La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation

Neuroscience

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Summary

Nous montrons comment préparer des tranches obliques de la moelle épinière chez les jeunes souris. Cette préparation permet la stimulation des racines ventrales.

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Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation. J. Vis. Exp. (116), e54525, doi:10.3791/54525 (2016).

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Abstract

enregistrements électrophysiologiques à partir de tranches de la moelle épinière se sont révélés être une technique précieuse pour enquêter sur un large éventail de questions, de cellulaire aux propriétés du réseau. Nous montrons comment préparer des tranches obliques viables de la moelle épinière des souris jeunes (P2 - P11). Dans cette préparation, les motoneurones conservent leurs axones sortant des racines ventrales de la moelle épinière. La stimulation de ces axones suscite back-propageant des potentiels d'action qui envahissent le soma des motoneurones et passionnants nantissements l'motoneuronales au sein de la moelle épinière. Enregistrement des potentiels d'action antidromiques est une façon immédiate, définitive et élégante pour caractériser l'identité du motoneurone, qui surpasse les autres méthodes d'identification. En outre, la stimulation des nantissements de motoneurones est un moyen simple et fiable pour exciter les cibles collatérales des motoneurones au sein de la moelle épinière, comme d'autres motoneurones ou Renshaw cellules. Dans ce protocole, nous présentons les enregistrements antidromiques du motoneurone somas ainsi que Renshaw cellulaire excitation, résultant de la stimulation de la racine ventrale.

Introduction

Historiquement, les enregistrements de motoneurones utilisant sharp-électrode ont été réalisées in vivo sur les grands animaux tels que les chats ou rats 1 ou sur un ensemble de la moelle épinière isolée chez la souris 2. L'émergence de la technique d'enregistrement patch-clamp pendant les années 1980, a appelé à un accès direct à la motoneurone somas que l'étanchéité nécessaire pour être réalisé sous guidage visuel. Ainsi, la moelle épinière préparation de tranche a été facilement atteint depuis le début des années 1990 3. Cependant, au début de la préparation tranche souvent ne permettait pas la stimulation des racines ventrales. Au meilleur de notre connaissance, seules deux études ont rapporté une stimulation réussie des racines ventrales en tranches transversales, et aucun n'a été obtenu à partir de souris 4,5.

Dans cet article, nous présentons une technique pour obtenir des tranches viables de la moelle épinière de souris néonatale (P2 - P11) dans lequel le pool de motoneurones conserve ses racines au départ ventrales axones. conduitla stimulation de la racine ral déclenche potentiel d'action antidromique de nouveau dans les somas de la piscine du motoneurone sortant de la même racine ventrale. Il excite aussi les cibles collatérales du motoneurone, d' autres motoneurones 6-10 et les cellules de Renshaw 11-13. Étant donné que seuls les motoneurones envoient leurs axones vers le bas les racines ventrales, nous utilisons l'enregistrement des potentiels d'action antidromiques comme un moyen simple et définitive à physiologicaly identifier motoneurones 10.

En plus d'utiliser des critères électrophysiologiques et morphologiques potentiellement non inclusives ou trompeuses pour confirmer l'identité des motoneurones, des études récentes sur les motoneurones de la moelle épinière invoquaient également fastidieuse et chronophage post hoc Colorations 16. Une telle identification est habituellement effectuée uniquement sur un échantillon des cellules enregistrées. D'autres stratégies d'identification reposent sur des lignées de souris dans lequel les motoneurones expriment une fluorescence endogène 1,2,20,21. Dans des conditions optimales, nous avons pu obtenir des potentiels d'action antidromiques de la quasi-totalité des motoneurones enregistrées.

En outre, la stimulation de la racine ventrale peut être utilisé de manière fiable pour exciter les autres motoneurones 22,23 ou leurs cibles. les cellules de Renshaw 10,24,25. Nous présentons ici les applications de la stimulation de la racine ventrale sous la forme d'actions antidromique enregistrements potentiels de motoneurone somas, ainsi que l'excitation des cellules de Renshaw.

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Protocol

Les expériences ont été réalisées conformément aux directives européennes (86/609 / CEE et 2010-63-UE) et de la législation française, et ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université Paris Descartes.

1. Préparation de la moelle épinière Slice

  1. Préparer les solutions quotidiennes ou suivantes un jour à l'avance. Si elles sont conservées pendant une nuit, bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 et de garder au réfrigérateur dans des flacons fermés hermétiquement.
    1. Préparer faible Na + liquide artificiel céphalorachidien (ACSF): 3 mM de KCl, 1 mM de NaH 2 PO 4, 230 mM de saccharose, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM de CaCl2, 8 mM de MgCl2, 25 mM de glucose, l' acide ascorbique 0,4 mM, 1 mM de Na-kynurénate, 2 mM de pyruvate. Bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 (pH 7,4). Depuis Na-kynurénate est souvent difficile à dissoudre, assurez-vous d'acheter celui indiqué dans le tableau des matériaux.
    2. Préparer solu K-gluconatetion: 130 mM de K-gluconate, 15 mM de KCl, 0,05 mM d' EGTA, 20 mM de HEPES, 25 mM de glucose, 1 mM de Na-kynurénate, 2 mM de Na-pyruvate, ajusté à pH 7,4 avec du KOH.
    3. Préparer ACSF: 130 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM de NaH 2 PO 4 26 mM NaHCO3, 25 mM de glucose, 0,4 mM d' acide ascorbique, 2 mM de pyruvate. Bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 (pH 7,4).
    4. Avant le début de la dissection, dissoudre 2% d'agar dans 80 ml de la solution K-gluconate, et garder au chaud à 60 ° C.
  2. intracardiaque perfusion
    1. Effectuer cette préparation sur des souris femelles et mâles, âgés de P2 à P11.
    2. Anesthésier la souris avec une injection intraperitoneale de 0,1 ml de 25 mM de pentobarbital sodique (50 mg / kg).
    3. L'utilisation d'aiguilles ou de bande, immobiliser la souris sur le dos sur une grande boîte de Pétri remplie de silicium. Utilisez un Microscope disséquante pour le reste de la dissection.
    4. Tenir la pointe du sternum, soulever la poitrine et couper la membrane à l'aide de ciseaux fins. Ouvrez ensuite la poitrine des deux côtés en coupant à travers les côtes pour exposer le cœur.
    5. Couper l'oreillette droite avant de percer le ventricule gauche avec une aiguille de 27G.
    6. Perfuser avec de la glace froide faible ACSF Na +. Au bout de 30 secondes, le plus bas de Na + ACSF doit être considéré circulant hors de l'atrium. De faibles quantités de sodium empêchent les cellules à partir de dopage et à réduire la mort cellulaire lors de la dissection.
    7. Maintenez l'aiguille dans le cœur sous le microscope de dissection jusqu'à ce que le foie devient jaune lorsque le sang est drainé.
  3. Spinal dissection du cordon
    1. Décapitez l'animal et le mettre sur le ventre.
    2. Retirez rapidement la peau du dos (figure 1A1). Faites deux coupes à travers les épaules et en descendant la cage thoracique (figure 1A2). Ensuite, couper le cordon en loe que possible dans la partie caudale afin d'isoler la colonne vertébrale avec le début des nervures de la partie inférieure de l'animal. Retournez l'animal à nouveau et retirer les viscères encore attachés aux côtes.
    3. Transférer la colonne vertébrale à un autre, plus petite boîte de Pétri silicium-rempli et utiliser 4 broches d' insectes pour le maintenir dorsale vers le haut (figure 1A).
    4. Perfuser en continu l'animal avec l' ACSF carbogène-barboter (à environ 4 ° C) tout en effectuant une laminectomie de la face dorsale, et l' exposition de la moelle épinière de l'extrémité rostrale (figure 1B). Pour ce faire, insérez la pointe des ciseaux fins entre l'os et la moelle épinière et couper l'os peu à peu de la fin rostrale, en veillant à rester à l'écart de la matière blanche. Alternate de chaque côté tout en utilisant des pinces pour tenir à l' écart de la bande de l' os déjà coupé (Figure 1B1).
    5. En utilisant les plus petits ciseaux et des pinces à ressort disponibles, soulevez la dure et coupesur les deux côtés tout en maintenant la partie non serrée de la dure-mère, afin d'éviter d'endommager la moelle épinière avec des ciseaux. Couper le long de l'axe rostro-caudale.
      NOTE: La dure est une membrane continue semi transparent; à cet âge la pie - mère est trop fragile et se désagréger lors de la dissection et le tranchage (Figure 1B2).
    6. Une fois que la dure est l'utilisation enlevé un verre contondant ou embout en plastique pour pousser doucement le cordon sur le côté gauche de la gorge formée par la colonne vertébrale demi-coupe, et couper les racines ventrales et dorsales sur le côté droit, en partant du côté rostral , le plus éloigné où ils entrent dans le cordon (quelques mm au moins, Figure 1B2).
    7. Répéter l'opération sur le côté gauche, allant toujours de rostrale à caudale. Si gaucher, démarrer à partir du côté gauche, puis déplacer vers le côté droit.
  4. Incorporation dans la gélose
    1. Glissez le cordon de la colonne vertébrale. Utilisez une épingle d'insectes plus petits à cernerle cordon avec la dorsale de surface et enlever délicatement toute pièce de membrane encore attaché à elle (Figure 1C1).
    2. Une fois nettoyé, coupez les deux extrémités (figure 1C2). Insérez une épingle d' insectes cintré dans la partie antérieure du cordon pour manipuler le cordon et notez son orientation (flèche dans la figure 1C2). Puis transférer la moelle épinière à une solution K-gluconate glacée.
      NOTE: Cette solution imite la composition intracellulaire du CSF et empêcher les cellules de mourir de choc osmotique une fois que les motoneurones seront coupés 26.
    3. Une fois que la moelle épinière est dans la solution intra-cellulaire, prenez le bécher avec l'agar du bain sec et refroidir sur un mélange de glace et d'eau.
    4. Gardez en remuant tout en mesurant la température. Lorsque la température atteint 38 ° C plonger la moelle épinière, en le tenant par la broche d'insectes et le placer côté rostral vers le bas. Assurez-vous que la moelle épinière est comme straight que possible, loin des murs, partie caudale légèrement vers le haut (Figure 1D1).
    5. Laisser le bécher dans le mélange de glace et de l'eau pour permettre à l'agar se solidifier le plus rapidement possible. Assurez - vous qu'il reste en place et que le cordon est aussi droite que possible (Figure 1D1).
  5. Slicing
    1. Après solidification, découper le bloc d' agar contenant de la moelle épinière , d'une manière telle que la base du bloc est à un angle de 35 ° avec la partie lombaire du cordon (flèche sur la figure 1D2). La surface dorsale doit être orientée de la base (Figure 1D2).
      NOTE: Ceci est une étape critique dans la procédure, pour le maintien de la continuité des pools de motoneurones aux racines ventrales à partir de laquelle ils sortent.
    2. Coller le bloc dans la chambre du vibratome en utilisant de la colle cyanoacrylate. Immergez en solution K-gluconate et ajouter la solution K-gluconate congelée en bouillie pour maintenirle bain refroidi (en dessous de 2 ° C).
    3. Couper 350 - 400 um d'épaisseur des tranches de la région lombaire (identifiable par sa courbure et plus grand diamètre). Dans sa bonne orientation (voir 1.4.1.), Utilisez la lame pour couper de la dorsale à la surface ventrale et faire des tranches en continu plus rostrale. En règle générale, il y a 4-5 tranches convenables avec des racines ventrales étendant de 2 mm ou plus. Utiliser les paramètres suivants: angle de 10 °, 70 Hz, la fréquence de vibration et de 10 mm / min Vitesse de découpe.
  6. Incubation
    1. Transférer les tranches à ACSF à 34 ° C. Au bout d'environ 30 minutes, refroidir les tranches jusqu'à la température ambiante et commencer la session d'enregistrement.

Figure 1
Figure 1. Dissection
A1:. L' élimination de la peau du dos pour exposer la colonne dorsale A2:Coupe des épaules et des côtes pour libérer la dorsale colonne B1:. Colonne vertébrale épinglé sur la boîte de Pétri silicium-rempli (côté dorsal haut, côté caudal gauche) B2:. Même avec la moelle épinière exposée et disséqués C1:. Moelle épinière isolée . (côté gauche rostrale) C2: moelle épinière prêt à être embarqué (face ventrale, latérale rostrale gauche). Notez la broche d'insecte plus petit sur le côté rostrale D1:.. La moelle épinière dans le bécher de gélose (côté rostrale dow, face ventrale tournée vers le bas) D2: Couper le bloc de gélose avec la moelle épinière incorporée. Notez l'angle de 35 ° les formes de la moelle épinière à la base du bloc et le renflement lombaire (flèche). Barres d'échelle 1 cm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Placer le Slice dans la Chambre

NOTE: Ventral racines sont de taille variable.

  1. Préparer une boîte de diverses pipettes avec des diamètres de pointe allant de 40 à 170 pm à l'avance. Pour préparer les pipettes d'aspiration, préparer de nombreux pipettes avec un long cône. L'utilisation d'un couteau de diamant, faire une coupe à différentes positions. Puis, sous un microscope à dissection, briser en frappant la pointe avec des pincettes.
  2. Retirer la chambre du microscope d'enregistrement et de le placer sous un microscope à dissection.
  3. Sélectionner une tranche contenant une racine ventrale d'une longueur suffisante de 2 mm (ou plus) pour être monté sur une électrode de stimulation d'aspiration. Sélectionnez la bonne orientation de la tranche avec les racines ventrales vers le haut (figure 2A) et couper délicatement l'agar autour des racines ventrales tout en laissant le reste de l'agar autour de la tranche (figure 2B).
    NOTE: Parce que l'agar-agar est plus ferme que la tranche, cela va permettre aux fils de l'ancre de la tranche de se reposer sur l'agar plutôt que sur la tranche et donc unnchor ne sera pas endommager le tissu. Assurez - vous que les fils de l'ancre de la tranche sont au- dessus de la piscine du motoneurone (en rouge sur la figure 2C).
  4. Monter la chambre arrière sur le microscope et perfuser en continu la chambre d'enregistrement avec ACSF à un taux de 1 - 2 ml / min, à la température ambiante. En utilisant une pipette en verre rempli d'ACSF et relié à une seringue, une aspiration de la racine ventrale (flèche sur la figure 2C). Afin d'obtenir une bonne stimulation de la racine ventrale, la pointe de la pipette doit être serré autour de la racine ventrale. Un pôle doit être de l'électrode de stimulation et l'autre dans le bain (ou relié à la plaque d'électrode de référence de serrage).
  5. Réaliser l' enregistrement patch-clamp du type cellulaire souhaité et enregistrer l'effet de la stimulation de la racine ventrale comme décrit previsouly 10.
    1. Ici, utiliser un amplificateur pour l'acquisition de données. Filtrez les enregistrements de cellules entières à 3 kHz. Numérisez à 10 kHz. Compenser résistance pont currele mode NT-pince.

Figure 2
Figure 2. ventral Racine Préparation
R: Lumbar tranche de la moelle épinière noyée dans de la gélose à la racine ventrale vers le haut B. Lumbar tranche de la moelle épinière avec les racines ventrales libérés de l'agar - agar . C: Lumbar tranche de la moelle épinière avec une électrode de stimulation ajusté serré autour des racines ventrales (flèche) . Notez l'emplacement des cellules de Renshaw exprimant la fluorescence rouge dans le 28 chrna2-Cre souris croisé avec le journaliste de la souris R26 Tom 17. Les barres d'échelle 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Representative Results

Confirmation de motoneurones Identité utilisant Potentiels antidromique action

ciblage cellulaire

Motoneurones se trouvent dans la corne ventrale (visible en rouge sur la figure 2C). Commencez par le faisceau d'axones formant la racine ventrale et remonter jusqu'à ce que le faisceau se disperse complètement et on commence à voir de grandes cellules (axe long soma, au-dessus de 20 um). Atteindre l'enregistrement de cellules entières d'une cellule ronde saine en utilisant une électrode de la résistance initiale de 3-4 MQ. La solution interne utilisé contenait: 140 mM de K-gluconate, 6 mM KCI, 10 mM de HEPES, 1 mM d' EGTA, 0,1 mM CaCl2, 4 mM de Mg-ATP, 0,3 mM de Na 2 GTP. Ajuster le pH à 7,3 avec du KOH et de l'osmolarité à 285-295 mOsm par addition d'eau distillée.

Une fois l' enregistrement de cellules entières est atteint, appliquer une seule stimulation biphasique de la racine ventrale (1 - 50 V, de 0,1 à 0,3 msec) pour déclencher un potentiel d'action antidromique dans les cellules enregistrées du cordon ventral figures 3A1 et 3A2 action show antidromique. les potentiels de tension ou de courant de serrage pince, respectivement. Quand on augmente l'intensité de stimulation entre 1 et 5 V (figure 3A1) et de 10 à 15 V (figure 3A2) , le potentiel d'action antidromique apparaît dans un mode tout ou rien avec un temps de latence de 0,9 ms et 1,1 ms respectivement. Étant donné que seuls les motoneurones envoient leurs axones à travers les racines ventrales, le potentiel d'action antidromique est une preuve de l'identité de la cellule.

Dans une minorité de motoneurones (environ 10%), la stimulation de la racine ventrale n'a passusciter un potentiel d'action antidromique mais plutôt suscité des potentiels d'action orthodromiques. Les figures 3B1 et 3B2 montrent des potentiels d'action orthodromiques en voltage-clamp ou courant-clamp, respectivement. En augmentant la stimulation 20 à 30 V (Figure 3B1) et de 25 à 40 V (Figure 3B2), un potentiel d'action apparaît, à la suite d' un excitateur précédent courant post-synaptique (RPEC) ou excitateur potentiel post-synaptique (EPSP). Les latences des potentiels d'action sont plus (5.1 msec et 5.3 msec, respectivement). Dans ces deux cellules, la stimulation de la racine ventrale a suscité une excitation feed-forward (motoneurones envoyer nantissements axonales eux-mêmes et à d'autres motoneurones) qui était assez forte pour susciter un potentiel d'action orthodromique. Dans ces cellules, l'échec à obtenir un potentiel d'action antidromique (caractérisé par son mode tout ou rien et une latence plus courte que 5 msec) ne nous permet pas de conclure que ces cellules ar e motoneurones. A noter que l'intensité de stimulation nécessaire pour provoquer précompensation d'excitation est supérieure à celle nécessaire pour déclencher un potentiel d'action antidromique. Toutes les stimulations présentées ici sont de 0,1 msec mais parfois, plus la stimulation (jusqu'à 0,3 msec) peut être nécessaire pour obtenir un potentiel d'action antidromique.

Figure 3
Figure 3. motoneurone Réponses à ventral racine Stimulation
A1: 1 V (trace rouge) et 5 V (trace noire) excitations A2:.. 10 V (trace rouge) et 15 V (trace noire) excitations B1: 20 V (trace rouge) et 30 V (trace noire) excitations . B2: 25 V (trace rouge) et 40 V (trace noire) excitations. Les points noirs indiquent le calendrier de relance. Double flèches soulignent la différence des latences entre pointes ortho- et antidromiques.m / files / ftp_upload / 54525 / 54525fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Renshaw cellulaire Stimulation

ciblage cellulaire

Cellules de Renshaw se trouvent dans la corne ventrale 27,28. Visualisez les faisceaux d'axones avec contraste d'interférence différentiel (DIC) imagerie utilisant un 20X et un 63X objectifs. Commencez par le faisceau d'axones formant la racine ventrale et remonter jusqu'à ce que les axones commencent à se disperser , mais sont encore perceptibles (figure 4A, flèches). But pour les cellules de taille intermédiaire (environ 10 à 15 um de diamètre, figure 4A, des pointes de flèches). Atteindre l'enregistrement de cellules entières d'une cellule ronde saine en utilisant une électrode de la résistance initiale de 5 à 7 MQ. En fonction de l'expérience, nous avons utilisé either Cs + à base ou K + à base de solutions internes 10. La solution à base de Cs a empêché les grands courants de potassium qui étaient visibles autour de -45 mV. Dans certaines expériences, nous avons également ajouté 5 mM QX-314 pour bloquer les canaux sodiques responsables de dopage dans la cellule enregistrée. La solution Cs + à base contient: 125 mM de gluconate de Cs, 5 mM QX-314 Cl, 10 mM de HEPES, 10 mM d' EGTA, 1 mM de CaCl2, 4 mM de Mg-ATP et 0,4 mM de GTP, le pH ajusté à 7,3 avec CsOH. K + à base de solution doit être utilisée pour analyser, à la fois dans voltage- et le courant-clamp, les réponses des cellules de Renshaw à la stimulation de la racine ventrale dans des conditions se rapprochant autant que possible celles physiologiques. Cette solution contient: 125 mM de K-gluconate, 10 mM HEPES, 1 mM d' EGTA, 0,1 mM CaCl2, 4 mM de Mg-ATP, 0,4 mM de GTP avec le pH ajusté à 7,3 avec du KOH. L'intensité du stimulus varie entre 10 et 100 V et sa durée varie entre 50 et 300 microsecondes. Bipo impulsions lar ont été utilisés dans tous les cas.

Réponse des cellules de Renshaw à la stimulation de la racine ventrale

La stimulation de la racine ventrale déclenche le corelease du glutamate et l' acétylcholine de nantissements de motoneurones sur les cellules de Renshaw 10. Inhibition Feed-forward médiée par le GABA et la glycine est également recruté 10. Figure 4B affiche les réponses à la stimulation unique de la racine ventrale. La cellule a été enregistrée dans un mode voltage-clamp avec la solution à base de césium, et on le maintient à une tension de -45 mV. QX-314 dans la solution intracellulaire a empêché la cellule de cuisson et le GABA et les réponses de la glycine ont été bloqués par 3 uM gabazine et 1 uM strychnine, respectivement. Le courant synaptique vers l' intérieur dans la figure 4B est la somme des courants glutamatergique et nicotiniques.

nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 4
Figure 4. Renshaw cellulaire stimulation de la racine ventrale
A: Images du pool de cellules Renshaw acquises à l' aide d' un condenseur oblique dans la même tranche prise à deux grossissements différents (20X et 40X objectifs). Notez les axones des motoneurones qui fusionnent dans la racine ventrale (flèche). cellules putatif Renshaw sont indiquées par des flèches. Barres d'échelle: 100 um à A1, 50 um en A2 B:. Enregistrements de tension-clamp d'une cellule Renshaw après stimulation de la racine ventrale (point noir). La trace rouge est la moyenne de ceux gris. tension de maintien a été fixé à -45 mV. QX-314 dans la solution intra-cellulaire a empêché la cellule de cuisson et le GABA et les réponses de la glycine ont été bloquées par 3 uM et 1 uM gabazine strychnine, respectivement. Point noir indique un temps de relance.com / fichiers / ftp_upload / 54525 / 54525fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

tranchage Oblique de la moelle épinière est importante car elle permet une stimulation unilatérale des pools de motoneurones et les cellules de Renshaw à un segment vertébral unique d'une manière fiable, complète et spécifique. En outre, il permet une identification rapide, élégant et non-ambiguë des motoneurones enregistrées. Ensuite, nous allons mettre en évidence les avantages de cette technique par rapport à d'autres méthodes de préparation de tranche, puis nous allons insister sur les pièges les plus courantes à éviter lors de l'exécution de cette procédure.

La plupart des études utilisant des tranches transversales fondent leur identification sur les propriétés électriques intrinsèques 3,14,15,29. Cependant, celles - ci varient grandement entre les pools de motoneurones ainsi qu'entre les sous - types de motoneurones dans un pool donné (alpha-, bêta- et gamma-motoneurones 30). Par conséquent, des études utilisant des paramètres de taille sont susceptibles d'exclure les petits gamma-motoneurones. D'un autre côté, Cooper et Sherrington described en 1940 un groupe de grandes cellules nerveuses dans la matière grise ventro-latérale de la moelle épinière lombaire de singes et de chats qui avait traversé ascendant axones 31,32. En plus d'être à proximité de la somas du motoneurone, ils ont noté qu'ils semblaient histologiquement indiscernable de motoneurones. Un article récent a confirmé l'existence de telles cellules chez la souris 33. En raison de la grande taille de ces cellules et leur emplacement, ils auraient pu être inclus par erreur dans les études antérieures. Notre critère d'identification exclut les cellules frontalières spinaux putatifs, depuis leur axone ne dépasse pas dans la racine ventrale, tout en permettant une identification fiable de tous les motoneurones indépendamment de leur taille. En outre, l' analyse des propriétés électriques intrinsèques, (par exemple, la résistance d'entrée), est plus longue que la simple observation d'un potentiel d'action antidromique.

En plus d'utiliser les propriétés électriques intrinsèques, certains studies en utilisant des tranches transversales, confirmer leur identification en effectuant une analyse post hoc du marqueur moléculaire pour motoneurones (comme Islet-1/2 16) ou par la visualisation de la morphologie en utilisant biocytin étiquetages 14,17. Ces identifications sont cependant fastidieux et ne fournissent pas une identification directe. Ils sont donc rarement systématiquement effectuées.

Certaines études ont tenté d'utiliser des lignées de souris exprimant un marqueur fluorescent motoneurones génétiquement codés (lignée de souris HB9-GFP 18, ChAT-EGFP souris transgéniques qui expriment eGFP dans les cellules cholinergiques dont motoneurones 19, ou des souris transgéniques G85R SOD1-YFP, qui expriment fortement la protéine de fusion dans la YFP motoneurones 17). Cependant, parce que l'expression de marqueur génétique est généralement conditionnée dans le temps et que les tranches sont généralement prises à partir d'embryons ou des juvéniles, l'expression du marqueur peut ne pas être adéquate à l'âge de la study est effectuée. D' autres études ont utilisé l' injection d'agent rétrograde pour visualiser la piscine de motoneurone 34. Nous avons également effectué des injections de choléra toxine bêta dans le soléaire ou l'EDL (d'observation personnelle). Ces techniques de marquage sont d'une grande valeur pour marquer un pool de motoneurones particulier, mais nécessitent une intervention chirurgicale fastidieuse quelques jours avant l'expérience. En outre, le jeune âge auquel les expériences de tranche sont en cours, il est nettement plus difficile de cibler spécifiquement les muscles. Enfin, il y a un réel souci de perturber le motoneurone par injection d'un agent exogène.

Dans des conditions optimales, nous avons pu obtenir des potentiels d'action antidromiques dans pratiquement tous les motoneurones enregistrées. L'angle de 35 ° utilisé est critique pour obtenir des racines ventrales de longueur suffisante. En conclusion, la préparation de la tranche oblique offre un moyen rapide et fiable pour identifier tous les motoneurones, ce qui est supérieur aux autres techniques d'identification.

Comme indiqué dans l'introduction, seules deux études ont rapporté une stimulation réussie des racines ventrales en tranches transversales. La première étude a enregistré les neurones du col utérin chez le rat et a stimulé la substance blanche , où la souche de la racine ventrale émerge 4. Ils induites avec succès potentiel d'action antidromique dans 85% des neurones enregistrés. Nous croyons que leur taux de réussite élevé fondé sur le fait que, au niveau du col utérin, les axones et somas de motoneurones sont sur le même plan. Cela ne veut pas le cas dans les tranches caudales plus. Même au niveau cervical, leurs tranches transversales seulement conservées moignons des racines ventrales, qui sont moins fiables pour stimuler. La deuxième étude a stimulé l'embryon de poulet dorso-lombaire secteur 5. Cependant, ils ont utilisé sensibles à la tension d'enregistrement de colorant, ce qui a manqué la résolution spatiale pour indiquer le succès de l'induction d'un potentiel d'action antidromiques au niveau de la cellule unique.

Notre tranche preparation offre également une meilleure façon de stimuler les cellules de Renshaw comme indiqué dans un récent article 28. En utilisant les tranches obliques, ils ont pu enregistrer monosynaptiques Renshaw cellules réponses dans 46% des cas, ce qui est une amélioration importante du taux de réussite de 10% rencontrés en utilisant des tranches transversales 35. Bien que nous ne pouvions pas trouver une comparaison similaire pour la stimulation des pools de motoneurones, cette observation dans la cellule Renshaw nous amène à croire que les motoneurones conservent également plus de connectivité.

tranchage Oblique de la moelle épinière est une technique très exigeante qui nécessite beaucoup de pratique avant d'obtenir de manière fiable une préparation à partir de laquelle on peut enregistrer. En utilisant des pinces très fines et nettes et des micro-ciseaux est essentiel. Le temps passé à disséquer peut être assez long (jusqu'à 1 heure) tant que la procédure se déroule en milieu réfrigéré de dissection carbogène-barboter. Alors que certains auteurs ne reconnaissent aucun avantage de perfusio intracardiaquen , dans la préparation des tranches 36, nous avons décidé de maintenir cette étape de la procédure. Il est difficile de mesurer objectivement l'avantage de la perfusion intracardiaque pour la qualité des enregistrements, en particulier parce qu'elle varie avec l'âge.

Le facteur le plus critique est l'âge de la souris. Nous avons enregistré avec succès à partir de souris entre P2 et P11 en utilisant le protocole ci-dessus. Passé cet âge, la myéline de la moelle épinière devient trop dense et les plus grandes cellules (les motoneurones) meurent avant de trancher, très probablement en raison de la privation d'oxygène. Après cette fenêtre, nous avons trouvé de plus en plus difficile d'obtenir des tranches saines. Récemment, de nouvelles techniques ont été rapportées pour obtenir des tranches saines chez les animaux plus âgés 17,36. Ils ont utilisé des additifs supplémentaires pour leur milieu de dissection et d' enregistrement tels que les sources d'énergie supplémentaires (éthyl-pyruvate), inférieurs Na + et Cl - concentrations pour empêcher oncosis des cellules 37,38 et le polyéthylène glycol pour limiter l'effète des vastes transections membranaires qui se produisent pendant le tranchage. Avec ces améliorations, ils ont pu enregistrer de jusqu'à 6 mois vieux animaux.

Dans le futur, il serait intéressant d'essayer des préparations de coupes obliques sur des animaux adultes de combiner les avantages des deux techniques. En combinant les deux protocoles devrait se révéler relativement facile et fournira un outil fiable pour confirmer l'identité des motoneurones et d'étudier la population ciblée par nantissements axonales des motoneurones chez les souris adultes. En outre, on pourrait tenter d'obtenir des tranches obliques chez la souris embryonnaire. Il convient de noter, notre préparation conserve également les racines dorsales, qui peuvent être stimulés pour étudier l'activation monosynaptique I innervation des neurones moteurs, ainsi que l'activation de la moelle épinière dorsale populations neuronales. En conclusion, excitations racines ventrales offrent un outil fiable pour confirmer l'identité des motoneurones et d'étudier la population ciblée par nantissements motoneurone axonales. </ P>

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Acknowledgements

Les auteurs remercient Marin Manuel et Olivia Goldman-Szwajkajzer pour leur aide dans la prise des photos. Les auteurs remercient également Arjun Masukar et Tobias Bock pour la relecture du manuscrit. supports financiers ont été fournis par l'Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-01), le NIH-NINDS (R01NS077863), la Fondation Thierry Latran (OHEX Project), l'association française de myopathie ( numéro de subvention 16026) et Target ALS sont appréciés. Felix Leroy était le destinataire d'un "Contrat doctoral" de l'Ecole Normale Supérieure, Cachan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Na-kynurenate ABCAM ab120256 dissolves better then other brands
KCl Sigma P3911
NaH2PO4 Sigma P5655
sucrose  Sigma S9378
NaHCO3  Sigma S6014
CaCl2  G Biosciences R040
MgCl2  Quality Biological 351-033-721
glucose  Sigma G5767
ascorbic acid  Sigma A5960
Na-pyruvate  Sigma P2250
K-gluconate  Sigma P1847
EGTA  Sigma E3889
HEPES  Sigma H4034
NaCl Sigma S9888
Agar Sigma A9799
QX-314 Alomone Q150
Mg-ATP Sigma A9187
CsOH Sigma 232041
Na-GTP Sigma 51120
gluconic acid Sigma G1951
Cesium hydroxide solution Sigma 232041
KOH Sigma P5958
Vannas Spring Scissors - 2.5mm  FST 15000-08 only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones
Stimulator A-M Systems Isolated Pulse Stimulator Model 2100
Vibratome Campden Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2

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References

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