उदर रूट उत्तेजना के लिए परोक्ष स्पाइनल कॉर्ड स्लाइस की तैयारी

Neuroscience

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Summary

हम कैसे युवा चूहों में रीढ़ की हड्डी के परोक्ष स्लाइस तैयार करने के लिए दिखा। यह तैयारी उदर जड़ों की उत्तेजना के लिए अनुमति देता है।

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Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation. J. Vis. Exp. (116), e54525, doi:10.3791/54525 (2016).

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Abstract

रीढ़ की हड्डी की स्लाइस से electrophysiological रिकॉर्डिंग एक महत्वपूर्ण तकनीक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए नेटवर्क गुण के लिए सेलुलर से साबित किया है। हम कैसे युवा चूहों (- P11 p2) की रीढ़ की हड्डी के व्यवहार्य परोक्ष स्लाइस तैयार करने के लिए दिखा। इस तैयारी में, motoneurons उनके axons रीढ़ की हड्डी के उदर जड़ों से बाहर आ बरकरार रहती है। इन axons की उत्तेजना वापस प्रचार कार्रवाई क्षमता रीढ़ की हड्डी के भीतर motoneuron somas और रोमांचक motoneuron कोलैटरल हमलावर elicits। antidromic कार्रवाई क्षमता की रिकॉर्डिंग motoneuron पहचान है, जो अन्य पहचान तरीकों से बढ़कर चिह्नित करने के लिए एक तत्काल निश्चित और सुंदर तरीका है। इसके अलावा, motoneuron कोलैटरल उत्तेजक जमानत के इस तरह के अन्य motoneurons या आर के रूप में रीढ़ की हड्डी के भीतर motoneurons के लक्ष्य, उत्तेजित करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका हैकोशिकाओं enshaw। इस प्रोटोकॉल में, हम motoneuron somas के साथ ही रेंशाव सेल उत्तेजना से antidromic रिकॉर्डिंग मौजूद है, उदर जड़ उत्तेजना से उत्पन्न।

Introduction

ऐतिहासिक, तेज इलेक्ट्रोड का उपयोग motoneuron रिकॉर्डिंग बिल्लियों या चूहों के रूप में 1 या 2 चूहों में एक अलग पूरे रीढ़ की हड्डी पर बड़े जानवरों पर विवो में आयोजित की गई। 1980 के दशक के दौरान पैच दबाना रिकॉर्डिंग तकनीक के उद्भव, somas के रूप में सीलिंग की जरूरत motoneuron तक सीधी पहुंच के लिए कहा जाता है दृश्य मार्गदर्शन के तहत प्राप्त किया जा सके। इस प्रकार, रीढ़ की हड्डी टुकड़ा तैयारी आसानी से 1990 के दशक के बाद से 3 हासिल किया गया है। हालांकि, जल्दी टुकड़ा तैयारी अक्सर उदर जड़ों की उत्तेजना के लिए अनुमति नहीं दी। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, केवल दो अध्ययनों अनुप्रस्थ स्लाइस में उदर जड़ों के सफल उत्तेजना को सूचित किया है, और कोई भी चूहों 4,5 से प्राप्त हुई थी।

(- P11 p2) जिसमें motoneuron पूल अपने उदर जड़ प्रस्थान एक्सोन को बरकरार रखे हुए इस लेख में हम नवजात चूहों की व्यवहार्य रीढ़ की हड्डी की स्लाइस को प्राप्त करने के लिए एक तकनीक मौजूद है। बाहर निकलने देनाRAL जड़ उत्तेजना motoneuron पूल में एक ही उदर जड़ से बाहर निकलने की somas में वापस antidromic संभावित कार्रवाई हो सके। यह भी motoneuron जमानत के लक्ष्य, अन्य motoneurons 6-10 और 11-13 रेंशाव कोशिकाओं उत्तेजित। चूंकि केवल motoneurons उनके axons नीचे उदर जड़ों भेजें, हम motoneurons 10 की पहचान physiologicaly करने के लिए एक सरल और निश्चित तरीके के रूप में antidromic कार्रवाई क्षमता की रिकॉर्डिंग का उपयोग करें।

Motoneuron पहचान की पुष्टि करने के लिए संभावित गैर-समावेशी या भ्रामक electrophysiological और रूपात्मक criterions उपयोग करने के अलावा, रीढ़ की हड्डी motoneurons पर हाल के अध्ययनों से भी कठिन और समय लेने वाली पोस्ट अस्थायी stainings 16 पर भरोसा किया। इस तरह की पहचान आमतौर पर ही दर्ज की कोशिकाओं का एक नमूना पर किया जाता है। अन्य पहचान रणनीतियों माउस लाइनों जिसमें motoneurons अंतर्जात प्रतिदीप्ति व्यक्त करने पर भरोसा करते हैं 1,2,20,21 पहचान की तकनीक का इस्तेमाल किया है। इष्टतम स्थितियों में, हम दर्ज की motoneurons के लगभग सभी से antidromic कार्रवाई क्षमता को प्रकाश में लाना करने में सक्षम थे।

इसके अलावा, उदर जड़ उत्तेजना मज़बूती अन्य motoneurons 22,23 या अपने लक्ष्य को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रेंशाव कोशिकाओं 10,24,25। हम यहाँ motoneuron somas से antidromic संभावित कार्रवाई रिकॉर्डिंग के रूप में उदर जड़ उत्तेजना के आवेदन पत्र, साथ ही रेंशाव कोशिकाओं की उत्तेजना प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

प्रयोगों यूरोपीय निर्देशों (86/609 / सीईई और 2010-63-UE) और फ्रांसीसी कानून के अनुसार में प्रदर्शन किया गया, और पेरिस डेसकार्टेस विश्वविद्यालय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. रीढ़ की हड्डी टुकड़ा तैयारी

  1. निम्न समाधानों दैनिक या अग्रिम में एक दिन की तैयारी। तो रात भर रखा है, 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ बुलबुला और कसकर बंद बोतलों में फ्रिज में रखें।
    1. तैयार करें कम ना + कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF): 3 मिमी KCl, 1 मिमी नः 2 पीओ 4, 230 मिमी सुक्रोज, 26 मिमी NaHCO 3, 0.8 मिमी CaCl 2, 8 मिमी 2 MgCl, 25 मिमी ग्लूकोज, 0.4 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड, 1 मिमी ना-kynurenate, 2 मिमी ना-पाइरूवेट। 95% ओ 2 और 5% सीओ 2 (7.4 पीएच) के साथ बुलबुला। चूंकि ना kynurenate अक्सर भंग करने के लिए मुश्किल है, सामग्री तालिका में सूचीबद्ध एक खरीद करने के लिए सुनिश्चित करें।
    2. कश्मीर gluconate समाधान तैयारtion: 130 मिमी कश्मीर gluconate, 15 मिमी KCl, 0.05 मिमी EGTA, 20 मिमी HEPES, 25 मिमी ग्लूकोज, 1 मिमी ना-kynurenate, 2 मिमी ना-पाइरूवेट, KOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित।
    3. ACSF तैयार: 130 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 2 मिमी CaCl 2, 1 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी नः 2 पीओ 4, 26 मिमी 3 NaHCO, 25 मिमी ग्लूकोज, 0.4 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड, 2 मिमी ना-पाइरूवेट। 95% ओ 2 और 5% सीओ 2 (7.4 पीएच) के साथ बुलबुला।
    4. विच्छेदन की शुरुआत से पहले, कश्मीर gluconate समाधान के 80 मिलीलीटर में 2% अगर भंग, और 60 डिग्री सेल्सियस पर गर्म रहते हैं।
  2. इंट्राकार्डियक छिड़काव
    1. महिला और पुरुष चूहों पर इस तैयारी उम्र में p2 से P11 को लेकर प्रदर्शन करते हैं।
    2. 25 मिमी pentobarbital सोडियम (50 मिलीग्राम / किग्रा) के 0.1 मिलीलीटर की एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ माउस anesthetize।
    3. सुई या टेप का उपयोग करना, सिलिकॉन से भरा एक बड़े पेट्री डिश पर अपनी पीठ पर माउस स्थिर करना। एक विदारक microscop का प्रयोग करेंविच्छेदन के आराम के लिए ई।
    4. उरोस्थि की नोक होल्डिंग, सीने में उठा और डायाफ्राम ठीक कैंची का उपयोग काटा। फिर पसलियों के माध्यम से काटने दिल को बेनकाब करने से दोनों पक्षों पर छाती खुला।
    5. एक 27G सुई के साथ बाएं वेंट्रिकल puncturing से पहले सही आलिंद कट।
    6. ठंडा कम ना + ACSF के साथ छिड़कना। 30 सेकंड के बाद, कम ना + ACSF आलिंद से बाहर बहने देखा जाना चाहिए। सोडियम की कम मात्रा spiking से कोशिकाओं को रोकने और विच्छेदन के दौरान सेलुलर मौत को कम।
    7. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत दिल में सुई पकड़े जब तक जिगर पीले रंग बदल जाता है जब खून बहा दिया जाता है रखें।
  3. स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन
    1. पशु सिर काटना और उसके पेट पर रख दिया।
    2. जल्दी वापस (चित्रा 1A1) की त्वचा को हटा दें। कंधे के माध्यम से और सीने पिंजरे (चित्रा 1A2) नीचे जा रहा दो कटौती करें। तब एल के रूप में रस्सी काटओउ आदेश जानवर के निचले हिस्से से पसलियों की शुरुआत के साथ कशेरुका स्तंभ को अलग करने में दुम खंड में के रूप में संभव। पशु फिर पलटें और अभी भी पसलियों से जुड़ी विसरा को हटा दें।
    3. दूसरे करने के लिए कशेरुका स्तंभ स्थानांतरण छोटे सिलिकॉन से भरे पेट्री डिश और 4 कीट पिन का उपयोग यह पृष्ठीय पक्ष (चित्रा 1 ए) धारण करने के लिए।
    4. लगातार (लगभग 4 डिग्री सेल्सियस पर) carbogen-bubbled ACSF के साथ पशु छिड़कना जबकि पृष्ठीय पक्ष के एक laminectomy प्रदर्शन, और व्याख्यान चबूतरे अंत (चित्रा 1 बी) से रीढ़ की हड्डी को उजागर। ऐसा करने के लिए, हड्डी और रीढ़ की हड्डी के बीच ठीक कैंची की नोक डालने और व्याख्यान चबूतरे अंत से हड्डी थोड़ा-थोड़ा करके कटौती, सफेद पदार्थ से दूर रहने के लिए सुनिश्चित कर रही है। प्रत्येक पक्ष पर वैकल्पिक चिमटी का उपयोग करते समय दूर हड्डी के बैंड पहले से ही कटौती (चित्रा 1B1) रखने के लिए।
    5. छोटी उपलब्ध वसंत कैंची और चिमटी का प्रयोग, ड्यूरा उठा और कटौतीआदेश कैंची से रीढ़ की हड्डी को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए ड्यूरा के ढीले हिस्सा धारण करते हुए दोनों पक्षों पर। rostro दुम अक्ष के साथ कट।
      नोट: ड्यूरा एक अर्द्ध पारदर्शी झिल्ली निरंतर है; इस उम्र में पिया मेटर भी नाजुक है और विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया (चित्रा 1B2) के दौरान अलग आ जाएगा।
    6. एक बार जब ड्यूरा हटा इस्तेमाल होता है एक कुंद कांच या प्लास्टिक टिप धीरे नाली आधे में कटौती स्पाइनल कॉलम द्वारा गठित की बाईं ओर की हड्डी को धक्का, और सही पक्ष पर उदर और पृष्ठीय जड़ों में कटौती, व्याख्यान चबूतरे की ओर से शुरू करने के लिए है, जहां वे कॉर्ड (कम से कम कुछ मिमी, चित्रा 1B2) में प्रवेश से दूर।
    7. बाईं ओर ऑपरेशन दोहराएँ, हमेशा व्याख्यान चबूतरे से दुम जा रहा है। अगर बाएं हाथ, बाईं ओर से शुरू करने और फिर सही पक्ष के लिए कदम।
  4. अगर में एम्बेड
    1. कशेरुका स्तंभ के बाहर की हड्डी की पर्ची। नीचे पिन के लिए एक छोटे कीट पिन का उपयोगपृष्ठीय साथ कॉर्ड सतह और नाजुक झिल्ली के किसी भी टुकड़ा अभी भी यह करने के लिए संलग्न (चित्रा 1C1) को हटा दें।
    2. एक बार साफ किया, दोनों सिरों (चित्रा 1C2) ट्रिम। कॉर्ड की हड्डी में हेरफेर और अपनी अभिविन्यास नोट करने के लिए पूर्वकाल हिस्से में एक मुड़ा हुआ कीट पिन डालें (चित्रा 1C2 में तीर)। फिर एक ठंडा कश्मीर gluconate समाधान के लिए रीढ़ की हड्डी हस्तांतरण।
      नोट: यह समाधान सीएसएफ के intracellular रचना mimics और आसमाटिक सदमे से मर रहा है एक बार motoneurons 26 में कटौती की जाएगी से कोशिकाओं को रोकने जाएगा।
    3. एक बार जब रीढ़ की हड्डी अंतर सेलुलर समाधान के भीतर है, सूखी स्नान से बाहर अगर साथ बीकर ले और बर्फ और पानी के मिश्रण पर इसे शांत।
    4. तापमान को मापने जबकि सरगर्मी रखें। तापमान 38 डिग्री तक पहुँच जाता है रीढ़ की हड्डी को विसर्जित कर दिया, कीट पिन द्वारा इसे पकड़ रहा है और यह नीचे जगह व्याख्यान चबूतरे वाला पक्ष सी। सुनिश्चित करें कि रीढ़ की हड्डी सेंट के रूप में है सुनिश्चित करेंraight संभव के रूप में, दूर दीवारों दुम हिस्से से थोड़ा ऊपर की ओर (चित्रा 1D1)।
    5. बर्फ और पानी के मिश्रण में बीकर छोड़ दो अगर के रूप में जल्दी संभव के रूप में जमना करने की अनुमति। यकीन है कि यह जगह में रहता है और उस कॉर्ड संभव (चित्रा 1D1) के रूप में के रूप में सीधे है सुनिश्चित करें।
  5. टुकड़ा करने की क्रिया
    1. Solidification के बाद, अगर इस तरह है कि ब्लॉक के आधार कॉर्ड की काठ भाग के साथ एक 35 डिग्री के कोण पर है में रीढ़ की हड्डी से युक्त ब्लॉक में कटौती (चित्रा 1D2 में तीर)। पृष्ठीय सतह आधार (चित्रा 1D2) से दूर का सामना करना पड़ जाना चाहिए।
      नोट: इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है, उदर जड़ों को motoneuron पूल की निरंतरता को बनाए रखने, जहां से वे बाहर निकलने के लिए है।
    2. vibratome cyanoacrylate गोंद का उपयोग कर के चैम्बर में ब्लॉक गोंद। कश्मीर gluconate समाधान में विसर्जित कर दिया और slushed जमे हुए कश्मीर gluconate समाधान जोड़ने बनाए रखने के लिएस्नान (2 डिग्री सेल्सियस से नीचे) ठंडा।
    3. 400 माइक्रोन काठ का क्षेत्र की मोटी स्लाइस (अपनी वक्रता और बड़ा व्यास द्वारा पहचाने जाने योग्य) - 350 कट। इसके समुचित अभिविन्यास (1.4.1 देखें।) में, ब्लेड का उपयोग पृष्ठीय से उदर की सतह के लिए कटौती और स्लाइस लगातार अधिक व्याख्यान चबूतरे बनाने के लिए। आमतौर पर, वहाँ उदर जड़ों 2 मिमी या उससे अधिक विस्तार देने के साथ 4-5 उपयुक्त स्लाइस हैं। 10 डिग्री के कोण, 70 हर्ट्ज कंपन आवृत्ति और टुकड़ा करने की क्रिया के 10 मिमी / मिनट की गति: निम्नलिखित मानकों का प्रयोग करें।
  6. ऊष्मायन
    1. 34 डिग्री सेल्सियस पर ACSF स्लाइस स्थानांतरण। लगभग 30 मिनट के बाद, आर टी करने के लिए नीचे स्लाइस शांत और रिकॉर्डिंग सत्र शुरू करते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. विच्छेदन
A1:। वापस पृष्ठीय स्तंभ को बेनकाब करने की त्वचा को हटाने A2:। कशेरुका स्तंभ सिलिकॉन से भरे पेट्री डिश पर टिकी (पृष्ठीय पक्ष, दुम की ओर बाएं) बी 2: कंधे और पसलियों के काटने पृष्ठीय स्तंभ बी 1 मुक्त करने के लिए। रीढ़ की हड्डी में अवगत कराया और विच्छेदित कॉर्ड के साथ ही C1:। रीढ़ की हड्डी से अलग-थलग । (व्याख्यान चबूतरे की ओर बाएं) C2: रीढ़ की हड्डी में एम्बेड करने के लिए तैयार कॉर्ड (अप उदर की ओर, व्याख्यान चबूतरे की ओर बाएं)। नोट व्याख्यान चबूतरे तरफ छोटे कीट पिन डी 1:।। अगर बीकर में रीढ़ की हड्डी (व्याख्यान चबूतरे की ओर डॉव, उदर पक्ष नीचे का सामना करना पड़) डी 2: एम्बेडेड रीढ़ की हड्डी के साथ कटौती अगर ब्लॉक। नोट 35 डिग्री के कोण ब्लॉक के आधार और काठ का इज़ाफ़ा (तीर) के साथ रीढ़ की हड्डी रूपों। स्केल सलाखों 1 सेमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. चैंबर में टुकड़ा डाल

ध्यान दें: Ventral जड़ों चर आकार के होते हैं।

  1. टिप 40 से अग्रिम में 170 माइक्रोन से लेकर व्यास के साथ विभिन्न pipettes का एक बॉक्स तैयार करें। सक्शन pipettes तैयार करने के लिए, एक लंबे शंकु के साथ कई pipettes तैयार करते हैं। एक हीरे की चाकू का उपयोग करना, विभिन्न पदों पर एक काट कर। फिर एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, यह चिमटी के साथ टिप मार से टूट गया।
  2. रिकॉर्डिंग माइक्रोस्कोप से चैम्बर निकालें और एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत जगह है।
  3. एक टुकड़ा है कि पर्याप्त लंबाई (2 मिमी या उससे अधिक है) की एक उदर रूट शामिल एक सक्शन उत्तेजना इलेक्ट्रोड पर रखा जा करने के लिए चयन करें। उदर जड़ों के साथ टुकड़ा ऊपर की ओर (2A चित्रा) के समुचित उन्मुखीकरण का चयन करें और जबकि टुकड़ा (चित्रा 2 बी) के आसपास अगर की आराम छोड़कर नाजुक उदर जड़ों के आसपास अगर काट दिया।
    नोट: क्योंकि अगर टुकड़ा से मजबूत है, यह टुकड़ा के लंगर के धागे अगर पर बजाय टुकड़ा और इस तरह एक पर आराम करने की अनुमति देगाnchor ऊतकों को नुकसान नहीं होगा। यकीन टुकड़ा के लंगर के धागे motoneuron पूल (चित्रा -2 में लाल रंग में दिखाया गया है) से ऊपर हैं बनाओ।
  4. वापस खुर्दबीन पर कक्ष माउंट और लगातार 1 की दर से ACSF के साथ रिकार्डिंग कक्ष छिड़कना - 2 मिलीग्राम / मिनट आरटी पर। एक गिलास पिपेट ACSF से भरा है और एक सिरिंज से जुड़े का उपयोग करना, उदर रूट (चित्रा -2 में तीर) में से एक चूसना। आदेश उदर जड़ का अच्छा उत्तेजना को प्राप्त करने के लिए, पिपेट टिप उदर जड़ के आसपास तंग होने की जरूरत है। एक पोल उत्तेजक इलेक्ट्रोड और स्नान में एक दूसरे को (या पैच-clamping इलेक्ट्रोड संदर्भ से जुड़े) में होना चाहिए।
  5. वांछित सेल प्रकार की पैच दबाना रिकॉर्डिंग पाना और के रूप में previsouly 10 में वर्णित उदर जड़ उत्तेजना का प्रभाव रिकॉर्ड है।
    1. इधर, डाटा अधिग्रहण के लिए एक एम्पलीफायर का उपयोग करें। 3 kHz पर पूरे सेल रिकॉर्डिंग फ़िल्टर। 10 kHz पर digitize। वर्तमान मुद्दों में पुल प्रतिरोध क्षतिपूर्तिNT दबाना मोड।

चित्र 2
चित्रा 2. उदर रूट तैयारी
एक: काठ का रीढ़ की हड्डी टुकड़ा उदर जड़ का सामना करना पड़ के साथ अगर में एम्बेडेड बी:।। उदर जड़ों अगर सी से मुक्त कर दिया साथ काठ का रीढ़ की हड्डी टुकड़ा: एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड कसकर (तीर) के उदर जड़ों के आसपास रखा के साथ काठ का रीढ़ की हड्डी टुकड़ा । रेंशाव कोशिकाओं chrna2-CRE माउस 28 माउस संवाददाता R26 टॉम 17। स्केल सलाखों 1 मिमी के साथ पार में लाल प्रतिदीप्ति व्यक्त करने का स्थान ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

Motoneuron पहचान की पुष्टि Antidromic कार्रवाई की क्षमता का उपयोग करना

सेल लक्ष्यीकरण

Motoneurons उदर सींग (चित्रा -2 में लाल रंग में दिखाई) में पाए जाते हैं। उदर जड़ गठन एक्सोन के बंडल से आरंभ और ऊपर जाने के लिए जब तक पूरी तरह से बंडल disperses और एक (, लंबे सोमा अक्ष 20 माइक्रोन से ऊपर) बड़े कोशिकाओं को देखकर शुरू होता है। एक दौर स्वस्थ लग सेल 4 MΩ करने के लिए 3 की प्रारंभिक प्रतिरोध की एक इलेक्ट्रोड का उपयोग कर के पूरे सेल रिकॉर्डिंग पाना। आंतरिक इस्तेमाल किया समाधान निहित: 140 मिमी कश्मीर gluconate, 6 मिमी KCl, 10 मिमी HEPES, 1 मिमी EGTA, 0.1 मिमी 2 CaCl, 4 मिमी मिलीग्राम एटीपी, 0.3 मिमी ना 2 जीटीपी। आसुत जल जोड़कर 295 mOsm - 285 के लिए KOH के साथ 7.3 पीएच, और परासारिता को समायोजित करें।

उदर की हड्डी के दर्ज की कोशिकाओं में एक antidromic संभावित कार्रवाई को प्रकाश में लाना (0.3 मिसे - - 50 वी, 0.1 1) 3A1 और 3A2 शो antidromic कार्रवाई के आंकड़े एक बार पूरे सेल रिकॉर्डिंग हासिल की है, उदर जड़ का एक भी biphasic उत्तेजना लागू होते हैं। वोल्टेज दबाना या वर्तमान दबाना, क्रमशः में क्षमता। जब 5 (चित्रा 3A1) के वी और से 1 से उत्तेजना तीव्रता में वृद्धि 10 से 15 (चित्रा 3A2) वी antidromic संभावित कार्रवाई 0.9 मिसे और 1.1 मिसे, क्रमशः के एक विलंबता साथ एक सभी या कुछ भी नहीं फैशन में प्रकट होता है। यह देखते हुए कि केवल motoneurons उदर जड़ों के माध्यम से अपने एक्सोन भेजते हैं, antidromic संभावित कार्रवाई सेल पहचान का सबूत है।

motoneurons (लगभग 10%) की अल्पमत में, उदर जड़ उत्तेजना करने में विफलantidromic संभावित कार्रवाई को प्रकाश में लाना बल्कि orthodromic कार्रवाई की क्षमता हासिल। आंकड़े 3B1 और 3B2, वोल्टेज दबाना या वर्तमान दबाना में orthodromic कार्रवाई क्षमता दिखाने क्रमशः। जब 30 वी (चित्रा 3B1) और 25 से 40 वी (चित्रा 3B2) से करने के लिए 20 से उत्तेजना में वृद्धि, एक संभावित कार्रवाई प्रतीत होता है, पिछले एक उत्तेजक बाद synaptic वर्तमान (EPSC) या उत्तेजक बाद synaptic क्षमता (EPSP) के बाद। कार्रवाई क्षमता की सुप्तावस्था (5.1 मिसे और 5.3 मिसे, क्रमशः) रह रहे हैं। इन दो कक्षों में, उदर जड़ उत्तेजक एक फ़ीड आगे उत्तेजना (motoneurons के लिए खुद को और अन्य motoneurons के लिए अक्षतंतु कोलैटरल भेज) इतनी ताकत है कि एक orthodromic संभावित कार्रवाई को प्रकाश में लाना था हासिल। ऐसी कोशिकाओं में, एक antidromic संभावित कार्रवाई को प्रकाश में लाना करने के लिए विफलता हमें निष्कर्ष है कि इन कोशिकाओं की गिरफ्तारी की अनुमति नहीं है (अपने सभी या कुछ भी नहीं फैशन और एक विलंबता कम से कम 5 मिसे की विशेषता) ई motoneurons। नोट आवश्यक उत्तेजना तीव्रता प्रकाश में लाना है कि फ़ीड आगे उत्तेजना एक antidromic संभावित कार्रवाई को प्रकाश में लाना करने की जरूरत है एक से अधिक है। यहाँ दिखाया गया है सभी stimulations 0.1 मिसे लेकिन कभी कभी, अब उत्तेजना (0.3 मिसे तक) एक antidromic संभावित कार्रवाई को प्रकाश में लाना करने के लिए आवश्यक हो सकता है कर रहे हैं।

चित्र तीन
चित्रा 3. उदर रूट उत्तेजना के motoneuron जवाब
A1: 1 वी (लाल ट्रेस) और 5 वी (काला ट्रेस) stimulations A2:।। 10 वी (लाल ट्रेस) और 15 वी (काला ट्रेस) stimulations बी 1: 20 वी (लाल ट्रेस) और 30 वी (काला ट्रेस) stimulations । बी 2: 25 वी (लाल ट्रेस) और 40 वी (काला ट्रेस) stimulations। काले डॉट्स प्रोत्साहन समय का संकेत मिलता है। डबल तीर ortho- और antidromic spikes के बीच सुप्तावस्था में अंतर पर जोर।M / फ़ाइलें / ftp_upload / 54525 / 54525fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रेंशाव सेल उत्तेजना

सेल लक्ष्यीकरण

रेंशाव कोशिकाओं उदर सींग 27,28 में पाए जाते हैं। अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) इमेजिंग एक 20X और एक 63X उद्देश्यों का उपयोग के साथ अक्षतंतु बंडलों कल्पना। उदर जड़ गठन एक्सोन के बंडल से आरंभ और ऊपर जाने तक एक्सोन को तितर-बितर करने के लिए शुरू है, लेकिन अभी भी नमूदार (तीर चित्रा -4 ए,) कर रहे हैं। (- व्यास में 15 माइक्रोन, चित्रा -4 ए, तीर के बारे में 10) मध्यवर्ती आकार की कोशिकाओं के लिए निशाना लगाओ। एक दौर स्वस्थ दिखने सेल 7 MΩ करने के लिए 5 की प्रारंभिक प्रतिरोध की एक इलेक्ट्रोड का उपयोग कर के पूरे सेल रिकॉर्डिंग पाना। प्रयोग के आधार पर हम Ei इस्तेमाल कियावहाँ सीएस + आधारित या + K आंतरिक समाधान 10 के आधार पर। सीएस आधारित समाधान बड़े पोटेशियम धाराओं कि एम वी -45 के आसपास दिखाई दे रहे थे रोका। कुछ प्रयोगों में, हम भी दर्ज की सेल में spiking के लिए जिम्मेदार सोडियम चैनल को ब्लॉक करने के लिए 5 मिमी QX-314 जोड़े। सीएस + आधारित समाधान में शामिल हैं: 125 मिमी सीएस-gluconate, 5 मिमी QX-314 सीएल, 10 मिमी HEPES, 10 मिमी EGTA, 1 मिमी 2 CaCl, 4 मिमी मिलीग्राम एटीपी, और 0.4 मिमी ना-जीटीपी, पीएच के साथ CsOH साथ 7.3 करने के लिए समायोजित। + K आधारित समाधान, विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए दोनों वोल्टेज और वर्तमान दबाना में, की स्थिति में उदर जड़ उत्तेजना के रेंशाव सेल प्रतिक्रिया संभव शारीरिक लोगों के रूप में के रूप में ज्यादा approximating। यह समाधान शामिल हैं: 125 मिमी कश्मीर gluconate, 10 मिमी HEPES, 1 मिमी EGTA, 0.1 मिमी 2 CaCl, 4 मिमी मिलीग्राम एटीपी, 0.4 मिमी ना-जीटीपी, पीएच KOH के साथ 7.3 करने के लिए समायोजित के साथ। उत्तेजना तीव्रता 10 और 100 वी और उसकी अवधि के बीच विभिन्न 50 और 300 के बीच μsec विविध। Bipo LAR दालों सभी मामलों में इस्तेमाल किया गया।

उदर जड़ उत्तेजना के रेंशाव कोशिकाओं की प्रतिक्रिया

उदर जड़ की उत्तेजना रेंशाव कोशिकाओं 10 पर ग्लूटामेट और motoneuron कोलैटरल से acetylcholine की corelease हो सके। फ़ीड आगे निषेध गाबा और ग्लाइसिन द्वारा मध्यस्थता भी भर्ती 10। चित्रा 4 बी उदर जड़ के एकल उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित करता है। सेल सीज़ियम आधारित समाधान के साथ एक वोल्टेज दबाना मोड में दर्ज किया गया था, और -45 एम वी के एक वोल्टेज पर बनाए रखा। QX-314 intracellular समाधान में गोलीबारी और गाबा से सेल को रोका और ग्लाइसिन प्रतिक्रियाओं 3 सुक्ष्ममापी gabazine और 1 माइक्रोन बच्छनाग, क्रमशः द्वारा अवरुद्ध किया गया। चित्रा 4 बी में आवक synaptic वर्तमान ग्लूटामेटरगिक और निकोटिनिक धाराओं का योग है।

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चित्रा 4. रेंशाव सेल उदर रूट से उत्तेजना
एक: रेंशाव सेल पूल की छवियों को एक ही टुकड़ा दो अलग आवर्धन (20X 40X और उद्देश्यों) पर ले जाया में एक परोक्ष कंडेनसर का उपयोग कर प्राप्त कर लिया। नोट उदर रूट (तीर) में विलय motoneuron एक्सोन। ख्यात रेंशाव कोशिकाओं तीर के साथ संकेत कर रहे हैं। स्केल सलाखों: A1 में 100 माइक्रोन, ए 2 बी में 50 माइक्रोन:। एक रेंशाव सेल का वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग उदर रूट (काले डॉट) की उत्तेजना के बाद। लाल निशान ग्रे लोगों का औसत है। होल्डिंग वोल्टेज -45 एम वी पर स्थापित किया गया था। QX-314 अंतर सेलुलर समाधान में गोलीबारी और गाबा से सेल को रोका और ग्लाइसिन प्रतिक्रियाओं 3 सुक्ष्ममापी gabazine और 1 माइक्रोन बच्छनाग, क्रमशः द्वारा अवरुद्ध किया गया। काले डॉट प्रोत्साहन समय इंगित करता है।com / फ़ाइलें / ftp_upload / 54525 / 54525fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

क्योंकि यह एक विश्वसनीय, व्यापक और विशिष्ट तरीके से एक भी कशेरुकी खंड पर motoneuron पूल और रेंशाव कोशिकाओं की एकतरफा उत्तेजना के लिए अनुमति देता है रीढ़ की हड्डी के तिर्यक टुकड़ा करने की क्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह दर्ज की गई motoneurons की एक त्वरित, सुरुचिपूर्ण और गैर अस्पष्ट पहचान के लिए अनुमति देता है। अगला, हम अन्य टुकड़ा तैयारी तरीकों की तुलना में इस तकनीक का लाभ पर प्रकाश डाला जाएगा, और फिर हम सबसे आम नुकसान, जबकि इस प्रक्रिया के प्रदर्शन से बचने के लिए तनाव से बाहर होगा।

अधिकांश अनुप्रस्थ स्लाइस का उपयोग अध्ययन आंतरिक बिजली के गुणों 3,14,15,29 पर उनकी पहचान का आधार। हालांकि, इन एक दिया पूल (अल्फा, बीटा और गामा-motoneurons 30) के भीतर motoneuron ताल के बीच के रूप में अच्छी तरह से motoneuron उपप्रकार के बीच काफी भिन्नता है। इसलिए, आकार मापदंडों का उपयोग पढ़ाई के छोटे-गामा motoneurons को बाहर करने की संभावना है। दूसरी ओर, कूपर और शेरिंग्टन घventro पार्श्व बंदरों और बिल्लियों की काठ का रीढ़ की हड्डी जो एक्सोन 31,32 आरोही पार किया था के ग्रे मामले में बड़े तंत्रिका कोशिकाओं का एक समूह 1940 में escribed। motoneuron somas के करीब होने के अलावा, उन्होंने कहा कि वे motoneurons से histologically पृथक दिखाई दिया। हाल के एक लेख माउस 33 में ऐसी कोशिकाओं के अस्तित्व की पुष्टि की। इन कोशिकाओं और उनके स्थान के बड़े आकार के कारण, वे गलती से पूर्व के अध्ययन में शामिल किया जा सकता था। हमारी पहचान कसौटी ख्यात रीढ़ की सीमा कोशिकाओं शामिल नहीं है, के बाद से उनके अक्षतंतु उदर जड़ में परियोजना नहीं है, जबकि सभी motoneurons के विश्वसनीय पहचान उनके आकार की परवाह किए बिना इजाजत दी। इसके अलावा, आंतरिक बिजली के गुणों का विश्लेषण, (उदाहरण के लिए, इनपुट प्रतिरोध), अधिक समय एक antidromic संभावित कार्रवाई के सरल अवलोकन से लगता है।

आंतरिक बिजली के गुण, कुछ अध्ययन उपयोग करने के अलावाअनुप्रस्थ स्लाइस का उपयोग कर रहा है, motoneurons के लिए आणविक मार्कर की पोस्ट अस्थायी विश्लेषण (जैसे आइलेट-1/2 16) के रूप में या आकृति विज्ञान visualizing labelings 14,17 biocytin का उपयोग करके प्रदर्शन से उनकी पहचान की पुष्टि करें। इस तरह की पहचान हालांकि थकाऊ रहे हैं और एक सीधा पहचान प्रदान नहीं करते। वे इसलिए शायद ही कभी व्यवस्थित ढंग से प्रदर्शन कर रहे हैं।

कुछ अध्ययनों से माउस लाइनों एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग motoneuron फ्लोरोसेंट मार्कर (Hb9-GFP माउस लाइन 18 व्यक्त करने का उपयोग करने के लिए, चैट-EGFP ट्रांसजेनिक चूहों, जो motoneurons 19, या G85R SOD1-YFP ट्रांसजेनिक चूहों, सहित कोलीनर्जिक कोशिकाओं में EGFP व्यक्त करने की कोशिश की जो दृढ़ता से motoneurons 17 में YFP संलयन प्रोटीन एक्सप्रेस)। हालांकि, क्योंकि आनुवंशिक मार्कर अभिव्यक्ति आमतौर पर समय में और स्लाइस के बाद से वातानुकूलित है आमतौर पर भ्रूण या किशोरों से ले रहे हैं, मार्कर की अभिव्यक्ति उम्र रों में पर्याप्त नहीं हो सकता हैtudy किया जाता है। अन्य अध्ययनों motoneuron पूल 34 कल्पना करने के लिए प्रतिगामी एजेंट इंजेक्शन का इस्तेमाल किया है। हम यह भी soleus या EDL (व्यक्तिगत अवलोकन) में हैजा विष बीटा इंजेक्शन प्रदर्शन किया। इस तरह की लेबलिंग तकनीक महान मूल्य के हैं एक विशेष motoneuron पूल लेबल करने के लिए, लेकिन थकाऊ सर्जरी प्रयोग करने से पहले कुछ दिनों के आवश्यकता होती है। इसके अलावा, युवा उम्र में टुकड़ा प्रयोग किया जा रहा है, बनाता है यह काफी कठिन विशेष रूप से मांसपेशियों को लक्षित करने के लिए। अंत में, वहाँ एक exogenous एजेंट इंजेक्शन लगाने के द्वारा motoneuron perturbing का एक वास्तविक चिंता का विषय है।

इष्टतम शर्तों के तहत हम दर्ज motoneurons के लगभग सभी में antidromic कार्रवाई की क्षमता प्राप्त करने के लिए सक्षम थे। 35 डिग्री के कोण इस्तेमाल किया पर्याप्त लंबाई के उदर जड़ों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, परोक्ष टुकड़ा तैयारी हर motoneuron, जो अन्य पहचान तकनीक से बेहतर है की पहचान करने के लिए एक त्वरित और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है।

के रूप में शुरूआत में कहा गया है, केवल दो अध्ययनों अनुप्रस्थ स्लाइस में उदर जड़ों के सफल उत्तेजना की सूचना दी। पहला अध्ययन चूहे में गर्भाशय ग्रीवा न्यूरॉन्स दर्ज की गई और सफेद पदार्थ जहां उदर जड़ ठूंठ उभर 4 को प्रेरित किया। वे सफलतापूर्वक दर्ज न्यूरॉन्स के 85% में antidromic संभावित कार्रवाई प्रेरित किया। हमारा मानना ​​है कि उनके उच्च सफलता दर तथ्य यह है कि गर्भाशय ग्रीवा के स्तर पर, एक्सोन और motoneurons की somas एक ही विमान पर कर रहे हैं पर भरोसा किया। यह और अधिक दुम स्लाइस में ऐसा नहीं है। यहाँ तक कि गर्भाशय ग्रीवा के स्तर पर, उनके अनुप्रस्थ स्लाइस केवल उदर जड़ों की स्टब्स, जो कम प्रोत्साहित करने के लिए विश्वसनीय हैं बनाए रखा। दूसरे अध्ययन लड़की भ्रूण dorso-काठ खंड 5 को प्रेरित किया। हालांकि, वे वोल्टेज संवेदनशील डाई रिकॉर्डिंग, जो एकल कोशिका के स्तर पर एक antidromic कार्रवाई क्षमता उत्प्रेरण की सफलता का संकेत करने के स्थानिक संकल्प का अभाव इस्तेमाल किया।

हमारे टुकड़ा preparatआयन के रूप में भी हाल ही में एक कागज 28 में कहा गया है रेंशाव कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए एक बेहतर तरीका प्रदान करता है। परोक्ष स्लाइस का उपयोग कर, वे अनुप्रस्थ स्लाइस 35 का उपयोग कर का सामना करना पड़ा मामलों में, जो 10% सफलता की दर से एक बड़ा सुधार था की 46% में monosynaptic रेंशाव कोशिकाओं प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने में सक्षम थे। हालांकि हम motoneuron पूल की उत्तेजना के लिए एक समान तुलना नहीं मिल सकता है, रेंशाव सेल में इस अवलोकन हमें विश्वास है कि motoneurons भी अधिक कनेक्टिविटी बरकरार रहती है।

रीढ़ की हड्डी के तिर्यक टुकड़ा करने की क्रिया एक अत्यधिक मांग तकनीक है कि मज़बूती से एक तैयारी जिसमें से एक रिकॉर्ड कर सकते हैं प्राप्त करने से पहले ज्यादा अभ्यास की आवश्यकता है। बहुत ही सुन्दर और तेज चिमटी और सूक्ष्म कैंची का प्रयोग आवश्यक है। समय बिताया विदारक काफी लंबे समय (1 घंटा तक) हो सकता है जब तक कि पूरी प्रक्रिया में ठंडा carbogen-bubbled विच्छेदन माध्यम में आयोजित किया जाता है। कुछ लेखकों intracardiac perfusio का कोई लाभ स्वीकार नहीं किया था जबकिn स्लाइस 36 की तैयारी में है, हम प्रक्रिया के इस कदम को बनाए रखने का फैसला किया है। यह निष्पक्ष, रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता के लिए intracardiac छिड़काव के लाभ को मापने के लिए विशेष रूप से, क्योंकि यह उम्र के साथ बदलता रहता है कठिन है।

सबसे महत्वपूर्ण कारक माउस उम्र है। हम सफलतापूर्वक p2 और P11 के बीच चूहों ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग करने से दर्ज की गई। इस उम्र अतीत, रीढ़ की हड्डी माइलिन भी घना हो जाता है और सबसे बड़ी कोशिकाओं (motoneurons) ऑक्सीजन के अभाव के कारण, टुकड़ा करने की क्रिया से पहले मर जाते हैं सबसे अधिक संभावना है। उस खिड़की के बाद, हम यह तेजी से मुश्किल स्वस्थ स्लाइस प्राप्त करने के लिए मिल गया। हाल ही में, नई तकनीकों बड़े पशुओं 17,36 में स्वस्थ स्लाइस प्राप्त करने के लिए सूचित किया गया है। सांद्रता eff को सीमित करने की कोशिकाओं 37,38 और पॉलीथीन ग्लाइकोल का oncosis को रोकने के लिए - वे ऐसी ऊर्जा (इथाइल-पाइरूवेट) की अनुपूरक स्रोतों, कम ना + और सीएल के रूप में उनके विदारक और रिकॉर्डिंग माध्यम के लिए अतिरिक्त additives इस्तेमालव्यापक झिल्ली लेनदेन है कि टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान होने की ECTS। इस तरह के संवर्द्धन के साथ, वे 6 महीने पुराने जानवरों के लिए ऊपर से रिकॉर्ड करने में सक्षम थे।

भविष्य में यह दो तकनीकों के फायदे गठबंधन करने के लिए वयस्क पशुओं में परोक्ष टुकड़ा तैयारी प्रयास करने के लिए दिलचस्प होगा। दो प्रोटोकॉल का मेल अपेक्षाकृत आसान साबित करना चाहिए और motoneuron पहचान की पुष्टि और जनसंख्या वयस्क चूहों में motoneurons के अक्षतंतु कोलैटरल द्वारा लक्षित अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करेगा। इसके अतिरिक्त, एक भ्रूण माउस में परोक्ष स्लाइस प्राप्त करने की कोशिश कर सकता है। उल्लेखनीय है, हमारी तैयारी भी पृष्ठीय जड़ है, जो सक्रियण monosynaptic अध्ययन करने के लिए प्रेरित किया जा सकता बरकरार रखे हुए मैं motoneurons के लिए एक तंत्रिका वितरण, साथ ही पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी neuronal आबादी के सक्रियण। अंत में, उदर जड़ stimulations motoneuron पहचान की पुष्टि करने के लिए और जनसंख्या motoneuron अक्षतंतु कोलैटरल द्वारा लक्षित अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करते हैं। </ P>

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Acknowledgements

लेखकों तस्वीरें लेने में उनकी मदद के लिए मारिन मैनुअल और ओलिविया गोल्डमैन-Szwajkajzer धन्यवाद। लेखकों को भी पांडुलिपि proofreading के लिए अर्जुन Masukar और टोबियास बोक धन्यवाद। वित्तीय समर्थन एजेसीं नेशनल द्वारा प्रदान किया गया ला Recherche (हाइपर-MND, ANR-2010-blan-1429-01) डालना, एनआईएच-NINDS (R01NS077863), थियरी Latran फाउंडेशन (OHEX परियोजना), मायोपथी के लिए फ्रेंच एसोसिएशन ( अनुदान संख्या 16026) और लक्ष्य ए एल एस आभार स्वीकार कर रहे हैं। फेलिक्स लेरॉय इकोले नॉर्मले Supérieure, Cachan से एक "Contrat डॉक्टरेट" से सम्मानित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Na-kynurenate ABCAM ab120256 dissolves better then other brands
KCl Sigma P3911
NaH2PO4 Sigma P5655
sucrose  Sigma S9378
NaHCO3  Sigma S6014
CaCl2  G Biosciences R040
MgCl2  Quality Biological 351-033-721
glucose  Sigma G5767
ascorbic acid  Sigma A5960
Na-pyruvate  Sigma P2250
K-gluconate  Sigma P1847
EGTA  Sigma E3889
HEPES  Sigma H4034
NaCl Sigma S9888
Agar Sigma A9799
QX-314 Alomone Q150
Mg-ATP Sigma A9187
CsOH Sigma 232041
Na-GTP Sigma 51120
gluconic acid Sigma G1951
Cesium hydroxide solution Sigma 232041
KOH Sigma P5958
Vannas Spring Scissors - 2.5mm  FST 15000-08 only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones
Stimulator A-M Systems Isolated Pulse Stimulator Model 2100
Vibratome Campden Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2

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References

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