A Repetitive concussive Head Injury Model hos möss

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yang, Z., Lin, F., Weissman, A. S., Jaalouk, E., Xue, Q. s., Wang, K. K. A Repetitive Concussive Head Injury Model in Mice. J. Vis. Exp. (116), e54530, doi:10.3791/54530 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Hjärnskakning, även kallad mild traumatisk hjärnskada (mTBI), är den mest frekventa förekomsten av traumatisk hjärnskada (TBI) och påverkar miljontals människor i USA. Hjärnskakningar kan vara svårt att diagnostisera och det finns ingen specifik bot för hjärnskakning. Det finns en växande insikt och vissa belägg för att mild mekanisk trauma till följd av idrottsskador, militär strid, och andra fysiskt engagerande sysselsättningar kan ha kumulativa och kroniska neurologiska konsekvenser 1,2. Men det finns fortfarande en brist på kunskap om hjärnskakningar och deras effekter. Nuvarande metoden begränsar studier av patologi och behandling hos människor eftersom endast neurologisk bedömning och bildbehandling utvärdering är tillgängliga för klinisk diagnos. Djurmodeller ger ett medel för att studera hjärnskakningar på ett effektivt, noggrant och kontrollerat sätt med hopp om vidare diagnos och behandling av mTBI.

Studier har anpassat traditionell TBImodeller såsom kontrollerad kortikal påverkan (CCI), att vätskeslagpåverkan (FPI), vikt droppe skada, och spränga skada utföra mTBI och stimulera låga skadesvårighetsgrader genom att ändra skadeparametrarna. Dessa modeller är fördelaktigt att använda på grund av deras förmåga att replikera hjärntrauma morfologiskt liknar det kliniska tillståndet; Men de har också sina egna begränsningar. Skadornas induceras av en accelerations skada (vikt droppe) är ofta mycket varierande. De två resultat av den milda CCI - subaraknoidalblödning och fokal kontusion - är inte jämförbara med typiska mänskliga hjärnskakningar. CCI och FPI kräver en kraniotomi, som inte är kliniskt relevant, medan sprängskada är en mer kontroversiell modell när det gäller de olika exponerings läge och topptryckmätningar samt variabel sekundär skada under exponeringen 3-6. En uppdaterad concussive djurmodell som kan översätta preklinisk forskning i klinisk setting är nödvändigt i forskning.

Nyckelfrågan i modellering mild TBI är att definiera den experimentella skadornas svårighetsgrad, som närmast replikerar skada i en klinisk miljö. Nyligen olika forskargrupper utvecklade slutna skada huvudet eller concussive huvudskada (CHI) modell 7-10. CHI är en modifiering av CCI utan en kraniotomi, men det är fortfarande använder en traditionell elektroniskt system magnetisk inverkan för att generera ett huvud inverkan. En CHI kan framkalla en hjärnskakning som sträcker sig från mild till måttlig genom att justera parametrar konsekvens. Medvetslöshet (LOC) kan observeras direkt efter en påverkan genom att detektera en minskning i andningshastigheten eller den transienta upphörande av andning. Perioden av LOC används för att avgöra hur allvarlig skadan. Detta dokument innehåller en något förbättrad och uppdaterad version av en upprepad CHI (rCHI) modell i möss, tillsammans med en detaljerad steg-för-steg-protokollet och representativa resultat. Den rCHI modell forskningsstrategier enåter till nytta vid fastställandet mTBI effekter och potentiella behandlingar, särskilt eftersom det inte finns någon enskild djurmodell som kan imitera alla hjärnskakning-inducerade patologiska förändringar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden utfördes under protokoll # 201207692 godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Florida och i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur.

1. Djurvård

  1. Använd 3-4 månader gamla C57BL / 6J möss. Tillhandahålla sängkläder, bomaterial, mat och vatten ad libitum. Håll mössen i omgivningstemperaturer kontrolleras vid 20-22 ° C med konstant 12-timmar ljus / 12-hr mörka cykler.

2. Pre-impac Förberedelse

  1. Fäst en skräddarsydd silikongummibelagd metallspets till en elektromagnetisk stereotaktisk slagverk. Se till den plana botten av spetsen är parallell med ytan av sondspetsen (Figur 1A).
  2. Söva musen med 4% isofluran följt av underhållsanestesi på 2,5% isofluran. Kontrollera anestesi via flödesmätaren. monitor anestesi nivå till dess att djuret når en kirurgisk nivå av anestesi genom att visa förlust av pedaltillbakadragande reflex.
  3. Sätta musen i liggande ställning på en värmedyna. Använda en trattformad noskonen för att hålla musen under anestesi. Helt raka huvudet med en trimmer. Använd vaselin oftalmologiska salva på mus ögon för att förhindra torrhet under narkos.

3. Impact Parametrar Inställnings

OBS: Systemet påverkan innefattar en styrbox för att ställa in slagparametrar, ett manöverdon för att utföra impaktion, och en digital stereotaktisk ram med tre-rörelse axlar.

  1. Förinställda hastigheten hos slaganordningen till 4 m / sek och uppehållstid till 240 msek på kontrollboxen.

4. Placering av Impact Center

  1. Sätta en mjuk värmedyna under djurets kropp för att hålla kroppen temperatur nära 39 ° C. Montera mus i en stereotaktisk ram i en prone plats med trubbiga end örat barer.
  2. Sänk effekten spets nära musens huvud genom att flytta Z-föraren. Justera plana stöt spetsen (9 mm i diameter) genom att flytta X- och Y-drivrutiner halvvägs till målet koordinater ovanför sagittala suturen.
  3. Se till en kant av effekterna spetsen är vertikalt parallellt med en tänkt horisontell linje dragen mellan de två öronen (Figur 1C). I mitten av påverkan motsvarar den centrala sagittal sutur halvvägs mellan interfrontal och lambdoid suturer (interaurala 9 mm interaurala 0 mm, lateral 4,5 mm).

5. Slagdjupinställning

  1. För att korrekt ställa in effekten djup, använda ytterligare sondens spets till ersätta den isolerade silikongummibelagd inverkan spets.
  2. För att se till att det inte finns någon förskjutning av effekterna centrum efter kopplings tips, ställa in X- och Y-kanalen på den digitala stereotaktisk kontrollpanel till noll innan du slår spetsarna.
  3. Flytta probe spetsen till mitten av nedslagsarean genom att manuellt flytta X-och Y-enheter.
  4. Clip kontakt sensorn på musens svans.
  5. Flytta provkroppen (Z-enheten) ned tills sondspetsen berör ytan av nedslagsplatsen.
  6. Ställa in Z-kanal på stereotaxic kontrollpanel till noll.
  7. Flytta effekterna spetsen tillbaka till påverkansområdet genom att manuellt justera X- och Y-förare (inte noll knappar på den digitala stereotaxic kontrollpanelen) tills X- och Y-förare är noll (där effekterna Tipset har tidigare placerat).
  8. Kör ställdonet genom att flytta indragnings brytare på kontrollboxen. flytta manuellt kroppen nedåt (Z förare) med 4 mm.

6. Effekter

  1. Trigger effekten genom att klicka på inverkan brytare på kontrollboxen och uppnå en deformation djup av 4 mm.

7. Post-impac

  1. Mät tiden från påverkan tills musens första andetag med hjälp av en timer.
  2. Tillåt för återvinning innan han återvände djuret tillbaka till en ren bur. Skicka inte tillbaka ett djur sällskap med andra djur tills återhämtat sig helt.
  3. Observera och väga mössen dagligen. Om mössen visar tecken på smärta, intraperitonealt injicera dem med Meloxicam till 1 - 2 mg / kg var 12 - 24 timmar.

8. Upprepad Impac

  1. Ge mössen ytterligare skador på dagarna 4, 7 och 10 efter den första skadan (72 timmar intervall mellan effekter).

9. Immunohistokemi (IHC)

  1. transcardial perfusion
    1. Söva möss via intraperitoneal injektion med 200 m / kg pentobarbital.
    2. Bedöma och försäkra kirurgisk-planet anestesi genom en tå nypa. sekure musen i ryggläge genom att försiktigt tejpa framtassarna och baktassarna till en styrofoam arbetsyta i en kemisk dragskåp.
    3. Gör ett snitt genom huden längs den bröstkorg mittlinjen från precis under xiphoid processen till nyckelbenet. Gör två ytterligare hud snitt vid xiphoid processen och fortsätta längs basen av den ventrala bröstkorgen i sidled.
    4. Öppna brösthålan och exponera hjärtat genom att skära genom bröstmuskulaturen och bröstkorg.
    5. Säkra bultande hjärta med trubbig pincett och göra en 1-2 mm snitt i den vänstra kammaren.
    6. Omedelbart sätta in en fjärilsnål i höger förmak. Börja infusion av 20 ml saltlösning genom att trycka på sprutan långsamt.
    7. Växla från saltlösning till 4% paraformaldehyd. Fortsätta perfusion med 20 ml av paraformaldehyd.
    8. Decapitate musen och ta bort huden med en sax. Isolera hjärnan från skallen med hjälp av en ben cutter.
  2. Cryostat sektione
    1. Bädda hjärnvävnad i optimal skär temperatur (oktober) formulering och frysa vid -80 ° C. Placera hjärnan i kryostaten i en sagittal orientering. Skurna hjärnsektioner 5 | j, m tjockt.
  3. färgning
    1. Torka de frysta sektioner vid rumstemperatur under 1 timme.
    2. Inkubera objektglasen med 100 pl av 2% getserum och 0,1% Triton X-100 i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) under 1 h vid RT.
    3. Tvätta bilderna 3 gånger med 300 ul av PBS. inkubera sedan bilderna med anti-GFAP (1: 200) eller anti-ferritin antikropp (1: 200) separat över natten vid 4 ° C.
    4. Tvätta bilderna 3 gånger med 300 ul av PBS. inkubera sedan objektglasen i 2 h vid rumstemperatur med biotin-konjugerad sekundär antikropp.
    5. Tvätta bilderna 3 gånger med 300 ul av PBS. inkubera sedan objektglasen med avidin-biotin-komplex (ABC) lösning (01:50) vid rumstemperatur under 30 min.
    6. Tvätta bilderna 3 gånger med 300 ul av PBS. Sedan inkubera i 3,3'-diaminobensidin (DAB) substratlösning (50 ml PBS, 10 jil H2O 2, 10 mg DAB piller, filter före användning) under 5-8 min. Observera glasen under mikroskop tills positiva celler visas.
    7. Skölj objektglasen i långsamt rinnande kranvatten under 5 min. Rena bilder med en labb torka. Sedan montera sektioner med monteringsmedium och täckglas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denna modell (figur 1 AC), fanns det korta perioder av flämtande och grunda andetag. En medvetslöshet (medvetslös) definieras som en minskning av andningsfrekvens eller övergående uppsägning av andning innan återuppta en normal andning. En påverkan på mitten av huvudet orsakade kortsiktiga medvetslöshet (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 sek vid varje stöt separat figur 1D). Mushjärnorna visade normal morfologi av H & E histologiska färgning, vilket indikerade ingen självklar strukturella skador eller vävnadsskador till följd av effekterna (Figur 2A). Som svar på TBI, är astrocyter kända för att genomgå vissa förändringar, bland annat aktivering, proliferation eller reaktiv glios 11,12. Ökade gliafibrillärt surt protein (GFAP) positiva celler med stora cellkroppar och tjocka synapser är de aktiverade astrocyter. den corpus callosum från rCHI mushjärnorna visade tydliga tecken på astrocyter aktivering vid 7 dagar efter den sista effekten (Figur 2B).

Microbleeds i vävnaden är vanliga i mTBI och kan leda till frigörandet av järn från hemoglobin 13. Järnöverskott i serum kan detekteras genom ferritintest i kliniska situationer 13. Ferritin immunpositiva celler i musen cortex hittades en dag efter den sista effekten och varade åtminstone sju dagar, vilket tyder på att flera impaktioner kan resultera i kortikala microbleeds (Figur 2C).

Figur 1
Figur 1. En musmodell av repetitiva concussive huvudskada. (A) Skräddarsydda 1 mm tjockt silikongummibelagd spets mäter 9 mm i diameter med en sondspets. (B) En mus är mounted i en stereotaktisk ram i en liggande ställning med en mjuk värmedyna under kroppen. (C) Effekten center positionering. Kanten av slagspetsen är vertikalt parallellt med en tänkt horisontell linje dragen mellan de två öronen. Effekten centrum motsvarar halvvägs mellan interfrontal och lambdoid suturer (interaurala 9 mm interaurala 0 mm, lateral 4,5 mm). (D) Apnea definieras som korta perioder av övergående uppsägning av andning. Medelvärde och SD visas i den nedre panelen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Histologi för upprepad concussive huvudskada. (A, vänster) En mus hjärna avlägsnades efter perfusion med 4% paraformaldehyd. Ingen vävnadsskada återfanns. (B) Ökning av biokemisk markör för glios (GFAP) i corpus callosum 7 dagar efter den sista skadan. Skalstreck = 200 | j, m. (C) Genom immunohistokemi ades ferritin-H-kedja befanns uttryckas i hjärnbarken efter skada. Insats bilder representerar förstorade positiva celler. Skalstreck = 200 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Att efterlikna hjärnskador morfologiskt liknar det kliniska tillståndet är efter hjärnskakning symptom väntat. Post-hjärnskakning symtom allmänhet huvudvärk, yrsel, svindel, trötthet, minnes- och sömnproblem, svårt att koncentrera liksom ångest och nedstämdhet. Eftersom somatiska symptom ännu inte kan vara mätbar i djurmodeller, är förändringarna i motor och kognitiv funktion och emotionella beteenden som används som kriterier för rationellt utvärdera hjärnskakning i djurmodeller. I en tidigare rapporterade studie visade det sig att rCHI musmodellen inducerar underskott i spatial inlärning, minne och ångest 8. Ännu viktigare är att rCHI modell som används i detta protokoll representerar klinisk miljö utan invasiv hjärnskada eller hjärnstruktur fraktur, vilka båda kan leda till blödningar, blödning, ödem, eller akut celldöd / vävnadsförlust.

Följande är viktiga tips för framgångsrikt modellering konsekvent concussion / mTBI med hjälp av ett elektroniskt system magnet konsekvenser:

Undvik andra hjärnskada direkt efter den första hjärnskada som kan orsakas av rörelse under påverkan. Musen huvudet kan röra sig något nedåt under påverkan. För att undvika en hjärna kontusion orsakas av en snabb rörelse mot hårt underlag eller huvudet sträckning, måste en mjuk värmedyna sättas under musen kroppen. Huvudet och kroppen måste också hållas horisontellt. Dessutom använder trubbiga end örat barer att fixera musen huvudet i den stereotaktiska ramen, och inte sätta dem i hörselgången. Detta skyddar musen från skada som orsakas av vassa kanter under rörelsen.

Korrekt placera effekten centrum och att noll. Till skillnad från öppna skallskada, är relativt svårt effekten spetsen positionering. Storleken av effekterna spetsen och slagmittpunkt påverkar skadornas svårighetsgrad och skador. Baserat på mus hjärnans anatomi är effekten centrum utformad för att motsvara halvvägsmellan interfrontal och lambdoid suturer (interaurala 9 mm interaurala 0 mm, lateral 4,5 mm). Således är en optimerad 9 mm spets krävs. Effekterna spetsen måste justeras till målet koordinater ovanför sagittala suturen halvvägs, och en kant av effekterna spetsen måste vara vertikalt parallellt med en tänkt horisontell linje dragen mellan de två öronen (Figur 1C). Den isolerade inverkan spets med en silikongummibeläggning blockerar kontaktsensorn och förhindrar inställningen påverkan djupet. En sondspetsen som behövs och bör vara parallell med ytan på knappen om effekterna spets. Centrum av den inverkan justeras till sondspetsen röra plats genom att manövrera stereotaxiskt instrument. Skrubba huvudet med koksaltlösning ökar elektro känslighet. Dessutom är sonden löstagbar eller utformats för att inte skada hjärnan under påverkan. Ett alternativt sätt är att bygga två tips som har samma längd; en spets belagd med silikongummi och den andra tips skulle vara metall, som kommer att varaanvändes som en sondspets. De två tips bör stängas mellan positionering och slag.

Övervaka musens korta omedvetna symptom omedelbart efter en påkörning. Såsom diskuterats ovan, de flesta efter hjärnskakning symtom är svåra att observera omedelbart i en laboratorie mus djurmodell. mTBI patienter kan uppleva en kort medvetslöshet efter skadan. Att fastställa de synliga skadeparametrar, en kort medvetslöshet var ett symptom som används för att utvärdera giltigheten av denna concussive TBI modell. Medvetslöshet (LOC) används normalt som kriterier för att klassificera skadornas svårighetsgrad i TBI patienter. I de flesta sportrelaterade hjärnskakning, är varaktigheten av LOC mindre än en minut 14. Genom att optimera de experimentella förhållanden, såsom kollisionshastighet och uppehållstid, är LOC mindre än 10 sek efter en påkörning. Den optimala effekten villkoret är en 4 mm inverkan djup, 240 ms uppehållstid, och 4 m / s kollisionshastighet. Ökad kollisionshastighet och botid kan orsaka akut ökat intrakraniellt tryck över en stor del av tiden, vilket kan leda till allvarlig hjärnskada eller dödsfall omedelbart från andningsdepression. Möss kommer att förlora kroppsvikt efter varje påverkan, men kommer upp i vikt efter 72 timmar av återhämtning. 72 h repetitiva intervall väljs att efterlikna en återhämtningsperiod för skadade idrottare innan han återvände till sin sport.

Bredvid medvetslöshet och andningssvårigheter, kan kliniken symtom på en hjärnskakning inkluderar kramper, huvudvärk, yrsel, illamående och kräkningar. I modell, kan hjärnan smärta vara majoriteten obekväma symptom till djuren. Kondition poäng och smärta kategori beskrivning bör användas som humana slutpunkter. Dessutom bör andra specifika neurologiska ändpunkter såsom okontrollerad beslag, spontan cirklande beteende, förlust av balans och inte kan gå eller stå betraktas som rCHI specifika humana slutpunkter. Eftersom detta är en mild skada modell, normalt ingen bety-dande tecken på smärta observeras efter varje stöt. Smärtstillande medel är vanligtvis onödigt på denna nivå av hjärnskada. Detta protokoll ger detaljerade viktiga steg för att modellera en repetitiv concussive mild TBI. Hastigheten och djupet av varje påverkan kan justeras beroende på den önskade typen av skada. Denna modell använder ett elektroniskt magnet inverkan systemet för att leverera effekter. Den är stabil med en exakt kontrollerad hastighet, uppehållstiden, och deformation djup. Men eftersom det är en stängd huvudskada utan en kraniotomi, är det omöjligt att exakt positionera mushjärna påverkan med stereotaxic koordinater. Också växla påverkan / sond tips kan leda till en nedslagsplatsen skift, vilket är den största orsaken till inkonsekventa skador. Med tanke på den diffusa skador och hjärnskakning visade sig som väntat, fortfarande exakt och lätt att kontrollera denna modell.

Denna modell är fördelaktigt att använda för sin noggrannhet och enkelhet i att bedöma effekterna av påverkan-relaterade mild hjärnskada, särskilt idrottsrelaterade hjärnskakning. Den fungerar som en plattform för prekliniska studier som undersöker diagnostiska och prognostiska biomarkörer samt testa medicintekniska produkter, läkemedel och genterapi lösning. Denna modell kan också användas för studier av kronisk traumatisk encefalopati (CTE), som för närvarande är endast diagnostiseras genom obduktion neuropatologiska examen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anesthesia machine Eagle Eye Anesthesia, Inc Model 150  anesthesia
Electromagnetic Impactor LeicaBiosystems Impact One Stereotaxic Impactor perform impaction
Digital Stereotaxic instrument LeicaBiosystems 39462501 mount mouse and positioning tips
Sicilone rubber-coated metal tip Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL custom-made impact tip
Lithium Ion All-in-One Trimmer WAHL Home Products 9854-600 shave mouse hair
paper clips custom-made probe tip
Cotton tipped applicators MEDLINE MDS202055 scrub head with saline
Tissue Tek O.C.T. ASKURA FINETEK USA INC 4583 tissue embedding
anti-GFAP Dako CA93013 antibody for IHC
anti Ferritin Sigma F6136 antibody for IHC
VECTASTAIN Elite ABC  kit Vector laboratories PK-6100 IHC detection system
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-100
Aperio XT ScanScope scanner Leica Microsystems Inc, slides scanning
Leica AutoStainer XL Leica the pathology Company ST2010 H&E staining
DAB  sigma D3939 IHC detection system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baugh, C. M., et al. Chronic traumatic encephalopathy: neurodegeneration following repetitive concussive and subconcussive brain trauma. Brain Imaging Behav. 6, (2), 244-254 (2012).
  2. McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J. Neuropathol Exp Neurol. 68, (7), 709-735 (2009).
  3. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75 Suppl, (4), S34-S49 (2014).
  4. Goldstein, L. E., McKee, A. C., Stanton, P. K. Considerations for animal models of blast-related traumatic brain injury and chronic traumatic encephalopathy. Alzheimers Res Ther. 6, (5), 64 (2014).
  5. Gold, E. M., et al. Functional assessment of long-term deficits in rodent models of traumatic brain injury. RegenMed. 8, (4), 483-516 (2013).
  6. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14, (2), 128-142 (2013).
  7. Luo, J., et al. Long-term cognitive impairments and pathological alterations in a mouse model of repetitive mild traumatic brain injury. Front Neurol. 5-12 (2014).
  8. Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Sci Rep. 10, (5), 11178 (2015).
  9. Zhang, J., et al. Inhibition of monoacylglycerol lipase prevents chronic traumatic encephalopathy-like neuropathology in a mouse model of repetitive mild closed head injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35, (3), 443-453 (2015).
  10. Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31, (13), 1211-1224 (2014).
  11. Lumpkins, K. M., Bochicchio, G. V., Keledjian, K., Simard, J. M., McCunn, M., Scalea, T. Glial fibrillary acidic protein is highly correlated with brain injury. J Trauma. 65, (4), 778-782 (2008).
  12. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38, (6), 364-374 (2015).
  13. Liu, H., et al. Increased expression of ferritin in cerebral cortex after human traumatic brain injury. Neurol Sci. 34, (7), 1173-1180 (2013).
  14. Jordan, B. D., et al. The clinical spectrum of sport-related traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 9, (4), 222-230 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics