纳米丝绸制造和药物输送应用

Bioengineering

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Summary

纳米颗粒正在成为有希望的药物递送系统用于范围广泛适应症。在这里,我们将介绍使用逆向工程桑蚕丝制作蚕丝纳米颗粒的简单而有效的方法。这些丝的纳米颗粒可以容易地加载有治疗有效载荷,并随后探索用于药物递送应用。

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Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).

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Abstract

丝是用于生物医学和制药应用的有前途的生物聚合物,由于其优异的机械特性,生物相容性和生物降解性,以及它的保护和随后释放其有效载荷响应于触发的能力。而丝可以配制成各种材料的格式,丝绸纳米颗粒正在成为有希望的药物递送系统。因此,本文涵盖了逆向工程丝茧的步骤以产生可用于产生稳定的丝纳米粒子的再生丝溶液。这些纳米颗粒随后被表征,药物加载并探索作为潜在的抗癌药物递送系统。简要地说,丝茧反向首先通过脱胶茧工程化,随后丝溶解和清理,得到水性丝溶液。接下来,再生丝溶液进行纳米沉淀产生的丝绸纳米粒子 - 一个简单而有效的方法产生均匀的纳米颗粒。根据它们的大小,ζ电位,形态和稳定在水介质中,以及其对截留化疗有效载荷和杀死人乳腺癌细胞的能力的丝的纳米颗粒的特征。总体而言,所描述的方法产生可以容易地探索应用无数均匀丝纳米颗粒,包括它们作为潜在的纳米使用。

Introduction

纳米尺寸的药物递送系统通常用来控制药物释放和递送多样化的治疗有效载荷 - 例如,蛋白质,肽和小分子量药物 - 靶细胞和组织。这些治疗的有效载荷常常结合到各种大分子药物载体,例如脂质体,水溶性聚合物(包括树枝状聚合物),以及微颗粒和纳米颗粒1。纳米颗粒(典型地在1纳米至1000纳米的粒度范围)被广泛作为潜在的药物载体,特别是用于抗癌药物递送2。成功引入Abraxane的的(装载紫杉醇120nm的尺寸的基于白蛋白的纳米颗粒)放入常规临床实践3已经催化的领域中,以便用于药物递送更多的纳米颗粒正在进入临床试验4。实体瘤一般显示较差淋巴引流,并有漏水的血管,这意味着是n高达200纳米anoparticles将被动地定位到静脉给药这些肿瘤。这种被动靶向现象被称为增强的渗透性和保留(EPR)效果,并在1986年5首次报道该EPR效应可导致50到100倍的增加中的药物浓度在肿瘤微环境中对于给定的药物剂量时药物有效负荷使用大分子药物载体的方法,而不是无药无承运人交付。设计用于抗癌药物递送载药纳米颗粒具有到达肿瘤微环境和通常必须输入特定的胞内区室,通常通过内吞摄取,用于药物,以实现其所需的治疗效果3。设计用于细胞内药物递送的纳米颗粒利用内吞作为网关进入细胞,以及克服耐药机制的路由。从纳米粒子药物释放往往是专门邻CCur函数在溶酶体( ,溶酶体药物递送)6,其中该纳米颗粒载体的pH响应性(溶酶体pH值约4.5)可以用作触发药物释放或溶酶体酶从载体7释放有效载荷。

许多不同类型的材料可以用于产生纳米颗粒( 例如,金属和许多有机和无机材料)。然而,生物聚合物不断涌现,因为他们已知的生物相容性,生物可降解性和低毒性8吸引力的材料。许多生物聚合物正在探索,其中包括白蛋白,海藻酸钠,壳聚糖和丝绸。其中,丝绸已成为一个有前途的竞争者发展注入药物输送系统9。各种类型的丝绸是由一些节肢动物,包括蜘蛛( 例如络clavipes)和蚕( 例如家蚕生产)。蚕丝被使用更为分配延长sively比蜘蛛丝,因为蚕驯化充分,因此,其丝绸代表重现的原料。蚕丝是食品和药物管理局(FDA)批准的材料供人类使用,特别是作为一个缝合材料;它在人类中健壮的安全记录,并已知在体内 10降解。丝的降解轮廓可以微调以从小时(低结晶丝),以12个月或以上(高结晶丝)的范围内。丝降解产物是无毒的并且在主体10中被代谢。丝绸结构赋予结合小分子量化合物和大分子蛋白药物11的能力,使其成为一个好材料药物控释。蛋白质药物( 例如,抗体)易受变性,聚集,蛋白水解裂解和清除由免疫系统。然而,丝稳定的治疗性蛋白质,由于其纳米晶重的缓冲能力gions及其在纳米尺度11来调整水分的能力。这些独特的功能提供人身保护,并降低流动性的有效载荷11和通常不与其他(生物)聚合物看到。许多抗癌药物递送系统,例如基于丝的水凝胶12,薄膜13-15和纳米颗粒16,17,现在已经开发了利用这些特征(参考文献18,19中综述)

此处,丝纳米颗粒通过确定在延长的时间帧的大小和电荷特征。阿霉素,临床相关的抗癌药物,被用来作为在用载药丝纳米颗粒处理过的三阴性人类乳癌细胞对药物装载和细胞毒性的研究模型药物。

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Protocol

1.从家蚕蚕茧反向工程的丝溶液的制备

注:此方法是基于其他地方12,27描述的协议。

  1. 5切断克干蚕茧用剪刀分成5 x 5毫米件。卸下所有脏层。
  2. 称出4.24克碳酸钠和小心添加此2升沸腾蒸馏水的。
    注意:这产生了0.02 2M碳酸钠溶液。
  3. 切件茧添加到沸腾的碳酸钠溶液煮沸60分钟,脱胶的蚕丝纤维。炒出的丝绸偶尔确保均匀样加工。
  4. 除去脱胶的丝,用20分钟1升的蒸馏水洗净;重复洗涤步骤至少3次。
  5. 取出水洗丝和挤压它很好地去除多余的液体,然后解开/用手拉丝。放置解开丝绸在通风橱中空气干燥过夜。这通常会产生3.6克脱胶的S之流纤维。
  6. 第二天,称量满分5 G空气干燥的脱胶丝纤维和紧密包装丝到50ml烧杯的底部。
  7. 准备一个新鲜的9.3中号溴化锂溶液。用一根1G的丝绸〜4毫升溴化锂比例溶于溴化锂丝纤维。用铝箔覆盖丝溴化锂样品以防止蒸发,并允许丝完全溶解在60℃。这一步需要长达4小时,并通过搅拌偶尔帮助。
  8. 润湿在水中的透析盒(3,500道尔顿分子量截留)5分钟。注入15ml的所述丝溴化锂溶液进入15毫升透析盒和使用针和注射器,以除去任何气泡。
  9. 透析针对1升蒸馏水,并在1,3和6小时( ,在第一天3的变化),并再次在第二天早晨和晚上( ,2的变化的第二天),并再次改变水第二天早上( 1变第三天)。
  10. 收集丝绸soluti从透析盒,离心20分钟,在5℃下以9500×g的溶液。恢复上清,两次重复此过程离心。
  11. 确定空称量船(W1)的重量和加入1毫升丝溶液。再次(W2)记录重量,然后通过使在60ºC称量舟过夜干燥样品。接下来,确定的总干重(W 3)(干燥丝和称量船)。丝溶液的浓度(重量/体积)为:(%)=(W3-W1 / W2-W1)×100。

从反向工程丝溶液丝绸纳米2.准备工作

  1. 添加5%(重量/体积)丝溶液滴加到丙酮,同时保持> 75%(体积/体积)丙酮溶液。例如,添加9mL经5%(重量/体积)丝溶液滴加至34毫升丙酮(以50滴/分钟的速度10微升/滴)。
  2. 离心沉淀物以48000×g离心在4℃下2小时。
  3. 吸出上清液,重悬PELLE吨蒸馏水通过首先用刮刀松脱沉淀,然后加入20ml蒸馏水。用枪头从锅铲去除沉淀。使用的超声波探头,在30%的幅度,持续30秒,20秒,随后由两个超声处理周期涡旋,顶部向上离心管以用蒸馏水后容量。
  4. 重复离心和再悬浮步骤至少两次。
  5. 悬浮在蒸馏水中,如在4℃直至使用在2.3和存储详述6毫升沉淀。对于细胞培养研究,纳米丝绸个股可以伽马辐射17。

3.丝绸纳米浓度测定

  1. 离心机丝纳米颗粒以48,000 xg离心在4℃下2小时。
  2. 收集所有纳米颗粒在3毫升的蒸馏水,然后由两个超声处理周期,在30%的幅度,持续30秒。
  3. 除以3 ml储备丝纳米颗粒于2ml和1ml地段并转入公关电子称重2ml管。记录2 ml样品的总重量。存储1ml的很多在4℃直至使用;此1ml样品将被用于产生校准曲线。
  4. 捕捉冻结,然后在一夜之间冻干2 mL萃取丝绸纳米很多冷冻干燥机。冷冻干燥后,重新称重2毫升管和计算蚕丝纳米颗粒(毫克),该最初2 ml样品中的存在量。
  5. 稀释1ml的丝的纳米颗粒的库存用蒸馏水,以产生一个5点标准曲线(0.04-7毫克/毫升)。保证样品不超过最大吸光度。
  6. 确定在600nm每标准稀释的吸光度。这是通过使用一个96孔板设置最佳完成。情节吸光度与浓度(mg / ml)的标准曲线。然后用这个标准曲线定期确定丝绸纳米粒子悬浮液中的浓度。

4.负载阿霉素的丝绸纳米颗粒的制备

  1. 溶解1.2毫克阿霉素HCl的蒸馏水加8毫升
  2. 补至10ml,用蒸馏水,得到的116微克/毫升(0.2微摩尔/毫升)的工作原液。
  • 负载阿霉素的丝绸纳米颗粒的制备
    1. 混合料2毫升0.2微摩尔/毫升阿霉素的溶液用200μl的10,30或50mg /在一个2毫升管毫升丝纳米颗粒。
    2. 在室温下孵育(25℃)过夜在旋转混合器丝 - 阿霉素悬浮液。
    3. 接下来,离心丝绸阿霉素在悬挂194,000 XG 30分钟。用蒸馏水洗涤负载阿霉素的纳米粒子的丝绸和重复此过程两次。
    4. 池上清液并注意的总体积(该样本被用于确定包封效率)。
    5. 悬浮负载阿霉素的纳米颗粒丝在蒸馏水中,从光并存储保护在4ºC未直到使用。
  • 包封率和载药量的测定
    1. 吸取200微升从步骤4.2.4上清变成了黑色微孔板。
    2. 使用荧光酶标仪在一个固定的光电倍增管设置测量阿霉素相关的荧光。
    3. 激发波长到485纳米,发射波长设置为590nm处并记录荧光值。
    4. 产生阿霉素的校准曲线。保证测量获得具有相同仪器设置( 即,具有固定的光电倍增管设置)。使用校正曲线,在合并上清液计算阿霉素浓度。在三个独立的实验重复这种测量。
    5. 用公式(1)确定包封率:
      式(1)
  • 5.表征丝绸纳米粒子

    1. 新鲜制备和贮存丝绸纳米粒子的尺寸和Zeta电位的评价。
      1. 在蒸馏水商店丝纳米颗粒在4℃和25℃。
      2. 测量丝的纳米颗粒上使用动态光散射(DLS)天0,14和28的大小和ζ电位。设置折射率1.33蒸馏水和1.60蛋白17。计算粒径与所述用户界面的软件。
    2. 丝绸纳米粒子的形态评价用扫描电子显微镜(SEM)。
      1. 放置一个碳粘合剂光盘上的SEM存根并随后附加的硅晶片。
      2. 稀释丝纳米至1mg / ml的浓度。移取10微升样品在硅晶片上的,冷冻在-80℃下的样品和冻干过夜使用冷冻干燥系统按照制造商的说明。
      3. 涂层用金样品层达20纳米厚使用低真空溅射镀膜机。
        注:仪器设置模式之间变化。这里使用的模型是完全自动化的并且仅由厚度进行操作。
      4. 图像样品在5kV的扫描型电子显微镜和40,000倍的放大倍率。

    6. 控制的体外细胞毒性和负载阿霉素的纳米丝绸

    1. 细胞活力暴露于纳米丝绸。
      1. 培养的MDA-MB-231细胞在RPMI 1640有10%v / v的FBS。组织培养板的细胞处理的聚苯乙烯,并在37℃下在湿润的5%的CO 2气氛孵育。在80%汇合常规传代培养每2-3天。
      2. 板的MDA-MB-231细胞在96孔板一个2×10 4个细胞/ cm 2的密度。使细胞恢复过夜。
      3. 加(ⅰ)0.001微克自由扩散阿霉素,(ⅱ)0.001〜0.5毫克丝纳米颗粒和0.1mg丝纳米颗粒装载有0.001微克的阿霉素为96孔板(最终体积每孔100μl)。
      4. 确定细胞存活力,并通过加入(3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-2,5-二苯基溴(MTT 5毫克/ PBS中)溶液在72小时的半最大抑制浓度(IC 50)。孵育5小时,小心地排出孔用吸管和溶解用100μl二甲基亚砜的甲,测量560nm处的吸光度。在三个独立的实验重复这种测量。
        注:未处理的对照组的吸光度值作为100%细胞生存力的基准值。
    2. 暴露于纳米丝绸细胞SEM。
      1. 以2×10 4个细胞/ cm 2的密度种子的MDA-MB-231细胞在无菌盖玻片。使细胞恢复过夜。露出元到达所希望的处理条件为72小时。
      2. 固定用PBS中2%的V / V戊二醛细胞30分钟,用二洗平息两次水,脱水用乙醇系列,以及临界点干燥的样品,其他地方28详述。
      3. 溅射涂层用金样品层高达20nm厚使用低真空溅射镀膜机。
        注:仪器设置模式之间变化。这里使用的模型是完全自动化的并且仅由厚度进行操作。
      4. 图片使用5千伏和700倍的放大倍率的电子加速通过SEM样品。

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    Representative Results

    进行统计学分析数据如以前17详细说明。用于随后的Bonferroni的多重比较事后检验对多个样品采样对和方差(ANOVA)的单向分析的学生t检验。一个星号表示统计显着性,如下所示:* P <0.05和** P <0.001。所有数据表示为平均值±标准差(SD)和在括号中的数字表示的独立实验的数目。

    再生丝溶液的制备,随后滴加到丙酮中,产生通过纳米沉淀丝纳米颗粒( 图1)。这种方法产生了均匀的(多分散性指数:0.1),球形,丝绸纳米颗粒(106.5毫微米±1.1)带有负的表面电荷(-49.57毫伏±0.6)( 图23)。丝绸纳米粒子ST在水分的能力通过监测颗粒尺寸,zeta电位和形态( 图23)评价长达28天。在28天的储存期,在任4℃或25℃,在颗粒大小,电荷( 图2)或形态无显著变化观察到( 图3)。

    阿霉素用作药物装载一个临床相关的化疗模型药物和体外细胞毒性研究。三种不同的丝的纳米颗粒浓度(10,30和50毫克/毫升)被用来评估丝纳米颗粒的药物负载能力。为10,30和50毫克/毫升丝纳米颗粒中的阿霉素包封效率( ,2,6或10mg丝和阿霉素的232微克)为73±2.2 87±1.8和97±0.2%,分别为( 图4A )。粒径和多柔比星 - 低的ζ电位交锋丝纳米颗粒(10毫克)进行测定并与10毫克丝纳米颗粒控制。粒度载药量( 图4B)之后,也没有发生变化,而负载阿霉素的丝纳米粒子的ζ电位显著从49.57±0.6毫伏降低至43.52±0.37毫伏( 图4C)。

    载药丝纳米颗粒的递送阿霉素并随后杀死癌细胞的能力, 在体外进行了评估。人乳腺癌MDA-MB-231细胞暴露于丝纳米颗粒,自由扩散阿霉素或负载阿霉素的丝纳米颗粒。细胞活力,一个72小时的曝光时间后评估。自由扩散阿霉素和负载阿霉素的丝纳米颗粒的IC 50值分别为0.48微克/毫升和0.24微克/毫升,分别同时蚕丝纳米颗粒具有的IC 50> 5毫克/毫升( 图5A)。在相当于药物剂量为0.1μg的,自由扩散阿霉素和负载阿霉素的纳米颗粒丝中的分别为83±11和65±11%,( 图5B)的细胞活力引起显著下跌。然而,自由扩散阿霉素显示出比负载阿霉素的纳米颗粒丝大幅度更大的细胞毒性。这些定量测量通过定性SEM成像( 图5c)证实。这里,对照培养物表现出较高的细胞密度和一个为主的间充质的MDA-MB-231型;类似的意见被暴露于纳米丝绸制成的文化。然而,暴露在阿霉素的文化表现出明显不同的细胞表型。在相当于阿霉素的剂量,MDA-MB-231细胞与自由扩散阿霉素和负载阿霉素的纳米颗粒丝处理表现出细胞数大幅减少。此外,许多细胞有非常广泛和分散形态。文化EXPosed到负载阿霉素的纳米颗粒丝显示出与质膜( 图5C)相关联的纳米颗粒(及其聚合物)的证据。

    图1
    图1:关键步骤生成反向工程解决方案的丝绸和丝绸纳米粒子首先,丝茧反被他们切断,然后脱胶60分钟( 沸腾)得到脱胶蚕丝纤维工程将纤维溶解在9.3中号溴化锂,然后在水中透析72小时。含水5%w / v的丝溶液是用来产生丝纳米颗粒。滴加丝成丙酮导致丝绸纳米沉淀。丝绸纳米粒子洗净并收集备用。 请点击此处查看这个大版本数字。

    图2
    图2:尺寸和丝绸纳米颗粒的电荷特性的粒子的大小和在4℃丝纳米颗粒的ζ电位和25℃下28天。 ±SD;误差棒情节符号中时隐时不可见,N = 3。 请点击此处查看该图的放大版本。

    图3
    图3:保存在4℃至25℃的丝绸纳米粒子的质量评估在28天丝绸纳米粒子用扫描电子显微镜成像(比例尺= 1微米)。 PLEASE点击此处查看该图的放大版本。

    图4
    图4:负载阿霉素的纳米颗粒丝表征(DOX的SNPs)的 (A)的封装响应于不同量的丝的纳米粒子(SNPs)的232微克的阿霉素的效率 2,6和10毫克丝纳米颗粒。为10毫克和5mg丝纳米颗粒中的包封效率相比至2mg丝纳米颗粒时显著增加。 (B)的粒径和(C)zeta电相比,控制丝的纳米颗粒负载阿霉素的丝的纳米颗粒的电势(10毫克丝纳米颗粒)。统计学上采样对显著差异用学生t检验确定。多个样品通过单向ANOVA,随后的Bonferroni的多重比较事后检验评估; * P&#60; 0.05,** P <0.001±SD;误差棒的情节符号中时隐时不可见,N = 3。 请点击此处查看该图的放大版本。

    图5
    图5: 丝纳米颗粒和在人乳腺癌细胞负载阿霉素的丝纳米颗粒的 体外 细胞毒性 (A)的细胞与丝纳米颗粒(SNPs)的一个72小时的治疗周期后的MDA-MB-231细胞的存活力(0.01-5毫克 /毫升);每孔体积为100微升。 (B)的用0.1mg丝纳米粒子的72小时的治疗周期后的MDA-MB-231细胞的细胞生存力,0.1微克自由扩散的阿霉素(阿霉素)或0.1mg丝纳米颗粒装载有0.1微克的阿霉素(阿霉素-SNPS)。与对照相比,当细胞存活率统计学上降低了暴露于0.1微克自由扩散的阿霉素和0.1mg装入0.1微克的阿霉素的丝纳米以下。暴露于(ⅰ)培养基(对照)的MDA-MB-231细胞,(ⅱ)0.1毫克丝纳米颗粒,(ⅲ)0.1微克自由扩散阿霉素,和(iv)负载阿霉素的丝的纳米颗粒在(C)的SEM图像等效剂量(比例尺= 50微米)。通过单向ANOVA,然后通过Bonferroni法的多重比较事后检验,NS =不显著,* P <0.05,** P <0.001进行统计分析,±SD;误差棒的情节符号中时隐时不可见,N = 3。 请点击此处查看该图的放大版本。

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    Discussion

    各种方法可用来生产丝纳米颗粒,包括聚乙烯醇共混20,喷雾干燥21,盐析22,毛细管网点印刷23,超临界CO 2的沉淀24和纳米沉淀16,25(参照26中综述)。然而,纳米沉淀,由于其整体简单,是用于产生丝纳米颗粒的最流行的技术。因此,本研究的目的是要应用纳米沉淀到反向工程丝来制造基于丝的纳米颗粒,可用于各种应用,包括溶酶体抗癌药物递送。

    在过去十年中,纳米沉淀已成为对基于蛋白的纳米颗粒29的生产中最常用的方法之一。我们的研究组16,17和其他25,26,30,31已成功地应用这个技术术丝绸;在这里,我们提出了一个简单而强大的逐步协议丝绸纳米粒子的生成。丙酮纳米沉淀产生,其在大小均匀并在纳米尺寸范围典型地落在球形蚕丝颗粒。丙酮已成为优选的连续相超过溶剂如甲醇,乙醇,异丙醇和丁醇16,25。丙酮产生相比于亚稳100-200纳米尺寸存在于天然和再生丝溶液32球形胶束结构时,是具有水合水平降低纳米颗粒。然而,有范围探索以产生丝(纳米)颗粒具有潜在不同的特性,以与此处描述的溶剂混合物,并在脱胶时间的变化。这里所描述的协议利用丙酮作为连续相,这允许带负的表面电荷是均匀的球状纳米尺寸蚕丝颗粒(106.5±1.1纳米)的制造中(-49.5777; 0.6毫伏)和具有疏水性,结晶丝链16,17的紧密包装。总体而言,所描述的过程需要很少的手工操作时间,并从一个反向工程的水溶液丝溶液( 图1)产生丝纳米颗粒。一些本过程的主要功能包括使用60分钟脱胶丝,适当的液滴尺寸(约10微升/滴)和50滴/分钟的最大滴速率。遵守这些关键特性导致的14%的典型产率。这些纳米颗粒是坚固的,我们提供的证据表明,它们是稳定的,并且不超过28天贮存期改变它们的物理特性。然而,所描述的方法的一个潜在的警告是不存在,以产生在宽的尺寸范围内的颗粒( 即,从纳米生成粒子到微米尺度,同时保持窄的多分散性指数)。

    控制颗粒大小,电荷和形状为important用于药物输送,瞄准实体瘤33时尤为如此。在100纳米粒度范围是为肿瘤靶向新兴的理想人选。因此,100纳米大小的纳米蚕丝是潜在的竞争者作为抗癌药物输送系统为实体瘤的治疗。丝纳米颗粒具有负的表面电荷,这使得它们容易通过静电相互作用16的开采装带正电荷的药物。然而,除了电荷,也被称为另外的药物的特性( 例如,logD),以影响药物加载和释放34。在本研究中,阿霉素,一种弱碱性的抗癌药物,被选为模型药物候选者。载药量的研究( 图4)表明,增加导致增加阿霉素包封效率的丝纳米颗粒浓度; 10毫克的丝绸纳米粒子可以封装阿霉素232微克。丝绸的载药呐noparticles,反过来,产生具有一个显著减少表面电荷,这是直接的实验证据证实了阿霉素丝电荷相互作用是对于该特定药物载体结合重要丝纳米颗粒。

    我们先前提供的证据表明,丝纳米颗粒可以作为溶酶体药物递送系统16,17。在这里,我们显示了使用负载阿霉素的纳米颗粒丝来治疗人类乳腺癌MDA-MB-231细胞系的测试。这些细胞是从一个高度侵入三阴性乳腺癌衍生(ER - / PR - / HER2 - )是难以在诊所35对待。因此,在设计针对这类患者的药物递送系统,预计产量巨大的利益。在不存在药物负载的,丝纳米颗粒不影响细胞生存力(IC 50值> 5毫克/毫升)( 图5a,三 )。然而,在相等价的剂量,用自由扩散阿霉素比负载阿霉素的纳米颗粒丝( 图5b)观察显著更大的细胞毒性。自由扩散和颗粒结合药物的体外细胞药代动力学之间的差异解释这一观察。的自由扩散的药物可以通过扩散迅速地穿过质膜,而载药纳米颗粒的摄取依赖内吞作用。然而,纳米粒子的内吞摄取可以增强药物保留和克服抗药性机构3。然而,纳米颗粒介导的抗癌药物递送的真正好处是,它利用了EPR效应,以促进被动肿瘤靶向以及提高药物动力学。因此,使用一个基于纳米颗粒的药物递送方法只能完全在体内评估。体外研究有局限性( 没有EPR效应),即排除全CHARACT这些类型的药物递送系统7的erization。

    总之,所描述的方法允许容易制造一致的大小和表面电荷的球形丝纳米颗粒。这些丝的纳米颗粒可用于范围广泛的应用( 例如 ,化妆品,纳米图案化,治疗诊断学,润滑剂,纳米毒性研究控制颗粒模板),包括它们作为抗癌药物递送平台上使用。

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Acetone VWR International, Radnor, PA, USA 20066.33
    Automated Critical Point Dryer Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM CPD300
    Balancing Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland NewClassic MS
    Black polystyrene microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3991
    Capillary cell (DTS 1070) Malvern Instrument, Worcestershire, UK DTS107
    Carbon adhesive disc Agar Scientific, Essex, UK G3347N
    Centrifuge  Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany Z323K
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Avanti J-E, Rotor: J20
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
    Coater, low vacuum Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM ACE200
    Cuvettes, polystyrene, disposable Fisher Scientific, Waltham, MA, USA FB55147
    Doxorubixin  LC Laboratories, Boston, MA, USA D4000
    Electronic pipetting, Easypet  Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    FE-SEM Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany SU6600
    Fetal Bovine Serum Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 16000-044
    Freeze dryer Martin Christ, Osterode, Germany Epsilon 2-4
    Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons Tajima Shoji, Kanagawa, Japan N/A
    Hotplate with Stirrer Bibby Scientific, Stanffordshire, UK US 152
    Incubator Memmert, Schwabach, Germany INB 200
    Insulin, human recombinant, zinc solution Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 12585-014
    Lithium bromide Acros Organics, Geel, Belgium AC199870025
    MDA-MB-231 ATCC, Manassas, VA, U.S.A N/A
    Micropipette and tips Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    Microplate Reader Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA SpectraMax M5
    Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA N/A
    Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml Beckman Coulter, Brea, CA, USA 355645
    Penicilin/streptomycin  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 15140-122
    RPMI medium Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 11875-093
    Serological pipettes, 5 ml Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
    Silicon wafers Agar Scientific, Essex, UK G3391
    Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 87724
    Sodium carbonate anhydrous Fisher Scientific, Waltham, MA, USA S/2840/62
    Specimen stubs for SEM Agar Scientific, Essex, UK G301
    Ultrasonic homogenizer Bandelin, Berlin, Germany Sonoplus HD 2070
    UV transparent microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3635
    Vortex IKA, Staufen, Germany Genius 3
    Zetasizer Malvern Instrument, Worcestershire, UK Nano ZS
    Zetasizer Software version 7.11 DLS software
    Micro Modulyo  Thermo Fisher 230 Freeze drying system 

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    References

    1. Haley, B., Frenkel, E. Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol. Oncol. 26, (1), 57-64 (2008).
    2. Sun, T., Zhang, Y. S., Pang, B., Hyun, D. C., Yang, M., Xia, Y. Engineered nanoparticles for drug delivery in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53, (46), 12320-12364 (2014).
    3. Davis, M. E., Chen, Z. G., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nat. Rev. Drug Discov. 7, (9), 771-782 (2008).
    4. Sheridan, C. Proof of concept for next-generation nanoparticle drugs in humans. Nature Biotechnol. 30, (6), 471-473 (2012).
    5. Matsumura, Y., Hitoshi, M. A New Concept for Macromolecular Therapeutics in Cancer Chemotherapy: Mechanism of Tumoritropic Accumulation of Proteins and the Antitumor Agent Smancs. Cancer Res. 46, 6387 (1986).
    6. De Duve, C., De Barsy, T., Poole, B., Trouet, A., Tulkens, P., Van Hoof, F. Lysosomotropic agents. Biochem. Pharmacol. 23, (18), 2495-2531 (1974).
    7. Duncan, R., Richardson, S. C. W. Endocytosis and intracellular trafficking as gateways for nanomedicine delivery: opportunities and challenges. Mol. Pharm. 9, (9), 2380-2402 (2012).
    8. Vishakha, K., Kishor, B., Sudha, R. Natural Polymers - A Comprehensive Review. Int. J. Pharm. Biomed. Res. 3, (4), 1597-1613 (2012).
    9. Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Silk fibroin biomaterials for controlled release drug delivery. Expert. Opin. Drug Del. 8, (6), 797-811 (2011).
    10. Thurber, A. E., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vivo bioresponses to silk proteins. Biomaterials. 71, 145-157 (2015).
    11. Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97, (6), 479-498 (2012).
    12. Seib, F. P., Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Self-Assembling Doxorubicin Silk Hydrogels for the Focal Treatment of Primary Breast. Adv. Funct. Mater. 23, (1), 58-65 (2013).
    13. Seib, F. P., Kaplan, D. L. Doxorubicin-loaded silk films: drug-silk interactions and in vivo performance in human orthotopic breast cancer. Biomaterials. 33, (33), 8442-8450 (2012).
    14. Seib, F. P., Coburn, J., et al. Focal therapy of neuroblastoma using silk films to deliver kinase and chemotherapeutic agents in vivo. Acta. Biomater. 20, 32-38 (2015).
    15. Coburn, J. M., Na, E., Kaplan, D. L. Modulation of vincristine and doxorubicin binding and release from silk films. J. Control. Release. 220, 229-238 (2015).
    16. Seib, F. P., Jones, G. T., Rnjak-Kovacina, J., Lin, Y., Kaplan, D. L. pH-dependent anticancer drug release from silk nanoparticles. Adv. Healthc. Mater. 2, (12), 1606-1611 (2013).
    17. Wongpinyochit, T., Uhlmann, P., Urquhart, A. J., Seib, F. P. PEGylated Silk Nanoparticles for Anticancer Drug Delivery. Biomacromolecules. 16, (11), 3712-3722 (2015).
    18. Seib, F. P., Kaplan, D. L. Silk for Drug Delivery Applications: Opportunities and Challenges. Isr. J. Chem. 53, (9-10), 1-12 (2013).
    19. Yucel, T., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Silk-based biomaterials for sustained drug delivery. J. Control. Release. 190, 381-397 (2014).
    20. Wang, X., Yucel, T., Lu, Q., Hu, X., Kaplan, D. L. Silk nanospheres and microspheres from silk/pva blend films for drug delivery. Biomaterials. 31, (6), 1025-1035 (2010).
    21. Qu, J., Wang, L., Hu, Y., You, R., Li, M. Preparation of Silk Fibroin Microspheres and Its Cytocompatibility. J. Biomater. Nanobiotechnol. 4, 84-90 (2013).
    22. Lammel, A., Hu, X., Park, S., Kaplan, D., Scheibel, T. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, (16), 4583-4591 (2010).
    23. Gupta, V., Aseh, A., Rìos, C. N., Aggarwal, B. B., Mathur, A. B. Fabrication and characterization of silk fibroin-derived curcumin nanoparticles for cancer therapy. Int. J. Nanomedicine. 4, 115-122 (2009).
    24. Zhao, Z., et al. Generation of silk fibroin nanoparticles via solution-enhanced dispersion by supercritical CO2. Ind. Eng. Chem. Res. 52, (10), 3752-3761 (2013).
    25. Tudora, M., Zaharia, C., Stancu, I. Natural silk Fibroin micro-and nanoparticles with potential uses in drug delivery systems. U.P.B. Sci. Bull., Series B. 75, (1), 43-52 (2013).
    26. Zhao, Z., Li, Y., Xie, M. B. Silk Fibroin-Based Nanoparticles for Drug Delivery. Int. J. Mol. Sci. 16, (3), 4880-4903 (2015).
    27. Rockwood, D., Preda, R., Yücel, T. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protoc. 6, (10), 1-43 (2011).
    28. Seib, F. P., Müller, K., Franke, M., Grimmer, M., Bornhäuser, M., Werner, C. Engineered extracellular matrices modulate the expression profile and feeder properties of bone marrow-derived human multipotent mesenchymal stromal cells. Tissue. Eng. Part A. 15, (10), 3161-3171 (2009).
    29. Lai, P., Daear, W., Löbenberg, R., Prenner, E. J. Overview of the preparation of organic polymeric nanoparticles for drug delivery based on gelatine, chitosan, poly(d,l-lactide-co-glycolic acid) and polyalkylcyanoacrylate. Colloids Surf., B, Biointerfaces. 118, 154-163 (2014).
    30. Subia, B., Kundu, S. C. Drug loading and release on tumor cells using silk fibroin-albumin nanoparticles as carriers. Nanotechnology. 24, (3), 035103 (2013).
    31. Zhang, Y. Q., Shen, W. D., Xiang, R. L., Zhuge, L. J., Gao, W. J., Wang, W. B. Formation of silk fibroin nanoparticles in water-miscible organic solvent and their characterization. J. Nanopart. Res. 9, (5), 885-900 (2006).
    32. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, (6952), 1057-1061 (2003).
    33. Yhr Bae,, Park, K. Targeted drug delivery to tumors: myths, reality and possibility. J. Control. Release. 153, (3), 198-205 (2011).
    34. Lammel, A., Schwab, M., Hofer, M., Winter, G., Scheibel, T. Recombinant spider silk particles as drug delivery vehicles. Biomaterials. 32, (8), 2233-2240 (2011).
    35. Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast. Cancer. Res. 13, 215 (2011).

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    1. good article

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      Posted by: Anonymous
      August 12, 2017 - 9:49 AM

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