Name: 纳米丝绸制造和药物输送应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学习利用纳米沉淀法从家蚕茧制备丝素蛋白纳米颗粒，用于药物递送应用。该方法简单可重复，可产生稳定且粒径分布均匀的纳米颗粒，适用于抗癌药物负载和体外细胞毒性研究。

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本研究得到了第七个欧盟框架计划内的玛丽·居里FP7职业整合基金334134的支持。

1. 从反向工程制备丝素蛋白溶液 家蚕 蚕茧
注意：本方法基于先前描述的方案12,27。
<ol>
	<li>用剪刀将5 g干燥的蚕茧切成5 mm × 5 mm的小块，去除任何受污染的外层。</li>
	<li>称取 4.24 g 碳酸钠，并小心加入 2 L 沸腾的蒸馏水中。 
	注意：这将得到 0.02 M 的碳酸钠溶液。</li>
	<li>将剪碎的蚕茧片段加入煮沸的碳酸钠溶液中，煮沸60分钟以脱除丝胶。偶尔搅拌丝纤维，以确保样品处理均匀。</li>
	<li>去除脱胶蚕丝，用1 L蒸馏水洗涤20分钟；重复洗涤步骤至少3次。</li>
	<li>取出洗涤后的蚕丝，充分挤压以去除多余液体，然后用手解开或拉开蚕丝。将解开的蚕丝置于通风橱中，静置过夜晾干。通常可得到3.6 g脱胶蚕丝纤维。</li>
	<li>第二天，称取5 g风干的脱胶丝素纤维，将丝素紧密地装入50 ml烧杯底部。</li>
	<li>配制新鲜的9.3 M LiBr溶液。按照1 g蚕丝纤维与4 ml LiBr溶液的比例，将蚕丝纤维溶解于LiBr溶液中。用铝箔覆盖蚕丝-LiBr样品，防止蒸发，并使蚕丝在 60 °C此步骤最长需要4小时，并需不时搅拌以辅助进行。</li>
	<li>将透析盒（截留分子量为3,500 Da）在水中润湿5分钟。将15 ml的丝素蛋白LiBr溶液注入15 ml透析盒中，并使用针头和注射器去除所有气泡。</li>
	<li>用1升蒸馏水透析，并在1小时、3小时和6小时更换水（即，第1天3次变化）以及次日早晨和晚上再次进行（即，第二天2次变化），然后在次日早晨再次进行（即，第3天更换1次。</li>
	<li>从透析盒中收集丝素溶液，并将溶液在20,000 × g下离心20分钟 5 °C 在9,500 × g条件下离心，收集上清液，并重复此离心过程两次。</li>
	<li>称量空称量皿的重量（W1），加入1 ml丝素溶液，再次记录重量（W2），然后将称量皿置于60 ºC下过夜干燥。随后测定总干重（W3）（即干燥后的丝素与称量皿重量）。丝素溶液的浓度（w/v）计算公式为：% = (W3-W1/W2-W1) × 100。</li>
</ol>
2. 从逆向工程蚕丝溶液制备蚕丝纳米颗粒
<ol>
	<li>将5% (w/v) 丝素溶液逐滴加入丙酮中，同时保持搅拌 &gt;75% (v/v) 丙酮溶液。例如，将9 ml 5% (w/v) 蚕丝溶液逐滴加入10 µl/drop 以50滴/分钟的速度加入34 ml丙酮中。</li>
	<li>48,000 × g 离心沉淀物 2 小时，温度为 4 °C.</li>
	<li>吸弃上清液，先用刮勺将沉淀物从管底刮下，加入20 ml蒸馏水重悬沉淀。用移液器吸头将附着在刮勺上的沉淀转移至管中。涡旋振荡20秒后，使用超声探头在30%振幅下超声处理两个循环，每个循环30秒，随后用蒸馏水将离心管补至最大体积。</li>
	<li>重复离心和重悬步骤至少两次。</li>
	<li>将沉淀重悬于6 ml蒸馏水中，具体步骤见2.3，并于 4 °C 直至使用前。用于细胞培养研究时，丝素蛋白纳米颗粒储备液可进行γ射线辐照17.</li>
</ol>
3. 丝素蛋白纳米颗粒浓度的测定
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 48,000 × g 离心丝素蛋白纳米颗粒 2 小时。</li>
	<li>将所有纳米颗粒重悬于 3 ml 蒸馏水中，随后进行两次超声处理，每次振幅为 30%，持续 30 秒。</li>
	<li>将 3 ml 丝素蛋白纳米颗粒储备液分为 2 ml 和 1 ml 两份，转移至预先称重的 2 ml 离心管中。记录 2 ml 样品的总重量。将 1 ml 样品于 4 °C 保存备用；该 1 ml 样品将用于生成标准曲线。</li>
	<li>迅速冷冻 2 ml 丝素蛋白纳米颗粒样品，然后在冷冻干燥机中过夜冻干。冻干后重新称量 2 ml 离心管的重量，并计算原始 2 ml 样品中所含丝素蛋白纳米颗粒的质量（mg）。</li>
	<li>用蒸馏水稀释 1 ml 丝素蛋白纳米颗粒储备液，制备 5 个浓度点的标准曲线（0.04–7 mg/ml）。确保样品吸光度不超过检测上限。</li>
	<li>在 600 nm 波长下测定各标准稀释液的吸光度。建议使用 96 孔板进行检测。以吸光度对浓度（mg/ml）作图，绘制标准曲线。此后可常规使用该标准曲线测定丝素蛋白纳米颗粒悬液的浓度。</li>
</ol>
4. 阿霉素负载丝素蛋白纳米颗粒的制备
<ol>
	<li>阿霉素溶液的制备
	<ol>
		<li>将1.2 mg盐酸多柔比星溶解于8 ml蒸馏水中。</li>
		<li>用蒸馏水定容至 10 ml，得到工作液 116 µg/ml (0.2 µmol/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阿霉素负载丝素蛋白纳米颗粒的制备
	<ol>
		<li>混合 2 ml 的 0.2 µmol/ml 阿霉素溶液与 200 µl 10、30 或 50 mg/ml 丝素蛋白纳米颗粒，置于 2 ml 离心管中。</li>
		<li>将丝素蛋白-阿霉素悬浮液在室温下孵育（25 °C在旋转混合仪上过夜混合。</li>
		<li>接下来，将丝素蛋白-阿霉素悬浮液在194,000 × g条件下离心30分钟。用蒸馏水洗涤载有阿霉素的丝素蛋白纳米颗粒，并重复此步骤两次。</li>
		<li>合并上清液并记录总体积（此样品用于测定包封率）。</li>
		<li>将载有阿霉素的丝素蛋白纳米颗粒重悬于蒸馏水中，避光保存于4 ºC，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包封率与载药量的测定
	<ol>
		<li>移液 200 µl 将步骤4.2.4中上清液加入黑色微孔板中。</li>
		<li>使用荧光酶标仪在固定的光电倍增管设置下检测阿霉素相关荧光。</li>
		<li>将激发波长设为485 nm，发射波长设为590 nm，并记录荧光值。</li>
		<li>生成阿霉素标准曲线。确保使用相同的仪器设置获取测量数据（即， 使用固定的光电倍增管设置，根据标准曲线计算合并上清液中阿霉素的浓度。在三个独立实验中重复该测量。</li>
		<li>使用公式（1）计算包封率： 
		<img alt="包封率计算公式：纳米颗粒中药物量 / 初始药物量 × 100。计算方法。" src="/files/ftp_upload/54669/54669equation1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 丝素蛋白纳米颗粒的表征
<ol>
	<li>新鲜制备及储存丝素蛋白纳米颗粒的粒径与Zeta电位评估。
	<ol>
		<li>将丝素蛋白纳米颗粒储存于蒸馏水中，分别置于4 °C和25 °C条件下。</li>
		<li>在第0、14和28天，采用动态光散射（DLS）法测定丝素蛋白纳米颗粒的粒径和Zeta电位。设定蒸馏水的折射率为1.33，蛋白质的折射率为1.6017。使用用户界面软件计算颗粒尺寸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过扫描电子显微镜（SEM）对丝素蛋白纳米颗粒进行形貌表征。
	<ol>
		<li>将碳导电胶带粘附于SEM样品台，随后将硅片固定于胶带上。</li>
		<li>将丝素蛋白纳米颗粒稀释至浓度为1 mg/ml。取10 µl样品滴加于硅片表面，于-80 °C冷冻，并按照仪器说明书使用冷冻干燥系统过夜冻干。</li>
		<li>使用低真空溅射镀膜仪在样品表面镀上厚度不超过20 nm的金层。 
		注意：不同型号仪器的设置参数有所差异。本实验所用型号为全自动操作，仅依据镀膜厚度进行控制。</li>
		<li>使用扫描电子显微镜在5 kV电压下以40,000倍放大倍数对样品进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 体外 对照组与载阿霉素丝素蛋白纳米颗粒的细胞毒性
<ol>
	<li>丝胶蛋白纳米颗粒暴露后细胞活力检测。
	<ol>
		<li>使用含10% v/v胎牛血清的RPMI 1640培养基培养MDA-MB-231细胞。将细胞接种于组织培养处理的聚苯乙烯表面，在37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育。常规情况下每2−3天在细胞融合度达80%时进行传代培养。</li>
		<li>将MDA-MB-231细胞以2 × 104 个细胞/cm2的密度接种于96孔板中，过夜培养使细胞恢复。</li>
		<li>向96孔板中分别加入：(i) 0.001–1 µg游离阿霉素，(ii) 0.001–0.5 mg丝胶蛋白纳米颗粒，以及负载0.001–1 µg阿霉素的0.1 mg丝胶蛋白纳米颗粒（每孔终体积为100 µl）。</li>
		<li>在处理72小时后，加入磷酸盐缓冲液配制的MTT溶液（5 mg/ml）检测细胞活力并计算半数抑制浓度（IC50）。孵育5小时后，小心用移液器吸除孔内液体，每孔加入100 µl二甲基亚砜溶解甲臜结晶，在560 nm波长下测定吸光度。该实验重复三次，独立进行。 
		注：未处理对照组的吸光度值作为100%细胞活力的参考值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>丝胶蛋白纳米颗粒处理后细胞的扫描电镜观察。
	<ol>
		<li>将MDA-MB-231细胞以2 × 104 个细胞/cm2的密度接种于无菌玻璃盖玻片上，过夜恢复后，在目标处理条件下暴露72小时。</li>
		<li>用含2% v/v戊二醛的PBS溶液固定细胞30分钟，蒸馏水洗涤两次，经乙醇梯度脱水后进行临界点干燥，具体步骤参见文献28。</li>
		<li>使用低真空溅射镀膜仪在样品表面溅射一层厚度不超过20 nm的金膜。 
		注：不同型号仪器参数设置有所差异。本实验所用型号为全自动操作，仅依据镀膜厚度进行控制。</li>
		<li>采用扫描电子显微镜（SEM）对样品成像，电子加速电压设为5 kV，放大倍数为700倍。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前已有多种方法可用于制备丝素蛋白纳米颗粒，包括聚乙烯醇共混20、喷雾干燥21、盐析法22、毛细管微点打印23、超临界CO2沉淀法24以及纳米沉淀法16,25（综述见参考文献26）。然而，由于纳米沉淀法整体操作简便，已成为制备丝素蛋白纳米颗粒最常用的技术。因此，本研究旨在将纳米沉淀法应用于逆向工程改造的丝素蛋白，以制备可用于多种用途的丝素蛋白基纳米颗粒，包括溶酶体靶向的抗癌药物递送。
在过去十年中，纳米沉淀法已成为制备基于蛋白质的纳米颗粒最常用的方法之一29。我们研究团队16,17及其他研究者25,26,30,31已成功将该技术应用于蚕丝蛋白；在此，我们提供一种简单且可靠的逐步操作方案，用于制备蚕丝纳米颗粒。丙酮纳米沉淀法可生成粒径均一、通常处于纳米尺度范围内的球形蚕丝颗粒。相比甲醇、乙醇、异丙醇和丁醇等溶剂，丙酮已成为首选的连续相溶剂<sup...

纳米级药物递送系统常用于控制药物释放，并将多种治疗性有效载荷（例如蛋白质、多肽和小分子药物）递送至靶细胞和组织。这些治疗性有效载荷通常被包载于多种大分子药物载体中，如脂质体、水溶性聚合物（包括树枝状大分子）以及微粒和纳米粒。1纳米颗粒（通常尺寸范围为1 nm至1000 nm）正被广泛研究作为潜在的药物载体，尤其用于抗癌药物的递送。2白蛋白结合型紫杉醇（Abraxane，一种直径约120 nm、载有紫杉醇的白蛋白纳米颗粒）成功引入常规临床实践3 推动了该领域的发展，使得更多用于药物递送的纳米颗粒正在进入临床试验4实体瘤通常表现出较差的淋巴引流并具有通透性较高的血管，这意味着粒径达200 nm的纳米颗粒在静脉给药后可被动靶向至这些肿瘤组织。这种被动靶向现象被称为增强渗透与滞留（enhanced permeability and retention, EPR）效应，最早于1986年被报道。5EPR效应可使给定剂量的药物在肿瘤微环境中浓度提高50至100倍，前提是药物通过大分子药物载体递送，而非以无载体的游离药物形式给药。用于抗癌药物递送的载药纳米颗粒必须到达肿瘤微环境，并通常需通过内吞作用进入特定的细胞内区室，才能实现预期的治疗效果3用于细胞内药物递送的纳米颗粒利用内吞作用作为进入细胞的门户，并以此途径克服药物耐药机制。纳米颗粒的药物释放通常被特异性设计为在溶酶体中进行即溶酶体靶向药物递送6 其中，纳米颗粒载体对pH的响应性（溶酶体pH约为4.5）可作为药物释放的触发机制，或利用溶酶体酶将载药从载体中释放出来7.
可用于制备纳米颗粒的材料种类繁多（例如， 金属以及许多有机和无机材料。然而，由于生物聚合物具有已知的生物相容性、可生物降解性和低毒性，正逐渐成为具有吸引力的材料8许多生物聚合物正在被研究，包括白蛋白、海藻酸盐、壳聚糖和丝素蛋白。其中，丝素蛋白已展现出作为药物递送系统开发的广阔前景9. 各种类型的丝由多种节肢动物产生，包括蜘蛛（例如, Nephila clavipes）和家蚕（例如, 家蚕）。家蚕丝的应用远比蜘蛛丝广泛，因为家蚕已被完全驯化，其丝可作为可重复获取的起始材料。家蚕丝是美国食品药品监督管理局（FDA）批准可用于人体的材料，尤其常用于缝合线；其在人体中具有良好的安全记录，并且已知可降解 体内10丝素蛋白的降解特性可精确调控，降解时间可从数小时（低结晶度丝素）到12个月以上（高结晶度丝素）不等。丝素蛋白的降解产物无毒，并可在体内代谢。10丝结构赋予了结合小分子量化合物和大分子蛋白质药物的能力11，使其成为控制药物释放的理想材料。蛋白质类药物（例如， 抗体易发生变性、聚集、蛋白水解切割以及被免疫系统清除。然而，丝素蛋白因其纳米晶区的缓冲能力及其在纳米尺度上调控水分含量的特性，能够稳定治疗性蛋白质。11这些独特特性可提供物理保护并降低有效载荷的移动性11 并且通常在其他（生物）聚合物中不常见。例如，基于蚕丝的水凝胶作为许多抗癌药物递送系统12，薄膜13-15 和纳米颗粒16,17，现已开发出利用这些特性的方法（详见参考文献）18,19 )
在此，通过在较长时间范围内测定丝素蛋白纳米颗粒的粒径和表面电荷对其进行了表征。选用临床上重要的抗癌药物阿霉素作为模型药物，研究负载药物的丝素蛋白纳米颗粒在三阴性人乳腺癌细胞中的载药及细胞毒性。

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>VWR International, Radnor, PA, USA</td><td>20066.33</td><td></td></tr><tr><td>全自动临界点干燥仪</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>EM CPD300</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland</td><td>NewClassic MS</td><td></td></tr><tr><td>黑色聚苯乙烯微孔板，96孔</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>3991</td><td></td></tr><tr><td>毛细管池（DTS 1070）</td><td>Malvern Instrument, Worcestershire, UK</td><td>DTS107</td><td></td></tr><tr><td>碳导电胶带</td><td>Agar