Herstellung von extrazellulären Matrix Proteinfasern für Brillouin-Spektroskopie

1School of Physics and Astronomy, University of Exeter, 2Department of Physics and Geology, University of Perugia, 3Istituto Officina dei Materiali del CNR, Unità di Perugia
Published 9/15/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Edginton, R. S., Mattana, S., Caponi, S., Fioretto, D., Green, E., Winlove, C. P., et al. Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy. J. Vis. Exp. (115), e54648, doi:10.3791/54648 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Die Brillouin - Lichtstreuung (BLS) Wirkung wurde im Jahre 1922 von 1 Léon Brillouin entdeckt Es besteht aus der inelastischen Streuung von sichtbarem Licht durch thermisch aktivierte akustischen Phononen in einem Material. In der Festkörperphysik, sind akustische Phononen kohärenten Schwingungen aller Atome in einem Gitter. Eine eindimensionale Kette von zwei alternierenden Typen von Atomen in einem Gitter ist ein einfaches Modell , das die Differenz zwischen den akustischen Phononen veranschaulicht, die von BLS offenbart, und optische Phononen, sondiert durch IR - Absorption und Raman - Streuung (Abbildung 1). Akustischen Phononen in Phase sind Bewegungen der Atome in der Kette mit einer Verschiebung entlang der Ausbreitungsrichtung (longitudinale akustische Phononen) oder senkrecht zur Ausbreitungsrichtung (transversale akustische Phononen), während optische Phononen sind out-of-Phase Bewegungen der Atome ein oszillierendes elektrisches Dipolmoment (Längs- oder Quermoden) zu erzeugen.

BLS SPECTROscopy wurde seit den 1920er Jahren in der analytischen Wissenschaft verwendet wird; aber erst seit den 1980er Jahren wurden hohe Kontrastmessungen möglich durch die Verwendung der Tandem-Mehrweg-Fabry-Perot-Spektrometer. Seitdem immer mehr Fortschritte in BLS für analytische Anwendungen in kondensierter Materie 2-4 und magnetischen Materialien (wobei die Photonen-Phonon - Wechselwirkung ausgenutzt wird) (durch photonen magnon Wechselwirkung) 5 wurde bewirkt. Seminal Arbeiten auf biomedizinische Anwendungen 6-8 haben den Weg für die Entwicklung der verschiedenen Ansätze geebnet, darunter auch die hier angewendet und die beschriebene eine zuvor 9 ein reflektierendes Substrat in einer plättchenförmigen Konfiguration die vollständige Beschreibung des Elastizitäts Tensor zu erreichen unter Verwendung von eine Probe.

In der vorliegenden Arbeit wenden wir BLS-Spektroskopie auf die grundlegenden Bestandteile der extrazellulären Matrix in Bindegewebe, die faserigen Proteine ​​Elastin und Typ I-Kollagen. Tim wesentlichen starren Fasern im Gewebe zu bilden, wie Sehnen yp I-Kollagen ist ein starres, Tripelhelix-Molekül, das seitlich und in Längsrichtung mit umfangreichen Vernetzung montiert. Netzwerke von Kollagen häufig koexistieren mit Netzwerken von Elastin, ein Protein, das ungewöhnlich, große Reichweite Elastizität durch eine Kombination aus Entropie und hydrophobe Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung erzeugt und auf die Funktionen von Geweben wie Lunge und der Haut von wesentlicher Bedeutung. Beide Fasern sind mit einer hexagonalen Kristallmodell in der aktuellen Forschung modelliert. 9 In Teil 1 beschreiben wir das Protokoll , um die Fasern aus tierischen Geweben zu extrahieren und die Probe für die spektroskopischen Messungen vorzubereiten. In Teil 2 wird das Verfahren zur Einstellung des Brillouin Vorrichtung und Erfassen Spektren aus den Fasern nach oben dargestellt. Teil 3 gibt Details der Datenanalyse auf die Brillouin-Spektren angewendet, um die relevanten mechanischen darin enthaltenen Informationen zu extrahieren. Dann werden repräsentative Ergebnisse präsentiert und discussed.

Protocol

Achtung: Bitte konsultieren biologischen Sicherheitsprotokolle und alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Der Laser in diesen Experimenten verwendet wird, ist ein Laser der Klasse 3B; die Einhaltung der örtlichen Vorschriften für eine sichere Verwendung des Systems erforderlich ist. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Praktiken Sicherheit bei, einschließlich der Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille) eine Laserspektroskopie Messung durchgeführt wird.

Schwanzsehnen wurden 7-8 Wochen alte Wistar-Ratten für andere Zwecke gemäß der EU-Verordnung 1099/2009 und das Wohlergehen der Tiere (Schlachtung oder Tötung) Regulations 1995 Rindernackenband von einem örtlichen Schlachthof erhalten wurden eingeschläfert erhalten.

1. Herstellung der Probe Fibers

HINWEIS: Protein Fasern der extrazellulären Matrix können aus verschiedenen Geweben extrahiert werden, verschiedene Verfahren. Protokolle wurden auf der Grundlage allgemein angewandten Verfahren verfeinert.

