Extractie van Plant-gebaseerde Capsules voor Micro-inkapseling Applications

1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Dit protocol / manuscript beschrijft een gestroomlijnde werkwijze voor de productie van sporopollenin exine capsules (SEC) van Lycopodium clavatum sporen en voor het laden van hydrofiele stoffen in deze SEC.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Microcapsules verkregen uit plantaardige sporen of pollen zorgen voor een robuust platform voor een breed scala aan micro-inkapseling toepassingen. Sporopollenin exine capsules (SEC) worden verkregen als sporen of pollen worden verwerkt teneinde de interne sporoplasmic inhoud te verwijderen. De verkregen holle microcapsules vertonen een hoge mate van uniformiteit en micromeritic behouden ingewikkelde microstructurele kenmerken in verband met de bepaalde plantensoort. Hierin tonen we een gestroomlijnde werkwijze voor de bereiding van SEC van Lycopodium clavatum sporen en voor het laden van hydrofiele stoffen in deze SEC. De huidige SEC isolatiewerkwijze is onlangs geoptimaliseerd om aanzienlijke vermindering van de verwerkingen die conventioneel worden toegepast in SEC isolatie, en de productie van intacte microcapsules waarborgen. Natuurlijke L. clavatum sporen worden ontvet met aceton, behandeld met fosforzuur, en grondig gewassen om sporoplasmi verwijderenc inhoud. Na ontvetting aceton, heeft één bewerkingsstap gebruikt 85% fosforzuur aangetoond dat alle sporoplasmic inhoud te verwijderen. Door de zure verwerkingstijd beperkt tot 30 uur, is het mogelijk om schone SEC isoleren en voorkomen SEC breken, waarvan is aangetoond dat optreedt met langere verwerkingstijd. Uitgebreid wassen met water, verdunde zuren, verdunde basen, oplosmiddelen en zorgt ervoor dat alle sporoplasmic materialen en chemische residuen adequate afvoer. Het vacuüm ladingstechniek wordt gebruikt om een ​​model eiwit (runderserumalbumine) als representatieve hydrofiele verbinding laden. Vacuüm laden een eenvoudige techniek om verschillende verbindingen geladen zonder het gebruik van agressieve oplosmiddelen of ongewenste chemicaliën die vaak in andere micro protocollen vereist. Op basis van deze isolatie en laden protocollen SEC bieden een veelbelovend materiaal voor gebruik in een breed scala aan micro-inkapseling toepassingen, zoals geneesmiddelen, voedingsmiddelen, cosmetica en persoonlijke verzorging prodducten.

Introduction

Er is grote belangstelling in natuurlijke plantaardige capsules verkregen uit plantaardige sporen en pollen voor gebruik in micro-inkapseling toepassingen. 15/01 In de natuur, sporen en pollen bieden bescherming voor gevoelige genetisch materiaal tegen barre omstandigheden. De basisstructuur van plantaardige sporen en pollen omvat typisch een buitenste schillaag (exine), een binnenste bekledingslaag (intine) en de interne cytoplasmatische materiaal. De exine bestaat uit een chemisch robuust biopolymeer 1,9,10,13,16 genoemd sporopollenin en de intine bestaat voornamelijk uit cellulosematerialen. 16-18 lege capsules kunnen worden geïsoleerd door verscheidene werkwijzen 7,9 voor het verwijderen van materiaal cytoplasmatische , eiwitten, en de intine laag. 2,12,16 Deze sporopollenin exine capsules (SEC) een aantrekkelijk alternatief voor synthetische encapsulants vanwege hun nauwe grootteverdeling en uniforme morfologie. 7,9,13,19,20 Theontwikkeling van gestandaardiseerde processen SEC uit verschillende plantensoorten, zoals Lycopodium clavatum verkrijgen, opent het potentieel voor een breed scala aan micro-inkapseling toepassingen op het gebied van geneesmiddelafgifte, voedingsmiddelen en cosmetica. 6,10-13,21

Om SEC verkrijgen onderzoekers eerst behandeld sporen en pollen met organische oplosmiddelen en gerefluxt in alkalische oplossingen cytoplasmatische inhoud te verwijderen. 22-25 De resterende capsule structuur bepaald nog bevatten de celluloseachtige intine laag. Om deze te verwijderen, onderzoekers onderzocht het gebruik van verlengde zure hydrolyse bewerking met zoutzuur, zwavelzuur hete of warme fosforzuur gedurende meerdere dagen 22-25 met fosforzuur steeds de voorkeur van de SEC intine verwijderen. 2 De aanhoudende onderzoek door de jaren heen is gebleken dat verschillende sporen en pollen hebben verschillende mate van weerstand tegen de harde behandeling van methods vaak gebruikt. 26,27 Sommige sporen en pollen zijn volledig afgebroken en verliest alle structurele integriteit in sterk alkalische oplossingen, of worden zwaar beschadigd in sterk zure oplossingen. 16 De variabiliteit in de SEC-respons op de behandeling omstandigheden is het gevolg van subtiele variaties in de chemische structuur en morfologie van de exine sporopollenin exine materiaal tussen species. 28 Vanwege de variabiliteit in de robuustheid van sporopollenin exine capsules (SEC), moet de verwerkingsomstandigheden voor elke soort sporen en pollen optimaliseren.

Plant sporen van de soort L. clavatum hebben de meest bestudeerde enkele bron van de SEC worden. Voorgesteld wordt dat dit vooral te danken aan de ruime beschikbaarheid, lage kosten, monodispersiteit, en chemische robuustheid 9,29 De sporen kunnen eenvoudig worden geoogst en bevatten sporoplasmic inhoud in de vorm van groepen van 1 -. 2 pm celorganellen en biomolecules. 11 L. clavatum sporen zijn gebruikt als een natuurlijke poederlaag, 30,31 basis voor cosmetica, 30 en kruidengeneeskunde 32-36 voor uiteenlopende therapeutische toepassingen. De SEC verkregen uit L. clavatum is aangetoond veerkrachtiger te verwerken dan de SEC van andere soorten van sporen en pollen. 2 Na de verwerking te zijn, hebben de resulterende SEC is aangetoond dat hun ingewikkelde microridge structuren en hoge morfologische uniformiteit terwijl het verstrekken van een grote inwendige holte voor inkapseling te behouden. 7 studies tonen aan dat L. clavatum SEC kan worden gebruikt voor het inkapselen van geneesmiddelen, vaccins 10,13, 11 eiwitten, cellen 7,14, 8 oliën, 5-7,9 en voedingssupplementen. 5,15 Waargenomen SEC loading efficiëntie relatief hoog in vergelijking met conventionele inkapselingsmaterialen. 7 zijn een aantal gerapporteerde voordelenSEC inkapseling zoals de mogelijkheid om smaak te maskeren, 6,10 en een zekere mate van natuurlijke bescherming tegen oxidatie. 12 In de huidige studies, de meest gebruikte SEC extractiemethode voor L. clavatum is gebaseerd op vier belangrijke stappen. Stap men oplosmiddel terugvloeiing in aceton gedurende 12 uur bij 50 ° C om de sporen te ontvetten. 11 Stap twee alkalisch refluxen in 6% kaliumhydroxide gedurende 12 uur bij 120 ° C cytoplasma en eiwitachtige materialen te verwijderen. 11 Stap drie zuur refluxen in 85% fosforzuur tot 7 dagen bij 180 ° C aan de celluloseachtige intine te verwijderen. 11 Stap vier is een uitgebreid wassen met water, oplosmiddelen, zuren en basen alle resterende niet-exine materiaal te verwijderen en chemische residuen.

De belangrijkste doelstellingen van de SEC extractie ten opzichte van inkapseling toepassingen zijn om capsules die leeg van cytoplasmatische materiaal te produceren, vrij toevoegdem potentieel allergene eiwitten en morfologisch intact. 2,37 echter van fabricageprocessen perspectief is het ook belangrijk om extra economische en milieufactoren, zoals energiebesparing, duur productie, veiligheid en resulterende afval beschouwen. Met betrekking tot energie-efficiëntie, zowel hoge temperaturen en lange doorlooptijden van invloed op de productiekosten en ecologische voetafdruk. Productie duur en doorlooptijd zijn de belangrijkste factoren die van invloed verwerking winstgevendheid. Van bijzonder belang is dat hoge temperatuur fosforzuur verwerking verhoogt veiligheid en is bekend te resulteren in corrosieve schaling wat leidt tot een aanzienlijke stijging van onderhoud van de infrastructuur en vertragingen in batch doorlooptijden. 38-40 waar mogelijk, minimaliseert het aantal vereiste stappen kunnen leiden naar een forse verlaging van de geproduceerde afval. De gebruikte vier stappen L. clavatum SEC extractie moet gewoon evolved van tientallen jaren van onderzoek en heeft weinig feitelijke procesoptimalisatie gehad. Onlangs, Mundargi et al., 41 een belangrijke bijdrage aan de lopende werkzaamheden op dit gebied gemaakt door het systematisch evalueren en het optimaliseren van een van de meest gemelde SEC extractie technieken.

In het eerste deel van deze studie: spore ontvetting blijkt gebruikmaking aceton verwerking bij 50 ° C gedurende 6 uur; sporoplasm en intine verwijderingsprocedures gedemonstreerd gebruik 85% fosforzuur verwerking bij 70 ° C gedurende 30 uur; uitgebreid wassen met water, oplosmiddel, zuur en base wordt gebruikt om de verwijdering van resterende sporoplasmic inhoud tonen; SEC en drogen blijkt gebruikmaking convectie en gedroogd in de vacuümoven. In het derde deel wordt SEC vacuüm loading gedemonstreerd met gebruikmaking van vacuüm laden van een model eiwit, runderserumalbumine (BSA), gevolgd door BSA-beladen SEC wassen en vriesdrogen. In het vierde deel, de determinatie van de BSA inkapselingsefficiëntie blijkt gebruikmaking centrifugeren probe sonificatie en UV / VIS spectrometrie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Winning van sporopollenin exine Capsules (SEC) van L. clavatum Sporen

Opmerking: De SEC extractie proces omvat een brandbaar poeder (L. clavatum), hot bijtende zuren, en brandbare oplosmiddelen, waardoor de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, gezichtsmasker, handschoenen, laboratoriumjas), goedgekeurde risicobeoordeling van het gebruik, en de verwijdering van chemicaliën door bevoegd laboratoriumpersoneel is van essentieel belang.

  1. Spore Ontvetten
    1. Bereid een reflux opstelling in een zuurkast met een glazen condensor, watercirculatiesysteem en waterbad (figuur 1).
    2. Weeg 100 g L. clavatum sporen zonder stofvorming te veroorzaken en onwillekeurig welke ontstekingsbron.
      Opmerking: De sporen die hier gebruikt werden commercieel verkregen (zie Materials List).
    3. Transfer sporen langzaam een ​​1 L polytetrafluorethyleen (PTFE) rondbodemkolf met een magnetische roerstaaf.
    4. Voeg 500 ml aceton om de sporen in dePTFE kolf en schud de kolf voorzichtig om een ​​homogene suspensie te vormen.
    5. Plaats de kolf PTFE in het waterbad van 50 ° C en verbinding met de terugvloeikoeler.
    6. Voeren refluxen in aceton gedurende 6 uur onder roeren bij 200 tpm en laat afkoelen bij kamertemperatuur.
    7. Filter de suspensie op met filterpapier onder vacuüm en het verzamelen van de ontvette sporen in grote (15 cm diameter) glazen petrischaaltjes.
    8. Droog de sporen bij kamertemperatuur (zuurkast) te bedekken met aluminiumfolie met gaten voor oplosmiddelverdamping.
  2. acidolyse
    1. Bereid 85% (v / v) fosforzuur met gedeïoniseerd (DI) water en breng ontvette droge sporen een 1 L kolf PTFE.
    2. Voeg 500 ml fosforzuur (85% v / v) om de ontvette sporen.
    3. Plaats de PTFE kolf in een waterbad ingesteld op 70 ° C en verbinding met de terugvloeikoeler.
    4. Voer zacht refluxen (70 ° C) in fosforzuur gedurende 30 uur en vervolgens laatkoele bij kamertemperatuur.
    5. Verdun de schorsing door het gebruik van 500 ml warm DI-water en het verzamelen van de SEC door vacuümfiltratie met behulp van filter papier.
    6. Breng de SEC een 3 L bekerglas een aantal wasbeurten uitgevoerd.
  3. SEC Wassen
    1. Plaats de 3 L glazen beker met SEC in een zuurkast.
    2. Voeg 800 ml warm (50 ° C) gedeïoniseerd water aan de SEC onder zachtjes roeren gedurende 10 min.
    3. Filter de schorsing door het gebruik van papieren filter en een vacuümfiltratie set-up.
    4. Verzamel de SEC in een schone 3 L glazen beker.
    5. Herhaal stap 1.3.1. naar 1.3.4. vijf keer.
    6. Voeg 600 ml warm (45 ° C) aceton aan de SEC onder zachtjes roeren gedurende 10 min.
    7. Verzamel de SEC door middel van filtratie onder vacuüm en de SEC over te dragen aan een schone 3 L glazen beker.
    8. Herhaal stap 1.3.6. en 1.3.7. van 600 ml warm (50 ° C) 2 M zoutzuur.
    9. Herhaal stap 1.3.6. en 1.3.7. van 600 ml hot (50 ° C) 2 M natriumhydroxide.
    10. Herhaal stap 1.3.1 en 1.3.4 acht keer.
    11. Herhaal stap 1.3.6. en 1.3.7. van 600 ml warm (45 ° C) aceton.
    12. Herhaal stap 1.3.6. en 1.3.7. van 600 ml warm (45 ° C) ethanol.
    13. Herhaal stap 1.3.6. en 1.3.7. met behulp van 800 ml warm (50 ° C) DI water.
    14. Breng de schone SEC tot zes grote glazen petrischaaltjes en droog in een zuurkast bij kamertemperatuur gedurende 24 uur om al het water inhoud te verwijderen.
    15. Droog de SEC in een vacuümoven bij 60 ° C en 1 mbar vacuüm gedurende 10 uur of tot constant gewicht.
    16. Verzamel de gedroogde SEC en over te dragen aan een polypropyleen fles.
    17. Bewaar de SEC in een droge kast.

2. Karakterisering van SEC

  1. Voer scanning electron microscopische analyse 41 met behulp van sporen en SEC geproduceerd in verschillende stadia.
  2. Voer elementanalyse 41 via sporen en SEC geproduceerd in verschillende stadia. Dry alle monsters bij 60 ° C gedurende ten minste 1 uur voor elementaire analyse en het berekenen van het eiwitgehalte behulp procent stikstof vermenigvuldigingsfactor 6,25. 11 verkrijgen resultaten gebruikt in triplo werden uitgevoerd voor elk monster.
  3. Gedrag micromeritic eigenschappen analyse met behulp van een dynamische particle image analyzer. 41
  4. Scan onverwerkte, verwerkt en FITC-BSA-geladen SEC met behulp van confocale laser scanning microscopie. 41

3. Biomacromolecule inkapseling door Vacuum laden Techniek

  1. Bereid 1,2 ml 125 mg ml oplossing / runderserumalbumine (BSA) gebruikt DI water overgebracht in een 50 ml polypropyleen buis.
  2. Weeg 150 mg van de SEC en over te dragen aan de BSA-oplossing.
  3. Vortex de buis gedurende 10 minuten om een ​​homogene oplossing te vormen.
  4. Bedek de buis met behulp van filter papier.
  5. Breng de buis naar een vriesdroger kolf en droog gedurende 4 uur met vacuüm bij 1 mbar.
  6. Voer stap 3.1tot 3,5. drie onafhankelijke batches.
  7. Verzamel de BSA-geladen SEC en verwijder de agglomeraten met een mortier en stamper.
  8. Breng de BSA-geladen SEC in een 50 ml buis en voeg 2 ml DI water om de resterende BSA te verwijderen.
  9. Verzamel de SEC door centrifugeren bij 4704 xg gedurende 5 minuten en gooi de supernatant.
  10. Herhaal het wassen met DI-water een keer.
  11. Bedek de buis met BSA-geladen SEC met behulp van filter papier.
  12. Breng de SEC een vriezer (-20 ° C) en vries gedurende 1 uur.
  13. Bevriezen droog de SEC gedurende 24 uur en op te slaan in een vriezer tot verdere karakterisering.
  14. Bereid de placebo SEC zonder BSA volgens dezelfde procedure als in de stappen 3.1. naar 3.13.
  15. Bereid de FITC-BSA loaded SEC volgens dezelfde procedure als in stap 3,1. naar 3.13.

4. Bepaling van de inkapselingsefficiëntie

  1. Weeg 5 mg BSA-loaded SEC in 2 ml polypropyleenbuizen.
  2. Voeg 1,4 ml fbsfate gebufferde zoutoplossing pH 7,4 (PBS) en vortex gedurende 5 min.
  3. Probe ultrasone trillingen de suspensie bij 40% amplitude gedurende 3 cycli van 10 sec.
  4. Filter de oplossing om met een 0,45 pm polyethersulfon (PES) filter.
  5. Voer dezelfde procedure als in stap 4,1. tot 4,4. het gebruik van placebo sec.
  6. Meet de absorptie bij 280 nm onder toepassing placebo als blanco.
  7. Kwantificeren hoeveelheid BSA ingekapseld onder toepassing van een standaardcurve BSA (200 tot 1000 ug / ml) in PBS. 42

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gestroomlijnde Extraction Process voor sporopollenin exine Capsules

L. clavatum SEC extractie werd uitgevoerd door drie stappen: (1) Ontvetten middels aceton; (2) acidolyse behulp fosforzuur 85% (v / v); en (3) Uitgebreide SEC wassen gebruikt oplosmiddel. De stroom van de gestroomlijnde SEC extractiewerkwijze wordt getoond in Figuur 1 A -. I kort omvat de werkwijze een ontvetten met aceton onder reflux gedurende 6 uur bij 50 ° C en de ontvette sporen werden vervolgens een nacht gedroogd in een zuurkast residu te verwijderen aceton. De ontvette sporen werden onderworpen aan acidolyse gebruiken fosforzuur gedurende 30 uur. Tijdens acidolyse de meeste sporoplasmic materialen worden opgelost en vervolgens verwijderd in vacuüm filtratiestap. Om de resterende sporoplasmic materialen te verwijderen een uitgebreide reeks van wasstappen met behulp van oplosmiddelen, zuur, Bodem en water wordt uitgevoerd. De SEC werden eerst gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 24 uur en verder gedroogd bij 60 ° C en 1 mbar vacuüm gedurende 10 uur om achtergebleven oplosmiddelen en vocht te verwijderen.

Zoals getoond in figuur 1, zijn alle SEC extractiestappen uitgevoerd in een zuurkast met een aankondiging gevaar. Tijdens SEC extractie ongeveer 70% massaverlies wordt waargenomen als gevolg van de verwijdering van sporoplasmic materialen en de data consistent met bestaande rapporten van de productie van schone en intacte sec. 7, 19,20,29 De gestroomlijnde proces van de eerste stap ontvetting het eindproduct wordt voltooid in ongeveer 5 dagen en het proces kan makkelijk worden opgeschaald tot 1 kg labschaal charge met de juiste veiligheidscontroles.

Inkapseling stappen gebruikmaking SEC worden getoond in Figuur 1 J - M Deze zijn voordelig doordat ze stappen zonder involving agressieve organische oplosmiddelen of die dwarskrachten mechanische. 7 Onze inkapseling experimenten te betrekken 150 mg van de SEC en een laad-oplossing volume voldoende is voor opname door de SEC. Het laden van deze SEC wordt beperkt door verbinding oplosbaarheid in geselecteerde waterige of organische oplosmiddelen en lading kan worden bereikt door een van drie laadmethoden: passief, compressie en vacuüm laden. Echter, vacuüm loading biedt relatief hogere inkapselen van verbindingen. 7, 19,20

Fysisch-chemische Karakteriseringen van sporopollenin exine Capsules

Om de zuiverheid van SEC aangemaakt met gestroomlijnde werkwijze weergegeven in figuur 1 bepalen, het oppervlak en doorsnede morfologie, micromeritic eigenschappen en elementaire samenstelling werden bepaald op verschillende stadia van de SEC extractieproces. Zoals getoond inFiguur 2, de SEM beelden geven intact sporen met een unieke microstructuur en vóór verwerking werden micronschaal sporoplasmic organellen waargenomen beeld de dwarsdoorsnede. Met spore ontvetting en alkali behandeling werden er geen morfologische en structurele veranderingen afgezien waargenomen vanuit het scheuren van de sporoplasmic organellen.

Figuur 3 toont SEM beelden van SEC na acidolyse behulp fosforzuur op verschillende tijdstippen van 5 uur tot 30 uur. Deze resultaten ondersteunen dat acidolyse tot 30 uur levert intact en schoon SEC zonder sporoplasmic materialen. Om resterende eiwitmateriaal bevestigen, werd CHN elementanalyse 29 uitgevoerd en de gegevens worden weergegeven in Figuur 4. Deze resultaten verschaffen een richtlijn voor het kiezen van de beste behandeling conditie schoon en onbeschadigd SEC bereiken. Bij ontvette en alkali behandeld SEC, geen wezenlijke eiwitachtigeverwijderen van materiaal wordt waargenomen. Echter, met behulp acidolyse fosforzuur de meeste eiwitachtige materialen in 30 uur verwijderd en zonder verdere verlaging waargenomen bij toenemende proces tot tot 120 uur. De elementaire gegevens zijn in overeenstemming met eerdere rapporten over uitgebreide verwerking van SEC 7,11 en commerciële SEC.

Micromeritic eigenschappen werden geanalyseerd door dynamische beeld deeltjesanalyse (DIPA) en de resultaten zijn weergegeven in Figuur 5. Deze resultaten ondersteunen de uniforme grootteverdeling van SEC na acidolyse tot 30 uur, met een grootte van 31,0 ± 2,2 urn. Daarentegen SEC structurele integriteit afneemt bij langdurige acidolyse en begint aanzienlijke fragmentatie van de SEC na 30 uur behandeling duur veroorzaken.

Figuur 6 toont de SEM en DIPA gegevens SEC geproduceerd met slechts acidolyse proverwerking middels fosforzuur gedurende 30 uur. Deze resultaten bevestigen dat na de ontvetting stap acidolyse geproduceerd schoon en intact SEC met een gelijkmatige grootteverdeling van 32,5 ± 2,7 micrometer. Alleen acidolyse-SEC een resterende eiwitgehalte van slechts 0,15 ± 0,0%, bepaald ten opzichte inhoud% stikstof, 11 vergelijkbaar met SEC door alkali en acidolyse behandeling zoals hierboven en met eerdere verslagen besproken. 7

Micro-inkapseling met behulp van sporopollenin exine Capsules

Om het gebruik van L. tonen clavatum SEC geproduceerd met behulp van de acidolyse-enige proces, werden micro-inkapseling experimenten uitgevoerd met behulp van BSA als een model eiwit. Het vullen van SEC werd gemaakt van een vacuüm ladingstechniek via 150 mg SEC en 1,2 ml van 125 mg / ml BSA. Figuur 7 toont de CLSM imleeftijd van de SEC voor en na acidolyse alleen verwerken met FITC-BSA inkapseling. De gegevens blijkt dat onbehandelde SEC autofluorescentie vertonen vanwege de aanwezigheid van sporoplasm bestanddelen in de spore holte. Echter, na slechts acidolyse-processing, alle sporoplasmic inhoud verwijderd waardoor een lege inwendige holte. Opvallend na inkapseling van FITC-BSA, groene fluorescentie waargenomen in de SEC, bevestigt het inkapselen van de eiwit in model SEC. 19,20,41

Verder de morfologische veranderingen en micromeritic eigenschappen van BSA-geladen SEC, SEM en DIPA analyses werden uitgevoerd en de gegevens worden gepresenteerd in figuur 8. De SEM beelden bevestigen de aanwezigheid van intacte en schoon microridges na BSA loading onderzoeken. Bovendien werden er geen belangrijke veranderingen waargenomen in diameter circulariteit en aspectverhouding BSA na het vullen van SEC. Deze gegevens zijn consistent met eerdere rapporten over de inkapseling van geneesmiddelen via SEC. 7,10

Om de hoeveelheid ingekapseld BSA kwantificeren, werd BSA geëxtraheerd uit 5 mg BSA-geladen SEC en de gegevens worden gepresenteerd in Tabel 1. De gegevens geven 0,170 ± 0,01 g BSA lading per gram SEC. Over het algemeen, de SEM, DIPA, CLSM en kwantificering van BSA door spectrografisch analyse, bevestigen de succesvolle inkapseling van BSA in L. clavatum SEC en SEC morfologische stabiliteit.

Figuur 1
Figuur 1. Gestroomlijnde extractieproces van L. clavatum sporopollenin exine Capsules (SEC). (A) Onbehandeld sporen. (B) Spore ontvetting met een reflux opstelling bij 50 ° C gedurende 6 uur. (C) en laat solventscheiding ion ontvette sporen. (D) drogen van ontvet sporen bij kamertemperatuur. (E) Spore acidolyse PTFE kolf via 85% (v / v) fosforzuur bij 70 ° C gedurende 30 uur. (F) Acid filtratie middels vacuümfiltratie set-up. (G) SEC wassen met een reeks water, zuur, base en oplosmiddel wasstappen. (H) SEC droging met vacuümoven bij 60 ° C en 1 mbar vacuüm gedurende 10 uur. (I) Intact, schoon en gedroogd SEC als eindproduct. (J) Het mengen van SEC en BSA oplossing. (K) homogenisering van SEC en BSA oplossing. (L) Vacuum laden van BSA in sec. (M) BSA-loaded sec. klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

54.768 / 54768fig2.jpg "/>
Figuur 2. Scanning Electron microscopisch onderzoek van L. clavatum Sporen tijdens de verschillende fasen van Pre-behandeling met zuur. (A) Onbehandelde sporen waaruit sporoplasmic celorganellen en biomoleculen. (B) Aceton behandeld sporen het tonen verstoord sporoplasmic inhoud. (C) & (D) Alkali behandeld sporen toont het verwijderen van sporoplasmic inhoud en gerimpelde interne cellulosehoudende intine laag. Aangepast van 41 en worden met toestemming van wetenschappelijke verslagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Scanning Electron microscopisch onderzoek van L. clavatum Sporen tijdens de verschillende fasen van AcidBehandeling 5 tot 30 uur (A - D). Respectievelijk, 5, 10, 20 en 30 uur zuur behandelde sporen toont intact externe microstructuur en schoon inwendige holte. Aangepast van 41 en worden met toestemming van wetenschappelijke verslagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. eiwitgehalte van Sporen en sporopollenin exine Capsules (SEC). Eiwitgehalte na verschillende stadia van de behandeling. Afgebeelde gegevens is een gemiddelde van drievoudige metingen met standaard afwijking (n = 3). Aangepast van 41 en worden met toestemming van wetenschappelijke verslagen. Klik hier om een grotere versie te bekijken of dit cijfer.

figuur 5
Figuur 5. Dynamische beeldvorming Particle Analysis (DIPA) van sporen en sporopollenin exine capsules (SEC) in verschillende stadia van behandeling Kolommen (A - C). Respectievelijk, pre-behandeling met zuur, zuurbehandeling, en intacte SEC. Plots zijn representatief grafieken van SEC diameter, circulariteit, aspect ratio, en de rand gradiënt. Aangepast van 41 en worden met toestemming van wetenschappelijke verslagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6. Scanning Electron Microscopy (SEM) en Dynamic Imaging Particle Analysis (DIPA) van 30 uur Acidolysis-only sporopollenin exine Capsules (SEC). (A) SEC blijkt intact externe microstructuur en schoon inwendige holte. (B) Vertegenwoordiger grafieken van SEC diameter, rondheid, en aspect ratio. Aangepast van 41 en worden met toestemming van wetenschappelijke verslagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7. confocale laser scanning microscopie (CLSM) Analyse van sporopollenin exine Capsules (SEC) voor en na de behandeling en BSA inkapseling. De eerste rij toont onbehandeld sporen tonen sporoplasmic cellulaire organel en biomolecuul autofluorescentie. De tweede rij toont 30 hr acidolyse-only SEC met een lege inwendige holte. De derde rij toont FITC- BSA beladenin 30 uur acidolyse alleen sec. (Schaal bars zijn 10 urn). Aangepast van 41 en worden met toestemming van wetenschappelijke verslagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8
Figuur 8. Scanning Electron Microscopy (SEM) en Dynamic Imaging Particle Analysis (DIPA) Karakterisering van BSA-geladen sporopollenin exine Capsules (SEC). (A) SEM beelden van BSA-geladen sec. (B) Vertegenwoordiger grafieken van BSA-geladen SEC diameter, circulariteit, aspect ratio, en de rand gradiënt. Aangepast van 41 en worden met toestemming van wetenschappelijke verslagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Materiaal BSA lading per batch (125 mg / ml) BSA in 5 mg SEC (mg) Bedrag van BSA beladen (g per g SEC) onbehandelde sporen 0,6 ml 0,654 ± 0,05 0,131 ± 0,01 SEC 1,2 ml 0,831 ± 0,05 0.170 ± 0.01

Tabel 1. Inkapseling van runderserumalbumine (BSA) in Onbehandeld Sporen en SEC. Volume van de BSA-oplossing gebruikt voor het laden per 150 mg partij 'onbehandeld sporen' of 'SEC'. Afgebeelde gegevens is een gemiddelde van drievoudige batches met standaarddeviatie (n = 3). Aangepast van 41 en worden met toestemming van wetenschappelijke verslagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit werk, een systematische analyse van de SEC extractie uit L. clavatum sporen wordt gepresenteerd en dit rapport toont aan dat het mogelijk is om een hogere kwaliteit capsules produceren voort als een belangrijke stroomlijning van de bestaande voorkomend protocol. 11 In tegenstelling tot de bestaande protocol die een hoge procestemperatuur (180 ° C) en lange procesduur (7 dagen), 11 de huidige SEC winning processing optimalisatie is primair gericht op het verlagen van de temperatuur en de duur van de acidolyse stap.

Het ontvetten en alkali behandelingen minimale verwijdering van sporoplasmic materiaal van sporen. Echter, acidolyse van 5 uur tot 120 uur het maximumbedrag van de sporoplasmic materiaal verwijderd. De resultaten gaven aan dat de totale duur en temperatuur behandeling drastisch kan worden teruggebracht van gebruikelijke technieken, 11 en dat slechts 30 uur bij gematigde temperatuur (70° C) fosforzuur ontvangen de optimale capsules. Ook na 30 uur acidolyse, bleek dat de SEC begon te breken en een significante toename van deeltjes fragmenten waargenomen, wat suggereert dat de gehele partij SEC kan vertonen een vermindering van de totale structurele integriteit. Bovendien moet worden opgemerkt dat L. clavatum wordt beschouwd als relatief robuuste sporopollenin, 2 omvatten en dat de specifieke verwerkingsomstandigheden betrokken bij dit protocol, zoals zuurconcentratie, temperatuur en / of duur hydrolyse, moet worden aangepast voor andere soorten pollen.

Er werd aangetoond dat de productie van SEC door acidolyse uitsluitend via fosforzuur (85% v / v) gedurende 30 uur opbrengsten schoon en intact sec. 41 De gegevens bevestigen dat acidolyse is de cruciale stap in SEC productie. Tenslotte werden de zuur-SEC alleen gebruikt voor het inkapselen van BSA en een hoge beladingsgraad waargenomen. Het laden wzoals bereikt met de toepassing van een vacuüm, waarbij de inwendige holte SEC druk wordt gewijzigd volgens de BSA oplossing in de lege capsules kracht trekken. Nanokanalen (dia 15 -. 20 nm), die eerder zijn geïdentificeerd in de exine wanden van L. clavatum, 7 laat de oplossing in de grote inwendige holte aan te gaan. Na het laden werden de capsules gewassen en in een vriesdroger gedroogd tot een vrij vloeiend poeder.

Size uniformiteit en morfologische kenmerken zijn belangrijke factoren voor het evalueren van de kwaliteit van een succesvolle inkapseling materiaal. De waargenomen omvang uniformiteit en intacte morfologie van BSA-geladen SEC bevestigde het potentieel gebruik van acidolyse-only verwerkt SEC voor micro-inkapseling toepassingen.

Deze resultaten zijn belangrijk voor de grootschalige industriële productie van SEC en wekken van grotere belangstelling voor de mogelijke toepassingen van SEC in de micro-inkapseling van geneesmiddelen,eiwitten, peptiden, voedingssupplementen, nutraceuticals, en cosmetica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paunov, V. N., Mackenzie, G., Stoyanov, S. D. Sporopollenin micro-reactors for in-situ preparation, encapsulation and targeted delivery of active components. J. Mater. Chem. 17, (7), 609-612 (2007).
  2. Barrier, S. Physical and chemical properties of sporopollenin exine particles. Doctoral dissertation thesis. University of Hull. (2008).
  3. Dosage Form. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. US 7,608,270 B2 (2009).
  4. Lorch, M., et al. MRI contrast agent delivery using spore capsules: controlled release in blood plasma. Chem. Comm. (42), 6442-6444 (2009).
  5. Wakil, A., Mackenzie, G., Diego-Taboada, A., Bell, J. G., Atkin, S. L. Enhanced bioavailability of eicosapentaenoic acid from fish oil after encapsulation within plant spore exines as microcapsules. Lipids. 45, (7), 645-649 (2010).
  6. Barrier, S., et al. Sporopollenin exines: A novel natural taste masking material. LWT-Food Sci. Technol. 43, (1), 73-76 (2010).
  7. Barrier, S., et al. Viability of plant spore exine capsules for microencapsulation. J. Mater. Chem. 21, (4), 975-981 (2011).
  8. Hamad, S. A., Dyab, A. F., Stoyanov, S. D., Paunov, V. N. Encapsulation of living cells into sporopollenin microcapsules. J. Mater. Chem. 21, (44), 18018-18023 (2011).
  9. Diego-Taboada, A., et al. Sequestration of edible oil from emulsions using new single and double layered microcapsules from plant spores. J. Mater. Chem. 22, (19), 9767-9773 (2012).
  10. Diego-Taboada, A., et al. Protein free microcapsules obtained from plant spores as a model for drug delivery: Ibuprofen encapsulation, release and taste. Mater. Chem. B. 1, (5), 707-713 (2013).
  11. Atwe, S. U., Ma, Y., Gill, H. S. Pollen grains for oral vaccination. J. Control. Release. 194, 45-52 (2014).
  12. Mackenzie, G., Beckett, S., Atkin, S., Diego-Taboada, A., et al. Ch 24. Microencapsulation in the Food Industry: A Practical Implementation Guide. Gaonkar, A. G., et al. Elsevier. 283-297 (2014).
  13. Diego-Taboada, A., Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. Hollow Pollen Shells to Enhance Drug Delivery. Pharmaceutics. 6, (1), 80-96 (2014).
  14. Ma, H., et al. Preparation of a novel rape pollen shell microencapsulation and its use for protein adsorption and pH-controlled release. J. Microencapsul. 31, (7), 667-673 (2014).
  15. Archibald, S. J., et al. How does iron interact with sporopollenin exine capsules? An X-ray absorption study including microfocus XANES and XRF imaging. J. Mater. Chem. B. 2, (8), 945-959 (2014).
  16. Southworth, D., et al. Ch 10. Microspores Evolution and Ontogeny: Evolution and Ontogeny. Blackmore, S., et al. Academic Press. 193-212 (2013).
  17. Stanley, R. G., Linskens, H. F. Pollen: Biology, Biochemistry, Management. Springer-Verlag. Berlin, Germany. 307 (1974).
  18. Ariizumi, T., Toriyama, K. Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine development. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 437-460 (2011).
  19. Mundargi, R. C., et al. Natural Sunflower Pollen as a Drug Delivery Vehicle. Small. 12, (9), 1167-1173 (2015).
  20. Mundargi, R. C., et al. Lycopodium Spores: A Naturally Manufactured, Superrobust Biomaterial for Drug Delivery. Adv. Funct. Mater. 26, (4), 487-497 (2015).
  21. Topical Formulations Containing Sporopollenin. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. WO2007012857A1 (2007).
  22. Zetzsche, F., Huggler, K. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen I. 1. Lycopodium clavatum L. Liebigs Ann. Chem. 461, (1), 89-109 (1928).
  23. Zetschke, F., Kaelin, O. Untersuchungen über die membran der sporen und pollen v. 4. Zur autoxydation der sporopollenine. Helv. Chim. Acta. 14, (1), 517-519 (1931).
  24. Zetzsche, F., Vicari, H. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen III. 2. Picea orientalis Pinus silvestris L., Corylus Avellana L. Helv. Chim. Acta. 14, (1), 62-67 (1931).
  25. Zetzsche, F., Kalt, P., Liechti, J., Ziegler, E. Zur Konstitution des Lycopodium-Sporonins, des Tasmanins und des Lange-Sporonins. XI. Mitteilung über die Membran der Sporen und Pollen. Journal für Praktische Chemie. 148, (9-10), 267-286 (1937).
  26. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. Grana. 5, (2), 247-252 (1964).
  27. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. J. Chem. Soc. C Org. 16-22 (1966).
  28. Domìnguez, E., Mercado, J. A., Quesada, M. A., Heredia, A. Pollen sporopollenin: degradation and structural elucidation. Sex. Plant Reprod. 12, (3), 171-178 (1999).
  29. Mundargi, R. C., Tan, E. L., Seo, J., Cho, N. J. Encapsulation and controlled release formulations of 5-fluorouracil from natural Lycopodium clavatum spores. J. Ind. Eng. Chem. 36, 102-108 (2016).
  30. Orhan, I., Küpeli, E., Şener, B., Yesilada, E. Appraisal of anti-inflammatory potential of the clubmoss, Lycopodium clavatum L. J. Ethnopharmacol. 109, (1), 146-150 (2007).
  31. Baytop, T. Therapy with medicinal plants in Turkey. 2nd, Nobel Tip Kitabevleri Ltd. Istanbul. 334-335 (1999).
  32. Pathak, S., Banerjee, A., Paul, S., Khuda-Bukhsh, A. R. Protective potentials of a plant extract (Lycopodium clavatum) on mice chronically fed hepato-carcinogens. Indian J. Exp. Biol. 47, (7), 602-607 (2009).
  33. Ma, X., Gang, D. R. The lycopodium alkaloids. Nat. Prod. Rep. 21, (6), 752-772 (2004).
  34. Bishayee, K., Chakraborty, D., Ghosh, S., Boujedaini, N., Khuda-Bukhsh, A. R. Lycopodine triggers apoptosis by modulating 5-lipoxygenase, and depolarizing mitochondrial membrane potential in androgen sensitive and refractory prostate cancer cells without modulating p53 activity: signaling cascade and drug-DNA interaction. Eur. J. Pharmacol. 698, (1), 110-121 (2013).
  35. Durdun, C., Papuc, C., Crivineanu, M., Nicorescu, V. Antioxidant potential of Lycopodium clavatum and Cnicus benedictus hydroethanolic extracts on stressed mice. Scientific Works-University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine, Bucharest Series C, Veterinary Medicine. 57, (3), 61-68 (2011).
  36. Banerjee, J., Biswas, S., Madhu, N. R., Karmakar, S. R., Biswas, S. J. A better understanding of pharmacological activities and uses of phytochemicals of Lycopodium clavatum: A review. J. Pharmacogn. Phytochem. 3, (1), 207-210 (2014).
  37. Mundargi, R. C., et al. Extraction of sporopollenin exine capsules from sunflower pollen grains. RSC Adv. 6, (20), 16533-16539 (2016).
  38. Modeling Polyethylene Fractionation Using the Statistical Associating Fluid Theory. Mathias, P. M., Chen, C. C., Walters, M. Proceedings of 3rd Joint China/USA Chemical Engineering Conference, Beijing, China, (2000).
  39. El-Bayaa, A., Badawy, N., Gamal, A., Zidan, I., Mowafy, A. Purification of wet process phosphoric acid by decreasing iron and uranium using white silica sand. J. Hazar. Mater. 190, (1), 324-329 (2011).
  40. Carr, J., Zhang, L., Davis, M., Ravishankar, S., Flieg, G. Scale Controlling Chemical Additives for Phosphoric Acid Production Plants. Procedia Engineering. 83, 233-242 (2014).
  41. Mundargi, R. C., et al. Eco-friendly streamlined process for sporopollenin exine capsule extraction. Sci. Rep. 6, 1-14 (2016).
  42. Smith, B. C. Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. CRC press. 182 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics