Beredning av extracellulära matrixproteinfibrer för Brillouin spektroskopi

1School of Physics and Astronomy, University of Exeter, 2Department of Physics and Geology, University of Perugia, 3Istituto Officina dei Materiali del CNR, Unità di Perugia
Published 9/15/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Edginton, R. S., Mattana, S., Caponi, S., Fioretto, D., Green, E., Winlove, C. P., et al. Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy. J. Vis. Exp. (115), e54648, doi:10.3791/54648 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Brillouin ljusspridning (BLS) effekt upptäcktes av Léon Brillouin i 1922. 1 Den består av oelastiska spridning av synligt ljus genom termiskt aktiverade akustiska fononer i ett material. I fasta tillståndets fysik, akustiska fononer är sammanhängande vibrationer i alla atomer i ett galler. En endimensionell kedja av två alternerande typer av atomer i ett gitter är en enkel modell som illustrerar skillnaden mellan akustiska fononer avslöjade av BLS och optiska fononer, sonderas av IR-absorption och Ramanspridning (Figur 1). Akustiska fononer är i fas rörelser atomer i kedjan med en förflyttning längs utbredningsriktningen (längsgående akustiska fononer) eller vinkelrätt mot utbredningsriktningen (tvärgående akustiska fononer), medan optiska fononer är out-of-fas rörelser atomerna producerar en oscillerande elektrisk dipolmoment (längsgående eller tvärgående lägen).

BLS spectroscopy har använts i analytisk vetenskap sedan 1920-talet; dock endast sedan 1980-talet har höga mätningar kontrast varit möjligt genom användningen av tandem multipass Fabry-Perot-spektrometer. Sedan dess har ett ökande antal framsteg i BLS för analytiska applikationer i kondenserade materiens (där foton fonon växelverkan utnyttjas) 2-4 och magnetiska material (genom foton Magnon interaktion) 5 har åstadkommits. Seminal verk om biomedicinska tillämpningar 6-8 har banat väg för utvecklingen av olika metoder, bland annat den som gäller här och en tidigare beskrivits 9 med en reflekterande substrat i en plattliknande konfiguration för att uppnå fullständig beskrivning av elasticitet tensor av ett prov.

I detta arbete, vi tillämpar BLS spektroskopi för att de grundläggande beståndsdelarna i den extracellulära matrisen i bindväv, de fibrösa proteinerna elastin och typ I-kollagen. TYP I-kollagen är en stel, trippel spiral molekyl som monterar i sidled och längdled med omfattande tvärbindning för att bilda väsentligen stela fibrer i vävnader såsom senor. Nätverk av kollagen ofta samexistera med nätverk av elastin, ett protein som, ovanligt, genererar långväga elasticitet genom en kombination av entropi och hydrofoba interaktioner med sin omgivning och är avgörande för funktioner vävnader, såsom lunga och hud. Båda fibrer modelleras med hjälp av en hexagonal kristallmodell i aktuell forskning. 9 I del 1, beskriver vi protokoll för att extrahera fibrer från djurvävnader och för att förbereda provet för mätningarna spektroskopiska. I del 2, är proceduren för att ställa in Brillouin apparaten och förvärva spektra från fibrerna presenteras. Del 3 ger information om dataanalys som appliceras på Brillouin spektra för att extrahera relevant mekanisk informationen däri. Då, är representativa resultat presenteras och discussed.

Protocol

Varning: Rådgör biologisk säkerhet protokoll och alla relevanta säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Lasern som användes i dessa experiment är en klass 3B laser; överensstämmelse med lokala regler för en säker användning av systemet krävs. Använd alla lämpliga säkerhetsåtgärder när du utför en laserspektroskopi mätning inklusive användning av personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon).

Svans senor erhölls 7-8 veckor gamla Wistar-råttor avlivas för andra ändamål i enlighet med EU: s förordning 1099/2009 och djurens välbefinnande (slakt eller avlivning) Regulations 1995. Bovina NACK ligament erhölls från en lokal slakteri.

1. Framställning av prov Fibrer

OBS: Protein fibrerna i den extracellulära matrisen kan extraheras från olika vävnader, med hjälp av olika förfaranden. Protokoll förfinades baserat på allmänt tillämpade förfaranden.

  1. Offra en råtta genom intraperitoneal injektion av 100 mg / kg kroppsvikt natriumpentobarbiton. Sedan avskilja svansen direkt vid punkten för kontakt med kroppen, trycka ned med en enda kant rakblad. Linda svansen i plastfolie och förvara den frystes vid -20 ° C tills de behövdes.
  2. Samla in svansen från frysen, skär ett 20 mm långt segment från den proximala änden samtidigt som det fortfarande frysta och sedan lämna den att tina i en petriskål fylld med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning (pH 7,4) vid rumstemperatur.
  3. När svansen tinas, gör ett snitt längs längden av segmentet under användning av en skalpell för att dela upp huden. Dra sedan tillbaka för att avslöja fyra mantlade senan buntar om svansen kotan.
  4. Med fin pincett och försiktigt så att inte tillämpa någon pre-stam, försiktigt dra varje fiber ut ur skidan och placera den i en flaska innehållande destillerat vatten med 0,01% vikt / volym natriumazid (NaN3) till prhändelse bakterietillväxt, och förvara i kylskåp. En enda svans ger ett trettiotal tendon fibrer.
  5. För att erhålla ren fiber typ I-kollagen, applicera en tredelad enzymatisk rötningsprocessen 10 till senan fibrerna för att avlägsna proteoglykaner och alla andra icke-kollagena material.
    1. Först, doppa fibrerna i 0,125 U / ml kondroitinas ABC i 0,05 M Tris-buffert och 0,06 M natriumacetat (CH3 COONa) vid pH 8,0 under 24 h vid 37 ° C i en skakinkubator vid 200 rpm.
    2. Då, doppa fibrerna i en U / ml streptomyces hyaluronidas i 0,05 M Tris-buffert och 0,15 M natriumklorid (NaCl) vid pH 6,0 och återgå till skakinkubator under 24 h vid 37 ° C.
    3. Slutligen doppa fibrerna i en mg / ml trypsin i 0,05 M natriumfosfat (NaHPO 4) och 0,15 M NaCl vid pH 7,2 under 16 timmar i skakinkubator vid 37 ° C.
  6. Förvara renade fibrerna kylts i flaskor som innehåller destillerat vatten, with 0,01% NaN3 för att förhindra bakterietillväxt, tills de behövdes för mätning.
  • Utvinning av elastinfibrer från nötkreatur nack ligament
    1. Skaffa bovint nuchal ligament från slakteriet, packa in den i plastfolie och förvara den frysta vid -20 ° C fram till användning.
    2. För att producera ren elastin, samla ligament från frysen, låt den tina vid RT, avfetta den med en skalpell och smälta ligament i ett kokande vattenbad enligt Lansing förfarandet 11 enligt följande.
      1. Förbered en 0,1 M lösning av natriumhydroxid (NaOH) i destillerat vatten och tillsätt det till avfettad ligament i en konisk kolv, som täcker vävnaden.
      2. Koka kolven i ett vattenbad vid 95 ° C under 45 min.
      3. Avlägsna ligamentet från digere kolven och tvätta den olösliga vävnadsblock upprepade gånger i destillerat vatten tills pH 7,0 (övervakades med användning av en pH-meter) erhålles.
      4. Ta bort vävnad från den slutligatvätta lösningen och dränka den i destillerat vatten (blandades med 0,01% NaN3 för att förhindra bakterietillväxt) i en förseglad behållare och lagra den i kylskåp.
    3. Samla vävnad från kylskåpet och försiktigt så att inte tillämpa alltför mycket kraft och pre-stammen, använd pincett för att försiktigt dra mindre elastin segment (20 till 50 mm lång, ca 2 mm tjock) från större block och placera dem i en petriskål med PBS-lösning (pH 7,4).
    4. Med fin pincett, försiktigt retas små fiberknippen runt 1 mm tjock och skär dem till längder av några få mm med hjälp av en skalpell.
    5. Överföra fibrerna till ampuller innehållande destillerat vatten (med 0,01% NaN3 för att förhindra bakterietillväxt) och lagra dem i kylskåp tills den behövdes för mätning.
  • Montering av fibrerna på reflekterande substrat
    1. Med hjälp av en diamant, skär en bit av reflekterande silikon bild.
    2. För att skapa en hydrerad facknt, skär en remsa av Parafilm för att passa över silikon glida med en ihålig snitt i mitten (tillräckligt stor för att passa en fiber) och placera den på silikonsubstrat.
      OBS: För mätningar torr fiber, skär parafilm i en U-form så att en av de fyra sidorna förblir öppen till luften när förseglade i steg 1.3.4.
    3. Ta fibrerna ur kylskåpet, använda ett par fina pincett för att samla in en enda fiber från lagringslösningen och placera den i en liten petriskål fylld med rent vatten vid RT under 5 min för att tvätta provet. Sedan samla fibern och överföra den till mitten av parafilm ihåliga på silikonsubstrat.
      Noggrann: Undvik att skada fibern genom att sträcka den under denna operation, och undvika omorientering av provet på underlaget eftersom det kan orsaka en förändring i mekaniska egenskaper.
    4. Placera ett tunt täckglas över fibern och försegla kammaren genom att passera ett uppvärmt lödkolv försiktigt över glasytan för att smälta parafilm underglaset.
      Noggrann: Undvik att skada fibern genom att inte föra lödspetsen för nära eller upphettning av substratet överdrivet.
    5. Placera den förseglade kammaren på en plan yta under en liten vikt och låt den stå cirka 12 timmar för att uppnå en god kontakt mellan provet och kiselsubstratet samtidigt undvika skador på provet.
    6. Ta bort vikten och fäst kammaren på plats på substratet, med hjälp av skruvar.
  • 2. Ställa in Brillouin Experiment och förvärva Fiber Spectra

    1. Framställning av provkammare
      1. Montera provet framställd som i del 1,3 på en vertikal hållare utrustad med en goniometer för att möjliggöra i planet rotation av provet under bibehållande av en konstant spridningsvinkeln (två Φ = 90 °, se figur SI-1) och spridande volymläget.
      2. Utför en noggrann fokusjustering av laserljuset på provet genom lens. 9
        Noggrann: Laser uteffekten kan vara för hög och producerar en brännskada i provet. Se till att den är inställd tillräckligt högt för att ge en god känslighet men inte alltför hög för att undvika skada på provet. Här har vi använt en effekt på ca 76 mW på provet. Detta var tillräckligt för att få en god känslighet utan att bränna provet, också med tanke på att detta är tunn och i kontakt med ett substrat som hjälper avleda den värme som alstras av laserbelysning.
      3. Placera provet vid en 45 ° vinkel (Φ) till den infallande laserstrålen med hjälp av en Nonieskala. Uppnå optimal positionering genom att köra en mätning och maximera intensiteten hos topparna i spektret (se nedan).
    2. Ställa in spektrometern
      1. Öppna programmet för förvärv och manipulation av data och konfigurerar förvärv av en Brillouin spektrum av provet 12. Det förfarande som beskrivs här gäller för den multipass tandem interferometer (Figur SI-1A).
      2. Rikta in de två Fabry-Perot (FP) interferometrar oberoende ändra spänningarna appliceras på piezo av styrenheten. För detta före justering förfarande, observera ljus som reflekteras av varje FP. När intensiteten reflekteras av två ramprogrammen går mot noll, är den korrekta inriktningen uppnåtts.
      3. Kalibrera spektrum: den åtkomliga frekvensområde, eller fri spektralområde (FSR), är beroende på avståndet mellan de två speglarna i den första FP kaviteten, L, genom FSR = c / 2 L, där c är ljusets hastighet och L mäts med en fjärrmätare.
      4. Synkronisera skanningar av de två FP interferometrar och slå det optiska systemet till tandem multipass konfigurationen. En återkopplingsstyrning av det utsända laserljusintensitet kommer automatiskt att bibehålla placeringen av två FP under mätningen.
    3. mätning of Brillouin Spectra
      Noggrann: Det Brillouin spektrum är i hög grad beroende på temperaturen och släckning av provet och så noggrann kontroll av dessa parametrar är nyckeln till att få reproducerbara spektra.
      1. Starta förvärv av en Brillouin spektrum av provet och kör den tills en bra signal-brusförhållande uppnås. Detta kan ta flera minuter beroende på spridningstvärsnittet, koncentration och tjocklek hos provet.
        OBS: Det är inte en tumregel för signal-till-brusförhållande, men den spektrala kvaliteten kontrolleras av experimentalist baseras på den specifika analyserade provet. Det finns en kompromiss mellan spektral kvalitet och varaktighet av mätningen, därför experimentella parametrar måste väljas enligt den specifika tillämpningen.
      2. För mätning av ett torrt prov, ta successiva spektra - för var och en av dem, efter steg 2.3.1 - tills inga förändringar i positionen av topparna is observerats. Detta uppnås när provet är i jämvikt med rumsatmosfär och ingen ytterligare torkning kommer att påverka spektrumet.
      3. Välj ljusets polarisation (VV eller VH; V står för vertikal och H för horisontell riktning av ljuset polarisation i förhållande till spridningsplanet) och förvärva spektra vid varje vinkel mot fiberaxeln (θ, fig SI-1) genom att vrida provet i planet för hand.
      4. Spara Brillouin spektra att ansöka om efterföljande behandling.

    3. Analys av Brillouin Spectra

    OBS: Fit analys av Brilloiun-topparna kan utföras med användning av olika funktioner. En dämpad harmonisk oscillator (DHO) funktion 4,13 valdes eftersom detta är en giltig modell för toppar som härrör från dämpade akustiska lägen i viskoelastiska medier.

    1. Fit analys av Brilloiun-topparna
      1. Välj spektralområdet för toppen av intresse i the Brillouin-spektrumet.
      2. Aktivera en baslinje i passningen om den spektrala bakgrunden är mycket högre än noll.
        OBS: Baslinjen kan variera mellan spektra. Se till att korrektionen tillämpas på ett systematiskt och reproducerbart sätt.
      3. Applicera en detaljerad minsta kvadrat montering med en DHO funktion 4,13 till Brillouin toppen av intresse iterativt tills konvergens uppnås och den bäst anpassade kurvan erhålls. Sedan spara passar resultat till fil.
      4. Erhålla medelvärden från passningsparametrarna för de två topparna i varje Brillouin dublett.
      5. Beräkna den akustiska våghastigheten från toppfrekvensen (användning av uttrycket nedan).
      6. Rita passnings resultat genom grafer, t ex akustisk vågshastigheten vs. vinkel mot fiberaxeln, θ Och tillämpa relevanta modeller (t.ex. för akustiskt anisotropa system 9) för att extrahera mekaniska storheter såsom elasticitet tensor koefficienter.

    Representative Results

    Brillouin spektroskopi apparat som används i detta experiment (figur SI-1A) har tidigare beskrivits. 9 Den använder en single-mode 532 nm solid-state laser med 76 mW uteffekt på provet. En 20 cm akromatisk lins fokuserar laserljuset på provet och samlar det spridda ljuset från provet i en bakåtspridning geometri. En tandem multipass Fabry-Perot-interferometer används för filtrering av det spridda ljuset, som sedan detekteras av en lågbrusig fotodioddetektor. Detta tillvägagångssätt ger extremt hög kontrast (ca 120 dB) och stabilitet genom självinställande piezo-scanning av etalons. En polarisator och analysator införs för att välja polarisationen av den infallande och spridda ljuset. Spektra erhålles vanligen med polarisatorn som hålls fast välja den vertikala (V) riktningen hos den infallande ljusets polarisation och analysatorn välja alternativt den vertikala (V) or horisontella (H) riktningen hos det spridda ljuset polarisation. I denna konfiguration, är längsgående och tvärgående akustiska moder detekteras respektive.

    En typisk Brillouin spektrum har en intensiv central topp på grund av elastisk spridning och en eller flera uppsättningar av lika förskjutna toppar, eller Brillouin dubletter, som är undertecknandet av mekaniken i provet. I dessa mätningar, kan det spridda ljuset härrör både från bulk fononer som reser kvasi-ortogonal till provet och, efter reflektion av det infallande ljuset vid prov-substrat-gränsytan, från bulk fononer som reser parallellt med ytan (PS lägen). 9

    Figur 2 visar BLS spektra av torra och hydratiserade trypsin omsatta kollagenfibrer som erhållits med VV polarisering vid 0,2 GHz upplösning, med en 30 GHz fri spektralområde och ca 10 min samling tidper spektrum. Varje spektrum motsvarar en viss rotationsvinkel, θ (Figur SI-1C). I torr kollagenfiber vid θ = 0 °, longitudinella moder ger upphov till en bulk topp vid (18,92 ± 0,02) GHz medan PS-läge är vid (9,85 ± 0,03) GHz (Figur 2A). De PS topp skiftar till lägre frekvenser som θ går från 0 ° (phonon sondera axiella orientering av fibern) till 90 ° (phonon sondera radiella orientering), medan huvuddelen topp endast något röda skift vid förändrade θ i samma område (phonon sondering en kvasi-radiell riktning under rotation). I våt kollagenfibrer, de två topparna på grund av longitudinella fononer är i huvudsak oförändrad under experimentet med huvuddelen topp vid ca 10,5 GHz och PS topp vid 4,9 GHz (Figur 2B). Detta tyder på en sänkning med 80 till 100% i toppfrekvens (i förhållande till data från 18,92och 9,85 GHz, respektive), och därmed av styvhet hos materialet, på grund av hydratisering. Observera att bulk- och PS sätt hydrerad kollagen ligger nära i frekvens till formerna för rent vatten, vilket tyder på att dess elastiska konstanter är en kombination av bidragen vatten och fiber, med en dominerande roll vatten.

    Figur 3 visar ett spektrum av torr trypsin-digerekollagenfiber mättes vid θ = 30 ° med VH polarisation; läckage av VV polarisering möjliggör PS och bulk toppar fortfarande observeras. Transversella moder står för en topp vid (4,1 ± 0,2) GHz = 0 °) som är något blå-skift som ö ändras från 0 ° till 90 °. Fit resultat för både den tvärgående och PS toppar visas också. Peak parametrar extraherades och akustiska vågor hastigheter härleddes som Vl = v λ / √2, där q s = 2 ki SIN (Φ), fig SI-1b, c), därav vilket gör denna metod speciellt fördelaktig.

    Figur 4 är ett diagram över den akustiska vågen hastigheter erhållna från längsgående och transversella moder (PS och T-toppar) som en funktion av vinkeln θ . Fit analys till en modell av hexagonalt symmetrisk elastisk solid 7 - Ekvationer A1 och A2 nedan - ger de fem komponenterna i elasticitet tensor torr trypsin omsatta typ I kollagenfibrer (tabell 1).

    9

    ekvation 1 (A1)

    ekvation 2 (A2)

    där ρ är densiteten hos materialet, och c 11, c 33, c 44 och c 13 är fyra av de fem elastiska konstanter som kännetecknar system med en sexkantig symmetri. Den femte konstant, c 12, kan härledas från den ungefärliga förhållande c 12 ~ c 11 -. 2 c 44 7

    Koefficienterna är liknande de som tidigare erhållits från orenad kollagen Fibers. 9 En märkbar skillnad uppträder för koefficienten c 13 som reflekteras i liknande värden på elasticitetsmodul E ǁ och E Vinkelrät (Ca 7,2 och 7,7 GPa) för den renade kollagen.

    Figur 5 är ett diagram över den längsgående akustiska våghastigheten av våt kollagen kontra θ . I detta fall är ingen periodisk förändring i frekvens observeras, vilket ger en konstant hastighet inom felet. Figur 6 visar spektra för torra och hydratiserade elastinfibrer uppmätt på ö = 0 °. Transversella moder upptäcktes inte för dessa prover. I torr elastin, inträffar bulk toppen vid 16,8 GHz medan PS-läge på 8,2 GHz 9 (13 och 20% lägre än motsvarande toppar av torr kollagen). Våta elastin fibrer presentera en bulk peak vid (12,30 ± 0,01) GHz (37% lägre i frekvens än bulk toppen av torr elastin). PS-läget av våt elastin framgår inte i spektrumet på grund av den intensiva svansen av den elastiska toppen vid dessa frekvenser. Å andra sidan, är toppen vid ca 7,5 GHz skrivas bulkvattnet.

    Figur 7 visar beroendet av akustisk våghastighet i torr elastin fiber på θ. Från dessa data, var de elasticitet tensor komponenter (och mekanisk moduli) erhölls (tabell 1). 9 Som i vått kollagen, det finns tecken på isotropi i den mekaniska modulen hos hydratiserade elastinfibrer. Dessa resultat indikerar hur Brillouin-spektroskopi kan ge relevant information om styvhet, sammansättning och strukturella aspekter av ett material.

    Figur 1
    figur 1. Akustiska och optiska fononer i endimensionell kedja av atomer. Skiss av akustiska och optiska vibrationer i en endimensionell diatomic kedja. Atomer har massan m 1 och m 2 och alterneras. Pilar indikerar förskjutningen av atomerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 2
    Figur 2. Brillouin-spektra för trypsin-renat typ I kollagen fibrer från råttsvanssena. Spectra av (A) torr fiber och (B) hydratiserat fiber från VV mätningar vid olika vinkel mot fiberaxeln θ, i grader. Ett spektrum av rent destillerat vatten visas också. Spektra normaliserades till intensiteten (höjd) av bulk topp. Etiketter B och PS betecknar toppar i samband med bulk och parallell-sport, respektive. Felstaplar anger standardfelet (kvadratroten av antalet räkningar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3. Brillouin spektrum av torr trypsin-renade typ I-kollagen fibrer från råttsvanssena. Spektrum från en VH mätning vid θ = 30 °. Etiketter T, PS och B betecknar toppar i samband med tvärgående, parallell-ytan och bulk lägen, respektive. Resultaten av passform analys med användning av en dämpad harmonisk oscillator (DHO) modell för både T och PS lägena visas också. Felstaplar anger medelfelet (kvadratroten av antalet räkningar)./54648fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    Figur 4. Rita av den akustiska våghastigheten i torr trypsin-renat kollagen vs vinkel mot fiberaxeln. Längsgående och tvärgående akustiska våg hastigheter av torr kollagenfiber härrörande från passform analys av Brilloiun-topparna. Data är monterade på en modell av hexagonalt symmetrisk elastisk fast. Röd linje: Ekvation A1 (R 2 = 0,99); blå linje: Ekvation A2 (R2 = 0,36). Felstaplar indikerar standardfel erhållna från kvadratroten ur de diagonala elementen i kovariansmatrisen efter en Levenberg-Marquardt ickelinjär minsta kvadratanpassning av Brillouin spektra. Klicka här för att se en större versi på denna siffra.

    figur 5
    Figur 5. Rita av den längsgående akustiska vågen hastighet i vått trypsin renade kollagen vs vinkel mot fiberaxeln. Längs akustisk våg hastighet av hydratiserad kollagenfibrer som härrör från passnings analys av Brilloiun-topparna. Linjen som visas är en guide för ögat och ger det genomsnittliga värdet för den akustiska vågen hastigheten i detta intervall. Felstaplar indikerar standardfel erhållna från kvadratroten ur de diagonala elementen i kovariansmatrisen efter en Levenberg-Marquardt ickelinjär minsta kvadratanpassning av Brillouin spektra. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

    jpg "/>
    Figur 6. Brillouin spektra av elastinfibrer från nötkreatur nack ligament. Spektra torr och släckt fiber på θ = 0 °. Spektra normaliserades till intensiteten (höjd) av bulk topp. Etiketter B och PS betecknar toppar i samband med bulk och parallell-sport, respektive. B F och B W hänvisar till de bulk topparna av fibrer och vatten, respektive. Felstaplar anger standardfelet (kvadratroten av antalet räkningar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 7
    Figur 7. Rita av den längsgående akustiska vågen hastighet i torr elastin vs vinkel mot fiberaxeln. Längs akustisk våg hastighet torr elastin fiber som härrör från passnings analys av Brilloiun-topparna. Data är monterade på en modell av hexagonalt symmetrisk elastisk fast. Röd linje: Ekvation A1 9 (R2 = 0,74). Felstaplar indikerar standardfel erhållna från kvadratroten ur de diagonala elementen i kovariansmatrisen efter en Levenberg-Marquardt ickelinjär minsta kvadratanpassning av Brillouin spektra. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

    Kompletterande Figur 1

    Figur SI-1. Schematisk bild av Brillouin set-up och BLS spridnings geometri. (A) infallande ljus som avges av en solid-state laser skickas till provet genom en akromatisk lins. Det ljus som sprids av bulk akustiska fononer och de som följer av reflektion av ljus vid substratytan, som är i kontakt med provet, uppsamlas av linsen, filtreras av ett tandem-multipass Fabry-Perot-interferometer och detekteras av en fotomultiplikator. FP1 och FP2 visar de två interferometrar utgör tandem set-up. En polarisator väljer den polarisering av infallande ljus, och en analysator används för att välja polarisationen av spritt ljus. (B) BLS geometri med ett prov i kontakt med ytan på en reflekterande kiselsubstrat. En glasskiva (ej visad) är placerad ovanför prov att täta facket, och ett lätt tryck appliceras genom elektroderna vid hörnen hos substratet. Det infallande ljuset (k i) passerar genom linsen, bryts vid luft-prov gränsyta (k 'i) och fokuserad vid prov-substrat-gränsytan. Det spridda ljuset samlas in av samma lins (k 's) resultat från interaktion med både bulk fononer (qb) och de som reser PS av provet (q s). . Vinklarna mellan riktningarna för ljus och normalen till ytan anges som Φ och Φ '(C) Schematisk beskrivning av provet och den antagna koordinatsystem; z definierar extra axel parallell med fiberriktningen. Vinklar θ och α är de mellan riktningen för fononer q s och q b z -axeln, respektive kj, k 'i, k s, k' s. Vågtal av händelsen och spritt ljus, q B, q s, vågvektor av bulk och PS lägena, respektive. (Utdrag ur ref 9.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Tabell 1. Elastiska tensor koefficienter härledda från passform analys av den akustiska vågen hastigheter Elastiska tensor koefficienter torr trypsin-renat typ I kollagen fibrer (. detta arbete) och elastin fibrer (ref 9).

    prov elastiska koefficienter (GPa)
    trypsin-digerekollagen c 33 18,7 ± 0,1
    c 11 14,4 ± 0,2
    c 44 3,4 ± 0,1
    c 12 7,2 ± 0,2
    c 13 11,2 ± 0,3
    elastin c 33 11,5 ± 0,2
    c 11 10,4 ± 0,1
    c 44 1,9 ± 0,2
    c 12 6,6 ± 0,2
    c 13 6,8 ± 0,3

    Discussion

    Brillouinspridning spektroskopi är ett unikt verktyg med vilket de individuella komponenterna i elasticiteten tensor av ett protein fiber kan karakteriseras på oöverträffad detaljrikedom. Vidare kan mätningar utföras på en mikroskopisk skala och därmed kommer att ge oss nya insikter i mikroskala mekanik biologiska strukturer, tillåter oss, för första gången, för att förstå den mekaniska och förmodligen funktionella, betydelsen av komplexiteten i matrisarkitektur och biokemi som har avslöjats på senare år.

    Tekniken mäter mekaniska egenskaper i en GHz. Den här domänen har aldrig undersökts tidigare för strukturella biopolymerer och det både höjer och ger möjlighet att svara på grundläggande frågor om molekylära mekanismer av elasticitet.

    Vi beskrev stegen för att extrahera kollagen och elastin fibrer från djurvävnader och för att mäta Brillouin scattering spektra med hjälp av ett reflekterande substrat för att uppnå fullständig beskrivning av fiber biomekanik. Kritiska steg i protokollet är de som säkerställer att renade fibrer erhålls och lämpliga experimentella betingelser är på plats för reproducerbara mätningar av fibrösa proteiner. Det måste emellertid hållas i minnet att de extraktionsmetoder kan modifiera de mekaniska egenskaperna hos fibrerna.

    Modifieringar av tekniken innebär kopplingen med optisk mikroskopi för microfocused Brillouin spridning och kartläggning närmar 13 och eventuell kombination med kompletterande metoder (t.ex. Raman-spridning). Nuvarande tillämpningar av tekniken är främst inriktade på utskurna biologiska material, men viktiga händelser, till exempel de som baseras på flera Vipa etalons 14, gör det möjligt att översättningen av denna teknik från bänk till sängen med en rad tillämpningar redan demonstrated 15,16 inklusive potential in vivo applikationer. Den VIPA tillvägagångssätt är ett alternativ till vad vi beskriva; Det har snabbare förvärv tid men är inte nödvändigtvis lämpligt när det gäller ogenomskinliga prover såsom de analyseras här. Dessutom är användningen av en reflekterande substrat inte praktiskt i uppställningar som använder Vipa etalons eftersom deras kontrast inte skulle vara tillräcklig för att avvisa kvasi-elastisk ljus. Begränsningar i samband med hastigheten för förvärv av en spektral dataset och den inneboende svaga spridningstvärsnittet av materialet kan begränsa ansökningar till dynamiska biologiska system och till förvärvet av data från djupt inom vävnader, men tekniska finesser kan förbättra nuvarande prestanda.

    BLS ser ut att bli ett viktigt verktyg i grundläggande biofysikalisk forskning på den extracellulära matrisen och därigenom ta fram nya insikter om utvecklingen av mekaniska egenskaper under matris tillväxt och deras förlust i patologiskadegeneration. Det är dock viktigt att komma ihåg att mätningarna är icke-invasiv och kan därför ske in vivo. Faktum är att det har redan gjorts i hornhinnan 16 och sådant arbete kan ge en plattform för utveckling av nya diagnostiska verktyg för ett brett spektrum av bindväv.

    Ultraljud elastografi och atomkraftsmikroskopi (AFM) finns alternativa metoder för mikromekaniska mätning, men BLS tekniken ger bättre spatial upplösning (på en subcellulär skala) än den förra och, till skillnad från AFM, medför inga mekaniska krafter på provet och är inte begränsad till analysen endast av ytsärdrag. Brillouin moduler av kollagen och elastin är i GPa intervallet, medan Youngs moduler från makroskopiska stammar är i storleksordningen MPa (ytterligare detaljer kommer att redovisas någon annanstans). Detta resultat indikerar en differentiell elasticitetsmodul med ett starkt beroende av exciteringsfrekvensen, på grund avdet viskoelastiska beteendet hos fibrerna. BLS kan tillämpas på ett brett spektrum av problem och material i biomedicinsk vetenskap. Det kan bidra till att svara på frågor om fysiologi och patologi biologiska vävnader, samt ge en fysisk verktyg för den grundläggande förståelsen av material och interaktioner på molekylär nivå.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C2905
    Tris Buffer Fluka 93358
    Sodium Acetate Fisher Scientific S608-500
    PBS Sigma-Aldrich P4417
    Sodium Azide Fisher Scientific S2002
    Streptomyces Hyaluronidase  Sigma-Aldrich H1136-1AMP
    Sodium Chloride Fisher Scientific S7653
    Trypsin Sigma-Aldrich T4665
    Sodium Phosphate Sigma-Aldrich S9638
    Sodium Hydroxide Fisher Scientific S320-500
    Pure Water Millipore ZRQS0P3WW Produced in-house
    Distilled Water Bibby Scientific Limited D4000 Produced in-house from water still
    Euthatal Merial  J01601A 
    Tandem Interferometer TFP-1 JRS Scientific Instruments
    Freezer Lec TU55144
    Refrigerator Zanussi ZBA15021SA
    Hot Plate Fisher Scientific SP88857206
    Clamps VWR 241-7311 & 241-7201
    Clamp Stand VWR  241-0093
    Thermometer Fisher Scientific 13-201-401
    Cling Film Sainsbury's 7650540
    Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
    Silicone IDB Technologies N/A No catalogue number. Order upon request.
    Cover Glass VWR 631-1571
    Conical Flask VWR 214-1175
    Beaker VWR 213-0469
    Measuring Cylinder VWR 612-3838
    Vial VWR 548-0051 & 548-0863
    Petri Dish VWR 391-0441
    Scalpel Swann Morton Ltd  0914 & 0308
    Diamond Scribe RS Instruments 394-217
    Soldering Iron RS Instruments 231-5332
    Fine Forceps VWR 232-0188
    Double Micro-Spatula VWR Various Sizes
    pH Meter Hanna Instruments HI-2210-02
    Orbital Shaker IKA  0002819000

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Brillouin, L. Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l'agitation thermique. Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).
    2. Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials. J. Chem. Phys. 141, (21), 214901 (2014).
    3. Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids. Soft Matter. 8, (15), 4235-4243 (2012).
    4. Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D. Solid State Physics. Robert, E. C., Robert, L. S. 63, Academic Press. 1-77 (2012).
    5. Madami, M., et al. Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque. Nat. Nanotechnol. 6, (10), 635-638 (2011).
    6. Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle. Nature. 267, (5608), 285-287 (1977).
    7. Cusack, S., Miller, A. Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering. J. Mol. Biol. 135, (1), 39-51 (1979).
    8. Vaughan, J. M., Randall, J. T. Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye. Nature. 284, (5755), 489-491 (1980).
    9. Palombo, F., et al. Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering. J. R. Soc. Interface. 11, (101), (2014).
    10. Sivan, S. S., et al. Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs. Biochem. J. 399, (1), 29-35 (2006).
    11. Leon, W. C. Methods in Enzymology. 144, Academic Press. 196-214 (1987).
    12. Fioretto, D., Scarponi, F. Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering. Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).
    13. Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy. Analyst. 139, (4), 729-733 (2014).
    14. Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Express. 19, (11), 10913-10922 (2011).
    15. Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101, (6), 1539-1545 (2011).
    16. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Express. 20, (8), 9197-9202 (2012).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Video Stats