  1. Opfere eine Ratte durch intraperitoneale Injektion von 100 mg / kg Körpergewicht Natriumpentobarbiton. Dann trennen den Schwanz direkt am Punkt der Kontakt mit dem Körper, mit einer einzigen Rasierklinge nach unten drücken. Wickeln Sie den Schwanz in Plastikfolie und lagern Sie es bei -20 ° C eingefroren, bis sie benötigt.
  2. Sammeln Sie den Schwanz aus dem Gefrierschrank, schneiden Sie ein 20 mm langes Segment von dem proximalen Ende, während immer noch gefroren und dann lassen Sie es in einer Petrischale mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (pH 7,4) bei RT gefüllt aufzutauen.
  3. Sobald der Schwanz aufgetaut wird, wird ein Einschnitt entlang der Länge des Segments unter Verwendung eines Skalpells um die Haut zu verteilen. Dann schälen zurück zu vier ummantelten Sehnenbündel über die Schwanzwirbel offenbaren.
  4. Mit einer feinen Pinzette und achten Sie darauf, keine Vorbelastung aufzubringen, ziehen sanft jede Faser aus der Hülle und legen Sie sie in einem Fläschchen destilliertem Wasser mit 0,01% enthalten , w / v Natriumazid (NaN 3) zu prEreignis Bakterienwachstum und gekühlt. Ein einziger Schwanz ergibt etwa dreißig Sehnenfasern.
  5. Zur Erzielung rein faserige Kollagen Typ I, tragen Sie eine dreiteilige enzymatische Verdauung 10 zu den Sehnenfasern , um die Proteoglykane und alle anderen nicht - kollagenen Material zu entfernen.
    1. Zunächst tauchen die Fasern in 0,125 U / ml Chondroitinase ABC in 0,05 M Tris - Puffer und 0,06 M Natriumacetat (CH 3 COONa) bei pH 8,0 für 24 h bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator bei 200 UpM.
    2. Dann tauchen die Fasern in 1 U / ml Streptomyces-Hyaluronidase in 0,05 M Tris-Puffer und 0,15 M Natriumchlorid (NaCl) bei pH 6,0 und Rückkehr zum Schüttelinkubator für 24 Stunden bei 37 ° C.
    3. Schließlich tauchen die Fasern in 1 mg / ml Trypsin in 0,05 M Natriumphosphat (NaHPO 4) und 0,15 M NaCl bei pH 7,2 für 16 Stunden im Schüttelinkubator bei 37 ° C.
  6. Lagern Sie die gereinigten Fasern gekühlt in Fläschchen destilliertem Wasser, with 0,01% NaN 3 Bakterienwachstum zu verhindern, bis sie für die Messung erforderlich.
  • Die Extraktion von Elastin - Fasern aus Rindernackenband
    1. Erhalten Rindernackenband vom Schlachthof, wickeln Sie es in Frischhaltefolie und lagern Sie es bei -20 ° C bis zur Verwendung eingefroren.
    2. Zur Herstellung von reinem Elastin, sammeln das Band aus dem Gefrierschrank, lassen Sie es bei RT auftauen, entfetten sie mit einem Skalpell und verdauen das Band in einem kochenden Wasserbad nach dem Lansing Verfahren, 11 wie folgt.
      1. Bereiten Sie eine 0,1 M Lösung von Natriumhydroxid (NaOH) in destilliertem Wasser und fügen Sie es dem entfettet Band in einem Erlenmeyerkolben, bedeckt das Gewebe.
      2. Sieden der Kolben in einem Wasserbad bei 95 ° C für 45 min.
      3. Entfernen Sie das Band aus dem Aufschlusskolben und wäscht den unlöslichen Gewebeblock wiederholt in destilliertem Wasser bis pH 7,0 (überwacht, um einen pH-Messgerät verwendet wird) erhalten wird.
      4. Entfernen Sie das Gewebe aus dem letztenWaschlösung und tauchen Sie es in destilliertem Wasser in einem verschlossenen Behälter (gemischt mit 0,01% NaN 3 Bakterienwachstum zu verhindern) und speichern Sie es gekühlt.
    3. Sammeln Sie das Gewebe aus dem Kühlschrank und, darauf achten , nicht zu viel Kraft anwenden und Vordehnung, mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig kleinere Elastin Segmente ziehen (20 bis 50 mm lang, ca. 2 mm dick) aus dem größeren Block entfernt und legen Sie sie in eine Petrischale mit PBS-Lösung (pH 7,4).
    4. Mit einer feinen Pinzette, necken sanft kleine Faserbündel um 1 mm dick und schneiden Sie sie auf Längen von wenigen mm mit einem Skalpell.
    5. Die Fasern werden zu Fläschchen destilliertem Wasser (mit 0,01% NaN 3 Bakterienwachstum zu verhindern) und speichern sie für die Messung , bis sie benötigt gekühlt.
  • Das Anbringen der Fasern auf reflektierende Substrat
    1. Mit einem Diamantschneider, schneiden Sie ein Stück reflektierende Silikon Folie.
    2. So erstellen Sie eine hydratisierte compartment, schneiden einen Streifen aus Parafilm des Silikonträger mit einem hohlen Schnitt in der Mitte (groß genug, um eine Faser zu passen) zu passen und auf das Siliziumsubstrat statt.
      HINWEIS: Für trockene Fasermessungen, schneiden Sie den Parafilm in eine U-Form-so, dass eine der vier Seiten der Luft offen bleibt, wenn in Schritt 1.3.4 abgedichtet.
    3. Entfernen Sie die Fasern aus dem Kühlschrank, ein Paar von feinen Pinzette verwenden, um eine einzelne Faser aus der Speicherlösung zu sammeln und sie in einer kleinen Schüssel Petri mit reinem Wasser bei RT gefüllt für 5 min, um die Probe zu waschen. Dann sammeln die Faser und übertragen sie auf die Mitte des Parafilm hohl auf dem Siliziumsubstrat.
      Achtung: Vermeiden Sie die Faser zu beschädigen, indem es während dieser Operation Stretching, und vermeiden auf dem Substrat der Probe Umorientierung, da dies eine Änderung der mechanischen Eigenschaften führen kann.
    4. Legen Sie ein dünnes Deckglas über die Faser und dichten die Kammer durch einen beheizten Lötkolben sanft über die Glasoberfläche Passieren der Parafilm unter zu schmelzendas Glas.
      Achtung: Vermeiden Sie die Faser, die durch nicht bringen die Lötspitze zu nahe oder Erwärmen des Substrats übermäßig zu beschädigen.
    5. Legen Sie die verschlossene Kammer auf einer flachen Oberfläche unter einem kleinen Gewicht und lassen Sie es für etwa 12 Stunden einen guten Kontakt zwischen der Probe und dem Siliziumsubstrat zu erreichen, während eine Beschädigung der Probe zu vermeiden.
    6. Entfernen Sie das Gewicht und sichern die Kammer an ihrem Platz auf dem Substrat, Schrauben.
  • 2. Einstellen der Brillouin-Experiment und Acquiring Fiber Spectra

    1. Vorbereitung der Probenraum
      1. Montieren Sie die Probe wie in Teil 1.3 auf einer vertikalen Halterung mit einem Goniometer ausgestattet in der gleichen Ebene Rotation der Probe zu ermöglichen , während eine konstante Streuwinkel beibehalten (2 Φ = 90 °; siehe Abbildung SI-1) und Streuvolumenposition.
      2. Führen Sie eine genaue Fokuseinstellung des Laserlichts auf der Probe durch die lens. 9
        Achtung: Die Laserleistung zu hoch sein kann und eine Verbrennung in der Probe erzeugen. Stellen Sie sicher, dass sie ausreichend hoch eingestellt ist eine gute Empfindlichkeit zu geben, aber nicht zu hoch Schäden an der Probe zu vermeiden. Hier haben wir eine Leistung von ca. 76 mW auf der Probe. Dies war ausreichend, um eine gute Empfindlichkeit zu erhalten, ohne die Probe zu brennen, wenn man bedenkt, dass diese dünn ist und in Kontakt mit einem Substrat, das die Wärme durch Laserbeleuchtung erzeugt hilft abzuführen.
      3. Positionieren Sie die Probe in einem 45 ° Winkel (Φ) mit dem einfallenden Laserstrahl eine Vernier - Skala. Eine optimale Positionierung durch eine Messung ausgeführt wird und die Intensität der Peaks in dem Spektrum maximiert (siehe unten).
    2. Einstellen des Spektrometers nach oben
      1. Öffnen Sie die Software für die Erfassung und Manipulation der Daten und richten Sie den Erwerb eines Brillouin - Spektrum der Probe 12. Das beschriebene Verfahren gilt hier für die multipass Tandem - Interferometer (Abbildung SI-1A).
      2. Ausrichten der beiden Fabry-Perot (FP) Interferometern unabhängig die Spannungen an die piezo durch die Steuereinheit angelegt zu verändern. Aus diesem Vororientierung Verfahren, beobachten das Licht von jedem FP reflektiert. Wenn die durch die beiden FPs reflektierte Intensität gegen Null geht, wird die richtige Ausrichtung erreicht.
      3. Kalibrieren des Spektrum: das bedienbare Frequenzbereich oder freie Spektralbereich (FSR), ist abhängig von dem Abstand zwischen den beiden Spiegeln der ersten FP Hohlraum, L, durch FSR = c / 2 L, wobei c die Lichtgeschwindigkeit und L wird durch eine Einwahllehre gemessen.
      4. Synchronisieren Sie die Scans der beiden FP-Interferometern und schalten Sie das optische System auf dem Tandem Multi Konfiguration. Eine Rückkopplungssteuerung der Intensität von Laserlicht übertragen wird, die Ausrichtung der beiden FPs während der Messung automatisch aufrechtzuerhalten.
    3. Die Messung of Brillouin Spectra
      Achtung: Die Brillouin Spektrum ist in hohem Maße abhängig von der Temperatur und Feuchtigkeit der Probe und so sorgfältige Steuerung dieser Parameter ist der Schlüssel reproduzierbare Spektren zu erhalten.
      1. Starten Sie den Erwerb eines Brillouin-Spektrum der Probe und führen Sie es, bis ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht wird. Dieser Vorgang kann einige Minuten dauern, auf dem Streuquerschnitt, Konzentration und Dicke der Probe abhängig.
        HINWEIS: Es gibt keine Faustregel gilt: für das Signal-zu-Rausch-Verhältnis, aber die spektrale Qualität wird durch die Experimentator auf der Grundlage der spezifischen Probe analysiert geprüft. Es gibt einen Kompromiß zwischen der spektralen Qualität und Dauer der Messung, damit die Versuchsparameter entsprechend ausgewählt werden, müssen auf die spezifische Anwendung.
      2. Für die Messung eines trockenen Probe, aufeinanderfolgende Spektren nehmen - für jeden von ihnen, nach Schritt 2.3.1 - bis keine Änderungen in der Position der Spitzen is beobachtet. Dies wird erreicht, wenn die Probe im Gleichgewicht mit der Raumatmosphäre und keine weitere Trocknung wird das Spektrum beeinflussen.
      3. Wählen Sie die Lichtpolarisation (VV oder VH, V steht für vertikale und H für die horizontale Richtung der Lichtpolarisation relativ zur Streuebene) und erwerben Spektren an jedem Winkel zur Faserachse (θ, Fig SI-1) durch Drehen der Probe in Flugzeug von Hand.
      4. Speichern Sie die Brillouin-Spektren für die nachfolgende Verarbeitung zu erheben.

    3. Analyse der Brillouin Spectra

    HINWEIS: Fit Analyse der Brillouin-Peaks können mit verschiedenen Funktionen ausgeführt werden. Ein gedämpften harmonischen Oszillator (DHO) -Funktion 4,13 ausgewählt wurde , da dies ein gültiges Modell für Spitzen ist aus gedämpften akustischen Moden in viskoelastischen Medien stammen.

    1. Fit Analyse der Brillouin - Peaks
      1. Wählen Sie den Spektralbereich für den Peak des Interesses an the Brillouin-Spektrum.
      2. Aktivieren Sie einen Ausgangswert in der Passform, wenn die spektrale Hintergrund viel höher als Null ist.
        HINWEIS: Die Basislinie zwischen Spektren variieren kann. Stellen Sie sicher, dass die Korrektur in einer systematischen und reproduzierbaren Weise angewendet wird.
      3. Tragen Sie eine detaillierte kleinsten Quadrate unter Verwendung eines DHO - Funktion 4,13 auf der Brillouin - Spitze von Interesse passend iterativ bis Konvergenz erreicht und die am besten passende Kurve erhalten wird . Dann speichern Sie die Anpassungsergebnisse einzureichen.
      4. Erhalten Mittelwerte aus den Anpassungsparameter der beiden Spitzen jedes Brillouin Dublette.
      5. Berechnen der Schallwellengeschwindigkeit von der Spitzenfrequenz (unter Verwendung des Ausdrucks unten).
      6. Zeichnen Sie die Anpassungsergebnisse durch grafische Darstellungen, zum Beispiel Schallwellengeschwindigkeit vs. Winkel zur Faserachse, θ Und (für akustisch anisotropen Systeme 9 zB) relevanten Modelle gelten mechanischer Größen wie Elastizität Tensorkoeffizienten zu extrahieren.

    Representative Results

    Die Brillouin - Spektroskopie Gerät in diesem Experiment verwendet (Abbildung SI-1A) wurde zuvor beschrieben. 9 Es verwendet einen Monomode - 532 nm Halbleiterlaser mit 76 mW Ausgangsleistung bei der Probe. Eine 20 cm achromatische Linse fokussiert das Laserlicht auf die Probe und sammelt das gestreute Licht von der Probe in einer Rückstreugeometrie. Ein Tandem Multi Fabry-Perot-Interferometer zum Filtern des Streulichts verwendet wird, die dann durch einen rauscharmen Photodiodendetektor detektiert wird. Dieser Ansatz bietet eine extrem hohe Kontrast (ca. 120 dB) und der Stabilität durch selbstausrichtende piezo Abtastung der Etalons. Ein Polarisator und Analysator eingeführt, um die Polarisation des einfallenden und gestreuten Lichts auszuwählen. Spektren werden in der Regel mit der Polarisator fixiert gehalten Auswählen der vertikalen (V) Richtung des einfallenden Lichtpolarisation und den Analysator Auswählen alternativ die vertikale (V) o erhaltenr horizontalen (H) Richtung der Streulichtpolarisation. In dieser Konfiguration sind Längs- und Quer akustischen Moden jeweils detektiert.

    Ein typisches Brillouin Spektrum hat eine intensive zentralen Spitze aufgrund der elastischen Streuung und einen oder mehrere Sätze von gleichmäßig verschobenen Peaks oder Brillouin Dubletts, die die Signatur der Mechanik der Probe sind. Bei diesen Messungen kann das Streulicht stammen beide aus bulk Phononen reisen quasi-orthogonal zu der Probe und nach der Reflexion des einfallenden Lichts an der Probe-Substrat - Grenzfläche, aus bulk Phononen sich parallel zur Oberfläche (PS - Modus). 9

    Abbildung 2 zeigt BLS - Spektren von trockenen und hydrierten trypsinverdauten Kollagenfasern mit VV Polarisation erhalten bei 0,2 GHz Auflösung, mit einem 30 - GHz - freie Spektralbereich und etwa 10 Minuten Sammelzeitpro Spektrum. Jedes Spektrum entspricht einem bestimmten Drehwinkel θ (Abbildung SI-1C). In trockenen Kollagenfaser bei θ = 0 °, Longitudinalmoden ergeben eine Massenpeak bei (18,92 ± 0,02) GHz , während die PS - Modus bei (9,85 ± 0,03) GHz (2A) ist. Die PS Peak verschiebt sich zu niedrigeren Frequenzen als θ von 0 ° (Phonon die axiale Ausrichtung des Faser Sondieren) wird auf 90 ° (Phonon die radiale Ausrichtung Sondieren), wohingegen die Schütt peak nur leicht rot-Verschiebungen auf θ im gleichen Bereich ändernden (Phononen Sondieren eine quasi-radialer Richtung auf der ganzen Drehung). In wet Kollagenfaser, sind die zwei Peaks aufgrund Längs Phononen wesentlichen unverändert während des gesamten Experiments, wobei der Groß Peak bei ca. 10,5 GHz und der PS - Peak bei 4,9 GHz (2B). Dies weist auf eine 80 bis 100% ige Verringerung der Spitzenfrequenz (bezogen auf die Daten von 18.92und 9,85 GHz, jeweils) und somit der Steifigkeit des Materials durch Hydratation. Beachten Sie, dass die Masse und das PS-Modi von hydratisiertem Kollagen nahe liegen in der Frequenz zu den Moden des reinen Wassers, was darauf hindeutet, dass seine elastischen Konstanten sind eine Kombination aus der Wasser- und Faser Beiträge, mit einer dominanten Rolle von Wasser gespielt.

    Figur 3 zeigt ein Spektrum von trockenem trypsinverdauten Kollagenfaser bei θ = 30 ° , gemessen mit VH Polarisation; eine Leckage der VV Polarisation ermöglicht die PS und bulk Spitzen noch beobachtet werden. Transversalmoden machen einen Spitzenwert bei (4,1 ± 0,2) GHz = 0 °) , die leicht blau-Verschiebungen als θ ändert sich von 0 ° bis 90 °. Anpassungsergebnisse sowohl für die Quer- und PS Peaks sind ebenfalls gezeigt. Peak - Parameter wurden extrahiert und akustischen Wellengeschwindigkeiten wurden als V L = v λ abgeleitet / √2, wo q s = 2 k i sin (Φ) ist , Fig SI-1b, c) erforderlich ist , damit dieser Ansatz macht besonders vorteilhaft.

    Figur 4 ist eine graphische Darstellung der Schallwellengeschwindigkeiten , erhalten aus Längs- und Quermoden (PS und T Peaks) als Funktion des Winkels θ . Fit - Analyse zu einem Modell von hexagonal symmetrischen elastischer Feststoff 7 - Gleichungen A1 und A2 unter - stellt die fünf Komponenten des Elastizitäts Tensor trockenen trypsinverdauten Typ - I - Kollagen - Fasern (Tabelle 1).

    9 gegeben

    Gleichung 1 , (A1)

    Gleichung 2 , (A2)

    wobei ρ die Dichte des Materials ist, und c 11, c 33, c 44 und c 13 sind vier der fünf elastischen Konstanten , die Systeme mit einer hexagonalen Symmetrie charakterisieren. Die fünfte Konstante, c 12, kann von der ungefähren Beziehung c 12 ~ c 11 abgeleitet werden . - 2 c 44 7

    Die Koeffizienten sind jene, die zuvor von ungereinigtem Kollagen fibe erhalten ähnlichrs. 9 einen spürbaren Unterschied tritt für den Koeffizienten c 13 , die in ähnliche Werte der Elastizitätsmodul E ǁ und E reflektiert wird Aufrecht (Etwa 7,2 und 7,7 GPa) für das gereinigte Kollagen.

    5 ist eine graphische Darstellung der longitudinalen akustischen Wellengeschwindigkeit des nassen Collagen gegen θ . In diesem Fall ist keine periodische Änderung der Frequenz beobachtet, eine konstante Geschwindigkeit in der Störung zu geben. 6 zeigt die Spektren von trockenen und hydratisierten Elastinfasern bei θ = 0 ° gemessen. Transversale Moden wurden für diese Proben nicht nachgewiesen. In trockenen Elastin, tritt der größte Peak bei 16,8 GHz , während die PS - Modus bei 8,2 GHz 9 (13 und 20% niedriger als die entsprechenden Spitzen von trockenem Kollagen). Wet Elastinfasern stellen eine Masse peak in (12.30 ± 0.01) GHz (37% niedriger in der Frequenz als der Schütt peak trockenem Elastin). Die PS-Modus von nassen Elastin ist im Spektrum nicht offensichtlich wegen der intensiven tail des elastischen Peak bei diesen Frequenzen. Auf der anderen Seite wird der Peak bei ca. 7,5 GHz an die Wassermasse zurückgeführt.

    Abbildung 7 zeigt die Abhängigkeit der Schallwellengeschwindigkeit in trockenem Elastin Faser auf θ. Aus diesen Daten wurden die Elastizität Tensorkomponenten (und mechanischen Moduli) erhalten (Tabelle 1). Wie in 9 nassen Collagen, gibt es Hinweise auf die Isotropie der mechanischen Modul von hydratisiertem Elastinfasern. Diese Ergebnisse zeigen, wie Brillouin-Spektroskopie relevanten Informationen über die Steifigkeit, die Zusammensetzung und strukturelle Aspekte eines Materials geben kann.

    Abbildung 1
    FiAbbildung 1. akustische und optische Phononen in eindimensionalen Kette von Atomen. Schematische Darstellung von akustischen und optischen Schwingungen in einem eindimensionalen zweiatomige Kette. Atome aufweisen Masse m 1 und m 2 und werden abgewechselt. Die Pfeile zeigen die Verschiebungen der Atome. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 2
    Abbildung 2. Brillouin - Spektren von Trypsin-gereinigten Typ - I - Kollagenfasern aus der Rattenschwanzsehne. Spektren von (A) und Trockenfaser (B) hydratisiert Faser von VV Messungen bei unterschiedlichen Winkel zur Faserachse θ in Grad. Ein Spektrum von reinem destilliertem Wasser wird ebenfalls gezeigt. Die Spektren wurden auf die Intensität (Höhe) des Schütt peak normalisiert. Etiketten B und PS bezeichnen Peaks in Bezug auf Masse und parallel zu Oberfläche Modi, respectively. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (Quadratwurzel Anzahl der Zählungen). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 3
    Abbildung 3. Brillouin - Spektrum von trockenem Trypsin-gereinigten Kollagen Typ I - Fasern aus Rattenschwanzsehnen. Spektrum aus einer VH - Messung bei θ = 30 °. Etiketten T, PS und B bezeichnen Peaks bezogen auf Quer-, parallel zur Oberfläche und Bulk-Modi, respectively. Die Ergebnisse der Fit-Analyse einen gedämpften harmonischen Oszillator (DHO) Modell für beide T und PS-Modi sind ebenfalls dargestellt. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (Quadratwurzel Anzahl von Zählungen)./54648fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 4
    Abbildung 4. Auftragung der Schallwellengeschwindigkeit in trockenen Trypsin-gereinigten Kollagens vs Winkel zur Faserachse. Längs- und Querschallwellengeschwindigkeiten von trockenen Kollagenfaser aus fit Analyse der Brillouin - Peaks abgeleitet. Die Daten werden zu einem Modell aus hexagonal symmetrischen elastischer Feststoff ausgestattet. Rote Linie: Gleichung A1 (R 2 = 0,99); blaue Linie: Gleichung A2 (R 2 = 0,36). Fehlerbalken zeigen die Standardfehler aus der Quadratwurzel der Diagonalelemente der Kovarianzmatrix erhalten , nachdem ein Levenberg-Marquardt nicht - lineare Anpassung der kleinsten Quadrate Brillouin - Spektren. Bitte klicken Sie hier um eine größere versi anzuzeigen auf dieser Figur.

    Abbildung 5
    Abbildung 5. Plot der Längsschallwellengeschwindigkeit in nassen Trypsin-gereinigten Kollagens vs Winkel zur Faserachse. Longitudinal Schallwellengeschwindigkeit von hydriertem Kollagenfaser aus fit Analyse der Brillouin - Peaks abgeleitet. Die Zeile ist ein Leitfaden für das Auge und gibt den Mittelwert der Schallwellengeschwindigkeit in diesem Bereich. Fehlerbalken zeigen die Standardfehler aus der Quadratwurzel der Diagonalelemente der Kovarianzmatrix erhalten , nachdem ein Levenberg-Marquardt nicht - lineare Anpassung der kleinsten Quadrate Brillouin - Spektren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    jpg "/>
    Abbildung 6. Brillouin - Spektren von Elastin - Fasern aus Rindernackenband. Spectra von trockenen und hydrierten Faser bei θ = 0 °. Die Spektren wurden auf die Intensität (Höhe) des Schütt peak normalisiert. Etiketten B und PS bezeichnen Peaks in Bezug auf Masse und parallel zu Oberfläche Modi, respectively. B F und B W beziehen sich auf die Masse Spitzen der Faser bzw. Wasser. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (Quadratwurzel Anzahl der Zählungen). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    7
    Abbildung 7. Plot der Längsschallwellengeschwindigkeit in trockenen Elastin vs Winkel zur Faserachse. Longitudinal Schallwellengeschwindigkeit von trockenem Elastin fiber von Fit-Analyse der Brillouin-Peaks abgeleitet. Die Daten werden zu einem Modell aus hexagonal symmetrischen elastischer Feststoff ausgestattet. Rote Linie: Gleichung A1 9 (R 2 = 0,74). Fehlerbalken zeigen die Standardfehler aus der Quadratwurzel der Diagonalelemente der Kovarianzmatrix erhalten , nachdem ein Levenberg-Marquardt nicht - lineare Anpassung der kleinsten Quadrate Brillouin - Spektren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Supplemental 1

    Figur SI-1. Schematische Darstellung des Brillouin - Set-up und BLS Streugeometrie. (A) Das Licht , von einem Festkörperlaser emittiert wird , auf die Probe durch eine achromatische Linse geschickt. Das Licht, das von akustischen Volumen Phononen gestreut und durch die aus refl resultierendenection von Licht an der Substratoberfläche, die in Kontakt mit der Probe ist, wird durch die Linse gesammelt, gefiltert durch ein Tandem-Multi Fabry-Perot-Interferometer und durch einen Photomultiplier detektiert. FP1 und FP2 zeigen die beiden Interferometern das Tandem Set-up bildet. Ein Polarisator wählt die Polarisation des einfallenden Lichts, und ein Analysator verwendet wird, um die Polarisation des gestreuten Lichts auszuwählen. (B) BLS Geometrie mit einer Probe in Kontakt mit der Oberfläche eines reflektierenden Siliziumsubstrat. Ein Glasobjektträger (nicht gezeigt) ist oberhalb der Probe angeordnet, um die Kammer abzudichten, und mit leichtem Druck an den Ecken des Substrats durch pads aufgetragen. Das einfallende Licht (k i) durch die Linse, an der Luft-Proben - Grenzfläche gebrochen wird (k 'i) und konzentrierte sich auf die Probe-Substrat - Grenzfläche. Das gestreute Licht durch die gleiche Linse gesammelt (k 's) ergibt sich aus der Interaktion mit den beiden Bulk - Phononen (qb) und die Reisen PS der Probe (q n). . Winkel zwischen den Richtungen des Lichts und der Normalen zu der Oberfläche als Φ und Φ 'bezeichnet (C) Schematische Darstellung der Probe und des angenommenen Koordinatensystems; z definiert die außerordentliche Achse parallel zur Richtung der Fasern. Winkel θ und α sind die zwischen der Richtung der Phononen q s und q b zu der z -Achse bzw. k i, k 'i, k s, k' s:. Wellenzahlen von dem einfallenden und gestreuten Licht; q b, q s, Wellenvektoren der Masse und PS - Modi sind. (Nachdruck aus Lit. 9.) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Tabelle 1 Elastic Tensorkoeffizienten abgeleitet von Fit - Analyse der akustischen Wellengeschwindigkeiten Elastic Tensorkoeffizienten trockenem Trypsin-gereinigten Typ - I - Fasern Kollagen (. diese Arbeit) und Elastin-Fasern (ref 9).

    Sample Elastizitätskoeffizienten (GPa)
    trypsinverdauten Kollagen c 33 18,7 ± 0,1
    c 11 14,4 ± 0,2
    c 44 3,4 ± 0,1
    c 12 7,2 ± 0,2
    c 13 11,2 ± 0,3
    Elastin c 33 11,5 ± 0,2
    c 11 10,4 ± 0,1
    c 44 1,9 ± 0,2
    c 12 6,6 ± 0,2
    c 13 6,8 ± 0,3

    Discussion

    Brillouin-Streuung-Spektroskopie ist ein einzigartiges Werkzeug, mit dem die einzelnen Komponenten des Elastizitäts Tensor eines Proteins Faser kann in bisher unerreichter Genauigkeit charakterisiert werden. Darüber hinaus können die Messungen in einem mikroskopischen Maßstab und dadurch wird uns vorgenommen werden schaffen, mit neue Einblicke in die Mikromaßstab Mechanik biologischer Strukturen, so dass wir zum ersten Mal, um die mechanische zu verstehen, und wahrscheinlich funktionell Bedeutung der Komplexitäten in Matrix-Architektur und Biochemie, die in den letzten Jahren aufgedeckt wurde.

    Die Technik misst die mechanischen Eigenschaften in einem GHz-Frequenzbereich. Diese Domain wurde noch nie zuvor für die strukturelle Biopolymere erforscht und es sowohl hebt und stellt die Mittel grundlegende Fragen über die molekularen Mechanismen der Elastizität zu beantworten.

    Wir beschrieben die Schritte Kollagen und Elastin-Fasern aus tierischen Geweben zu extrahieren und Brillouin scatteri zu messenng Spektren ein reflektierendes Substrat verwendet die vollständige Beschreibung von Faser Biomechanik zu erreichen. Kritischen Schritte in dem Protokoll sind solche, die gewährleisten, dass gereinigte Fasern erhalten werden und geeignete Versuchsbedingungen bestehen für reproduzierbare Messungen der Faserproteine. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass die Extraktionsverfahren, die mechanischen Eigenschaften der Fasern modifizieren kann.

    Modifikationen der Technik betreffen die Kopplung mit der optischen Mikroskopie für microfocused Brillouin - Streuung und Abbildung 13 und die mögliche Kombination mit komplementären Techniken Ansätze (zB Raman - Streuung). Aktuelle Anwendungen der Technik sind vor allem auf excised biologischen Materialien konzentriert, aber wichtige Entwicklungen, beispielsweise solche auf Basis von 14 mehrere VIPA Etalons machen möglich , die Übersetzung dieser Technik aus der Benchtop an das Bett mit einer Reihe von Anwendungen , die bereits Dämonstrated 15,16 einschließlich Potenzial in vivo - Anwendungen. Die VIPA Ansatz ist eine Alternative zu dem, was wir beschreiben; es hat schnellere Erfassungszeit, ist aber nicht unbedingt geeignet im Falle von lichtundurchlässigen Proben, wie sie hier untersucht. Darüber hinaus ist die Verwendung eines reflektierenden Substrats nicht praktisch in Set-ups, die die VIPA Etalons verwenden, da ihr Kontrast nicht ausreichen würde, die quasi-elastische Licht abzulehnen. Einschränkungen der Geschwindigkeit des Erwerbs eines spektralen Datensatzes bezogen und die von Natur aus schwach Streuquerschnitt des Materials kann aus der Tiefe Gewebe Anwendungen dynamische biologische Systeme und auf den Erwerb von Daten beschränken, sondern technische Raffinessen auf die aktuelle Leistung verbessern kann.

    BLS verspricht ein wichtiges Instrument in grundlegenden biophysikalischen Forschung auf der extrazellulären Matrix zu sein und damit neue Einblicke in die Evolution der mechanischen Eigenschaften während der Matrix Wachstum und ihren Verlust in pathologischen produzierenDegeneration. Allerdings ist es wichtig , sich daran zu erinnern , dass die Messungen nicht - invasive sind und könnten daher in vivo durchgeführt werden. Tatsächlich hat dies bereits in der Hornhaut 16 und eine solche Arbeit erreicht worden für die Entwicklung neuer Diagnoseinstrumente für ein breites Spektrum von Erkrankungen des Bindegewebes , eine Plattform zur Verfügung stellen kann.

    Ultraschall-Elastographie und Rasterkraftmikroskopie (AFM) sind alternative Methoden der mikromechanischen Messung, aber die BLS-Technik bietet eine bessere räumliche Auflösung (auf subzellulärer Skala) als die alte und, im Gegensatz zu AFM erlegt keine mechanischen Kräfte auf die Probe und ist nicht beschränkt auf die Analyse nur von Oberflächenmerkmalen. Brillouin-Module von Kollagen und Elastin sind im GPa-Bereich, während Young-Module von makroskopischen Stämmen in der Größenordnung von MPa sind (weitere Einzelheiten werden an anderer Stelle berichtet). Dieses Ergebnis zeigt einen differentiellen Elastizitätsmodul mit einer starken Abhängigkeit von der Anregungsfrequenz aufgrunddas viskoelastische Verhalten der Fasern. BLS kann auf ein breites Spektrum von Problemen und Materialien, die in der biomedizinischen Wissenschaft angewendet werden. Es kann auf molekularer Ebene ein physikalisches Werkzeug für das grundlegende Verständnis der Materialien und Wechselwirkungen in Beantwortung von Fragen auf die Physiologie und Pathologie von biologischen Geweben sowie bereitzustellen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C2905
    Tris Buffer Fluka 93358
    Sodium Acetate Fisher Scientific S608-500
    PBS Sigma-Aldrich P4417
    Sodium Azide Fisher Scientific S2002
    Streptomyces Hyaluronidase  Sigma-Aldrich H1136-1AMP
    Sodium Chloride Fisher Scientific S7653
    Trypsin Sigma-Aldrich T4665
    Sodium Phosphate Sigma-Aldrich S9638
    Sodium Hydroxide Fisher Scientific S320-500
    Pure Water Millipore ZRQS0P3WW Produced in-house
    Distilled Water Bibby Scientific Limited D4000 Produced in-house from water still
    Euthatal Merial  J01601A 
    Tandem Interferometer TFP-1 JRS Scientific Instruments
    Freezer Lec TU55144
    Refrigerator Zanussi ZBA15021SA
    Hot Plate Fisher Scientific SP88857206
    Clamps VWR 241-7311 & 241-7201
    Clamp Stand VWR  241-0093
    Thermometer Fisher Scientific 13-201-401
    Cling Film Sainsbury's 7650540
    Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
    Silicone IDB Technologies N/A No catalogue number. Order upon request.
    Cover Glass VWR 631-1571
    Conical Flask VWR 214-1175
    Beaker VWR 213-0469
    Measuring Cylinder VWR 612-3838
    Vial VWR 548-0051 & 548-0863
    Petri Dish VWR 391-0441
    Scalpel Swann Morton Ltd  0914 & 0308
    Diamond Scribe RS Instruments 394-217
    Soldering Iron RS Instruments 231-5332
    Fine Forceps VWR 232-0188
    Double Micro-Spatula VWR Various Sizes
    pH Meter Hanna Instruments HI-2210-02
    Orbital Shaker IKA  0002819000

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Brillouin, L. Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l'agitation thermique. Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).
    2. Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials. J. Chem. Phys. 141, (21), 214901 (2014).
    3. Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids. Soft Matter. 8, (15), 4235-4243 (2012).
    4. Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D. Solid State Physics. Robert, E. C., Robert, L. S. 63, Academic Press. 1-77 (2012).
    5. Madami, M., et al. Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque. Nat. Nanotechnol. 6, (10), 635-638 (2011).
    6. Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle. Nature. 267, (5608), 285-287 (1977).
    7. Cusack, S., Miller, A. Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering. J. Mol. Biol. 135, (1), 39-51 (1979).
    8. Vaughan, J. M., Randall, J. T. Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye. Nature. 284, (5755), 489-491 (1980).
    9. Palombo, F., et al. Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering. J. R. Soc. Interface. 11, (101), (2014).
    10. Sivan, S. S., et al. Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs. Biochem. J. 399, (1), 29-35 (2006).
    11. Leon, W. C. Methods in Enzymology. 144, Academic Press. 196-214 (1987).
    12. Fioretto, D., Scarponi, F. Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering. Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).
    13. Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy. Analyst. 139, (4), 729-733 (2014).
    14. Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Express. 19, (11), 10913-10922 (2011).
    15. Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101, (6), 1539-1545 (2011).
    16. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Express. 20, (8), 9197-9202 (2012).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Video Stats