Scientific, Essex, UK</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany</td><td>Z323K</td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td>Avanti J-E, 转子：J20</td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td>Optima L-70K, 转子：50.2 Ti, 适配器 303392</td><td></td></tr><tr><td>低真空镀膜仪</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>EM ACE200</td><td></td></tr><tr><td>一次性聚苯乙烯比色皿</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>FB55147</td><td></td></tr><tr><td>阿霉素&amp;nbsp;</td><td>LC Laboratories, Boston, MA, USA</td><td>D4000</td><td></td></tr><tr><td>电子移液器，Easypet&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）</td><td>Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany</td><td>SU6600</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Martin Christ, Osterode, Germany</td><td>Epsilon 2-4</td><td></td></tr><tr><td>热灭活家蚕丝茧</td><td>Tajima Shoji, Kanagawa, Japan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>带搅拌功能的加热板</td><td>Bibby Scientific, Stanffordshire, UK</td><td>US 152</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Memmert, Schwabach, Germany</td><td>INB 200</td><td></td></tr><tr><td>人重组胰岛素锌溶液</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>溴化锂</td><td>Acros Organics, Geel, Belgium</td><td>AC199870025</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC, Manassas, VA, U.S.A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器及吸头</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>微孔板读数仪</td><td>Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA</td><td>SpectraMax M5</td><td></td></tr><tr><td>橡树岭高速离心管，50 ml</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>开口厚壁聚碳酸酯离心管，4 ml</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td>355645</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI培养基</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 血清移液管</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅片</td><td>Agar Scientific, Essex, UK</td><td>G3391</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer透析盒，截留分子量3.5K，15 ml</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>无水碳酸钠</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>S/2840/62</td><td></td></tr><tr><td>扫描电镜样品台</td><td>Agar Scientific, Essex, UK</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>超声波均质器</td><td>Bandelin, Berlin, Germany</td><td>Sonoplus HD 2070</td><td></td></tr><tr><td>紫外透光微孔板，96孔</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>IKA, Staufen, Germany</td><td>Genius 3</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer粒径及电位分析仪</td><td>Malvern Instrument, Worcestershire, UK</td><td>Nano ZS</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer软件版本7.11</td><td></td><td>DLS软件</td><td></td></tr><tr><td>Micro Modulyo</td><td>&amp;nbsp;Thermo Fisher</td><td>230</td><td>冷冻干燥系统&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

丝素蛋白纳米颗粒的制备及其在药物递送中的应用

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

丝素蛋白因其优异的机械性能、生物相容性和可生物降解性，以及能够保护载药并在特定刺激下实现可控释放的特性，成为生物医学和药物应用领域极具前景的生物高分子材料。尽管丝素蛋白可被制备成多种材料形式，但丝素蛋白纳米颗粒正逐渐成为一种有前景的药物递送系统。因此，本文介绍了将蚕茧逆向工程处理以获得再生丝素蛋白溶液的操作流程，该溶液可用于制备稳定的丝素蛋白纳米颗粒。随后对这些纳米颗粒进行表征、载药，并探索其作为潜在抗癌药物递送系统的可行性。简而言之，首先通过脱胶处理去除蚕茧中的丝胶蛋白，继而进行丝素蛋白的溶解与纯化，从而获得水相丝素蛋白溶液。接着，将再生丝素蛋白溶液通过纳米沉淀法处理以制备丝素蛋白纳米颗粒——这是一种简单而高效的方法，可生成粒径均一的纳米颗粒。对所制备的丝素蛋白纳米颗粒进行表征，包括其粒径、Zeta电位、形态、在水相介质中的稳定性，以及其包载化疗药物的能力和杀伤人乳腺癌细胞的效果。总体而言，所述方法可制备出均一的丝素蛋白纳米颗粒，便于进一步探索其在多种应用场景中的潜力，包括作为潜在的纳米药物使用。

数据的统计学分析方法如前所述17。样本对之间采用学生t检验，多个样本之间则采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Bonferroni多重比较事后检验。星号表示统计学显著性，定义如下：*P &lt;0.05，**P &lt;0.001。所有数据均以均值±标准差（SD）表示，括号中的数字表示独立实验的次数。
将再生的蚕丝溶液制备完成后，逐滴加入丙酮中，通过纳米沉淀法生成蚕丝纳米颗粒（图1）。该方法制得的蚕丝纳米颗粒呈均匀的球形（多分散指数：0.1），粒径为106.5 nm ± 1.1，表面带负电荷（-49.57 mV ± 0.6）（图2和图3）。通过监测颗粒的粒径、zeta电位和形貌，评估蚕丝纳米颗粒在水中的稳定性，观察期长达28天（图2和图3）。在4 °C或25...

纳米颗粒正成为多种适应症下极具前景的药物递送系统。本文介绍一种简单而高效的方法，利用反向工程改造的家蚕（Bombyx mori）丝素蛋白制备丝素蛋白纳米颗粒。这些丝素蛋白纳米颗粒可轻松负载治疗性药物，并进一步用于药物递送应用的研究。

丝素蛋白因其优异的机械性能、生物相容性以及在生物医学和制药应用中的潜力，是一种极具前景的生物聚合物。

本实验的总体目标是从反向工程获得的水性丝素溶液中制备丝素纳米颗粒，并进一步将这些丝素纳米颗粒应用于药物递送。该方法采用纳米沉淀法制备基于丝素的颗粒，可用于多种应用，例如药物递送。该技术的主要优势在于操作简单、可重复性强，能够制备出稳定性高、粒径分布窄且均一的丝素纳米颗粒。开始此操作时，将两升蒸馏水煮沸。然后，小心加入 4.24 克碳酸钠。接下来，使用剪刀将五克干燥蚕茧切成 5 毫米 × 5 毫米的碎片。将蚕茧碎片加入碳酸钠溶液中，煮沸60分钟以去除丝胶，期间偶尔搅拌。煮沸完成后，取出脱胶后的蚕丝。用一升蒸馏水洗涤20分钟，重复三次。然后，挤压已清洗的蚕丝以去除多余液体，用手解开蚕丝，并将其置于通风橱中过夜自然干燥。干燥完成后，将五克干燥的蚕丝纤维紧密地装入一个50毫升烧杯的底部。接着，配制新鲜的9.3摩尔浓度的溴化锂溶液。将蚕丝溶于溴化锂中，每克蚕丝加入4毫升溴化锂。用铝箔覆盖烧杯以防止蒸发。在60 °C条件下搅拌溶解4小时，期间偶尔搅拌。溶解完全后，将透析盒在水中润湿五分钟。然后，将 15 毫升丝素蛋白-溴化锂溶液转移至透析盒中。使用针头和注射器去除所有气泡。用一升蒸馏水进行透析。在1小时、3小时和6小时时更换水。第二天早晨和晚上用新水更换烧杯中的水，并在第三天早晨再更换一次。透析完成后，从夹心盒中收集丝素溶液，在5 °C条件下以9,500 × g离心20分钟。收集上清液，并重复离心两次。然后，按文本方案所述，去除水分、干燥，并测定丝素溶液的总干重和浓度。接下来，将5%（质量/体积）的丝素溶液逐滴加入丙酮中，保持丙酮的体积比浓度超过75%。将离心管完全充满，以确保在离心过程中不会发生塌陷。在4°C条件下，以48,000 ×g离心两小时，收集沉淀物。用刮勺将沉淀物刮下，并加入20毫升蒸馏水。用移液器吸头将沉淀物从刮勺上转移至容器中，涡旋振荡20秒。随后使用超声探头在30%振幅下超声处理30秒，重复两次。超声处理完成后，用蒸馏水将离心管补至满刻度。重复离心和重悬至少再进行两次。随后，于4 °C保存以备后续使用。首先，按照文本方案制备阿霉素溶液。然后，在2毫升离心管中，将2毫升浓度为0.2微摩尔/毫升的阿霉素溶液与200微升浓度分别为10、30或50毫克/毫升的丝素蛋白纳米颗粒混合。将丝素蛋白-阿霉素悬浮液在室温下置于旋转混合仪中孵育过夜。药物装载完成后，在194,000 × g条件下离心悬浮液30分钟。用蒸馏水洗涤载有阿霉素的丝素蛋白纳米颗粒，并重复离心两次。随后，移除上清液并记录总体积。用移液器将200微升上清液加入黑色微孔板中。使用荧光酶标仪，将激发波长设为485纳米，发射波长设为590纳米，并记录荧光值。在培养并接种MDA-MB-231细胞后，分别向96孔板中加入自由扩散的阿霉素、丝素蛋白纳米颗粒以及载有阿霉素的丝素蛋白纳米颗粒。然后，在72小时时加入MTT，以测定细胞活力和半数抑制浓度。孵育5小时。孵育结束后，用移液器小心吸出各孔中的液体。加入100微升二甲基亚砜以溶解甲臜。使用吸光度酶标仪，在560纳米波长下测定吸光度。收集三次独立实验的该数据。在此方案中，丝素蛋白纳米颗粒由家蚕（Bombyx mori）蚕茧制备。阿霉素被用作具有临床相关性的化疗模型药物，用于载药及体外细胞毒性研究。此处展示的是2、6和10毫克丝素蛋白纳米颗粒对阿霉素的包封效率的代表性结果。通过人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞体外实验评估载药丝素纳米颗粒递送阿霉素并随后杀死癌细胞的能力。在 0.1 微克的等效药物剂量下，游离扩散性阿霉素和载阿霉素丝素颗粒均显著降低细胞活力。由于细胞摄取差异，游离扩散性阿霉素表现出比载药丝素纳米颗粒更强的细胞毒性。定量测量结果通过定性的扫描电子显微镜成像得到验证。对照组培养物显示出更高的细胞密度和以间充质样表型为主的特点。在暴露于丝素蛋白纳米颗粒的培养物中也观察到类似结果。暴露于阿霉素的细胞表现出明显不同的表型，形态宽大且铺展。无论是游离扩散型阿霉素还是载阿霉素的丝素蛋白纳米颗粒，均导致细胞数量显著减少。因此，一种可传递的工程化丝素溶液可实现三天内送达。并且可以在一天内制备出丝素蛋白纳米颗粒。在进行此操作时，重要的是要记住使用耐丙酮的离心机，以确保纳米沉淀和样品处理的顺利进行。此外，确保离心管完全装满，以防止在离心过程中发生塌陷。观看本视频后，您应能充分理解如何制备反向工程化的丝素溶液，并利用该溶液生成粒径分布窄且均匀的丝素纳米颗粒。

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