Получение Косой спинного мозга Ломтики для вентральных корешков стимуляции

1Centre National de la Recherche Scientifique (UMR 8119), Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes
Published 10/13/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Мы покажем, как подготовить косые срезы спинного мозга у молодых мышей. Этот препарат позволяет для стимуляции брюшных корней.

Cite this Article

Copy Citation

Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation. J. Vis. Exp. (116), e54525, doi:10.3791/54525 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Электрофизиологические записи из спинного мозга срезов оказались ценным техникой, чтобы исследовать широкий круг вопросов, от сотовой сети к свойствам. Мы покажем, как подготовить жизнеспособные косые срезы спинного мозга молодых мышей (P2 - P11). В этом препарате, мотонейронов сохраняют свои аксоны выходят из вентральных корешков спинного мозга. Стимуляция этих аксонов вызывает обратно распространяющихся потенциалов действия агрессора мотонейроного Somas и захватывающие мотонейроного коллатерали в спинном мозге. Возможность записи Антидромные потенциалов действия является непосредственным, окончательным и элегантный способ охарактеризовать личность мотонейроном, которая превосходит другие методы идентификации. Кроме того, стимулируя мотонейроного коллатерали является простым и надежным способом для возбуждения залога целей мотонейронов в спинном мозге, такие как другие мотонейронов или Renshaw клетки. В этом протоколе, мы представляем антидромным записи с мотонейроного СОСМ, а также клеточного возбуждения Реншоу, в результате чего из вентральных корешков стимуляции.

Introduction

Исторически сложилось так , мотонейронов записи с помощью острых электрода сравнения были проведены в естественных условиях на крупных животных , таких как кошки или крысы 1 или на изолированном всего спинного мозга у мышей 2. Появление метода записи патч-зажим в течение 1980-х годов, называемый прямой доступ к мотонейроном СОСМ в качестве герметизирующего необходимо достичь под визуальным руководством. Таким образом, спинной мозг препарат срез был легко достигнут с начала 1990 - х годов 3. Тем не менее, в начале подготовки срез часто не позволяли для стимуляции брюшных корней. Насколько нам известно, только два исследования сообщили об успешном стимуляцию брюшных корней в поперечных срезах, и никто не был получен от мышей 4,5.

В этой статье мы представляем технику для достижения жизнеспособных спинного мозга ломтиков неонатального мышей (P2 - P11), в котором мотонейрон бассейн сохраняет свои вентральных корешков отходя аксонов. вентиляционныйКорневой стимуляция RAL вызывает Антидромные потенциал действия обратно в РРОС из мотонейроного бассейна, выходящего из того же корня вентральной. Он также возбуждает цели залога мотонейроном, другие мотонейронов 6-10 и клетки Реншоу 11-13. Так как только мотонейроны послать свои аксоны вниз вентральной корни, мы используем запись Антидромные потенциалов действия в качестве простого и окончательного способа physiologicaly идентифицировать мотонейроны 10.

В дополнение к использованию потенциально не включено или вводящие в заблуждение электрофизиологические и морфологические критерии для подтверждения личности мотонейроном, недавние исследования по мотонейронов спинного мозга также опирался на утомительно и отнимает много времени постфактум 16 окрашивания. Такая идентификация обычно выполняется только на образце записанных клеток. Другие стратегии идентификации полагаются на линии мышей, в которых мотонейроны выражающих эндогенной флуоресценции 1,2,20,21. В оптимальных условиях, мы смогли выявить Антидромные потенциалы действия практически из всех записанных мотонейронов.

Кроме того, вентральной корень стимуляция может быть использована для надежного возбуждения других мотонейронов 22,23 или их цели. клетки Реншоу 10,24,25. Мы представляем здесь приложения вентральной корня стимуляции в виде Антидромная потенциала действия записей из мотонейроного РРОС, а также возбуждение клеток Реншоу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты проводились в соответствии с европейскими директивами (86/609 / CEE и 2010-63-UE) и французского законодательства, и были одобрены комитетом по этике университета Париж Декарт.

1. спинного мозга Кусочек Приготовление

  1. Подготовьте следующие решения ежедневно или за один день. Если выдерживают в течение ночи, пузырь с 95% O 2 и 5% СО 2 и хранить в холодильнике в плотно закрытой посуде.
    1. Приготовьте низкий Na + искусственную спинномозговую жидкость (ACSF): 3 мМ KCl, 1 мМ NaH 2 PO 4, 230 мМ сахарозы, 26 мМ NaHCO 3, 0,8 мМ CaCl 2, 8 мМ MgCl 2, 25 мМ глюкозы, 0,4 мМ аскорбиновой кислоты, 1 мМ Na-kynurenate, 2 мМ Na-пируват. Пузырь с 95% O 2 и 5% CO 2 (рН 7,4). Так как Na-kynurenate часто бывает трудно распустить, убедитесь, чтобы купить один из перечисленных в таблице материалов.
    2. Подготовка К-глюконат Солуции: 130 мМ К-глюконат, 15 мМ КСl, 0,05 мМ EGTA, 20 мМ HEPES, 25 мМ глюкозы, 1 мМ Na-kynurenate, 2 мМ Na-пируват, доведенный до рН 7,4 с помощью КОН.
    3. Готовят ACSF: 130 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 1 мМ NaH 2 PO 4, 26 мМ NaHCO 3, 25 мМ глюкозы, 0,4 мМ аскорбиновой кислоты, 2 мМ Na-пируват. Пузырь с 95% O 2 и 5% CO 2 (рН 7,4).
    4. До начала диссекции, растворите 2% агара в 80 мл раствора К-глюконат, и держать в тепле при 60 ° C.
  2. Внутриутробная перфузия
    1. Выполните этот препарат на самок и самцов мышей, в возрасте от P2 до P11.
    2. Обезболить мышь с внутрибрюшинного введения 0,1 мл 25 мМ пентобарбиталнатрием (50 мг / кг).
    3. С помощью иглы или ленты, иммобилизации мышь на спине на большой чашке Петри заполнены с кремнием. Используйте рассекает микроскопе для остальной части рассечение.
    4. Удерживая кончик грудной кости, поднимите грудь и перерезал диафрагму с помощью тонких ножниц. Затем откройте сундук с обеих сторон путем разрезания через ребра, чтобы обнажить сердце.
    5. Разрежьте правое предсердие, прежде чем прокалывание левого желудочка с 27G иглой.
    6. Заливать с ледяным низким Na + ACSF. Через 30 сек, низкий Na + , ACSF следует рассматривать вытекающей из предсердия. Низкое количество натрия предотвратить клетки от пики и снижают клеточную смерть во время вскрытия.
    7. Продолжайте удерживать иглу в сердце под микроскопом рассекает, пока печень не станет желтым, когда кровь сливают.
  3. Спинной рассечение шнур
    1. Обезглавьте животное и положить его на живот.
    2. Быстро удалить кожу спины (рис 1A1). Сделайте два разреза через плечи и спускаясь грудной клетки (рис 1A2). Тогда обрезали кабель, как лвл, как это возможно в хвостовую секции, чтобы изолировать позвоночный столб с началом ребра из нижней части тела животного. Флип животное снова и удалить потроха все еще прикрепленные к ребрам.
    3. Передача позвоночный столб в другой, меньший кремний заполненные чашку Петри и использовать 4 насекомых булавками , чтобы держать его спинной стороной вверх (рисунок 1А).
    4. Постоянно заливать животное с карбогена-ыми ACSF (при температуре около 4 ° С) во время выполнения ламинэктомии спинной стороны, и подвергая спинной мозг от ростральной конца (рис 1В). Для этого, вставьте кончик тонких ножниц между костью и спинного мозга и вырезать кости понемногу от ростральной конца, убедившись в том, чтобы держаться подальше от белого вещества. Alternate на каждой стороне в то время как с помощью пинцета , чтобы держаться подальше полосу кости уже вырезать (рис 1B1).
    5. Используя самые маленькие доступные пружинные ножницы и пинцет, поднимите твердую мозговую оболочку и нарезатьс обеих сторон, удерживая свободную часть ТМО для того, чтобы избежать повреждения спинного мозга с ножницами. Разрежьте вдоль ростро-каудальном оси.
      Примечание: Твердая представляет собой полупрозрачный непрерывная мембрана; в этом возрасте мягкая мозговая оболочка слишком хрупким и будет распадаться во время вскрытия и разделки (рис 1B2).
    6. После того, как Dura удаляется с затупившейся стекло или пластиковый наконечник, чтобы аккуратно вставьте шнур на левой стороне канавки, образованной наполовину сократить позвоночника, и разрезают вентральной и дорсальной корни с правой стороны, начиная с ростральной стороны , дальше всего от того, где они входят шнур (несколько мм , по меньшей мере, рис 1B2).
    7. Повторите эту операцию на левой стороне, всегда идет от ростральной до хвостового. Если левой рукой, начните с левой стороны, а затем перейти на правую сторону.
  4. Вложение в агар
    1. Скольжение шнур из позвоночного столба. Используйте меньший штифт насекомого придавитьшнур с дорсальной поверхности и деликатно удалить любую часть мембраны все еще прикрепленный к нему (рис 1C1).
    2. После очистки, обрезки обоих концов (рис 1C2). Вставьте изогнутый штифт насекомых в передней части шнура , чтобы манипулировать шнур и отметить его ориентацию (стрелка на рисунке 1C2). Затем перенесите спинной мозг к охлажденному льдом раствору K-глюконата.
      Примечание: Это решение имитирует внутриклеточный состав спинномозговой жидкости и предотвратить клетки от смерти от осмотического шока после того , как мотонейроны будут сокращены 26.
    3. После того, как спинной мозг находится в пределах внутриклеточного раствора, возьмите стакан с агаром из сухой бане и охладить его на смесь льда и воды.
    4. Продолжайте перемешивание во время измерения температуры. Когда температура достигает 38 ° C погружать спинной мозг, держа его пальца насекомых и поместить его ростральной стороной вниз. Убедитесь, что спинной мозг в стraight , насколько это возможно, подальше от стен, каудальной части немного вверх (рис 1D1).
    5. Оставьте химический стакан в смесь льда и воды, чтобы позволить агар затвердеть настолько быстро, насколько это возможно. Убедитесь , что он остается на месте и что шнур как можно более прямой (рисунок 1D1).
  5. нарезка
    1. После затвердевания, вырезать агар блок , содержащий спинной мозг таким образом , что основание блока находится при 35 ° угол с поясничной части спинного мозга (стрелка на рисунке 1D2). Дорсальная поверхность должна быть обращена в сторону от основания (рис 1D2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важный шаг в процедуре, для поддержания непрерывности бассейнов мотонейронов к вентральных корешков, из которого они выходят.
    2. Клей блок в камеру vibratome использованием цианакрилатный клей. Погрузить его в K-глюконата раствор и добавляют распускали замороженного раствора K-глюконата для поддержанияванны охлажденным (ниже 2 ° С).
    3. Вырезать 350 - 400 мкм срезы толщиной поясничной области (идентифицируемые по его кривизны и большего диаметра). В своей правильной ориентации (см 1.4.1.), Используйте лезвие, чтобы отрезать от дорсальной к вентральной поверхности и сделать ломтики непрерывно более ростральной. Как правило, есть 4-5 подходящие кусочки с вентральных корешков, простирающихся на 2 мм или более. Используйте следующие параметры: 10 ° угол, частота колебаний 70 Гц и 10 мм / мин Скорость нарезки.
  6. инкубация
    1. Перенесите ломтики ACSF при температуре 34 ° C. Примерно через 30 мин, охладить ломтики до комнатной температуры и начать сеанс записи.

Рисунок 1
Рисунок 1. Вскрытие
A1:. Удаление кожи спины , чтобы обнажить спинной колонки A2:Нарезка плеч и ребер , чтобы освободить спинной столбец B1:. Позвоночнике возлагали на кремниевом заполненные чашку Петри (спинной стороной вверх, хвостовой стороне слева) B2:. То же самое с спинного мозга подвергаются и расчлененный C1:. Спинной мозг изолированных . (ростральной сторона слева) C2: спинной мозг готов для встраивания (вентральной стороной вверх, ростральной сторона слева). Обратите внимание на меньший штифт насекомое на ростральной стороне D1:.. Спинной мозг в агара стакане (ростральной сторона Дау, вентральной стороне , обращенной к нижней части ) D2: Вырезать агар блок со встроенным спинным мозгом. Обратите внимание на угол 35 ° спинальные формы шнура с основанием блока и поясничного утолщения (стрелка). Шкала баров 1 см. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Размещение нарежьте Палаты

Примечание: Ventral корни переменного размера.

  1. Подготовьте коробку различных пипеток с диаметром наконечника в пределах от 40 до 170 мкм, заранее. Для приготовления всасывающие пипеток, готовят много пипетки с длинным конусом. Используя алмазный нож, сделать разрез в разных положениях. Затем под рассекает микроскопом, разбить его, нажав на кончик с помощью пинцета.
  2. Удалите камеру из записи микроскопа и поместите его под рассекает микроскопом.
  3. Выберите фрагмент, который содержит вентральной корень достаточной длины (2 мм и более), чтобы быть установлен на всасывающей стимуляции электрода. Выбор правильной ориентации среза с брюшным корнями вверх (рис 2А) и тонко разрезал агар вокруг вентральные корешки, оставляя остальную часть агара вокруг среза (Фигура 2В).
    Примечание: Поскольку агар тверже, чем срез, это позволит нити якоря срезе, чтобы опираться на агар, а не на срез и, таким образом, вnchor не повредит ткань. Убедитесь , что нити якоря срезе находятся выше мотонейроного бассейна (показано красным цветом на рисунке 2в).
  4. Установите камеру обратно на микроскоп и непрерывно заливать записи камеры с ACSF со скоростью 1 - 2 мл / мин, при комнатной температуре. Используя стеклянную пипетку , заполненную ACSF и подсоединенный к шприцу, сосать один из вентральной корня (стрелка на рисунке 2 , в ). Для достижения хорошей стимуляции вентрального корня, кончик пипетки должен быть плотно вокруг вентральной корня. Один полюс должен быть в стимулирующий электрод, а другой в ванне (или подсоединенного к фиксации потенциала электрода сравнения,).
  5. Достичь пэтч-кламп записи требуемого типа клеток и записывают эффект вентральной корня стимуляции , как описано previsouly 10.
    1. При этом использовать усилитель для сбора данных. Фильтр записи целых клеток на 3 кГц. Оцифровка на 10 кГц. Компенсировать мост сопротивление в Curreнт-зажим режима.

фигура 2
Рисунок 2. Брюшной Root Получение
A: поясничного отдела спинного мозга срез встроен в агар с вентральной корень лицевой стороной вверх B:. Поясничного отдела спинного мозга срез с вентральных корешках освобождали от агара C:. Поясничного отдела спинного мозга срез с раздражающего электрода плотно расположенных вокруг брюшных корней (стрелка) , Обратите внимание на расположение клеток Реншоу , выражающих красную флуоресценцию в 28 chrna2-Cre мышей скрещивали с репортером мыши R26 Том 17. Шкала баров 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Подтверждение идентичности мотонейроном Использование Потенциалы Антидромная действий

Cell нацеливание

Мотонейроны находятся в вентральном роге (видимый в красном цвете на рисунке 2в). Начните с пачкой аксонов, образующих вентральной корень и идти вверх до тех пор, пока пучок полностью рассеивает и один начинает видеть крупные клетки (ось длиной Сома, выше 20 мкм). Достичь запись целой клетки из круглой здоровый вид ячейки с использованием электрода начального сопротивления от 3 до 4 МОм. Внутренний раствор , используемый содержал: 140 мМ K-глюконат, 6 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, 0,1 мМ CaCl 2, 4 мМ Mg-АТФ, 0,3 мМ Na 2 ГТФ. Доводят рН до 7,3 с помощью КОН, а также осмолярность 285 - 295 мОсм добавлением дистиллированной воды.

После записи цельноклеточная достигается, применять единый двухфазный стимуляцию вентральной корня (1 - 50 В, 0,1 - 0,3 мс) , чтобы вызвать Антидромные потенциал действия в записанном клетках вентральной мозга Фигуры 3A1 и 3A2 шоу Антидромные действие. потенциалы в напряжении-зажим или ток-зажим, соответственно. При увеличении интенсивности стимуляции от 1 до 5 В (рис 3A1) и от 10 до 15 В (рис 3A2) потенциал Антидромная действие появляется в все или ничего моды с задержкой 0,9 мс и 1,1 мс соответственно. Учитывая, что только мотонейроны послать свои аксоны через вентральные корешки, потенциал Антидромная действие является доказательством идентичности клеток.

В меньшинстве мотонейронов (около 10%), вентральной корень стимуляции не удалосьвызывают Антидромные потенциал действия, а вызвал ортодромном потенциалы действия. На рисунках 3B1 и 3B2 показывают ортодромном потенциалы действия в напряжении-зажим или ток-зажим, соответственно. При увеличении стимуляции от 20 до 30 В (рис 3B1) и от 25 до 40 В (рис 3B2), появляется потенциал действия, после предыдущего возбуждающим постсинаптического тока (EPSC) или возбуждающими постсинаптического потенциала (ВПСП). В латентности потенциалов действия больше (5,1 мс и 5,3 мс соответственно). В этих двух клеток, стимулируя вентральной корень вызвал упреждающего возбуждения (мотонейроны отправить аксонов коллатерали к себе и к другим мотонейронов), который был достаточно сильным, чтобы вызвать ортодромном потенциал действия. В таких клетках неспособность вызывать Антидромные потенциал действия (характеризуется все или ничего моды и времени ожидания короче 5 мсек) не позволяет сделать вывод о том, что эти клетки ар е мотонейронов. Обратите внимание, что требуемая интенсивность стимуляции, чтобы вызвать опережающее возбуждение выше, чем необходимы, чтобы вызвать антидромным потенциала действия. Все раздражений, показанные здесь, 0,1 мс, но иногда, больше стимуляция (до 0,3 мс) может потребоваться, чтобы вызвать антидромным потенциала действия.

Рисунок 3
Рисунок 3. мотонейроном Ответы на вентральных корешков стимуляции
A1: 1 В (красный след) и 5 В (черный след) раздражений A2:.. 10 В (красный след) и 15 В (черный след) раздражений B1: 20 В (красный след) и 30 В (черный след) раздражений . B2: 25 В (красный след) и 40 В (черный след) раздражений. Черные точки обозначают временные стимула. Двойные наконечники стрел подчеркивают разницу в задержках между орто- и Антидромные шипами.м / файлы / ftp_upload / 54525 / 54525fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Реншоу стимуляции клеток

Cell нацеливание

Реншоу клетки находятся в вентральном роге 27,28. Визуализируйте аксона расслоения с дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображений с использованием 20X и А 63x цели. Начните с пачкой аксонов , образующих вентральной корень и идти вверх до тех пор , пока аксоны начинают расходиться , но до сих пор различимы (рис 4A, стрелки). Цель для клеток промежуточного размера (около 10 - 15 мкм в диаметре, рис 4A, размерные стрелки). Достичь запись целой клетки круглой здоровый вид ячейки с использованием электрода начального сопротивления от 5 до 7 МОм. В зависимости от эксперимента, мы использовали ехTher Cs + или K основанное + -На внутренние решения 10. Cs-решение предотвратить большие токи калия, которые были видны около -45 мВ. В некоторых экспериментах, мы также добавили 5 мМ QX-314, чтобы блокировать натриевые каналы, ответственные за пики в записанном ячейке. + Раствор Cs основанное содержит: 125 мМ Cs-глюконата, 5 мМ QX-314 Cl, 10 мМ HEPES, 10 мМ EGTA, 1 мМ CaCl 2, 4 мМ Mg-АТФ и 0,4 мМ Na-ГТФ, с рН доводят до 7,3 с CsOH. + Основанное решение K должно быть использовано для анализа, как в током и напряжением зажима, ответы клеток Реншоу к вентральной корневой стимуляции в условиях , близких как можно больше физиологическим. Этот раствор содержит: 125 мМ К-глюконат, 10 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, 0,1 мМ CaCl 2, 4 мМ Mg-АТФ, 0,4 мМ Na-ГТФ, с рН , доведенным до 7,3 с помощью КОН. Интенсивность стимула варьировали от 10 до 100 В и его продолжительность колебалась от 50 до 300 мкс. Bipo LAR импульсы использовались во всех случаях.

Реакция клеток Реншоу к вентральной стимуляции корневой

Стимуляция вентральной корня вызывает corelease глутамата и ацетилхолина из мотонейронов коллатералей на клетки Реншоу 10. Feed-вперед ингибирование опосредованного ГАМК и глицин также набраны 10. Рисунок 4B показывает ответы на одной стимуляции вентральной корня. Ячейка была записана в режиме напряжения зажим с раствором цезиевой основе, и поддерживается при напряжении -45 мВ. QX-314 в растворе внутриклеточного предотвратить клетки от стрельбы и ГАМК и глицин ответы были заблокированы 3 мкМ габазин и 1 мкМ стрихнина, соответственно. Внутрь синаптической тока на фиг.4В представляет собой сумму глутаматэргическую и никотиновых токов.

нт "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Рисунок 4
Рисунок 4. Реншоу стимуляции клеток от вентральных корешков
A: Изображения клеточного пула Реншоу , приобретенный с помощью косой конденсатор в том же срезе в два разных увеличениях (20х и 40х). Обратите внимание мотонейроного аксоны, переходящего в вентральной корень (стрелка). Предполагаемые Реншоу клетки обозначены стрелками. Шкала баров: 100 мкм в A1, 50 мкм A2 B:. Напряжение-зажим записи ячейки Реншоу после стимуляции вентрального корня (черная точка). Красный след среднее из серых. Удержание напряжения был установлен на уровне -45 мВ. QX-314 в внутриклеточной растворе предотвратили клетки от стрельбы и ГАМК и глицин ответы были заблокированы 3 мкМ габазин и 1 мкМ стрихнина, соответственно. Черная точка указывает сроки стимула.COM / файлы / ftp_upload / 54525 / 54525fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Косая нарезка спинного мозга имеет важное значение, поскольку она позволяет односторонней стимуляции мотонейронов бассейнов и клеток Реншоу в одном позвоночном сегменте в надежной, всеобъемлющей и определенным образом. Кроме того, она позволяет быстро, элегантной и не двусмысленной идентификации зарегистрированных мотонейронов. Далее, мы будем выделить преимущества этого метода по сравнению с другими способами получения среза, а затем мы подчеркиваем из наиболее распространенных ошибок, которых следует избегать при выполнении этой процедуры.

Большинство исследований с использованием поперечных срезов основу их идентификации на внутренних электрических свойств 3,14,15,29. Тем не менее, эти сильно различаются между мотонейронов бассейнов, а также между мотонейронов подтипов в пределах данного пула (альфа-, бета- и гамма-мотонейронов 30). Таким образом, исследования с использованием параметров размера, вероятно, чтобы исключить меньшие гамма-мотонейронов. С другой стороны, Купер и Шеррингтон dвневписанной в 1940 году группа крупных нервных клеток в вентро-латеральной серого вещества поясничного отдела спинного мозга обезьян и кошек , которые перешли по возрастанию аксонов 31,32. Помимо того, что близко к мотонейроного РРОС, они отметили, что они появились гистологически неотличим от мотонейронов. В недавней статье подтвердили существование таких клеток у мышей 33. Из-за большого размера этих клеток и их расположения, они могли быть ошибочно включены в прежних исследованиях. Наш критерий идентификации исключает предполагаемые спинальные пограничные клетки, так как их аксонов не выступает в вентральной корень, позволяя при этом надежную идентификацию всех мотонейронов независимо от их размера. Кроме того, анализируя внутренние электрические свойства (например, входное сопротивление), занимает больше времени , чем простое наблюдение с антидромным потенциала действия.

В дополнение к использованию внутренние электрические свойства, некоторые Studieс с помощью поперечных срезов, подтвердить их идентификацию, выполняя постфактум анализ молекулярного маркера для мотонейронов (например, Островок-1/2 16) или путем визуализации морфологии с использованием biocytin маркировок 14,17. Такие идентификаций, однако, утомительной и не обеспечивают возможность непосредственной идентификации. Поэтому они редко систематически выполняются.

Некоторые исследования пытались использовать мышей линий , экспрессирующих генетически закодированы мотонейроном флуоресцентный маркер (Hb9-GFP мыши линии 18, общайся-EGFP трансгенных мышей, которые выражают EGFP в холинергических клеток , включая мотонейронов 19 или G85R SOD1-YFP трансгенных мышей, которые сильно экспрессируют слитый белок YFP в мотонейронов 17). Тем не менее, поскольку выражение генетический маркер, как правило, обусловлено во времени и так как срезы обычно берутся из эмбрионов или молоди, экспрессию маркера не может быть адекватным в возрасте амиTudy выполняется. Другие исследования использовали инъекции ретроградную агента для визуализации мотонейроного бассейн 34. Мы также провели холерный токсин бета-инъекции в камбаловидной или EDL (личное наблюдение). Такие методы маркировки имеют большое значение для обозначения конкретного мотонейроном бассейн, но требуют утомительной операции за несколько дней до начала эксперимента. Кроме того, молодой возраст, в котором эксперименты ломтик делаются, делает его значительно труднее конкретно нацелены на мышцы. И, наконец, существует реальная забота о возмущении мотонейроного путем введения экзогенного агента.

При оптимальных условиях мы смогли получить Антидромные потенциалы действия практически всех записанных мотонейронов. Угол 35 ° используемый имеет решающее значение для получения вентральные корешки достаточной длины. В заключение отметим, что косой срез подготовка предлагает быстрый и надежный способ идентифицировать каждую мотонейроном, который превосходит других методов идентификации.

Как было сказано во введении, только два исследования сообщили об успешном стимуляции брюшных корней в поперечных срезах. Первое исследование цервикальной записано нейроны у крыс и стимулировали белое вещество , где вентральный корень окурка выходит 4. Они успешно индуцированное Антидромные потенциал действия в 85% зарегистрированных нейронов. Мы считаем, что их высокий уровень успеха опирался на тот факт, что на шейном уровне, аксоны и СОСМ мотонейронов находятся на одной плоскости. Это не тот случай в более каудальных срезов. Даже на шейном уровне, их поперечные срезы только сохранили заглушек вентральной корней, которые являются менее надежными, чтобы стимулировать. Второе исследование стимулировало куриного эмбриона спинно-поясничный сегмент 5. Тем не менее, они использовали напряжение регистрирующих краситель, который не хватало пространственное разрешение, чтобы указать успех индукции Антидромные потенциалов действия на уровне одной клетки.

Наш ломтик подготовка трион также предлагает превосходный способ стимулировать клетки Реншоу , как указано в недавней статье 28. Используя косые срезы, они были в состоянии регистрировать моносинаптических Клетка Реншоу ответов в 46% случаев, что является одним из основных улучшение по сравнению с вероятностью успеха 10% столкнулись с использованием поперечных срезов 35. Несмотря на то, что мы не могли найти подобное сравнение для стимуляции бассейнов мотонейронов, это наблюдение в камере Реншоу приводит нас к мысли, что мотонейроны также сохраняют больше возможностей подключения.

Косая нарезка спинного мозга является весьма требовательным метод, который требует много практики, прежде чем надежно получить препарат, из которого можно записывать. Используя очень тонкие и острые пинцеты и микро-ножницы имеет важное значение. Время, проведенное рассечения может быть довольно долго (до 1 ч) до тех пор, как вся процедура проводится в охлажденном карбогена-ыми рассечение среды. В то время как некоторые авторы не признают никакой пользы внутрисердечной perfusioп в подготовке ломтиков 36, мы решили поддержать этот шаг процедуры. Трудно объективно оценить преимущества внутрисердечного перфузией за качество записи, особенно потому, что она меняется с возрастом.

Наиболее важным фактором является возраст мыши. Мы успешно записаны от мышей между Р2 и Р11 с использованием вышеуказанного протокола. Прошлое этого возраста, спинной мозг миелин становится слишком плотным и большие клетки (мотонейронов) умирают до нарезка, скорее всего, из-за недостатка кислорода. После этого окна, мы обнаружили, что все труднее получить здоровые ломтики. Недавно сообщалось , новые методы , чтобы получить здоровые срезы у пожилых животных 17,36. Они использовали дополнительные добавки к их анатомического и носитель записи , такой как дополнительные источники энергии (этил-пируват), нижний Na + и Cl - концентрации , чтобы предотвратить oncosis клеток 37,38 и полиэтиленгликоль , чтобы ограничить эффЕКТС из обширных мембранных transections, которые происходят во время нарезки. С помощью таких усовершенствований, они были в состоянии произвести запись до 6-месячных животных.

В будущем было бы интересно попытаться косой срез препаратов у взрослых животных, чтобы объединить преимущества двух методов. Объединение этих двух протоколов должны доказать относительно легко и обеспечит надежный инструмент для подтверждения идентичности мотонейроном и изучать население мишенью аксонов коллатерали мотонейронов у взрослых мышей. Кроме того, можно попытаться получить косые срезы в эмбрион мыши. Стоит отметить, что наш препарат также сохраняет спинной корни, которые могут быть стимулированы к изучению моносинаптических активации I A иннервацию мотонейронов, а также активация спинных спинного мозга нейрональных популяций. В заключение, брюшные корень раздражений предлагают надежный инструмент для подтверждения идентичности мотонейроном и изучать население мишенью мотонейрон аксона залогов. </ Р>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Авторы благодарят Marin Мануэля и Оливия Гольдмана-Szwajkajzer за помощь в принятии фотографии. Авторы также благодарят Arjun Masukar и Tobias Бок за вычитку рукописи. Финансовые опоры были предоставлены Agence Nationale Recherche пур ля (Гипер-БДН, ANR-2010-Blan-1429-01), НИЗ-NINDS (R01NS077863), то Тьерри Latran Foundation (OHEX проекта), французская ассоциация миопатия ( грант номер 16026) и Target ALS Бидани. Феликс Лерой был получателем "Contrat докторских" из Ecole Normale Supérieure, Качан.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Na-kynurenate ABCAM ab120256 dissolves better then other brands
KCl Sigma P3911
NaH2PO4 Sigma P5655
sucrose  Sigma S9378
NaHCO3  Sigma S6014
CaCl2  G Biosciences R040
MgCl2  Quality Biological 351-033-721
glucose  Sigma G5767
ascorbic acid  Sigma A5960
Na-pyruvate  Sigma P2250
K-gluconate  Sigma P1847
EGTA  Sigma E3889
HEPES  Sigma H4034
NaCl Sigma S9888
Agar Sigma A9799
QX-314 Alomone Q150
Mg-ATP Sigma A9187
CsOH Sigma 232041
Na-GTP Sigma 51120
gluconic acid Sigma G1951
Cesium hydroxide solution Sigma 232041
KOH Sigma P5958
Vannas Spring Scissors - 2.5mm  FST 15000-08 only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones
Stimulator A-M Systems Isolated Pulse Stimulator Model 2100
Vibratome Campden Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13, (1), 9-38 (1950).
  2. Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25, (2), 451-459 (2007).
  3. Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
  4. Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112, (2), 185-191 (2001).
  5. Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2, (5), e417 (2007).
  6. Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308, (1), 196-199 (1984).
  7. Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132, (1), 1-10 (1977).
  8. Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272, (3), 755-767 (1977).
  9. Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31, (3), 179-187 (1998).
  10. Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28, (52), 14121-14131 (2008).
  11. Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
  12. Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5, (1 Pt 2), 86 (1946).
  13. Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
  14. Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102, (6), 3627-3642 (2009).
  15. Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589, (Pt 9), 2245-2260 (2011).
  16. Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
  17. Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (47), 16883-16888 (2014).
  18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, (3), 385-397 (2002).
  19. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27, (3), 391-397 (2006).
  20. Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29, (36), 11246-11256 (2009).
  21. Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112, (9), 2302-2315 (2014).
  22. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
  23. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114, (3), 1963-1973 (2015).
  24. Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86, (8), 1114-1121 (2013).
  25. Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32, (24), 8413-8423 (2012).
  26. Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25, (28), 6490-6498 (2005).
  27. Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26, (51), 13297-13310 (2006).
  28. Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41, (7), 889-900 (2015).
  29. Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79, (5), 2485-2502 (1998).
  30. Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53, (5), 1323-1344 (1985).
  31. Cooper, S., Sherington, C. S. Gower's tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
  32. Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26, (3-4), 371-396 (1951).
  33. Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220, (5), 2997-3009 (2015).
  34. Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549, (Pt 1), 21-36 (2003).
  35. Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87, (6), 3117-3125 (2002).
  36. Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107, (2), 728-741 (2012).
  37. Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5, (6), 1483-1489 (1985).
  38. Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65, (1), 65-71 (1986).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats