Lipofilik Doksorubisin Pro-ilaç misellerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Lipofilik doksorubisin ön-ilacın hazırlanması ve tanımlanması için bir protokol, 1,2-distearoil, sn -glisero-3-phosphoethanolamine- N yüklü - [amino (polietilen glikol) -2000] (DSPE-PEG) miseller anlatılmıştır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kemoterapi genellikle çeşitli kanser tiplerini tedavi etmek için kullanılır. hepsi değilse de çoğu, kemoterapi ilaçları daha fazla yaşamı tehdit eden koşullara, bulantı ve ishal gibi yönetilebilir küçük koşullar değişebilir toksik yan etkileri vardır. En antikanser ilaçların toksik olduğundan, normal dokuya bu ilaçların seçici olmayan maruz kaçınılmaz toksisiteye neden olur. Bu nedenle, seçici bir şekilde kanser hücrelerine ilaç teslim bir terapötik yaklaşım için büyük bir ihtiyaç vardır. antikanser ilaçların verilmesi ile diğer zorluk da kötü su çözünürlüğü olduğunu. Genellikle, çözündürücü maddeler, bu az çözünen ilaçların formüle edilmesi gereklidir. Bununla birlikte, dimetil sülfoksit gibi en çözündürücü maddeler, (DMSO), Cremophor EL, ve polisorbat 80 (Tween 80), karaciğer ve böbrek toksisitesi, hemoliz, akut yüksek tansiyon tepkilerine ve periferal nöropatiler neden olabilir. 1 Bu nedenle, güvenli ve biyo-uyumlu formülasyonlar için gerekli olan yoksul klinik kullanımıly çözünür antikanser ilaçlar. Nanocarriers yukarıdaki zorlukları ele almak için ilaç taşıyıcı sistemleri umut vericidir. Bu nanocarriers lipozomlar, 2 nano-tanecikleri, 3 miseller, 4-7, polimer-ilaç konjügatları, 8 ve inorganik malzemeler bulunmaktadır. 9 Çeşitli Nanomedicine ürünleri (örneğin, Doxil, Abraxane ve Genexol) kanser hastalarının tedavisinde düzenleyici kurumlar tarafından onaylanmıştır. 10

Polimerik miseller başarılı antikanser ilaçların verilmesi için kullanılan nano ölçekli ilaç verme taşıyıcılar, umut vericidir. 4-7,11,12 tipik bir polimerik miseller kendinden montaj işlemi boyunca amfifil polimerlerle hazırlanır. Çekirdek-kabuk yapılı polimer miseller bir hidrofilik ve bir hidrofobik kabuk çekirdek bulunmaktadır. hidrofil kabuk sterik miseller stabilize ve kanda kendi dolaşımını uzatabilir. hidrofobik çekirdek etkin bir şekilde hidrofobik d sarabilirizkilim. Çünkü miseller (tipik olarak en az 200 nm) ve uzun sirkülasyon özelliklerinin küçük boyutu, polimerik miseller gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkileri (pasif tümör hedefleme) ile hedef tümör elde inanılmaktadır.

İlaç yükü stabilite miseller yeteneğini hedef tümör için önemlidir. Optimal tümör hedefleme ulaşmak için, misel tümör sitesine ulaşmadan önce en az ilaç sızıntısı, henüz hızlı bir şekilde kanser hücrelerini girdikten sonra ilacı tahliye edilmelidir. formülasyon istikrar ürün geliştirme fizibilite yanı sıra geliştirilen ürünlerin raf ömrünü belirler, çünkü ek olarak, formülasyon stabilitesi, aynı zamanda ürün geliştirme için temel bir gerekliliktir. Son zamanlarda, çok çaba dağıtım taşıyıcılara ilaçların yükleme geliştirmek için yapılmıştır. Lipofilik ön-ilaç bir yaklaşım lipit nanopartiküller ve emülsiyonlar halinde ilaç yüklemesine geliştirmek için araştırılmaktadır bir stratejidir. 13,14 conjilaçlarla lipidlerin ugation önemli ölçüde iyileştirmek ve lipofilliğini nanocarriers lipofilik bileşenleri yükleme ve tutma artırabilir.

Burada, lipofilik doksorubisin yanlısı ilaç yüklü miseller hazırlamak için bir protokol açıklar. İlk olarak, lipofilik yanlısı ilaç doksorubisin için sentez prosedürü tarif edilmektedir. Daha sonra, bir film-dispersiyon yöntemi ile miseller oluşturmak için bir protokol verilmektedir. Bu yöntem, başarılı bir şekilde daha önceki çalışmalarda kullanılmıştır. 5 DSPE-PEG başarıyla misel ilaç verilmesi için kullanılmıştır, çünkü miseller hazırlanması için taşıyıcı malzeme olarak seçilmiştir. 15,16 Son olarak, misel karakterize etmek için kullanılan çeşitli in vitro analizler açıklanmaktadır formülasyonlar ve antikanser aktivitesini değerlendirmek için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

DOX-PA 1. Sentezi

  1. Doksorubisinin 390 mg ve palmitik asit hidrazid 243 mg ağırlığında ve yuvarlak dipli bir şişeye aktarın.
  2. cam şırınga ile şişeye susuz metanol 150 ml ekleyin. bir pipet ile trifloroasetik asit (TFA) 39 ul ekle. Manyetik bir karıştırıcı kullanarak, karanlıkta, oda sıcaklığında 18 saat boyunca reaksiyon karışımının karıştırın.
    NOT: Reaksiyon malzemelerin miktarları kadar ölçeklendirilebilir veya aşağı DOX-PA farklı miktarlarda elde etmek için. reaktiflerin oranı, aynı oranlarda muhafaza edilmelidir. 78 mg 1.170 mg aralığında DOX miktarlar kullanılarak reaksiyonlar düzenli kimya laboratuvar gerçekleştirilebilir.
  3. Bir silika jel kolonu kullanılarak DOX-PA ile saflaştırılması. 17.
    1. Bir dönen buharlaştıncı ile reaksiyon karışımında çözücüyü çıkarın. Karışımın hacmi yaklaşık 20 ml azaltılmış sonra, silika jel, 3 g ekleyin. kuru tozlar elde etmek için döner buharlaştırma devam edin ve t sağlamak içinO silika jel üzerine ürünlerin adsorplanmadan. Kuru tozlar oluştuktan sonra ilave bir 30 dakika boyunca vakum altında örnek tutun.
    2. bir çözücü olarak diklorometan kullanılarak bir sütun halinde, silika jel 50 g paketleyin. Dikkatle kolonuna adsorbe ürün silika jel içeren bir örnek ilave edin.
    3. Yavaş yavaş ve böylece çözücünün polaritesi (Tablo 1), artan metanol yüzdesi artırırken, bir diklorometan ve metanol karışımı ile sütun yıkayın.
    4. Test tüpleri içinde eluent fraksiyonlar (25 mi / tüp) toplayın ve ince tabaka kromatografisi (TLC) ile ilerlemesini izlemek.
    5. Saf DOX-PA içeren tüm fraksiyonlar birleştirilir ve kuru toz elde edilinceye kadar, bir döner evaporatör kullanılarak solvent çıkartılmıştır. Bundan başka, bir vakum O / N ve ürünle kurutun.
  4. TLC ile DOX-PA analizi.
    1. TLC plakası bir 4 cm x 8 cm uzunluğunda kesilir. TLC tespit kılcal damarların ile plakanın alt spot örnek çözümler 0.5 cm buluştu kullanarakçözücü olarak HANOL.
    2. diklorometan ve metanol karışımı içeren bir geliştirme odasına TLC plakasını (3/1, hac / hac). Çözücünün derinliği 0.5 cm sadece az olmalıdır.
    3. Çözücü ön plaka üst ulaştığında gelişmekte odasından plakasını sökün. Bir kalemle çözücü ön yerini işaretlemek ve plaka kurumasını bekleyin. örnekleri görselleştirmek için doymuş iyodin buharı ihtiva eden bir boyama odasına TLC plakasını.
  5. 1H-Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (1 'H-NMR) ile DOX-PA analizi. 18
    1. metil sülfoksit-d6 (DMSO) içinde 1 ml DOX-PS 15 mg çözülür ve bir NMR tüpü içine örnek aktarmak.
    2. NMR aracın cazibe merkezi haline NMR tüpü yerleştirin. Bir çözücü olarak DMSO seçilmesi, proton spektrumunun ölçün. mıknatıstan NMR tüpü çıkarın. NMR sonucu 18 analiz edin.

2. Film dağıtım metodu ile DOX-PA miseller hazırlanması

  1. DSPE-PEG (40 mg) ve DOX-PA (4 mg), 10 ml bir cam şişe içinde, 2 ml metanol ile çözülür.
  2. şişede ince bir film oluşana kadar bir döner buharlaştırıcı kullanılarak vakum altında organik çözücüyü çıkarın.
    Alternatif olarak, (örneğin, argon veya azot gazı), bir film oluşturmak ve daha fazla kalan solventin çıkması için bir vakum desikatörde flakon tutmak için atıl gaz altında, organik çözücüler buharlaştırılmış: NOT.
  3. Aktarım cam şişeye Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (pH 7.4, DPBS) içinde 2 mi.
  4. miseller oluşturmak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca ultrasonik bir banyoda şişe yerleştirin.
    NOT: Ultrasonik güç ultrasonik banyolarda farklı modeller arasında değişir. ince polimer / ilaç filmi dağıtmak için yeterli ultrasonik güç üretebilir bir birimi seçin. Bu protokolde kullanılan ultrasonik banyosunun çıkış gücü 110 W olan
  5. Kısa süreli depolama için 4 ° C'de miseller tutmak ve -20 ° C de, uzunuzun dönem depolama.
    Not: Alternatif olarak, misellerin dondurularak kurutulmuş ve kullanımdan önce su ile yeniden oluşturulabilir. Genellikle, herhangi bir dondurarak saklama koruyucusu ve liyoprotektan, bu formülasyon için gereklidir.

DOX-PA misellerin 3. karakterizasyonu

  1. Miseller ve ilaç kapsülleme verimliliği DOX-PA konsantrasyonunun belirlenmesi
    1. 1 ug / ml, 5 ug / ml, 20 ug / ml, 50 ug / ml ve 100 ug / ml: DOX-PA beş farklı konsantrasyonlarda DOX-PA çözeltiler hazırlanması DMSO içinde bir önceki adımda sentezlenmiştir çözülür. 490 nm'de bir UV-VIS spektrometresi ile DOX-PA çözeltiler emilimini belirlemek. DOX-PA madde konsantrasyonları ve 490 nm'de bunların karşılık gelen emme göre bir standart eğri oluşturur.
    2. DMSO, 500 ul ilaç yüklü misel 25 ul seyreltilir. Bir UV-VIS spektrometresi ile 490 nm'de emilim ölçülür. 3.1.1 oluşturulan standart eğri ile ilaç konsantrasyonlarını hesaplayın.
    3. Aşağıdaki denklem kullanılarak Kapsülleme verimliliği hesaplayın:
      İlaç Kapsülleme verimliliği (%) = (miseller ilaç miktarı) / (ilave ilaç miktarı) x% 100
  2. Dinamik ışık dağılımı ile parçacık boyutunun Karakterizasyonu (DLS)
    1. 1 mg / ml'lik bir son DSPE-PEG konsantrasyonuna DPBS (pH 7.4) ile miseller seyreltilir. Z-ortalama boyutu ve çok yönlü dağılma indeksi (PDI) elde etmek için bir parçacık boyutu analiz cihazı ile, 2 ml lik bir numuneyi analiz edin.
  3. In vitro anti-kanser etkinliğinin değerlendirilmesi
    NOT: Uygun steril tekniği kullanın ve bir biyogüvenlik kabini içinde çalışırlar.
    1. Bir hücre kültür şişesine (örn, T25) ihtiva eden, DU-145, insan prostat kanseri hücreleri, hücre kültürü ortamının çıkarın ve DPBS, 2 ml (pH 7.4) ile hücrelerin yıkayın.
    2. Aspire DPBS, tripsin solüsyonu (% 0.25) 1 ml ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edin.
    3. 10 m eklehücre kültürü aracı maddesi (RPMI 1640 +% 10 cenin sığır serumu +% 1 antibiyotik antimikotik), hücrelerin en şişeden çözülmüş olduğunda. 15 ml santrifüj tüpüne ve santrifüj 5 dakika boyunca 1000 x g'de hücreleri hücreleri aktarın.
    4. Hücre kültür ortamı, 5 ml hücre pelet yeniden askıya ve bir hemositometrede hücre adedini saymak için bir örnek çıkarın. 50,000 hücre / ml'lik bir yoğunluğa kadar hücre kültürü ortamı ile hücreleri seyreltilir. Bir 96-yuvalı hücre kültürü plakasının seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin (100 ul / oyuk). Bir hücre kültür inkübatörü içinde inkübe hücreleri (37 ° C,% 5 CO2) 18 saat hücre tutunmasını sağlar.
    5. sırasıyla, 0.1 uM ve 0.5 uM, 2 uM, 5 uM ve 10 uM nihai ilaç konsantrasyonlarını elde etmek için hücre kültürü ortamı ile DOX dimetil sülfoksit (DMSO) çözeltisi ve DOX-PA DMSO çözeltisi ile seyreltilir. % 0.5 her şeyden örneklerde nihai DMSO konsantrasyonu muhafaza edin. nihai ilaç CO elde etmek için hücre kültürü ortamı ile DOX-PA misel seyreltin0.1 uM ncentrations sırasıyla 0.5 uM, 2 uM, 5 uM, 10 uM,. Boş hücre kültürü ortamında bir denetimi kullanın.
    6. inkübatör 96 oyuklu hücre kültürü plakasının çıkarın ve (her bir grup için n = 4) adım 3.3.5 hazırlandı, farklı işleme maddeleri içeren ortama, 100 ul hücre kültür ortamı yerine. (2, 37 ° C,% 5 CO) ek 72 saat için hücre kültürü inkübatöründe inkübe hücreleri.
    7. orta aspire ve 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) ve 0.5 mg / ml ihtiva eden ortam 100 ul -2,5-difenil tetrazolyum bromid (MTT) ilave edin.
    8. 2 saat daha, hücre kültürü inkübatöründe inkübe hücreleri. Dikkatle orta kaldırmak ve formazan kristalleri eritmek için DMSO 100 ul ekleyin.
    9. 570 nm'lik bir dalga boyu ve 670 nm'lik bir referans dalga boyu mikroplaka spektrofotometresiyle absorbansı ölçülür.
    10. Aşağıdaki denklem kullanılarak hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması:
      (A Testi / bir kontrol) x% 100
      NOT: varyans (ANOVA) istatistik testi, tek-yönlü analizi kullanılarak farklı gruplar arasında hücre canlılığı karşılaştır. Ilaç konsantrasyon verileri vs hücre canlılığı dayalı IC 50 hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1, DOX-PS sentez şemasını göstermektedir. DOX-PA pH'a duyarlı hidrazon bağ yoluyla doksorubisin palmitik asit konjügasyonu sentezlendi. palmitik asit hidrazid hafif bir fazlalığı reaksiyon tamamlanmasını sağlamak için kullanılmıştır. Bu reaksiyon yöntemi çok yüksek bir etkinliğe sahip ve doksorubisinin sadece küçük bir miktar, bir 18 saat sonra (Şekil 2) ile gösterilmektedir. Verim yaklaşık% 88 idi. Reaksiyonun sonunda, DOX-PA, bir silika jel kolonu kullanılarak saflaştırılmış ve saf kırmızı bir katı ürün elde etmek için kurutulmuştur. DOX-PA saflaştırılmış DOX-PA (Şekil 2) için tek bir nokta gösterdi TLC ile analiz edildi. 3 DOX-PS 1 'H-NMR spektrumunu göstermektedir. Doksorubisin ve palmitik asit hem de karakteristik NMR tepe noktaları daha konjugasyon reaksiyon başarısı doğruladı gözlendi.

görünümü, Şekil 4 'de gösterilmiştir. ilaçsız boş DSPE-PEG miseller şeffaf bir sıvı olarak görünür. DOX-PA DSPE-PEG miseller kırmızı bir sıvı olarak görünür; Kırmızı renk miselleri yüklü DOX-PA kaynaklanmaktadır. Parçacık büyüklüğü analizi Örnek sonuçlar Şekil 5'de gösterilmektedir. Boş DSPE-PEG miseller Z-ortalama ortalama parçacık boyutu 17.0 ± 0.5 nM (PDI = 0.034 ± 0.019) idi. DOX-PA yükleme biraz misel partikül boyutu arttı; DOX-PA DSPE-PEG miseller Z-ortalama ortalama partikül büyüklüğü 25.7 ± 1.6 nm (PDI = 0.407 ± 0.035) idi.

misel formülasyonunda DOX-PA konsantrasyonu, 490 nm'de absorpsiyon göre belirlenmiştir. DSPE-PEG DOX-PA konsantrasyonunun analizi müdahale etmez, böylece, bu dalga boyunda çok az absorbsiyon yapar. misel formülasyonunda DOX-PA konsantrasyonu1.99 ± 0.11 mg / ml ve ilaç yükleme verimi 99.3 ±% 5.7 olmuştur. yüksek bir kapsülleme etkinliği nedeniyle miseller hidrofobik çekirdekte tutma artırır DOX-PA, lipofilik özelliği etmektir. daha yüksek kararlılık göstermiştir. 3 hafta boyunca 4 ° C'de - arasında saklandığında hiç bir görünür çökelme oluştu. ilaç konsantrasyonu önemli bir değişiklik depolama sırasında gözlenmemiştir.

DU-145, insan prostat kanseri hücreleri serbest doksorubisin, farklı konsantrasyonlarda serbest DOX-PA ve DOX-PA DSPE-PEG miseller ile muamele edilmiştir. Hücre canlılığı MTT (Şekil 6) ile 72 saat muamele sonunda belirlenmiştir. Hücre canlılığı, konsantrasyona bağımlı bir azalma serbest doksorubisin (IC50 = 0.10 uM), serbest DOX-PA (IC50 = 0.33 uM) ya da DOX-PA miseller (IC50 = 0.25 uM) ile birlikte, DU145 hücreleri muamele edilmesiyle elde edilmiştir. bilgilerini doksorubisin olmasına rağmen ücretsiz DOX-PA veya daha düşük konsantrasyonlarda DOX-PA miseller (0.1 uM ve 0.5 uM) daha etkili, DOX-PA grupları yüksek konsantrasyonlarda (2-10 uM) ücretsiz doksorubisin daha hücre canlılığı daha fazla azalma gösterdi. Ayrıca, hem yüksek ve düşük konsantrasyonlarda DOX-PA ve DOX-PA miseller arasında anlamlı bir fark olduğu ortaya çıktı. Boş DSPE-PEG miseller bir ilaç verme taşıyıcı malzeme olarak iyi bir biyo-uyumluluk ve DSPE-PEG güvenliğini göstermektedir (veriler gösterilmemiştir) hiç bir toksisite göstermiştir.

Şekil 1
Şekil 1 doksorubisin lipofilik ön-ilaç sentezi (DOX-PA) Tepkime maddeleri ve koşullar:., Metanol içerisinde çözündürüldü doksorubisin (DOX), palmitik asit hidrazid (PA) ve trifloroasetik asit (TFA), oda sıcaklığında 18 saat karıştırılmıştır karanlık. t = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. İnce tabaka kromatografisi (TLC),. (1) doksorubisin TLC, (2) Ham reaksiyon karışımı, (3) palmitik asit hidrazid, ve (4) DOX-PA konjugatı. Numuneler diklorometan ve metanol karışımı ile geliştirilmiştir (3/1, v / v) ve iyot ile boyandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Ikincil hale getirilmiş DMSO içinde DOX-PS Şekil 3. 1 'H-NMR. DOX PA ve karakteristik tepe noktası mevcudiyetiyle konjugasyon reaksiyonu başarısını ortaya koymaktadır.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Misellerin Şekil 4. hali. (A) DSPE-PEG miselleri ve (B) DOX-PA DSPE-PEG miseller. Temsili rakamlar boş DSPE-PEG miseller ve DOX-PA DSPE-PEG misellerin görünümünü göstermek için sunulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5. Partikül büyüklüğü ve misellerin boyut dağılımı. (A) DSPE-PEG miselleri ve (B) DOX -PA DSPE-PEG miseller. misel boyutu, dinamik ışık saçılımı ile belirlenir. Temsili rakamlar parçacık boyutu ve boyut dağılımı göstermek için sunulmuştur. Sunulan veriler ortalama ± SD (n = 3). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Misel formülasyonlarının Şekil 6. Kansere aktivitesi. DU145 hücreleri, MTT deneyi kullanılarak ölçüldü 72 saat ve hücre canlılığı için muamele edilmiştir. Şekilde sunulan veriler, ortalama ± SD (n = 4) bulunmaktadır. DOX grupları tedavi için * P <0.01, karşılaştırıldı. gruplar tedavi DOX-PA ve DOX-PA miseller arasında istatistiksel bir fark yoktur. IC50 ilaç konsantrasyon verileri genel hücre canlılığı ile hesaplanmıştır.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

tablo 1

DOX-PA saflaştırılmasında kullanılan çözücüleri elüsyon Tablo 1. CH2C! 2 / CH3 OH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, miseller hazırlanması için basit ve hızlı bir film-dispersiyon bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir amfifilik polimerin kendinden montaj özelliklerinden istifade (örneğin, DSPE-PEG) sulu bir ortamda çekirdek-kabuk yapılı miseller oluşturmak için. Bu misel hazırlama yöntemi birçok avantaja sahiptir. 1. Genellikle lipozom, nanopartiküller ve nanoemülsiyonlar. 19 2 hazırlanmasında kullanılan (örneğin, haddeleme ya da homojenizasyon gibi) karışık büyüklük azaltma adımlarının kullanımı önler, basit bir formülasyon işlemi içerir. İyi bir tekrarlanabilirlik vardır. Formülasyon optimize edilmiş ve kurulduktan sonra mükemmel partiden partiye tutarlılık elde edilebilir. protokol, sonikasyon gücü ve zaman olarak hazırlama prosesi değişkenlerde varyasyon, kalmaya toleranslıdır. (Örneğin, diyaliz yaklaşım ya da emülsiyon çözücü buharlaştırma yaklaşımı) için diğer yöntemler hazırlanması miseller için uygun olmasına rağmen, filmin dispersiyonyöntem daha kullanışlı ve verimli. Bu nedenle, ilaç endüstrisinde miseller büyük ölçekli üretiminde kullanılmak üzere adapte olmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu yöntemin bir sınırlama bu tür özelliklere sahip malzemelerin sınırlandırılmıştır ve böylece taşıyıcı malzeme montajı çok durumuna bağlıdır ve olmasıdır. Polimer malzemelerin uygunsuz seçimi tatmin edici misel formülasyonları üreten yetmezliğine yol açabilir. Buna ek olarak, hazırlama yöntemi, polimer / ilaç filmi dağılmasını ve misellerin oluşumunu kolaylaştırmak üzere ultrasonikasyon dayanır. sadece zayıf bir ultrasonik güç miselleri meydana getirmek üzere gerekli olan, çünkü çoğu ticari olarak temin edilebilen ultrasonik küvet uygundur. Çok zayıf bir güç ile bir ultrasonik banyoda kullanılan, ancak, bu bir sorun olabilir.

Kötü ilaç yükleme ve erken ilaç salım misel ilaç dağıtımı için önemli endişeleri vardır. Bu protokol, biz yükü geliştirmek için bir lipofilik ön-ilaç stratejisi geliştirdiDSPE-PEG miseller içine doksorubisin ing. lipidler ile doksorubisin çekimi anlamlı DSPE-PEG misellerin lipid çekirdeği ile ilacın uyumluluk ve etkileşim düzeldi. ön-ilaç, DOX-PA, bir asidik pH değerine duyarlı hidrazon bağ maddesi vasıtası ile lipid ile doksorubisin konjuge edilmesi yoluyla sentezlendi. Bu bağlayıcı. Bu nedenle, stabil bir şekilde DOX nötr pH'ta bir ön-ilaç olarak DSPE-PEG miseller yüklenen 20,21 asidik pH değerinde, nötr pH değerinde sabit ve ayrılabilen ve depolama sırasında ve kan dolaşım boyunca çok az ilaç kaçak var. DOX-PA misellerin endositoz yoluyla tümör hücrelerinin girdikten sonra, DOX-PA ön-ilaç ayrıldı ve asidik endozom ortamında (pH 5-6) karşılık olarak serbest DOX dönüştürülecektir. DOX DOX-PA 'den daha hidrofilik olduğu için, bu dönüşüm DOX miselin hidrofobik çekirdek arasında etkileşimlere müdahale, ve böylece misellerin gelen DOX hızlı salınmasını kolaylaştırmak olacaktır. Bu yenilikçi tasarım özelliği eksik ilaç salımı, önlemek hangiparçalanamayan ya da yavaş-yaran bağlayıcılar kullanılarak ilaç konjugatları ile ilişkili önemli bir sorun değildir. 22. Bu yaklaşım, diğer ilaçların verilmesinde uygulanabilir. Uygun bir bağlayıcı seçimi bu yaklaşımın başarı için önemlidir. bağlayıcılar, formülasyonun stabilitesini maksimize etmek için fizyolojik bir ortamda kararlı olmalıdır. Bağlayıcılar, aynı zamanda etkin bir şekilde ana ilacı serbest bırakmak için tümörün mikro (örneğin, pH, enzimler, vs.) tetikler yanıt olarak ayrılabilir olmalıdır.

Bu protokol, DOX-PA verimli yüksek bir kapsülleme etkinliği (~% 100) miseller içine yüklendi. misel Formülasyon daha yüksek kararlılık göstermiştir ve ilaç çökeltme veya ilaç konsantrasyonundaki azalma olmaksızın en az üç hafta boyunca bozulmadan kalmıştır. Bu ön-ilaç lipid parçacıkları arasındaki etkileşim ve DSPE-PEG miseller lipid çekirdeği kaynaklanmaktadır. compatibi mühendisliketkileşimlerini arttırmak için ilaç taşıyıcı moleküllerin vasıflı miseller ve nanocarriers performansının geliştirilmesi için ümit verici bir stratejidir. Bu yaklaşım, ilaç yükleme geliştirmek ve bu nanocarriers öncesi olgun ilaç salınımını en aza indirebilirsiniz. 23 uygun bir ilaç / polimer çiftinin seçimi misel formülasyonu tasarımında önemli bir adımdır. Ilaç moleküllerinin yapısı değiştirilebilir (ön-ilaç yaklaşım) veya taşıyıcı materyallerin tasarım uyumluluğunu geliştirmek ve ilaç / taşıyıcı etkileşimleri geliştirmek amacıyla optimize edilebilir. Buna ek olarak 23 24, sayısal modelleme yardımcı olmak için yararlı bir araç olabilir ve nanocarriers optimizasyonu mümkün özgü belirli bir ilaç için özel tasarlanmış tasarlanmış nanocarrier hazırlamak için yapmak.

Özet olarak, burada doksorubisinin lipofilik ön-ilaç sentez etmek için bir yöntem tarif eder. ilaç yüklü misellerin hazırlanması ve karakterizasyonu için protokoller de descr vardırIBED. film dağıtım metodu nano ölçekli montajı çok verme sistemleri bir dizi hazırlamak için basit ve gelecek vaat eden bir yöntemdir. Burada açıklanan karakterizasyon yöntemleri formülasyon ve ürün geliştirme işlemlerinin optimizasyonu kolaylaştırabilir ve böylece, nanomedicines özelliklerini belirlemek amacıyla in vitro deneyler, standart olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17, (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6, (6), 1085-1100 (2011).
  3. Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9, (55), (2011).
  4. Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26, (9), 2081-2092 (2009).
  5. Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11, (10), 2610-2620 (2010).
  6. Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1, (6), 9 (2011).
  7. Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143, (1), 151-158 (2010).
  8. Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54, (2), 223-233 (1998).
  9. Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7, (1), 111-120 (2012).
  10. Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
  11. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48, (2), 101-111 (1999).
  12. Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11, (8), 2600-2611 (2014).
  13. Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334, (2), 253-262 (2013).
  14. Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86, (1), 93-100 (2003).
  15. Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164, (1), 95-102 (2012).
  16. Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46, (1-2), 67-71 (2012).
  17. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43, (14), 2923-2925 (1978).
  18. New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
  19. Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
  20. Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87, (1-3), 33-47 (2003).
  21. Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13, (9), 11681-11693 (2012).
  22. Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11, (8), 2094-2102 (2010).
  23. Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8, (1), 20-36 (2012).
  24. Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics