Bereiding en karakterisering van lipofiele doxorubicine Pro-drug micellen

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een protocol voor de bereiding en karakterisering van lipofiele doxorubicine pro-geneesmiddel beladen 1,2-distearoyl- sn glycero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polyethyleenglycol) -2000] (DSPE-PEG) micellen wordt beschreven.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Chemotherapie wordt vaak gebruikt om diverse vormen van kanker te behandelen. De meeste, zo niet alle, chemotherapie drugs hebben toxische bijwerkingen die kunnen variëren van kleine beheersbare omstandigheden zoals misselijkheid en diarree, meer levensbedreigende aandoeningen. Omdat de meeste antikankergeneesmiddelen zijn giftig, niet-selectieve blootstelling van deze geneesmiddelen met normaal weefsel onvermijdelijk een toxiciteit. Daarom is er een grote behoefte aan een therapeutische benadering die selectief geneesmiddelen kan leveren in kankercellen. Een andere uitdaging met de toediening van geneesmiddelen tegen kanker is hun slechte oplosbaarheid in water. Gewoonlijk worden oplosbaarmakende middelen nodig om deze slecht oplosbare geneesmiddelen te formuleren. Evenwel meeste solubiliserende middelen, zoals dimethylsulfoxide (DMSO), Cremophor EL en Polysorbaat 80 (Tween 80) lever- en niertoxiciteit, hemolyse, acute overgevoeligheidsreacties en perifere neuropathieën Daarom veroorzaken. 1, zijn veilige en biocompatibele samenstellingen die nodig zijn voor het klinisch gebruik van slechtely oplosbare geneesmiddelen tegen kanker. Nanocarriers zijn veelbelovende drug delivery systemen voor de aanpak van de bovengenoemde uitdagingen. Deze nanocarriers omvatten liposomen, 2 nanodeeltjes, 3 micellen, 4-7 polymeer-drug conjugaten, 8 en anorganische materialen. 9 Verschillende nanomedicine producten (bv Doxil, Abraxane en Genexol) zijn goedgekeurd door de regelgevende agentschappen goedgekeurd voor de behandeling van kankerpatiënten. 10

Polymere micellen zijn veelbelovende nano-schaal drug delivery dragers, die met succes zijn gebruikt voor de levering van geneesmiddelen tegen kanker. 4-7,11,12 Typische polymere micellen worden bereid uit amfifiele polymeren door middel van een zelf-assemblage proces. De kern-schil gestructureerde polymere micellen omvatten een hydrofiele schaal en een hydrofobe kern. De hydrofiele dop kunnen sterisch stabiliseren micellen en verlengen hun circulatie in het bloed stream. De hydrofobe kern kan effectief kapselen hydrofobe dtapijten. Door de geringe omvang van micellen (typisch minder dan 200 nm) en de lange circulatie eigenschappen zijn polymere micellen aangenomen tumor targeting bereiken via verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effect (passieve tumortargeting).

Geneesmiddelbelading stabiliteit is kritisch voor de tumor targeting vermogen van micellen. Optimale tumor targeting bereiken moeten micellen minimale drug lekkage alvorens de tumor, maar snel het geneesmiddel af te geven na het invoeren van kankercellen. Daarnaast formulering stabiliteit is een essentiële voorwaarde voor productontwikkeling, omdat formulering stabiliteit bepaalt de haalbaarheid van productontwikkeling, evenals de houdbaarheid van ontwikkelde producten. Onlangs heeft veel moeite gedaan om het laden van drugs te verbeteren in de levering dragers. Het lipofiele prodrug benadering is een strategie die is onderzocht om geneesmiddelbelading verbetering in lipidenanodeeltjes en emulsies. 13,14 de conjugation van lipiden met geneesmiddelen kan een aanzienlijke verbetering van hun lipofiliteit en versterken van het laden en retentie in de lipofiele componenten van nanocarriers.

We beschrijven hier een protocol voor het bereiden lipofiele doxorubicine pro-geneesmiddel beladen micellen. Eerst wordt de syntheseprocedure voor doxorubicine lipofiele prodrug beschreven. Vervolgens wordt een protocol voor het genereren van micellen met een film-dispersiewerkwijze geïntroduceerd. Deze werkwijze is met succes gebruikt in onze eerdere studies. 5 DSPE-PEG werd geselecteerd als dragermateriaal voor de bereiding micellen omdat het succes gebruikt voor micel geneesmiddelafgifte. 15,16 Tenslotte wij verschillende in vitro assays worden gebruikt om micellen te karakteriseren beschrijven formuleringen en antikanker activiteit te evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Synthese van DOX-PA

  1. Weeg 390 mg doxorubicine en 243 mg palmitinezuur hydrazide en overbrengen naar een rondbodemkolf.
  2. Voeg 150 ml watervrije methanol aan de kolf met een glazen spuit. Voeg 39 ul trifluorazijnzuur (TFA) met een pipet. Met behulp van een magnetische roerder, roer het reactiemengsel gedurende 18 uur bij KT in het donker.
    OPMERKING: De hoeveelheden reactiematerialen kan worden vergroot of verkleind met verschillende hoeveelheden DOX-PA verkrijgen. De verhouding van reactanten moeten in dezelfde verhouding wordt gehandhaafd. Reacties onder gebruikmaking DOX hoeveelheden in het traject van 78 mg tot 1170 mg kan worden uitgevoerd in een gewone chemisch laboratorium.
  3. Zuivering van DOX-PA gebruikmaking van een silicagelkolom. 17
    1. Verwijder het oplosmiddel in het reactiemengsel met een roterende verdamper. Voeg 3 g silicagel na het volume van het mengsel wordt teruggebracht tot ongeveer 20 ml. Blijven rotatieverdamping droge poeders geven en t toestaanhij adsorptie van producten op het silicagel. Bewaar het monster onder vacuüm gedurende nog 30 min nadat de droge poeders worden gevormd.
    2. Pak 50 g silicagel in een kolom met dichloormethaan als oplosmiddel. Voeg voorzichtig het silicagel monster met geadsorbeerde product aan de kolom.
    3. Elueer de kolom met een mengsel van dichloormethaan en methanol, en stijgt het percentage methanol toe, waardoor oplosmiddelpolariteit (tabel 1) verhogen.
    4. Verzamel fracties eluent in reageerbuizen (25 ml / buis) en de voortgang van dunnelaagchromatografie (TLC).
    5. Combineer alle fracties die zuiver DOX-PA en verwijder het oplosmiddel met een rotatieverdamper tot droog poeder wordt gevormd. Verdere droog het product onder vacuüm O / N.
  4. Analyse van DOX-PA door TLC.
    1. Snijd een 4 cm x 8 cm doorsnede van TLC-plaat. Steekproefmetingen oplossingen 0,5 cm van de bodem van de plaat met TLC spotting capillairen met gebruikmakinghanol als oplosmiddel.
    2. Plaats de TLC plaat in een ontwikkelkamer die een mengsel van dichloormethaan en methanol (3/1, v / v). De diepte van oplosmiddel dient iets minder dan 0,5 cm.
    3. Neem de plaat uit de tank, wanneer het oplosmiddel voor de bovenkant van de plaat is gekomen. Markeer de locatie van het oplosmiddel front met een potlood en laat de plaat drogen. Plaats de DLC-plaat in een kleuring kamer die verzadigde jodium damp om monsters te visualiseren.
  5. Analyse van DOX-PA met een 1 H-NMR spectroscopie (1H-NMR). 18
    1. Los op 15 mg DOX-PA in 1 ml methyl-d6 sulfoxide (DMSO) en breng het monster in een NMR-buis.
    2. Plaats de NMR buis in de magneet van de NMR instrument. Meet de proton spectrum, selecteren DMSO als oplosmiddel. Verwijder de NMR-buis van de magneet. Analyseer de NMR resultaat 18.

2. Bereiding van DOX-PA micellen door Film dispersie Methode

  1. Oplossen DSPE-PEG (40 mg) en DOX-PA (4 mg) met 2 ml methanol in een 10 ml glazen flesje.
  2. Verwijder het organische oplosmiddel onder vacuüm met een rotatieverdamper tot een dunne film vormt in de flacon.
    NB: Als alternatief, verdampen de organische oplosmiddelen onder inert gas (bijvoorbeeld argon of stikstofgas) om een film te vormen en houdt het flesje in een vacuüm exsiccator om resterend oplosmiddel verder te verwijderen.
  3. Overdracht 2 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4, DPBS) op het glazen flesje.
  4. Plaats het flesje in een ultrasoon bad gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om micellen te genereren.
    OPMERKING: Ultrasone vermogen varieert tussen de verschillende modellen van ultrasoon baden. Selecteer een eenheid die voldoende ultrasone macht om de dunne polymeer / drug film verspreiden kan genereren. Het uitgangsvermogen van ultrasoonbad in dit protocol is 110 W.
  5. Houd micellen bij 4 ° C voor korte-termijn opslag en -20 ° C voor langere-term opslag.
    LET OP: U kunt micellen ook gevriesdroogd en gereconstitueerd met water voor gebruik. Gewoonlijk wordt geen cryoprotectant of lyoprotectant nodig voor deze formulering.

3. Karakterisering van DOX-PA micellen

  1. Bepaling van DOX-PA-concentratie in micellen en drugs inkapseling efficiëntie
    1. Dissolve DOX-PA gesynthetiseerd in vorige stappen in DMSO tot DOX-PA oplossingen van vijf verschillende concentraties te bereiden: 1 ug / ml, 5 ug / ml, 20 ug / ml, 50 ug / ml en 100 ug / ml. Meet de absorptie van DOX-PA oplossingen met een UV-VIS-spectrometer bij 490 nm. Genereren van een standaardcurve gebaseerd op de DOX-PA geneesmiddelconcentraties en bijbehorende absorptie bij 490 nm.
    2. Verdun 25 pl met geneesmiddel beladen micellen met 500 ul DMSO. Meet de absorptie bij 490 nm met een UV-VIS-spectrometer. Bereken geneesmiddelconcentraties met de standaard curve gegenereerd in 3.1.1.
    3. Bepalen inkapselingsefficiëntie met de volgende vergelijking:
      Drug inkapselingsefficiëntie (%) = (hoeveelheid geneesmiddelen in micellen) / (hoeveelheid toegevoegd geneesmiddel) x 100%
  2. Karakterisering van de deeltjesgrootte met dynamische lichtverstrooiing (DLS)
    1. Verdun micellen met DPBS (pH 7,4) tot een uiteindelijke DSPE-PEG concentratie van 1 mg / ml. Analyseren van een monster 2 ml met een deeltjesgrootte analysator om de Z-gemiddelde en polydispersiteitsindex (PDI) te verkrijgen.
  3. Evaluatie van in vitro antikanker activiteit
    LET OP: Gebruik de juiste steriele techniek en werken in een bioveiligheid kast.
    1. Verwijder het celkweekmedium van een celkweekkolf (bijv T25) bevattende DU-145 menselijke prostaatkankercellen en spoel de cellen met 2 ml DPBS (pH 7,4).
    2. Aspireren DPBS, voeg 1 ml trypsine-oplossing (0,25%) en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C om de cellen los.
    3. Voeg 10 ml celkweekmedium (RPMI 1640 + 10% foetaal runderserum + 1% antibiotica Antimycoticum), wanneer de meeste van de cellen losgemaakt van de fles. Overdracht cellen om een ​​15 ml centrifugebuis en gecentrifugeerd bij 1000 xg cellen gedurende 5 min.
    4. Resuspendeer de celpellet met 5 ml celkweekmedium en verwijderen van een monster voor tellen celaantallen met een hemocytometer. Verdun de cellen met celkweekmedium tot een dichtheid van 50.000 cellen / ml. Voeg de verdunde-celsuspensies in een 96-well celcultuur platen (100 ul / putje). Incubeer de cellen in een celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 18 uur om celhechting mogelijk.
    5. Verdun DOX dimethylsulfoxide (DMSO) oplossing en DOX-PA DMSO oplossing celkweekmedium definitieve geneesmiddel verdunningen bereid van 0,1 pM, 0,5 pM, 2 pM, 5 pM en 10 pM, respectievelijk. Houd uiteindelijke DMSO-concentratie in alle bovenstaande monsters naar 0,5%. Verdun DOX-PA micellen met celkweekmedium tot de uiteindelijke drug co verkrijgenncentrations van 0,1 pM, 0,5 pM, 2 pM, 5 pM en 10 pM, respectievelijk. Gebruik de lege cel kweekmedium controle.
    6. Verwijder de 96-well celkweek plaat uit de incubator en vervang het celkweekmedium met 100 pl medium dat verschillende behandelingsmiddelen bereid in stap 3.3.5 (n = 4 per groep). Incubeer de cellen in de celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende nog 72 uur.
    7. Zuig het medium en voeg 100 pl medium dat 0,5 mg / ml 3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolium bromide (MTT).
    8. Incubeer de cellen in de celkweek incubator gedurende nog 2 uur. Verwijder voorzichtig het medium en voeg 100 ul DMSO tot formazan kristallen op te lossen.
    9. Meet absorptie bij de microplaat spectrofotometer bij een golflengte van 570 nm en een referentie golflengte van 670 nm.
    10. Bereken de cellevensvatbaarheid met behulp van de volgende vergelijking:
      (A test / controle) × 100%
      OPMERKING: Vergelijk de levensvatbaarheid van de cellen tussen verschillende groepen met behulp van een one-way variantie-analyse (ANOVA) statistische toets. Bereken de IC 50 op basis van cellevensvatbaarheid versus geneesmiddelconcentratie data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont het syntheseschema van DOX-PA. DOX-PA werd bereid door conjugatie van palmitinezuur met doxorubicine via een pH-gevoelige hydrazon binding. Een geringe overmaat palmitinezuur hydrazide werd gebruikt voor de voltooiing van de reactie te vergemakkelijken. Deze reactiewerkwijze heeft een zeer hoog rendement en slechts een kleine hoeveelheid doxorubicine bleef na 18 uur reactie (Figuur 2). De opbrengst was ongeveer 88%. Na afloop van de reactie werd DOX-PA gezuiverd met een silicagelkolom en gedroogd tot een pure red vast product. DOX-PA werd geanalyseerd met TLC, waarbij een enkele plek voor gezuiverd DOX-PA (figuur 2) vertoonde. Figuur 3 toont het 1H-NMR spectrum van DOX-PA. NMR karakteristieke pieken van zowel doxorubicine en palmitinezuur werden waargenomen, hetgeen verder bevestigd succes van de conjugatiereactie.

figuur 4. Lege DSPE-PEG micellen zonder geneesmiddel verschijnen als een transparante vloeistof. DOX-PA DSPE-PEG micellen weergegeven als een rode vloeistof; de rode kleur is als gevolg van de DOX-PA in de micellen geladen. Representatieve resultaten van de deeltjesgrootte analyse zijn weergegeven in figuur 5. De gemiddelde grootte Z-gemiddelde deeltjesgrootte van blanco DSPE-PEG micellen was 17,0 ± 0,5 nm (PDI = 0,034 ± 0,019). Het laden van DOX-PA verhoogd micellen deeltjesgrootte iets; de gemiddelde afmeting Z-gemiddelde deeltjesdiameter van DOX-PA DSPE-PEG micellen was 25,7 ± 1,6 nm (PDI = 0,407 ± 0,035).

De DOX-PA-concentratie in de micellen formulering werd bepaald op basis van de absorptie bij 490 nm. DSPE-PEG verwaarloosbare absorptie bij deze golflengte, dus niet mengen in de analyse van DOX-PA-concentratie. De DOX-PA-concentratie in het preparaat was micellen1,99 ± 0,11 mg / ml en de geneesmiddelbelading rendement bedroeg 99,3 ± 5,7%. De hoge inkapselingsefficiëntie te wijten aan de lipofiele eigenschap van DOX-PA, die het behoud ervan in de hydrofobe kern van de micellen verbetert. De formulering heeft een uitstekende stabiliteit. Er was geen zichtbare neerslag indien bewaard bij - 4 ° C gedurende 3 weken. Geen significante verandering in geneesmiddelconcentratie werd waargenomen tijdens opslag.

DU-145 menselijke prostaatkankercellen werden behandeld met verschillende concentraties van vrij doxorubicine, vrij DOX-PA en PA-DOX DSPE-PEG micellen. Cellevensvatbaarheid werd bepaald aan het einde van een 72 uur behandeling met behulp van een MTT assay (figuur 6). Een concentratie-afhankelijke vermindering in cellevensvatbaarheid werd bereikt door behandeling DU145 cellen met vrij doxorubicine (IC50 = 0,10 uM), vrij DOX-PA (IC50 = 0,33 uM) of DOX-PA micellen (IC50 = 0,25 uM). Hoewel vrij doxorubicine is effectiever dan free DOX-PA of DOX-PA micellen bij lagere concentraties (0,1 uM en 0,5 uM), DOX-PA vertoonden grotere vermindering van levensvatbaarheid van de cellen dan vrij doxorubicine bij hogere concentraties (2-10 uM). Ook bleek er geen significant verschil tussen DOX-PA en PA-DOX micellen bij zowel hogere als lagere concentraties. Lege DSPE-PEG micellen vertoonden geen toxiciteit (gegevens niet getoond), wat aangeeft goede biocompatibiliteit en veiligheid van DSPE-PEG als geneesmiddelafgifte dragermateriaal.

Figuur 1
Figuur 1. Synthese van lipofiele prodrug van doxorubicine (DOX-PA) Reagentia en omstandigheden:. Doxorubicine (DOX), palmitinezuur hydrazide (PA) en trifluorazijnzuur (TFA) opgelost in methanol werd gedurende 18 uur bij KT in het donker. t = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Dunne laag chromatografie (TLC). TLC van (1) doxorubicine, (2) ruwe reactiemengsel (3) palmitinezuur hydrazide, en (4) DOX-conjugaat PA. De monsters werden ontwikkeld met een mengsel van dichloormethaan en methanol (3/1, v / v) en gekleurd met jodium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. 1H-NMR DOX-PA in gedeutereerd DMSO. De aanwezigheid van karakteristieke pieken van zowel DOX en PA toont het succes van de conjugatiereactie.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Uiterlijk van micellen. (A) DSPE-PEG micellen en (B) DOX-PA DSPE-PEG micellen. Representatieve cijfers worden gepresenteerd om de verschijning van blanco DSPE-PEG micellen en DOX-PA DSPE-PEG micellen te tonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Deeltjesgrootte en grootteverdeling van micellen. (A) DSPE-PEG micellen en (B) DOX -PA DSPE-PEG micellen. De micel grootte wordt bepaald door middel van dynamische lichtverstrooiing. Representatieve cijfers gegeven deeltjesgrootte en grootteverdeling demonstreren. Gepresenteerde gegevens zijn gemiddelden ± SD (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6. Anti-kanker activiteit van micel samenstellingen. DU145 cellen werden gedurende 72 uur en cellevensvatbaarheid werd gemeten met de MTT assay. Gegevens die in de figuur zijn gemiddelden ± SD (n = 4). * P <0,01, vergeleken met DOX behandelde groepen. Er is geen statistisch verschil tussen DOX-PA en DOX-PA micellen behandelde groepen. IC50 werd berekend op basis cellevensvatbaarheid versus geneesmiddelconcentratie data.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

tafel 1

Tabel 1. CH 2Cl 2 / CH3OH eluens gebruikt bij de zuivering van DOX-PA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit werk beschrijven we een eenvoudige, snelle werkwijze film-dispersie voor de bereiding van micellen. Deze werkwijze gebruikt de zelfassemblage eigenschappen van een amfifiel polymeer (bijvoorbeeld PEG-DSPE) aan kern-mantel structuur micellen vormen in een waterige omgeving. Deze micellen bereidingswijze heeft verschillende voordelen. 1. Het gaat om een eenvoudige formulering proces dat het gebruik van ingewikkelde stappen verkleinen van de deeltjes (zoals extrusie of homogeniseren) gewoonlijk in de bereiding van liposomen, nanodeeltjes en nano-emulsies. 19 2 voorkomt. Het heeft een goede reproduceerbaarheid. Uitstekende batch-tot-batch consistentie wordt bereikt zodra de formulering geoptimaliseerd en vastgesteld. Het protocol is tolerant voor variaties in voorbereiding procesvariabelen, zoals sonicatie kracht en tijd. Hoewel andere werkwijzen (zoals dialyse benadering of emulsie-oplosmiddelverdamping benadering) zijn beschikbaar voor het bereiden micellen, de film dispersiemethode is gemakkelijker en efficiënter. Derhalve heeft een groot potentieel om te worden aangepast voor gebruik in grootschalige productie van micellen in de farmaceutische industrie. De beperking van deze werkwijze is dat het afhangt van de zelfassemblage eigenschappen dragermaterialen en wordt dus beperkt tot materialen met dergelijke eigenschappen. De ongepaste selectie van polymere materialen kan leiden tot storing in het genereren van een bevredigende micellen formuleringen. Bovendien, de bereidingswijze berust op ultrasone trillingen aan het polymeer / geneesmiddelfilm dispergeren en om de vorming van micellen te vergemakkelijken. De meeste commercieel beschikbare ultrasone baden geschikt omdat slechts een zwakke ultrasone vermogen nodig om micellen te vormen. Het kan echter een probleem zijn als een ultrasoon bad met een zeer zwakke stroom wordt gebruikt.

Slechte drug laden en voortijdige geneesmiddelafgifte zijn grote bezorgdheid voor micellen drug delivery. In dit protocol, ontwikkelden we een lipofiel pro-drug strategie om de belasting te verbeterening van doxorubicine in DSPE-PEG micellen. Conjugatie van doxorubicine met lipiden aanzienlijk verbeterde verenigbaarheid en interactie van het geneesmiddel met het lipide kern van DSPE-PEG micellen. De prodrug, DOX-PA, gesynthetiseerd door conjugeren met doxorubicine lipide met een zure pH-responsieve hydrazon linker. Deze linker is stabiel bij een neutrale pH en splitsbare bij zure pH. 20,21 Aldus wordt DOX stabiel in DSPE-PEG geladen micellen als een prodrug bij neutrale pH en een minimale drugs lekkage tijdens opslag en tijdens circulatie in het bloed. Zodra DOX-PA micellen Voer tumorcellen door middel van endocytose, zal DOX-PA prodrug worden gesplitst en omgezet in vrije DOX in reactie op de endosomale zure milieu (pH 5-6). Omdat DOX is meer hydrofiel dan DOX-PA, zal deze omzetting de interacties tussen DOX en de hydrofobe kern van de micellen verstoren en daardoor de snelspanner DOX van micellen vergemakkelijken. Dit innovatieve ontwerp functie zal onvolledige drug release, te voorkomen dieis een belangrijk probleem in verband met geneesmiddelconjugaten met behulp van niet-splitsbare of slow-linkers splitsen. 22 Deze benadering kan ook worden toegepast op de afgifte van andere geneesmiddelen. De keuze van een geschikte linker is cruciaal voor het succes van deze benadering. De linkers moet stabiel zijn in een fysiologische omgeving om de stabiliteit van de formulering te maximaliseren. De linkers moet ook efficiënt worden gesplitst in reactie op triggers in de tumor micro-omgeving (bijvoorbeeld pH, enzymen, etc.) aan de ouder geneesmiddel af te geven.

In dit protocol werd DOX-PA efficiënt geladen in micellen met een hoge inkapselingsefficiëntie (~ 100%). De micel formulering ook een superieure stabiliteit en bleef intact gedurende ten minste drie weken zonder geneesmiddel precipitatie of vermindering van geneesmiddelconcentratie. Dit komt door de verbeterde interactie tussen lipidedelen in de prodrug en de lipide kern van DSPE-PEG micellen. Engineering van de compatibibaarheid van dragermoleculen met geneesmiddelen op hun wisselwerking te verbeteren is een veelbelovende strategie voor het verbeteren van de prestaties van micellen en andere nanocarriers. Deze benadering kan geneesmiddelbelading verbeteren en het minimaliseren voortijdige geneesmiddelafgifte deze nanocarriers. 23 De keuze van een geschikt geneesmiddel / polymeer paar is een kritische stap in het ontwerp van de micel formulering. De structuur van geneesmiddel moleculen worden gemodificeerd (prodrug benadering) of het ontwerp van dragermaterialen kan teneinde de compatibiliteit te verbeteren en geneesmiddel / carrier interacties versterken geoptimaliseerd. 23 24 Bovendien kan computermodellering een nuttig hulpmiddel zijn bij te in de optimalisatie van nanocarriers en maken het mogelijk om een ​​op maat gemaakt voor specifieke Nanodrager een specifiek geneesmiddel te bereiden.

Samengevat beschrijven we hier een methode om een ​​lipofiel prodrug van doxorubicine synthetiseren. Protocollen voor de bereiding en karakterisering van het geneesmiddel beladen micellen zijn ook descrik wed. De film-dispersie methode is een eenvoudige en veelbelovende werkwijze voor de bereiding van een verscheidenheid van nanoschaal zelfassemblage afgiftesystemen. De karakterisering hier beschreven methoden kunnen worden gebruikt als standaard in vitro assays om de eigenschappen van nanomedicijnen bepalen, kan dus het optimaliseren van formulering en productontwikkelingsprocessen vergemakkelijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17, (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6, (6), 1085-1100 (2011).
  3. Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9, (55), (2011).
  4. Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26, (9), 2081-2092 (2009).
  5. Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11, (10), 2610-2620 (2010).
  6. Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1, (6), 9 (2011).
  7. Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143, (1), 151-158 (2010).
  8. Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54, (2), 223-233 (1998).
  9. Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7, (1), 111-120 (2012).
  10. Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
  11. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48, (2), 101-111 (1999).
  12. Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11, (8), 2600-2611 (2014).
  13. Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334, (2), 253-262 (2013).
  14. Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86, (1), 93-100 (2003).
  15. Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164, (1), 95-102 (2012).
  16. Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46, (1-2), 67-71 (2012).
  17. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43, (14), 2923-2925 (1978).
  18. New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
  19. Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
  20. Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87, (1-3), 33-47 (2003).
  21. Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13, (9), 11681-11693 (2012).
  22. Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11, (8), 2094-2102 (2010).
  23. Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8, (1), 20-36 (2012).
  24. Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics