لإعداد المائل الحبل الشوكي شرائح لبطني الجذر تحفيز

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وتبين لنا كيفية تحضير شرائح مائلة من الحبل الشوكي في الفئران الشابة. هذا الإعداد يسمح لتحفيز الجذور البطنية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation. J. Vis. Exp. (116), e54525, doi:10.3791/54525 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد أثبتت التسجيلات الكهربية من شرائح الحبل الشوكي لتكون تقنية قيمة للتحقيق في مجموعة واسعة من الأسئلة، من الخلوية إلى خصائص الشبكة. وتبين لنا كيفية تحضير شرائح مائلة قابلة للحياة من الحبل الشوكي من الفئران الشابة (P2 - P11). في هذا الإعداد، والعصبونات الحركية تحتفظ المحاور التي تخرج من الجذور البطنية من النخاع الشوكي. تحفيز هذه المحاور يثير-نشر يعود إمكانات العمل غزو somas العصبون الحركي ومثيرة الضمانات والعصبون الحركي داخل الحبل الشوكي. تسجيل امكانات العمل معاكسة للمسيرة هو وسيلة فورية، نهائية وأنيقة لتوصيف هوية العصبون الحركي، والذي يتجاوز أساليب هوية أخرى. وعلاوة على ذلك، وحفز الضمانات العصبون الحركي هو وسيلة بسيطة وموثوق بها لإثارة أهداف ضمانات من العصبونات الحركية في النخاع الشوكي، مثل العصبونات الحركية أو R أخرىenshaw الخلايا. في هذا البروتوكول، ونحن تقديم التسجيلات معاكسة للمسيرة من العصبون الحركي somas وكذلك رينشو إثارة الخلية، الناجم عن التحفيز الجذر البطني.

Introduction

تاريخيا، أجريت التسجيلات العصبون الحركي باستخدام حاد الكهربائي في الجسم الحي على الحيوانات الكبيرة مثل القطط والفئران 1 أو على الحبل الشوكي كله معزولة في الفئران 2. ودعا الوصول المباشر إلى العصبون الحركي ظهور تقنية تسجيل التصحيح، المشبك خلال 1980s، somas كما الختم اللازمة لتحقيقها تحت التوجيه البصري. وهكذا، تم تحقيق الشوكي إعداد الحبل شريحة بسهولة منذ أوائل 1990s 3. ومع ذلك، إعداد شريحة في وقت مبكر في كثير من الأحيان لا تسمح لتحفيز الجذور البطنية. إلى علمنا، وذكرت اثنين فقط من الدراسات التحفيز الناجح لجذور بطني في شرائح عرضية، وتم الحصول على أي من الفئران 4،5.

في هذه المقالة نقدم تقنية لتحقيق شرائح الحبل الشوكي قابلة للحياة الفئران حديثي الولادة (P2 - P11) الذي تجمع العصبون الحركي يحتفظ الجذر المغادرين المحاور في بطني. منفسالتحفيز الجذرية راؤول يطلق إمكانات العمل معاكسة للمسيرة العودة الى somas تجمع العصبون الحركي تخرج من نفس الجذر البطني. لأنه يثير أيضا الأهداف ضمانات العصبون الحركي، العصبونات الحركية الأخرى 6-10 والخلايا رينشو 11-13. منذ العصبونات الحركية فقط ترسل المحاور إلى أسفل جذور بطني، ونحن نستخدم تسجيل إمكانات العمل معاكسة للمسيرة باعتبارها وسيلة بسيطة ونهائية لphysiologicaly تحديد العصبونات الحركية 10.

بالإضافة إلى استخدام معيارا الكهربية والمورفولوجية يحتمل أن تكون غير شاملة أو مضللة لتأكيد هوية العصبون الحركي، اعتمدت الدراسات التي أجريت مؤخرا على العصبونات الحركية في النخاع الشوكي أيضا على مملة ومضيعة للوقت اللاحق stainings 16. عادة ما يتم إجراء هذا التحديد فقط على عينة من الخلايا المسجلة. تعتمد استراتيجيات هوية أخرى على خطوط الماوس فيه العصبونات الحركية تعبر عن مضان الذاتية 1،2،20،21. في الظروف المثلى، تمكنا من انتزاع امكانات العمل معاكسة للمسيرة من تقريبا كل من العصبونات الحركية المسجلة.

وعلاوة على ذلك، وتحفيز جذر بطني يمكن استخدامها لإثارة موثوق العصبونات الحركية الأخرى 22،23 أو أهدافها. الخلايا رينشو 10،24،25. نقدم هنا تطبيقات التحفيز الجذر البطني في شكل عمل معاكس للمسيرة التسجيلات المحتملة من somas العصبون الحركي، فضلا عن إثارة الخلايا رينشو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت التجارب وفقا للتوجيهات الأوروبية (86/609 / أوروبا الوسطى والشرقية و2010-63-UE) والتشريع الفرنسي، وتمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاق جامعة باريس ديكارت.

1. الحبل الشوكي إعداد شريحة

  1. إعداد الحلول التالية يوميا أو يوم واحد مقدما. إذا كان يحتفظ بها بين عشية وضحاها، فقاعة مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 و يحفظ في الثلاجة في زجاجة مغلقة بإحكام.
    1. إعداد منخفضة الصوديوم السائل الاصطناعي النخاعي (ACSF): 3 ملي بوكل، 1 ملم ناه 2 ص 230 ملي السكروز، 26 مم NaHCO 0.8 ملي CaCl 8 ملي MgCl 2 و 25 ملي الجلوكوز، 0.4 ملي حمض الاسكوربيك، 1 ملم نا kynurenate، 2 مم نا البيروفات. فقاعة مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 (7.4 درجة الحموضة). منذ نا kynurenate غالبا ما يكون من الصعب حل، تأكد من شراء واحدة المدرجة في جدول المواد.
    2. تحضير المحاليل K-جلوكوناتنشوئها: 130 ملي K-غلوكونات، 15 ملي بوكل، 0.05 ملي EGTA، 20 ملي HEPES 25 ملي الجلوكوز، 1 ملم نا kynurenate، 2 مم نا البيروفات، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.4 مع KOH.
    3. إعداد ACSF: 130 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 2 مم CaCl 1 ملم MgCl 1 ملم ناه 2 ص 26 ملم NaHCO 3 و 25 ملي الجلوكوز، 0.4 ملي حمض الاسكوربيك، 2 مم نا البيروفات. فقاعة مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 (7.4 درجة الحموضة).
    4. قبل بداية التشريح، حل 2٪ أجار في 80 مل من محلول K-غلوكونات، والدفء عند 60 درجة مئوية.
  2. داخل القلب نضح
    1. أداء هذا المستحضر على الفئران الذكور والإناث، تتراوح أعمارهم بين P2 إلى P11.
    2. تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من 0.1 مل من 25 ملي الصوديوم بنتوباربيتال (50 ملغ / كلغ).
    3. استخدام الإبر أو شريط، لشل حركة الماوس على ظهرها على طبق بتري كبيرة مملوءة السيليكون. استخدام مجهر تشريحه لبقية تشريح.
    4. عقد غيض من القص، ورفع الصدر وقطع الحجاب الحاجز باستخدام مقص غرامة. ثم فتح الصدر على كلا الجانبين من خلال قطع أضلاعه لفضح القلب.
    5. قطع الأذين الأيمن قبل ثقب البطين الأيسر مع إبرة 27G.
    6. يروي مع انخفاض الصوديوم + ACSF الجليد الباردة. بعد 30 ثانية، وينبغي أن ينظر المنخفض الصوديوم + ACSF المتدفقة من الأذين. كميات قليلة من الصوديوم تمنع الخلايا من ارتفاعه وتقلل من الموت الخلوي أثناء تشريح.
    7. الحفاظ على عقد إبرة في قلب تحت المجهر تشريح حتى يتحول الكبد الصفراء عندما يتم استنزاف الدم.
  3. تشريح الحبل الشوكي
    1. قطع رأس الحيوان ووضعه على بطنه.
    2. بسرعة إزالة الجلد من الخلف (الشكل 1A1). جعل اثنين من التخفيضات من خلال الكتفين ونزول القفص الصدر (الشكل 1A2). ثم قطع الحبل كما لآه ممكن في قسم الذيلية من أجل عزل العمود الفقري مع بداية الأضلاع من الجزء السفلي من الحيوان. الوجه الحيوان مرة أخرى وإزالة الأحشاء لا تزال تعلق على الأضلاع.
    3. نقل العمود الفقري لآخر، أصغر المليئة السيليكون طبق بتري واستخدام 4 دبابيس الحشرات لأنه عقد ظهري حتى الجانب (الشكل 1A).
    4. باستمرار يروي الحيوان مع ACSF-فقاعات كربوجين (في حوالي 4 درجات مئوية) أثناء إجراء الثقب من الجانب الظهري، وفضح الحبل الشوكي من نهاية منقاري (الشكل 1B). للقيام بذلك، إدراج غيض من مقص غرامة بين العظم والنخاع الشوكي وقطع العظام شيئا فشيئا من نهاية منقاري، والتأكد من أن يبقى بعيدا عن المادة البيضاء. تتناوب على كل جانب في حين أن استخدام ملاقط لالابتعاد الفرقة العظام خفضت بالفعل (الشكل 1B1).
    5. باستخدام أصغر مقص الربيع المتاحة وملاقط، ورفع الجافية وقطععلى كلا الجانبين في حين عقد الجزء فضفاض من الجافية من أجل تجنب إتلاف الحبل الشوكي مع مقص. قطع على طول محور rostro الذيلية.
      ملاحظة: الجافية هو غشاء شفاف المستمر نصف. في هذا العصر الأم الحنون هشة للغاية وسوف تأتي بعيدا أثناء تشريح وتقطيع (الشكل 1B2).
    6. مرة واحدة الجافية هو استخدام إزالة الزجاج حادة أو طرف من البلاستيك لدفع برفق الحبل على الجانب الأيسر من الأخدود التي شكلتها العمود الفقري نصف قطع، وقطع الجذور البطنية والظهرية على الجانب الأيمن، بدءا من الجانب منقاري ، الأبعد من حيث تدخل النخاع (عدد قليل من مم على الأقل، الشكل 1B2).
    7. كرر العملية على الجانب الأيسر، والذهاب دائما من منقاري إلى الذيلية. إذا أعسر، بدء من الجانب الأيسر ومن ثم الانتقال إلى الجانب الأيمن.
  4. التضمين في أجار
    1. زلة الحبل من العمود الفقري. استخدام دبوس الحشرات أصغر ليتعرفواالحبل مع الظهرية سطح صعودا وبدقة إزالة أي جزء من الغشاء لا تزال تعلق عليه (الشكل 1C1).
    2. تنظيفها مرة واحدة، وتقليم طرفي (الشكل 1C2). إدراج دبوس الحشرات محني في الجزء الأمامي من الحبل لمعالجة الحبل وملاحظة توجهها (السهم في الشكل 1C2). ثم نقل النخاع الشوكي إلى حل K-جلوكونات الجليد الباردة.
      ملاحظة: هذا الحل يقلد تكوين الخلايا من السائل النخاعي، وسوف يمنع الخلايا من الموت من صدمة التناضحي مرة واحدة سيتم قطع العصبونات الحركية 26.
    3. مرة واحدة في الحبل الشوكي ضمن الحل داخل الخلايا، واتخاذ الكأس مع آغار من الحمام الجاف وتبريده على مزيج من الثلج والماء.
    4. الحفاظ على اثارة بينما قياس درجة الحرارة. عندما تصل درجة الحرارة إلى 38 درجة مئوية تزج الحبل الشوكي، وعقد من قبل دبوس الحشرات ووضعه الجانب منقاري أسفل. تأكد من أن الحبل الشوكي كما هو الواحدraight ممكن، بعيدا عن الجدران، جزء الذيلية قليلا نحو الأعلى (الشكل 1D1).
    5. ترك الدورق في خليط من الثلج والماء للسماح للأجار ليصلب في أسرع وقت ممكن. تأكد من أنه يبقى في مكان وأن الحبل هو كما مستقيم ممكن (الشكل 1D1).
  5. تشريح
    1. بعد التصلب، وخفض كتلة آغار تحتوي على النخاع الشوكي في مثل هذه الطريقة التي قاعدة كتلة هي في زاوية 35 درجة مع الجزء القطنية من الحبل (السهم في الشكل 1D2). السطح الظهري يجب أن تواجه بعيدا عن قاعدة (الشكل 1D2).
      ملاحظة: هذا هو خطوة حاسمة في هذا الإجراء، للحفاظ على استمرارية حمامات العصبون الحركي للجذور بطني من الذي الخروج.
    2. الغراء كتلة في غرفة من vibratome باستخدام cyanoacrylate الغراء. تزج به في حل K-جلوكونات وإضافة slushed المجمدة حل K-جلوكونات للحفاظ علىحمام برود (أقل من 2 درجة مئوية).
    3. قطع 350-400 ميكرون شرائح سميكة من منطقة أسفل الظهر (التعرف عليها عن طريق انحناء وقطر أكبر). في التوجه السليم (انظر 1.4.1.)، استخدم شفرة لقطع من ظهري إلى السطح البطني وجعل شرائح أكثر باستمرار منقاري. عادة، هناك 4-5 شرائح مناسبة مع الجذور البطنية تمتد 2 مم أو أكثر. استخدام المعلمات التالية: 10 درجة زاوية، 70 هرتز تردد الاهتزاز و 10 مم / سرعة دقيقة من تشريح.
  6. حضانة
    1. نقل شرائح لACSF في 34 درجة مئوية. بعد ما يقرب من 30 دقيقة، تبريد شرائح وصولا الى RT والبدء في تسجيل الدورة.

شكل 1
الشكل 1. تشريح
A1: إزالة الجلد من الجزء الخلفي لفضح العمود الظهري A2:قطع الكتفين والضلوع لتحرير ظهري العمود B1: العمود الفقري معقود على طبق بتري مليئة السيليكون (الجانب الظهري، والجانب الذيلية اليسار) B2: الشيء نفسه مع الحبل الشوكي المكشوفة وتشريح C1: الحبل الشوكي معزولة (الجانب منقاري إلى اليسار) C2: الحبل الشوكي على استعداد لتكون جزءا لا يتجزأ (الجانب البطني، والجانب منقاري إلى اليسار). لاحظ دبوس الحشرات أصغر على الجانب منقاري D1:. الحبل الشوكي في الدورق أجار (الجانب منقاري داو، الجانب البطني مواجهة القاع) D2: قص كتلة أجار مع الحبل الشوكي المضمنة. لاحظ زاوية 35 درجة الأشكال الحبل الشوكي مع قاعدة كتلة وتوسيع قطني (السهم). أشرطة النطاق 1 سم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. وضع شريحة في الغرفة

ملاحظة: هاءجذور ntral ذات حجم متغير.

  1. يعد مربع من مختلف الماصات بأقطار تتراوح طرف 40-170 ميكرون مقدما. لإعداد الماصات الشفط، وإعداد العديد من الماصات مع تفتق طويل. باستخدام سكين الماس، اجراء خفض في المواقف المختلفة. ثم تشريح تحت المجهر، وكسر ذلك عن طريق ضرب طرف مع ملاقط.
  2. إزالة غرفة من المجهر تسجيل ووضعه تحت المجهر تشريح.
  3. اختيار شريحة تحتوي على جذر بطني من مدة كافية (2 ملم أو أكثر) لتركيبها على القطب التحفيز الشفط. حدد الاتجاه الصحيح للشريحة مع الجذور البطنية التصاعدي (الشكل 2A) وقطع بدقة آغار حول الجذور البطنية بينما ترك بقية آغار حول شريحة (الشكل 2B).
    ملاحظة: نظرا لأن أجار هو أقوى من شريحة، وهذا سوف يسمح للخيوط مرساة شريحة للراحة على أجار بدلا من التركيز على شريحة وبالتالي لسوف nchor لا تضر الأنسجة. تأكد من خيوط مرساة شريحة هي فوق بركة العصبون الحركي (كما هو موضح باللون الأحمر في الشكل 2C).
  4. جبل الغرفة مرة أخرى على المجهر ويروي باستمرار غرفة تسجيل مع ACSF بمعدل 1-2 مل / دقيقة، في RT. باستخدام ماصة زجاجية مملوءة ACSF وتوصيلها إلى حقنة، تمتص واحد من جذر بطني (السهم في الشكل 2C). من أجل تحقيق التحفيز الجيد من جذر بطني، وغيض ماصة يجب أن يكون ضيق حول الجذر البطني. وينبغي أن تكون واحدة القطب في القطب محفزة وغيرها من واحد في الحمام (أو متصلا إشارة القطب-لقط التصحيح).
  5. تحقيق تسجيل التصحيح، المشبك من المطلوب من نوع الخلية وتسجيل تأثير التحفيز جذر بطني كما هو موضح previsouly 10.
    1. هنا، استخدام مكبر للصوت للحصول على البيانات. تصفية تسجيلات خلية كاملة في 3 كيلو هرتز. رقمنة في 10 كيلوهرتز. تعويض مقاومة جسر في كوريهوضع الإقليم الشمالي المشبك.

الشكل 2
الشكل 2. إعداد جذر بطني
ج: قطني شريحة الحبل الشوكي جزءا لا يتجزأ من أجار مع الجذر البطني مواجها لها ب: قطني شريحة الحبل الشوكي مع الجذور البطنية تحررت من أجار C: قطني شريحة الحبل الشوكي مع القطب محفزة وضعت بإحكام حول جذور بطني (السهم) . لاحظ مكان الخلايا رينشو التعبير عن مضان أحمر في 28 chrna2-لجنة المساواة العرقية الماوس عبرت مع مراسل الماوس R26 توم 17. القضبان مقياس 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تأكيد العصبون الحركي الهوية باستخدام إمكانيات معاكس للمسيرة العمل

استهداف الخلايا

تم العثور على العصبونات الحركية في القرن البطني (مرئية باللون الأحمر في الشكل 2C). ابدأ من حزمة من المحاور التي تشكل جذر بطني وترتفع حتى يشتت حزمة كاملة واحد يبدأ رؤية الخلايا الكبيرة (محور سوما طويلة، أكثر من 20 ميكرون). تحقيق تسجيل كامل الخلية من خلية أبحث صحية جولة باستخدام القطب المقاومة الأولية من 3-4 MΩ. الحل الداخلي المستخدمة يرد: 140 ملي K-غلوكونات، 6 ملي بوكل، 10 ملي HEPES، 1 ملي EGTA، 0.1 ملي CaCl 4 مم المغنيسيوم، ATP، 0.3 ملي نا 2 GTP. ضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع KOH، والأسمولية إلى 285-295 ملي أوزمول بإضافة الماء المقطر.

مرة واحدة ويتحقق تسجيل كامل الخلية، وتطبيق التحفيز ثنائي الطور واحد من جذر بطني (1-50 V، 0،1-0،3 مللي ثانية) للحصول على إمكانات العمل معاكسة للمسيرة في الخلايا المسجلة من الحبل البطني أرقام 3A1 و3A2 عرض عمل معاكس للمسيرة. إمكانات في الجهد المشبك أو المشبك الحالي على التوالي. عند زيادة كثافة التحفيز 1-5 الخامس (الشكل 3A1) و10-15 V (الشكل 3A2) تظهر إمكانات العمل معاكسة للمسيرة بطريقة كل شيء أو لا شيء مع الكمون من 0.9 ميللي ثانية و 1.1 ميللي ثانية، على التوالي. وبالنظر إلى أن العصبونات الحركية فقط ارسل المحاور من خلال الجذور البطنية، وإمكانات العمل معاكسة للمسيرة هو دليل على هوية الخلية.

في أقلية من العصبونات الحركية (حوالي 10٪)، فشل لتحفيز جذر بطنيانتزاع إمكانات العمل معاكسة للمسيرة، بل أثارت إمكانات العمل سوي المسار. أرقام 3B1 و3B2 تظهر إمكانات العمل سوي المسار في الجهد المشبك أو المشبك الحالي على التوالي. عند زيادة التحفيز 20-30 V (الشكل 3B1) و25-40 V (الشكل 3B2)، تظهر إمكانات العمل، بعد سابقة مثير بعد متشابك الحالية (EPSC) أو مثير محتمل بعد متشابك (EPSP). والإختفاء من إمكانات العمل أطول (5.1 ميللي ثانية و 5.3 ميللي ثانية، على التوالي). في هذه الخلايا اثنين، وتحفيز جذر بطني أثارت الإثارة التغذية إلى الأمام (العصبونات الحركية إرسال الضمانات محور عصبي إلى أنفسهم وإلى العصبونات الحركية الأخرى) التي كانت قوية بما فيه الكفاية للحصول على إمكانات العمل سوي المسار. في مثل هذه الخلايا، والفشل في انتزاع إمكانات العمل معاكسة للمسيرة (تميزت في عروض الأزياء في كل شيء أو لا شيء، والكمون أقصر من 5 ميللي ثانية) لا تسمح لنا أن نستنتج أن هذه الخلايا ع العصبونات الحركية ه. لاحظ أن كثافة التحفيز اللازم لتثير التغذية إلى الأمام الإثارة أعلى من واحد يحتاج للحصول على إمكانات العمل معاكسة للمسيرة. كل التحفيز المعروضة هنا هي 0.1 ميللي ثانية ولكن في بعض الأحيان، وتحفيز أطول (تصل إلى 0.3 مللي ثانية) قد تكون هناك حاجة للحصول على إمكانات العمل معاكسة للمسيرة.

الشكل (3)
الشكل 3. الردود العصبون الحركي إلى بطني الجذر تحفيز
A1: 1 V (تتبع الأحمر) و 5 V (تتبع الأسود) التحفيز A2: 10 V (تتبع الأحمر) و 15 V (تتبع الأسود) التحفيز B1: 20 V (تتبع الأحمر) و 30 V (تتبع الأسود) التحفيز . B2: 25 V (تتبع الأحمر) و 40 V (تتبع الأسود) التحفيز. وتشير النقط السوداء توقيت التحفيز. تؤكد النصال مزدوجة الفرق في الإختفاء بين المسامير عظمية ومعاكسة للمسيرة.م / الملفات / ftp_upload / 54525 / 54525fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحفيز رينشو خلية

استهداف الخلايا

تم العثور على خلايا رينشو في القرن البطني 27،28. تصور حزم محور عصبي مع تدخل الفرق التصوير النقيض (DIC) باستخدام 20X 63X والأهداف. ابدأ من حزمة من المحاور التي تشكل جذر بطني وترتفع حتى تبدأ محاور لتفريق لكن لا تزال ملحوظة (الشكل 4A، السهام). تهدف للخلايا من حجم متوسط (حوالي 10-15 ميكرون في القطر، الشكل 4A، السهام). تحقيق تسجيل خلية كاملة من جولة خلية أبحث صحية باستخدام إلكترود المقاومة الأولية من 5-7 MΩ. اعتمادا على التجربة، كنا الصناعات الاستخراجيةذر جيم + المستندة أو K + المستندة إلى حلول داخلية 10. منع حل يستند CS-التيارات البوتاسيوم الكبيرة التي كانت واضحة في جميع أنحاء -45 بالسيارات. في بعض التجارب، ونحن أيضا اضافة 5 ملي QX-314 لمنع قنوات الصوديوم مسؤولة عن ارتفاعه في الخلية المسجلة. يحتوي على جيم + المستندة الحل: 125 ملم CS-غلوكونات، 5 ملي QX-314 الكلورين، 10 ملي HEPES، 10 ملي EGTA، 1 ملم CaCl 2 و 4 ملي المغنيسيوم اعبي التنس المحترفين، و 0.4 ملي نا-GTP، مع درجة الحموضة تعديل على 7.3 مع CsOH. وK + المستندة الحل يجب أن تستخدم لتحليل، سواء في voltage- والمشبك الحالي، واستجابات الخلايا رينشو لتحفيز جذر بطني في ظروف تقارب أكبر قدر ممكن منها الفسيولوجية. هذا الحل يحتوي على: 125 ملي K-غلوكونات، 10 ملي HEPES، 1 ملي EGTA، 0.1 ملي CaCl 4 مم المغنيسيوم، ATP، 0.4 ملي نا-GTP، مع تعديل درجة الحموضة إلى 7.3 مع KOH. كثافة التحفيز تنوعت ما بين 10 و 100 فولت ومدته تتراوح بين 50 و 300 μsec. Bipo واستخدمت البقول لار في جميع الحالات.

استجابة الخلايا رينشو لتحفيز جذر بطني

التحفيز من جذر بطني بتشغيل corelease الغلوتامات والأستيل كولين من الضمانات العصبون الحركي على الخلايا رينشو 10. وجندت تثبيط تغذية الأمام بوساطة GABA والجلايسين أيضا 10. يعرض الشكل 4B الردود على التحفيز واحد من جذر بطني. وسجلت الخلية في وضع الجهد المشبك مع الحل القائم على السيزيوم، والحفاظ على الجهد -45 بالسيارات. QX-314 في الحل داخل الخلايا منع الخلية من اطلاق النار وGABA وسدت الردود الجلايسين بنسبة 3 gabazine ميكرومتر و 1 ميكرومتر الإستركنين، على التوالي. التيار متشابك الداخل في الشكل 4B هو مجموع glutamatergic والتيارات النيكوتين.

الإقليم الشمالي "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل (4)
الشكل 4. رينشو تحفيز الخلية من جذر بطني
الحصول على الصور من تجمع الخلايا رينشو باستخدام مكثف منحرف في نفس شريحة التي اتخذت في اثنين من تكبير مختلفة (20X 40X والأهداف): A. لاحظ محاور العصبون الحركي الاندماج في جذر بطني (السهم). يشار إلى خلايا المفترضة رينشو مع رؤوس سهام. الحانات مقياس: 100 ميكرون في A1، A2 50 ميكرون في (ب): تسجيلات الجهد المشبك من خلية رينشو بعد التحفيز من جذر بطني (نقطة سوداء). تتبع الأحمر هو المتوسط ​​من تلك الرمادية. كان من المقرر عقد الجهد في -45 بالسيارات. QX-314 في الحل داخل الخلوي منع الخلية من اطلاق النار وGABA وسدت الردود الجلايسين بنسبة 3 gabazine ميكرومتر و 1 ميكرومتر الإستركنين، على التوالي. نقطة سوداء تشير توقيت التحفيز.كوم / ملفات / ftp_upload / 54525 / 54525fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تشريح منحرف من الحبل الشوكي هو مهم لأنه يسمح لتحفيز جانب واحد من حمامات العصبون الحركي والخلايا رينشو في الجزء الفقري واحد بطريقة موثوقة وشاملة ومحددة. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح لتحديد سريع، أنيق وغير ملتبس من العصبونات الحركية المسجلة. المقبل، ونحن سوف تسلط الضوء على مزايا هذه التقنية مقارنة مع أساليب إعداد شريحة أخرى، وبعد ذلك سوف نؤكد من المزالق الأكثر شيوعا لتجنب حين تنفيذ هذا الإجراء.

معظم الدراسات التي تستخدم شرائح عرضية تؤسس التعرف عليهم على الخصائص الكهربائية الجوهرية 3،14،15،29. ومع ذلك، هذه تختلف اختلافا كبيرا بين برك العصبون الحركي وكذلك بين أنواع فرعية العصبون الحركي داخل مجمع بعينه (ألفا وبيتا وغاما العصبونات الحركية 30). لذلك، الدراسات التي تستخدم المعلمات حجم من المرجح أن استبعاد أصغر غاما العصبونات الحركية. من ناحية أخرى، كوبر وشيرينجتون دescribed في عام 1940 مجموعة من الخلايا العصبية كبيرة في هذا الشأن، ventro الجانبي الرمادية للنخاع الشوكي القطني من القرود والقطط التي قد عبروا تصاعدي محاور 31،32. بالإضافة إلى كونها قريبة إلى somas العصبون الحركي، لاحظوا أنها ظهرت تمييزه تشريحيا من العصبونات الحركية. وأكدت مقالة نشرت مؤخرا وجود مثل هذه الخلايا في الماوس 33. نظرا لكبر حجم هذه الخلايا ومواقعها، لكانوا قد أدرج خطأ في الدراسات السابقة. معيار تحديد لدينا يستبعد خلايا الحدود العمود الفقري المفترضة، لأن محور عصبي من لا مشروع في جذر بطني، في الوقت الذي تسمح تحديد موثوق للجميع العصبونات الحركية بغض النظر عن حجمها. وعلاوة على ذلك، وتحليل الخصائص الكهربائية الجوهرية، (على سبيل المثال، ومقاومة المدخلات)، هو أكثر استهلاكا للوقت من الملاحظة البسيطة من إمكانات العمل معاكسة للمسيرة.

بالإضافة إلى استخدام الخواص الكهربائية الجوهرية، وبعض الى الدراساتق باستخدام شرائح عرضية، تأكيد الهوية الخاصة بهم عن طريق إجراء التحليل اللاحق للالواسمات الجزيئية للالعصبونات الحركية (مثل جزيرة-1/2 16) أو من خلال وضع تصور التشكل باستخدام biocytin labelings 14،17. هذه الهويات هي إلا مملة ولا توفر التعرف المباشر. وبالتالي يتم تنفيذ نادرا منهجي فيها.

حاولت بعض الدراسات إلى الاستفادة من خطوط الماوس تعبر عن علامة فلوري العصبون الحركي المشفرة وراثيا (HB9-GFP خط الماوس 18، الفئران المعدلة وراثيا والتي تعبر EGFP في الخلايا كوليني بما في ذلك العصبونات الحركية 19، أو G85R SOD1-YFP الفئران المعدلة وراثيا، دردشة-EGFP التي التعبير بقوة انصهار بروتين YFP في العصبونات الحركية 17). ومع ذلك، لأن التعبير الجيني علامة يشترط عادة في وقت ومنذ شرائح تؤخذ عادة من الأجنة أو الأحداث، والتعبير عن علامة قد لا تكون كافية في سن قيتم تنفيذ tudy. وقد استخدمت دراسات أخرى حقن عامل الوراء لتصور تجمع العصبون الحركي 34. نحن أيضا تنفيذ الكوليرا حقن توكسين بيتا في النعلية أو مؤسسة كهرباء لبنان (الملاحظة الشخصية). تقنيات وسم هذه هي ذات قيمة كبيرة لتسمية تجمع العصبون الحركي معين ولكن تتطلب جراحة شاقة بضعة أيام قبل التجربة. وعلاوة على ذلك، سن الشباب الذي يجري القيام به من تجارب شريحة، يجعل من الصعب بشكل ملحوظ خصيصا لاستهداف العضلات. وأخيرا، هناك قلق حقيقي من تشويش العصبون الحركي عن طريق حقن عامل خارجي.

تحت الظروف المثلى كنا قادرين على الحصول على إمكانات العمل معاكسة للمسيرة في تقريبا كل من العصبونات الحركية المسجلة. زاوية 35 درجة استخدامها أمر بالغ الأهمية للحصول على الجذور البطنية من مدة كافية. وفي الختام، وإعداد شريحة المائل يوفر طريقة سريعة وموثوقة لتحديد كل العصبون الحركي، وهي متفوقة على التقنيات هوية أخرى.

كما جاء في المقدمة، ذكرت اثنين فقط من الدراسات التحفيز الناجح لجذور بطني في شرائح عرضية. وسجلت الدراسة الأولى الخلايا العصبية عنق الرحم في الفئران وحفز المادة البيضاء حيث يخرج كعب جذر بطني 4. اقنعوا بنجاح إمكانات العمل معاكسة للمسيرة في 85٪ من الخلايا العصبية المسجلة. ونحن نعتقد نسبة نجاح عالية من الاعتماد على حقيقة أنه في مستوى عنق الرحم، والمحاور وsomas من العصبونات الحركية على نفس الطائرة. ليست هذه هي الحال في شرائح أكثر الذيلية. حتى على مستوى عنق الرحم، وشرائح من عرضية الاحتفاظ فقط بذرة من الجذور البطنية، والتي هي أقل موثوقية لتحفيز. حفزت الدراسة الثانية الفرخ الجنين جزء ظهراني قطني 5. ومع ذلك، فإنها تستخدم الجهد حساسة تسجيل صبغ، التي تفتقر إلى التحليل المكاني للإشارة إلى نجاح يحفز على إمكانات العمل معاكسة للمسيرة على مستوى خلية واحدة.

لدينا شريحة preparatكما يقدم أيون بطريقة متفوقة على تحفيز الخلايا رينشو كما جاء في ورقة حديثة 28. باستخدام شرائح مائلة، أنهم كانوا قادرين على تسجيل الأحادي المشبك رينشو خلايا الردود في 46٪ من الحالات، والتي كانت تحسن كبير من نسبة النجاح 10٪ واجهتها باستخدام شرائح عرضية (35). على الرغم من أننا لا يمكن أن تجد مقارنة مماثلة لتحفيز حمامات العصبون الحركي، هذه الملاحظة في الخلية رينشو تقودنا إلى الاعتقاد بأن العصبونات الحركية أيضا الاحتفاظ بالمزيد من الاتصالات.

تشريح منحرف من الحبل الشوكي هو أسلوب الصعبة للغاية التي تتطلب الكثير من الممارسة قبل الحصول موثوق استعدادا من أي واحد يمكن أن تسجل. باستخدام الملقط الجميلة جدا وحادة ومقص الصغرى أمر ضروري. الوقت الذي يقضيه تشريح يمكن أن تكون طويلة جدا (تصل إلى 1 ساعة) طالما يجري الإجراء بأكمله في المبرد-فقاعات كربوجين تشريح المتوسطة. في حين أن بعض الكتاب لم يعترف أي فائدة من perfusio داخل القلبن في إعداد شرائح 36، قررنا أن الحفاظ على هذه الخطوة من الإجراء. ومن الصعب قياس موضوعي صالح نضح داخل القلب لجودة التسجيلات، لا سيما وأنه يختلف مع تقدم العمر.

العامل الأكثر أهمية هو عصر الماوس. سجلنا بنجاح من الفئران بين P2 وP11 باستخدام بروتوكول أعلاه. بعد هذا العمر، والمايلين الحبل الشوكي يصبح كثيفا جدا وأكبر الخلايا (العصبونات الحركية) يموت قبل التقطيع، على الأرجح بسبب نقص الأكسجين. بعد هذا الإطار، وجدنا أنه من الصعب على نحو متزايد للحصول على شرائح صحية. مؤخرا، تم الإبلاغ عن تقنيات جديدة للحصول على شرائح صحية في الحيوانات الأكبر سنا 17،36. أنها تستخدم إضافات زائدة لتشريح وتسجيل المتوسطة من مثل مصادر تكميلية للطاقة (أثيل البيروفات)، وانخفاض الصوديوم والكلور - تركيزات لمنع ورام الخلايا 37،38 والبولي ايثيلين جلايكول للحد من ممثل المؤسسةالنظام الأوروبي للtransections الغشاء واسعة النطاق التي تحدث أثناء تشريح. مع هذه التحسينات، أنهم كانوا قادرين على تسجيل من يصل إلى 6 أشهر الحيوانات القديمة.

في المستقبل سيكون من المثير للاهتمام أن محاولة الاستعدادات شريحة المائلة في الحيوانات البالغة إلى الجمع بين مزايا الطريقتين. يجب الجمع بين البروتوكولين إثبات سهلة نسبيا، وسوف توفر أداة موثوقة لتأكيد هوية العصبون الحركي ودراسة السكان المستهدفين من الضمانات محور عصبي من العصبونات الحركية في فئران بالغة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن محاولة الحصول على شرائح مائلة في جنين فأر. الجدير بالذكر، يحتفظ إعداد لدينا أيضا جذور الظهرية، والتي يمكن أن تكون حافزا لدراسة أحادي المشبك تفعيل لي تعصيب إلى العصبونات الحركية، فضلا عن تفعيل الظهري الحبل الشوكي السكان العصبية. في الختام، التحفيز جذر بطني توفر أداة موثوقة لتأكيد هوية العصبون الحركي ودراسة السكان المستهدفين من الضمانات العصبون الحركي محور عصبي. </ P>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

الكتاب أشكر مارين مانويل وأوليفيا غولدمان Szwajkajzer لمساعدتهم في اتخاذ الصور. أشكر الكتاب أيضا أرجون Masukar وتوبياس بوك لتنقيح الكتابة المخطوطة. وقدمت الدعم المالي من قبل الوكالة الوطنية من أجل لا بحوث (HYPER-الفرقة المتعددة الجنسيات، وكالة الاستخبارات الوطنية-2010-بلان-1429-1401)، والمعاهد الوطنية للصحة NINDS (R01NS077863)، ومؤسسة لاتران تييري (مشروع OHEX)، والجمعية الفرنسية لاعتلال عضلي ( منحة رقم 16026)، والهدف ALS وامتنان. وكان فيليكس ليروي المستفيد من "Contrat الدكتوراه" من مدرسة المعلمين العليا، كاشان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Na-kynurenate ABCAM ab120256 dissolves better then other brands
KCl Sigma P3911
NaH2PO4 Sigma P5655
sucrose  Sigma S9378
NaHCO3  Sigma S6014
CaCl2  G Biosciences R040
MgCl2  Quality Biological 351-033-721
glucose  Sigma G5767
ascorbic acid  Sigma A5960
Na-pyruvate  Sigma P2250
K-gluconate  Sigma P1847
EGTA  Sigma E3889
HEPES  Sigma H4034
NaCl Sigma S9888
Agar Sigma A9799
QX-314 Alomone Q150
Mg-ATP Sigma A9187
CsOH Sigma 232041
Na-GTP Sigma 51120
gluconic acid Sigma G1951
Cesium hydroxide solution Sigma 232041
KOH Sigma P5958
Vannas Spring Scissors - 2.5mm  FST 15000-08 only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones
Stimulator A-M Systems Isolated Pulse Stimulator Model 2100
Vibratome Campden Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13, (1), 9-38 (1950).
  2. Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25, (2), 451-459 (2007).
  3. Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
  4. Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112, (2), 185-191 (2001).
  5. Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2, (5), e417 (2007).
  6. Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308, (1), 196-199 (1984).
  7. Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132, (1), 1-10 (1977).
  8. Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272, (3), 755-767 (1977).
  9. Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31, (3), 179-187 (1998).
  10. Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28, (52), 14121-14131 (2008).
  11. Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
  12. Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5, (1 Pt 2), 86 (1946).
  13. Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
  14. Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102, (6), 3627-3642 (2009).
  15. Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589, (Pt 9), 2245-2260 (2011).
  16. Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
  17. Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (47), 16883-16888 (2014).
  18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, (3), 385-397 (2002).
  19. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27, (3), 391-397 (2006).
  20. Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29, (36), 11246-11256 (2009).
  21. Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112, (9), 2302-2315 (2014).
  22. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
  23. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114, (3), 1963-1973 (2015).
  24. Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86, (8), 1114-1121 (2013).
  25. Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32, (24), 8413-8423 (2012).
  26. Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25, (28), 6490-6498 (2005).
  27. Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26, (51), 13297-13310 (2006).
  28. Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41, (7), 889-900 (2015).
  29. Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79, (5), 2485-2502 (1998).
  30. Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53, (5), 1323-1344 (1985).
  31. Cooper, S., Sherington, C. S. Gower's tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
  32. Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26, (3-4), 371-396 (1951).
  33. Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220, (5), 2997-3009 (2015).
  34. Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549, (Pt 1), 21-36 (2003).
  35. Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87, (6), 3117-3125 (2002).
  36. Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107, (2), 728-741 (2012).
  37. Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5, (6), 1483-1489 (1985).
  38. Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65, (1), 65-71 (1986).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics