देखी गई। 3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस - जब कम से संग्रहीत नहीं दिखाई वर्षा नहीं हुई। दवा एकाग्रता में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन भंडारण के दौरान मनाया गया।

DU-145 मानव प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को मुक्त डॉक्सोरूबिसिन के विभिन्न सांद्रता, नि: शुल्क DOX-पीए, और DOX-पीए डीएसपीई खूंटी micelles के साथ इलाज किया गया। सेल व्यवहार्यता एक MTT परख (चित्रा 6) का उपयोग कर एक 72 घंटा उपचार के अंत में निर्धारित किया गया था। सेल व्यवहार्यता में एक एकाग्रता पर निर्भर कमी मुक्त डॉक्सोरूबिसिन (आईसी 50 = 0.10 सुक्ष्ममापी), नि: शुल्क DOX-पीए (आईसी 50 = 0.33 सुक्ष्ममापी), या DOX-पीए micelles (आईसी 50 = 0.25 माइक्रोन) के साथ DU145 कोशिकाओं के इलाज से हासिल की थी। हालांकि मुक्त डॉक्सोरूबिसिन है मुक्त DOX-पीए या कम सांद्रता में DOX-पीए micelles (0.1 सुक्ष्ममापी और 0.5 सुक्ष्ममापी) की तुलना में अधिक प्रभावी है, DOX-पीए समूहों उच्च सांद्रता (2-10 माइक्रोन) के पर मुफ्त डॉक्सोरूबिसिन से सेल व्यवहार्यता में अधिक से अधिक कमी देखी गई। इसके अलावा, वहाँ दोनों उच्च और कम सांद्रता में DOX-पीए और DOX-पीए micelles के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर हो दिखाई दिया। खाली डीएसपीई खूंटी micelles कोई विषाक्तता से पता चला है (डेटा) नहीं दिखाया, अच्छा biocompatibility और एक दवा वितरण वाहक सामग्री के रूप में डीएसपीई खूंटी की सुरक्षा के संकेत मिलते हैं।

आकृति 1
डॉक्सोरूबिसिन की lipophilic समर्थक दवा की चित्रा 1. संश्लेषण (DOX-पीए) अभिकर्मकों और शर्तों:। डॉक्सोरूबिसिन (DOX), पामिटिक एसिड hydrazide (पीए) और trifluoroacetic एसिड (टीएफए) मेथनॉल में भंग में आरटी पर 18 घंटे के लिए हड़कंप मच गया अंधेरा। टी = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी)। (1) के डॉक्सोरूबिसिन टीएलसी, (2) कच्चे प्रतिक्रिया मिश्रण, (3) पामिटिक एसिड hydrazide, और (4) DOX-पीए साधना। नमूने क्लोराइड और मेथनॉल का एक मिश्रण के साथ विकसित किया गया था (3/1, वी / वी) और आयोडीन के साथ दाग। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. 1 DOX-पीए की deuterated DMSO में एच एनएमआर। दोनों DOX और फिलीस्तीनी अथॉरिटी से विशेषता चोटियों की उपस्थिति विकार प्रतिक्रिया की सफलता को दर्शाता है।: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. micelles का प्रस्तुतिकरण। (ए) डीएसपीई खूंटी micelles और (बी) DOX-पीए डीएसपीई खूंटी micelles। प्रतिनिधि आंकड़े खाली डीएसपीई खूंटी micelles और DOX-पीए डीएसपीई खूंटी micelles की उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. कण आकार और micelles के आकार के वितरण। (ए) डीएसपीई खूंटी micelles और (बी) DOX -PA डीएसपीई खूंटी micelles। मिसेल आकार गतिशील प्रकाश बिखरने से निर्धारित होता है। प्रतिनिधि आंकड़े कण आकार और आकार के वितरण प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। प्रस्तुत डाटा रहे हैं इसका मतलब ± एसडी (एन = 3)। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 मिसेल योगों के विरोधी गतिविधि। DU145 कोशिकाओं 72 घंटा और सेल व्यवहार्यता के लिए इलाज किया गया MTT परख का उपयोग मापा गया था। आकृति में प्रस्तुत डाटा मतलब ± एसडी (एन = 4) कर रहे हैं। *, पी <0.01, तुलना DOX समूहों में इलाज करने के लिए। वहां इलाज समूहों DOX-पीए और DOX-पीए micelles के बीच कोई सांख्यिकीय अंतर है। आईसी 50 सेल व्यवहार्यता बनाम दवा एकाग्रता डेटा के आधार पर गणना की गई।p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक

तालिका 1 सीएच 2 सीएल 2 / CH 3 ओह DOX-पीए की शुद्धि में इस्तेमाल सॉल्वैंट्स एल्यूटिंग।

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Discussion

इस काम में, हम micelles की तैयारी के लिए एक सीधी, तेजी से फिल्म फैलाव विधि का वर्णन है। (जैसे, डीएसपीई-खूंटी) एक जलीय वातावरण में कोर-खोल संरचित micelles फार्म के लिए इस पद्धति का एक amphiphilic बहुलक की आत्म विधानसभा गुण का इस्तेमाल करता है। इस मिसेल तैयारी विधि के कई फायदे हैं। 1. यह एक सरल तैयार करने की प्रक्रिया है, जो जटिल आकार में कमी कदम (जैसे बाहर निकालना या homogenization के रूप में) आमतौर पर liposomes, नैनोकणों, और nanoemulsions। 19 2 की तैयारी में इस्तेमाल के उपयोग से बचा जाता है शामिल है। यह एक अच्छा reproducibility है। एक बार तैयार करने के लिए अनुकूलित किया गया है और स्थापित उत्कृष्ट बैच को बैच स्थिरता प्राप्त किया जा सकता है। प्रोटोकॉल ऐसे sonication शक्ति और समय के रूप में तैयार करने की प्रक्रिया में बदलाव चर, सहिष्णु है। हालांकि (जैसे डायलिसिस दृष्टिकोण या पायस विलायक वाष्पीकरण दृष्टिकोण के रूप में) अन्य तरीकों तैयारी micelles के लिए उपलब्ध हैं, फिल्म फैलावविधि और अधिक सुविधाजनक और कुशल है। इसलिए, यह एक महान क्षमता दवा उद्योग में micelles का बड़े पैमाने पर उत्पादन के क्षेत्र में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जाना है। इस विधि की सीमा है कि यह वाहक सामग्री की आत्म विधानसभा गुणों पर निर्भर करता है और इस प्रकार इस तरह के गुणों के साथ सामग्री के लिए प्रतिबंधित है। बहुलक सामग्री का अनुचित चयन संतोषजनक मिसेल योगों पैदा करने में विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसके अलावा, तैयारी विधि ultrasonication पर निर्भर करता है बहुलक / दवा फिल्म को तितर-बितर करने के लिए और micelles के गठन की सुविधा के लिए। अधिकांश व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अल्ट्रासोनिक स्नान उपयुक्त है, क्योंकि केवल एक कमजोर अल्ट्रासोनिक शक्ति micelles फार्म की जरूरत है। हालांकि, यह एक समस्या है, तो एक बहुत कमजोर शक्ति के साथ एक अल्ट्रासोनिक स्नान प्रयोग किया जाता है हो सकता है।

गरीब दवा लोड हो रहा है और समय से पहले दवा रिहाई मिसेल दवा वितरण के लिए प्रमुख चिंता कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम एक lipophilic समर्थक दवा रणनीति लोड बढ़ाने के लिए विकसितडीएसपीई खूंटी मिसेल्स में डॉक्सोरूबिसिन की आईएनजी। लिपिड के साथ डॉक्सोरूबिसिन के विकार काफी संगतता और डीएसपीई खूंटी micelles के लिपिड कोर के साथ दवा की बातचीत में सुधार हुआ। समर्थक दवा, DOX-पीए, एक अम्लीय पीएच उत्तरदायी hydrazone लिंकर के माध्यम से लिपिड के साथ डॉक्सोरूबिसिन conjugating द्वारा संश्लेषित किया गया था। इस लिंकर तटस्थ पीएच पर स्थिर है और अम्लीय पीएच पर cleavable है। 20,21 इस प्रकार, DOX स्थिरतापूर्वक तटस्थ पीएच पर एक समर्थक दवा के रूप में डीएसपीई खूंटी micelles में भरी हुई है और भंडारण के दौरान और रक्त परिसंचरण में दौरान कम से कम दवा रिसाव है। एक बार जब DOX-पीए micelles endocytosis के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं में प्रवेश, DOX-पीए समर्थक दवा cleaved और अम्लीय इंडोसोम पर्यावरण (पीएच 5-6) के जवाब में मुक्त DOX में परिवर्तित किया जाएगा। चूंकि DOX DOX-पीए की तुलना में अधिक हाइड्रोफिलिक है, इस रूपांतरण DOX और micelles के हाइड्रोफोबिक कोर के बीच बातचीत को बाधित करेगा, और इस तरह से micelles DOX की जल्दी रिहाई की सुविधा। इस अभिनव डिजाइन सुविधा अधूरा दवा रिहाई, बचना होगा जोएक प्रमुख गैर cleavable या धीमी गति से cleaving linkers का उपयोग कर दवा conjugates के साथ जुड़े समस्या है। 22 यह दृष्टिकोण भी अन्य दवाओं के वितरण के लिए लागू किया जा सकता है। एक उचित लिंकर के चयन के इस दृष्टिकोण की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। linkers आदेश तैयार करने की स्थिरता को अधिकतम करने के लिए एक मनोवैज्ञानिक वातावरण में स्थिर होना चाहिए। Linkers भी कुशलतापूर्वक जवाब में cleaved किया जाना चाहिए ट्यूमर microenvironment (जैसे, पीएच, एंजाइमों, आदि) के माता-पिता दवा को रिहा करने में चलाता है।

इस प्रोटोकॉल में, DOX-पीए कुशलता से उच्च दक्षता encapsulation (~ 100%) के साथ micelles में लोड किया गया था। मिसेल सूत्रीकरण भी बेहतर स्थिरता का प्रदर्शन किया और दवा वर्षा या दवा एकाग्रता में कमी के बिना कम से कम तीन सप्ताह के लिए बरकरार रह गए। यह समर्थक दवा में लिपिड moieties के बीच बढ़ाया संपर्क और डीएसपीई खूंटी micelles के लिपिड कोर के कारण है। compatibi इंजीनियरिंगदवाओं उनकी बातचीत को बढ़ाने के लिए साथ वाहक अणुओं के रूप में lity micelles और अन्य nanocarriers के प्रदर्शन में सुधार के लिए एक आशाजनक रणनीति है। यह दृष्टिकोण दवा लोडिंग बढ़ाने और इन nanocarriers के लिए पूर्व परिपक्व दवा रिहाई को कम कर सकते हैं। 23 एक उपयुक्त दवा / बहुलक जोड़ी के चयन मिसेल सूत्रीकरण डिजाइन करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। दवा अणुओं की संरचना संशोधित किया जा सकता है (प्रो-दवा दृष्टिकोण) या वाहक सामग्री की डिजाइन क्रम में संगतता में सुधार करने के लिए और दवा / वाहक बातचीत को बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता। 23 24 इसके अलावा, कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग की सहायता के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है nanocarriers की और अनुकूलन में यह संभव विशिष्ट एक विशेष दवा के लिए एक दर्जी से डिजाइन nanocarrier तैयार करने के लिए बनाते हैं।

सारांश में, हम यहाँ डॉक्सोरूबिसिन की एक lipophilic समर्थक दवा के संश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन। तैयारी और दवा भरी हुई micelles के लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल भी descr हैंमैं बिस्तर। फिल्म फैलाव विधि nanoscale आत्म विधानसभा वितरण प्रणाली की एक किस्म तैयार करने के लिए एक सरल और आशाजनक तरीका है। लक्षण वर्णन यहाँ वर्णित विधियों, nanomedicines के गुणों को निर्धारित करने के लिए इन विट्रो assays में मानक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इस प्रकार तैयार करने और उत्पाद विकास प्रक्रियाओं के अनुकूलन की सुविधा कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

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References

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