Beredning och karakterisering av lipofila Doxorubicin prodrug Miceller

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ett protokoll för beredning och karakterisering av lipofil doxorubicin pro-läkemedelsladdade 1,2-distearoyl--sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polyetylenglykol) -2000] (DSPE-PEG) miceller beskrivs.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kemoterapi används ofta för att behandla olika former av cancer. De flesta, om inte alla, cytostatika har toxiska biverkningar som kan variera från hanterbara mindre förhållanden, såsom illamående och diarré, mer livshotande tillstånd. Eftersom de flesta läkemedel mot cancer är giftiga, icke-selektiva exponeringen av dessa läkemedel till normal vävnad orsakar oundvikligen toxicitet. Det finns därför ett stort behov av ett terapeutiskt angreppssätt som selektivt kan leverera läkemedel in i cancerceller. En annan utmaning med administrering av läkemedel mot cancer är deras dåliga vattenlöslighet. Vanligtvis är solubiliseringsmedel som behövs för att formulera dessa svårlösliga läkemedel. Dock kan de flesta solubiliseringsmedel, såsom dimetylsulfoxid (DMSO), Cremophor EL, och polysorbat 80 (Tween 80) orsaka lever och njurtoxicitet, hemolys, akuta överkänslighetsreaktioner och perifera neuropatier. 1 Därför är säkra och biokompatibla formuleringar som behövs för den kliniska användningen av dåligly lösliga cytostatika. Nanocarriers är lovande läkemedelsleveranssystem för att ta itu med dessa utmaningar. Dessa nanocarriers inkluderar liposomer, 2 nanopartiklar, 3 miceller, 4-7 polymer-läkemedelskonjugat, 8 och oorganiska material. 9 Flera nanomedicin produkter (t.ex. Doxil, Abraxane, och Genexol) har godkänts av tillsynsmyndigheter för behandling av cancerpatienter. 10

Polymera miceller är lovande nanoskala drug delivery bärare, som har framgångsrikt använts för leverans av läkemedel mot cancer. 4-7,11,12 Typiska polymera miceller framställs från amfifila polymerer genom en självorganiserande processen. Kärna-skal-strukturerade polymera miceller innefattar ett hydrofilt skal och en hydrofob kärna. Den hydrofila skalet kan steriskt stabilisera miceller och förlänga deras omsättning i blodet. Den hydrofoba kärnan effektivt kan kapsla hydrofoba dmattor. På grund av den lilla storleken av miceller (typiskt mindre än 200 nm) och långcirkulations egenskaper, polymera miceller tros uppnå tumör inriktning genom ökad permeabilitet och retention (EPR) effekter (passiv tumörmåls).

Läkemedelsladdning stabilitet är avgörande för tumörmålsförmåga miceller. För att uppnå optimal tumör inriktning bör miceller ha minimal läkemedelsläckage innan tumörstället, men snabbt frisätter läkemedlet efter att cancerceller. Dessutom är formuleringsstabilitet också en nödvändig förutsättning för produktutveckling, eftersom formuleringsstabilitet bestämmer möjligheten av produktutvecklingen, liksom hållbarheten av utvecklade produkter. Nyligen har mycket arbete gjorts för att förbättra laddningen av läkemedel i leveransbärare. Den lipofila prodrug strategi är en strategi som har undersökts för att förbättra läkemedelsbelastning i lipid nanopartiklar och emulsioner. 13,14 den jämfördaugation av lipider med läkemedel kan avsevärt förbättra sin lipofilicitet och förbättra lastning och retention i de lipofila komponenterna i nanocarriers.

Här beskriver vi ett protokoll för framställning av lipofila doxorubicin pro-läkemedelsladdade miceller. För det första är syntesförfarande för doxorubicin lipofila pro-läkemedel beskrivits. Då, är ett protokoll för att generera miceller med en film dispersion metod som introducerades. Denna metod har framgångsrikt använts i våra tidigare studier. 5 DSPE-PEG valdes som bärarmaterialet för framställning av miceller eftersom det har med framgång använts för micell läkemedelsavgivning. 15,16 Slutligen beskriver vi flera in vitro-analyser används för att karakterisera micell formuleringar och för att utvärdera anticanceraktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntes av DOX-PA

  1. Väg upp 390 mg doxorubicin och 243 mg palmitinsyra hydrazid, och överför till en rundbottnad kolv.
  2. Tillsätt 150 ml vattenfri metanol till kolven med en glasspruta. Lägg 39 pl av trifluorättiksyra (TFA) med en pipett. Användning av en magnetisk omrörare, omrör reaktionsblandningen under 18 timmar vid RT i mörker.
    OBS: De mängder av reaktionsmaterialen kan skalas upp eller ner för att erhålla olika mängder av DOX-PA. Förhållandet mellan reaktanterna bör bibehållas i samma proportioner. Reaktioner med användning av DOX mängder i intervallet 78 mg till 1170 mg kan utföras i en vanlig kemilaboratorium.
  3. Rening av DOX-PA med hjälp av en silikagelkolonn. 17
    1. Avlägsna lösningsmedlet i reaktionsblandningen med en rotationsindunstare. Lägg 3 g silikagel efter volymen av blandningen reduceras till ca 20 ml. Fortsätta rotationsindunstning för erhållande av torra pulver och för att möjliggöra than adsorption av produkter på silikagel. Hålla provet under ett vakuum under ytterligare 30 min efter de torra pulvren bildas.
    2. Pack 50 g silikagel i en kolonn med användning av diklormetan som lösningsmedel. Tillsätt försiktigt provet kiselgel innehållande adsorberad produkt till kolonnen.
    3. Eluera kolonnen med en blandning av diklormetan och metanol, samtidigt som man gradvis öka andelen metanol, och därigenom ökande polaritet lösningsmedel (Tabell 1).
    4. Samla fraktioner av eluent i provrör (25 ml / rör) och övervaka utvecklingen genom tunnskiktskromatografi (TLC).
    5. Kombinera alla fraktioner innehållande ren DOX-PA och avlägsna lösningsmedlet under användning av en rotationsindunstare tills torrt pulver bildas. Ytterligare torka produkten under vakuum O / N.
  4. Analys av DOX-PA med TLC.
    1. Skär en 4 cm x 8 cm sektion av TLC-platta. Stickprovs lösningar 0,5 cm från botten av plattan med TLC observation kapillärer med hjälp uppfyllshanol som lösningsmedel.
    2. Placera TLC-plattan i en framkallningskammare innehållande en blandning av diklormetan och metanol (3/1, vol / vol). Djupet av lösningsmedlet bör vara knappt 0,5 cm.
    3. Ta bort plattan från framkallningskammaren när lösningsmedelsfronten når toppen av plattan. Markera platsen för lösningsmedelsfronten med en blyertspenna och låt plattan torka. Placera TLC-plattan i en färgningskammare innehållande mättad jodånga för att visualisera prover.
  5. Analys av DOX-PA med en H-kärnmagnetisk resonansspektroskopi (1 H-NMR). 18
    1. Lös 15 mg DOX-PA i 1 ml metylsulfoxid-D6 (DMSO) och överföra provet i ett NMR-rör.
    2. Sätt i NMR-röret i magnet av NMR-instrumentet. Mäta protonspektrum, välja DMSO som ett lösningsmedel. Ta NMR-röret från magneten. Analysera NMR resultat 18.

2. Framställning av DOX-PA miceller av Film-spridningsmetoden

  1. Upplösa DSPE-PEG (40 mg) och DOX-PA (4 mg) med 2 ml metanol i en 10 ml glasampull.
  2. Avlägsna det organiska lösningsmedlet under vakuum med användning av en rotationsindunstare tills en tunn film bildas i flaskan.
    OBS: Alternativt avdunsta de organiska lösningsmedlen under inert gas (t.ex. argon eller kvävgas) för att bilda en film och hålla flaskan i en vakuumexsickator för att ytterligare avlägsna kvarvarande lösningsmedel.
  3. Överför 2 ml av Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (pH 7,4, DPBS) till glasflaskan.
  4. Placera flaskan i ett ultraljudsbad under 3 min vid RT för att generera miceller.
    OBS: Ultraljuds kraft varierar mellan olika modeller av ultraljud bad. Välj en enhet som kan generera tillräckligt ultraljudseffekt för att dispergera den tunna polymer / läkemedels-film. Uteffekten av ultraljudsbad används i detta protokoll är 110 W.
  5. Håll miceller vid 4 ° C för korttidslagring och -20 ° C för lång-term lagring.
    OBS: Alternativt kan miceller också frystorkas och rekonstitueras med vatten före användning. Vanligtvis behövs ingen kryoskyddande eller lyoprotectant för denna formulering.

3. Karakterisering av DOX-PA Miceller

  1. Fastställande av DOX-PA-koncentrationen i miceller och narkotikainkapslingseffektivitet
    1. Lös DOX-PA syntetiseras i föregående steg i DMSO för att förbereda DOX-PA-lösningar av fem olika koncentrationer: 1 | j, g / ml, 5 | ig / ml, 20 | ig / ml, 50 | ig / ml och 100 pg / ml. Mäta absorptionen av DOX-PA-lösningar med en UV-VIS-spektrometer vid 490 nm. Generera en standardkurva baserad på DOX-PA läkemedelskoncentrationer och deras motsvarande absorption vid 490 nm.
    2. Späd 25 | il läkemedelsladdad micell med 500 pl DMSO. Mäta absorptionen vid 490 nm med en UV-VIS-spektrometer. Beräkna läkemedelskoncentrationer med standardkurvan som genereras i 3.1.1.
    3. Beräkna inkapslingseffektiviteten med hjälp av följande ekvation:
      Läkemedelsinkapsling Effektivitet (%) = (mängd läkemedel i miceller) / (mängd tillsatt läkemedel) × 100%
  2. Karakterisering av partikelstorleken med dynamisk ljusspridning (DLS)
    1. Späd miceller med DPBS (pH 7,4) till en slutlig DSPE-PEG-koncentration av 1 mg / ml. Analysera ett 2 ml prov med en partikelstorlek analysator för att erhålla Z-genomsnittliga storleken och polydispersitetsindex (PDI).
  3. Utvärdering av in vitro-anticanceraktivitet
    OBS: Använd lämplig steril teknik och verka innanför en biosäkerhet skåp.
    1. Avlägsna cellodlingsmediet från en cellodlingskolv (t.ex. T25) innehållande DU-145 humana prostatacancerceller och skölj cellerna med 2 ml DPBS (pH 7,4).
    2. Aspirera DPBS, tillsätt 1 ml trypsinlösning (0,25%), och inkubera i 2 min vid 37 ° C för att lösgöra cellerna.
    3. Tillsätt 10 ml av cellkulturmedium (RPMI 1640 + 10% fetalt bovint serum + 1% Antibiotic-Antimykotika), när de flesta av cellerna lösgörs från kolven. Överför celler till en 15-ml centrifugrör och centrifugera cellerna vid 1000 xg under 5 min.
    4. Återsuspendera cellpelleten med 5 ml cellodlingsmedium och ta bort ett prov för räkning av cellantal med en hemocytometer. Späd cellerna med cellkulturmedium till en densitet av 50.000 celler / ml. Tillsätt de utspädda-cellsuspensioner in i en 96-brunnars cellodlingsplatta (100 | j, l / brunn). Inkubera cellerna i en cellkultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) under 18 timmar för att tillåta cellvidhäftning.
    5. Späd DOX dimetylsulfoxid (DMSO) -lösning och DOX-PA DMSO-lösning med cellodlingsmedium för att erhålla slutliga läkemedelskoncentrationer av 0,1 ^ M, 0,5 ^ iM, 2 jiM, 5 pM, och 10 | iM, respektive. Hålla slutliga DMSO-koncentrationen i alla ovanstående prover till 0,5%. Späd DOX-PA micell med cellodlingsmedium för att erhålla slutliga läkemedels concentrations av 0,1 ^ M, 0,5 ^ iM, 2 jiM, 5 pM, och 10 pm, respektive. Använda den tomma cellkulturmediet en kontroll.
    6. Avlägsna 96-brunnars cellodlingsplatta från inkubatorn och ersätt cellodlingsmediet med 100 pl av mediet innehållande olika behandlingsmedel framställda i steg 3.3.5 (n = 4 för varje grupp). Inkubera cellerna i cellodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2) under ytterligare 72 timmar.
    7. Aspirera mediet och tillsätt 100 | il medium innehållande 0,5 mg / ml av 3- (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT).
    8. Inkubera cellerna i cellodlingsinkubator för ytterligare 2 h. Försiktigt bort mediet och tillsätt 100 pl DMSO för att upplösa formazankristallema.
    9. Mät absorbansen med mikro spektrofotometer vid en våglängd av 570 nm och en referensvåglängd av 670 nm.
    10. Beräkna cellviabiliteten med användning av följande ekvation:
      (A Test / A kontroll) × 100%
      OBS: Jämför cellviabiliteten mellan olika grupper med användning av en en-vägs variansanalys (ANOVA) statistiskt test. Beräkna IC 50 baserat på cellviabilitet uppgifter läkemedelskoncentration kontra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar syntesschemat av DOX-PA. DOX-PA syntetiserades genom konjugering av palmitinsyra med doxorubicin genom en pH-känslig hydrazon-bindning. Ett lätt överskott av palmitinsyra hydrazid användes för att underlätta fullbordandet av reaktionen. Denna reaktionsmetod har en mycket hög verkningsgrad och endast en liten mängd av doxorubicin återstod efter en 18 h reaktion (figur 2). Utbytet var ca 88%. Vid slutet av reaktionen tillsattes DOX-PA renas med användning av en silikagelkolonn och torkades för att erhålla en ren röd fast produkt. DOX-PA analyserades med TLC, som visade en enda fläck för renat DOX-PA (figur 2). Figur 3 visar ett H-NMR-spektrum av DOX-PA. Karakteristiska NMR toppar från både doxorubicin och palmitinsyra observerades, vilket ytterligare bekräftas framgångsrik konjugeringsreaktionen.

fig 4. Tomma DSPE-PEG-miceller utan läkemedel visas som en transparent vätska. DOX-PA DSPE-PEG miceller visas som en röd vätska; den röda färgen beror på DOX-PA laddad i micellerna. Representativa resultat av partikelstorleksanalys visas i figur 5. Z-genomsnittliga medelpartikelstorleken för tomma DSPE-PEG-miceller var 17,0 ± 0,5 nm (PDI = 0,034 ± 0,019). Laddningen av DOX-PA ökade micell partikelstorlek något; Z-genomsnittliga medelpartikelstorlek för DOX-PA DSPE-PEG miceller var 25,7 ± 1,6 nm (PDI = 0,407 ± 0,035).

DOX-PA-koncentrationen i micellen formuleringen bestämdes baserat på absorptionen vid 490 nm. DSPE-PEG har försumbar absorption vid denna våglängd, alltså inte blanda sig i analysen av DOX-PA koncentration. DOX-PA-koncentrationen i micellen formuleringen var1,99 ± 0,11 mg / ml och läkemedelsladdningen Effektiviteten var 99,3 ± 5,7%. Den höga inkapslingseffektiviteten är på grund av den lipofila särdrag av DOX-PA, vilket förbättrar dess retention i den hydrofoba kärnan av miceller. Formuleringen uppvisade utmärkt stabilitet. Det fanns ingen synlig utfällning vid förvaring vid - 4 ° C under 3 veckor. Ingen signifikant förändring i läkemedelskoncentration observerades under lagring.

DU-145 humana prostatacancerceller behandlades med olika koncentrationer av fritt doxorubicin, fri DOX-PA, och DOX-PA DSPE-PEG-miceller. Cellviabilitet bestämdes vid slutet av en 72 h behandling med användning av en MTT-analys (Figur 6). En koncentrationsberoende minskning av cellernas livsduglighet uppnåddes genom behandling av DU145-celler med fritt doxorubicin (IC50 = 0,10 | iM), fri DOX-PA (IC50 = 0,33 | iM), eller DOX-PA-miceller (IC50 = 0,25 | iM). Trots att den fria doxorubicin är effektivare än fri DOX-PA eller DOX-PA miceller vid lägre koncentrationer (0,1 ^ M och 0,5 M), DOX-PA grupperna visade större minskning av cellviabilitet än fri doxorubicin vid högre koncentrationer (2-10 mikrometer). Dessutom föreföll det inte finnas någon signifikant skillnad mellan DOX-PA och DOX-PA miceller vid både högre och lägre koncentrationer. Tomma DSPE-PEG-miceller visade ingen toxicitet (data ej visade), vilket tyder på god biokompatibilitet och säkerhet för DSPE-PEG som ett läkemedelstillförsel bärarmaterial.

Figur 1
Figur 1. Syntes av lipofil prodrug av doxorubicin (DOX-PA) Reagens och betingelser:. Doxorubicin (DOX), palmitinsyra hydrazid (PA) och trifluorättiksyra (TFA) löst i metanol omrördes under 18 h vid RT i mörk. t = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Tunnskiktskromatografi (TLC). TLC av (1) doxorubicin, (2) råreaktionsblandningen, (3) palmitinsyra hydrazid, och (4) DOX-PA-konjugat. Prover togs fram med en blandning av diklormetan och metanol (3/1, v / v) och färgades med jod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. 1 H-NMR av DOX-PA i deutererad DMSO. Förekomsten av karakteristiska toppar från både DOX och PA visar framgång konjugeringsreaktionen.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Utseende av miceller. (A) DSPE-PEG miceller och (B) DOX-PA DSPE-PEG miceller. Representativa siffror presenteras för att visa förekomsten av tomma DSPE-PEG-miceller och DOX-PA DSPE-PEG miceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Partikelstorlek och storleksfördelning av miceller. (A) DSPE-PEG-miceller och (B) DOX -PA DSPE-PEG miceller. Micellen Storleken bestäms genom dynamisk ljusspridning. Representativa siffror presenteras för att visa partikelstorlek och storleksfördelning. Data som presenteras är medelvärde ± SD (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Anticancer aktivitet hos micell formuleringar DU145-celler behandlades. Under 72 timmar och cellviabiliteten mättes med användning av MTT-analysen. Data som presenteras i figuren är medelvärde ± SD (n = 4). *, P <0,01, jämfört med DOX behandlade grupperna. Det finns ingen statistisk skillnad mellan DOX-PA och DOX-PA miceller behandlade grupper. IC 50 beräknades baserat på cellviabilitet uppgifter läkemedelskoncentration kontra.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

bord 1

Tabell 1. CH 2 Cl 2 / CH3OH eluerande lösningsmedel som används vid rening av DOX-PA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta arbete, beskriver vi en okomplicerad, snabb film dispersion metod för framställning av miceller. Denna metod använder de självmonteringsegenskaperna hos en amfifil polymer (t.ex., DSPE-PEG) för att bilda kärna-skal-strukturerade miceller i en vattenhaltig miljö. Denna micell framställningsmetod har flera fördelar. 1. Det handlar om en enkel formulering process, som undviker användningen av komplicerade storleksreduktionssteg (såsom extrudering eller homogenisering) som vanligen används vid framställning av liposomer, nanopartiklar, och nanoemulsioner. 19 2. Den har en god reproducerbarhet. Utmärkt sats till sats konsistens kan uppnås när beredningen har optimerats och etablerat. Protokollet är tolerant mot variationer i framställningsprocessvariabler, såsom sonikering styrka och tid. Även om andra metoder (t.ex. dialys tillvägagångssätt eller emulsions lösningsmedelsindunstning metod) är tillgängliga för framställning av miceller, film dispersionMetoden är mer bekväm och effektiv. Därför har den en stor potential att vara anpassade för användning i storskalig tillverkning av miceller inom den farmaceutiska industrin. Begränsningen med denna metod är att det beror på självmonteringsegenskaper bärarmaterial och därmed är begränsad till material med sådana egenskaper. Olämplig val av polymera material kan leda till fel i att generera tillfredsställande micell formuleringar. Dessutom förlitar sig framställningsmetoden på ultrasonication att dispergera polymer / läkemedels-film och att underlätta bildningen av miceller. De flesta kommersiellt tillgängliga ultraljuds bad är lämpliga för det krävs bara en svag ultraljud makt för att bilda miceller. Emellertid kan det vara ett problem om ett ultraljudsbad med en mycket svag effekt används.

Dålig läkemedelsbelastning och för tidig frisättning av läkemedel är viktiga frågor för micell drug delivery. I detta protokoll, har vi utvecklat ett lipofilt prodrug strategi för att öka belastningenIng av doxorubicin till DSPE-PEG miceller. Konjugering av doxorubicin med lipider avsevärt förbättrad kompatibilitet och interaktion av läkemedlet med lipid kärna DSPE-PEG miceller. Den pro-drug, DOX-PA, syntetiserades genom att konjugera doxorubicin med lipid genom ett surt pH-känslig hydrazon-linker. Denna länk är stabil vid neutralt pH och kan klyvas vid surt pH. 20,21 således DOX stabilt laddad i DSPE-PEG miceller som en pro-läkemedel vid neutralt pH och har minimal läkemedelsläckage under lagring och under cirkulation i blodet. Gång DOX-PA-miceller anger tumörceller genom endocytos, kommer DOX-PA prodrug klyvas och omvandlas till fri DOX som svar på den sura endosom miljö (pH 5-6). Eftersom DOX är mer hydrofila än DOX-PA, kommer denna omvandling störa samspelet mellan DOX och den hydrofoba kärnan av miceller, och på så sätt underlätta en snabb frigivning av DOX från miceller. Denna innovativa design funktionen undvika ofullständig frisättning av läkemedel, somär ett stort problem i samband med läkemedelskonjugat som använder icke-klyvbara eller långsam-klyvnings linkers. 22 Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas till leverans av andra droger. Valet av en lämplig linker är avgörande för att lyckas med detta tillvägagångssätt. De linkrar bör vara stabila i en fysiologisk miljö för att maximera stabiliteten hos formuleringen. Linkers bör också effektivt klyvs som svar på triggers i tumören mikromiljö (t.ex. pH, enzymer, etc) för att frigöra moderläkemedlet.

I detta protokoll, var DOX-PA effektivt laddas i miceller med hög inkapslingseffektivitet (~ 100%). Micellen formulering visade också överlägsen stabilitet och förblev intakt under åtminstone tre veckor utan läkemedel utfällning eller minskning av läkemedelskoncentrationen. Detta beror på den ökade interaktionen mellan lipiddelar i pro-läkemedlet och lipid kärna DSPE-PEG miceller. Engineering compatibility av bärarmolekyler med läkemedel för att förbättra deras interaktion är en lovande strategi för att förbättra prestandan hos miceller och andra nanocarriers. Denna metod kan förbättra läkemedelsbelastning och minimera för tidigt frisättning av läkemedel för dessa nanocarriers. 23 Valet av en lämplig läkemedels / polymerparet är ett kritiskt steg i utformningen micellen formuleringen. Strukturen för läkemedelsmolekyler kan modifieras (pro-drug metod) eller utformningen av bärarmaterial kan optimeras för att förbättra kompatibiliteten och öka läkemedel / bärare interaktioner. 23 24 Dessutom kan datormodellering vara ett användbart verktyg för att hjälpa i optimeringen av nanocarriers och gör det möjligt att framställa ett skräddarsytt utformad nanocarrier för specifik ett specifikt läkemedel.

Sammanfattningsvis beskriver vi här ett förfarande för att syntetisera en lipofil prodrug av doxorubicin. Protokoll för framställning och karakterisering av läkemedelsladdade miceller är också described. Den film dispersionen metod är ett enkelt och lovande metod för framställning av en mängd olika nanoskala självmonteringsleveranssystem. De karakteriseringsmetoder som beskrivs här kan användas som standard in vitro-analyser för att bestämma egenskaperna hos nanoläkemedel, vilket kan underlätta optimering av formulerings- och produktutvecklingsprocesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17, (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6, (6), 1085-1100 (2011).
  3. Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9, (55), (2011).
  4. Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26, (9), 2081-2092 (2009).
  5. Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11, (10), 2610-2620 (2010).
  6. Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1, (6), 9 (2011).
  7. Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143, (1), 151-158 (2010).
  8. Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54, (2), 223-233 (1998).
  9. Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7, (1), 111-120 (2012).
  10. Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
  11. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48, (2), 101-111 (1999).
  12. Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11, (8), 2600-2611 (2014).
  13. Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334, (2), 253-262 (2013).
  14. Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86, (1), 93-100 (2003).
  15. Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164, (1), 95-102 (2012).
  16. Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46, (1-2), 67-71 (2012).
  17. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43, (14), 2923-2925 (1978).
  18. New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
  19. Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
  20. Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87, (1-3), 33-47 (2003).
  21. Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13, (9), 11681-11693 (2012).
  22. Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11, (8), 2094-2102 (2010).
  23. Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8, (1), 20-36 (2012).
  24. Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics