Las cápsulas de origen vegetal extracción de microencapsulación para Aplicaciones

1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
Bioengineering

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Summary

Este protocolo / manuscrito describe un proceso simplificado para la producción de cápsulas exina sporopollenin (segundos) de las esporas de Lycopodium clavatum y para la carga de compuestos hidrófilos en estos SEC.

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Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

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Abstract

Las microcápsulas derivadas de esporas o polen de origen vegetal proporcionan una plataforma sólida para una amplia gama de aplicaciones de microencapsulación. cápsulas sporopollenin exina (segundos) se obtienen cuando las esporas o polen son procesadas a fin de eliminar el contenido sporoplasmic internos. Las microcápsulas huecas resultantes exhiben un alto grado de uniformidad micromeritic y conservan características microestructurales intrincados relacionados con las especies de plantas particulares. En este documento, se demuestra un proceso simplificado para la producción de los CEE a partir de esporas clavatum Lycopodium y para la carga de compuestos hidrófilos en estos SEC. El procedimiento actual aislamiento SEC ha sido optimizado recientemente para reducir significativamente los requisitos de transformación que se usan convencionalmente en el aislamiento de la SEC, y para asegurar la producción de microcápsulas intactas. L. Natural esporas clavatum se desgrasados con acetona, se trató con ácido fosfórico, y extensamente lavadas para eliminar sporoplasmicontenido c. Después de desgrase acetona, un solo paso de procesamiento utilizando ácido fosfórico al 85% se ha demostrado para eliminar todos los contenidos sporoplasmic. Al limitar el tiempo de procesamiento de ácido a 30 hr, es posible aislar SEC limpias y evitar SEC fracturación, que se ha demostrado que se producen con el tiempo de procesamiento prolongado. Lavado extensivo con agua, ácidos diluidos, diluir bases, y disolventes asegura que todos los residuos de material y químicas sporoplasmic se eliminan adecuadamente. La técnica de carga de vacío se utiliza para cargar una proteína modelo (albúmina de suero bovino) como un compuesto hidrófilo representante. carga de vacío proporciona una técnica sencilla para cargar varios compuestos sin la necesidad de disolventes agresivos o productos químicos indeseables que a menudo se requieren en otros protocolos de microencapsulación. Sobre la base de estos protocolos de aislamiento y de carga, SEC proporcionar un material prometedor para su uso en una amplia gama de aplicaciones de microencapsulación, como por ejemplo, terapéutica, alimentos, cosméticos, cuidado personal y prodductos.

Introduction

Existe un interés significativo en cápsulas a base de plantas naturales obtenidos a partir de las esporas y el polen de las plantas para uso en aplicaciones de microencapsulación. 1-15 En la naturaleza, las esporas y el polen proporcionan protección para materiales genéticos sensibles contra condiciones ambientales duras. La estructura básica de las esporas de plantas y polen comprende típicamente una capa externa shell (exina), una capa envolvente interior (intine), y el material citoplásmica interna. La exina se compone de una químicamente robusto biopolímero 1,9,10,13,16 referido como sporopollenin y de la intine se compone principalmente de materiales celulósicos. 16-18 cápsulas vacías se pueden aislar mediante diversos procesos de 7,9 para la eliminación de material citoplásmico , proteínas, y la capa intine. 2,12,16 Estas cápsulas exina sporopollenin (SEC) proporcionan una alternativa atractiva a los encapsulantes sintéticas debido a su estrecha distribución de tamaño y morfología uniforme. 7,9,13,19,20 eldesarrollo de procesos estandarizados para obtener SEC de diversas especies de plantas, tales como Lycopodium clavatum, se abre la posibilidad de una amplia gama de aplicaciones de microencapsulación en los campos de la administración de fármacos, alimentos y cosméticos. 6,10-13,21

Con el fin de obtener SEC, los investigadores trataron primero esporas y el polen con disolventes orgánicos y calentó a reflujo en soluciones alcalinas para eliminar contenido citoplásmico. 22-25 Sin embargo, se determinó la estructura de cápsula restante todavía contienen la capa intine celulósico. Para eliminar esto, los investigadores exploraron el uso del procesamiento de la hidrólisis ácida prolongado con ácido clorhídrico, ácido sulfúrico caliente, o ácido fosfórico caliente durante varios días, 22-25 con ácido fosfórico convertirse en el método preferido de eliminación intine SEC. 2 Sin embargo, en curso la investigación en los últimos años ha demostrado que varias esporas y pólenes tienen diferentes grados de firmeza frente a la dura conmigo procesamientothods comúnmente utilizado. 26,27 Algunas esporas y el polen son completamente degradados y pierden toda la integridad estructural en soluciones alcalinas fuertes, o se vuelven fuertemente dañado de fuertes soluciones ácidas. 16 La variabilidad en la respuesta a SEC condiciones de tratamiento es debido a las variaciones sutiles en el producto químico la estructura y la morfología del material exina sporopollenin exina entre las especies. 28 Debido a la variabilidad en la robustez de cápsulas exina sporopollenin (segundos), es necesario optimizar las condiciones de transformación para cada especie de esporas y el polen.

Esporas de plantas de la especie L. Clavatum se han convertido en la fuente más ampliamente estudiado de la SEC. Se propone que esto es principalmente debido a su amplia disponibilidad, bajo coste, monodispersividad, química y robustez 9,29 Las esporas pueden ser fácilmente cosechada y contiene contenidos sporoplasmic en forma de agrupaciones de 1 -. 2 micras orgánulos celulares y biomolecules. 11 L. esporas clavatum se han utilizado como un lubricante en polvo natural, 30,31 una base para cosméticos, 30 y 32 a 36 en la medicina herbal para una amplia gama de aplicaciones terapéuticas. Las SEC obtenidos de L. clavatum han demostrado ser más resistentes al procesamiento de SEC de otras especies de esporas y el polen. 2 Después del procesamiento, las SEC resultantes se han demostrado para conservar sus estructuras microridge intrincados y alta uniformidad morfológica mientras que proporciona una gran cavidad interna para la encapsulación. 7 Los estudios indican que L. SEC clavatum se pueden utilizar para la encapsulación de medicamentos, vacunas, 10,13 11 proteínas, células, 7,14 8 aceites, 5-7,9 y suplementos alimenticios. 5,15 observados eficiencias de carga de la SEC son relativamente altos en comparación con los convencionales encapsulación de materiales. 7 también hay una serie de beneficios reportadosa SEC encapsulación tales como la capacidad de enmascarar sabores, 6,10 y para proporcionar algún grado de protección natural contra la oxidación. 12 En los estudios existentes, el método de extracción más utilizada SEC para L. Clavatum se basa en cuatro pasos principales. El primer paso es de reflujo del disolvente en acetona durante un máximo de 12 horas a 50 ° C para desecar las esporas. 11 El segundo paso es el reflujo alcalino en hidróxido de potasio al 6% para un máximo de 12 horas a 120 ° C para eliminar citoplasmática y materiales proteicos. 11 Paso tres es el reflujo ácido en ácido fosfórico al 85% durante un máximo de 7 días a 180 ° C para eliminar el material intine celulósico. 11 el cuarto paso es un proceso exhaustivo lavado usando agua, disolventes, ácidos y bases para eliminar todo el material no exina restante y residuos químicos.

Los principales objetivos de la extracción de la SEC en relación con las aplicaciones de encapsulación son para producir cápsulas que están vacías de material citoplasmático, libre de aquí para alláproteínas M potencialmente alergénicos, y morfológicamente intactos. 2,37 Sin embargo, desde una perspectiva de fabricación industrial, también es importante tener en cuenta factores económicos y ambientales adicionales, tales como, la eficiencia energética, la duración de producción, seguridad, y los residuos resultantes. Con respecto a la eficiencia energética, tanto en altas temperaturas y largos tiempos de procesamiento afectan a los costes de producción, así como el impacto medioambiental. duración de la producción y el tiempo de respuesta son factores clave que influyen en la rentabilidad de procesamiento. De particular preocupación es que el procesamiento de ácido fosfórico de alta temperatura aumenta los problemas de seguridad y es conocido por producir incrustaciones corrosivo que conduce a un aumento significativo en el mantenimiento de infraestructuras y los retrasos en los tiempos de respuesta por lotes. 38-40 Siempre que sea posible, reduciendo al mínimo el número de pasos necesarios puede conducir a reducir significativamente los residuos producidos. Sin embargo, el comúnmente utilizado proceso de cuatro pasos de L. extracción Clavatum SEC tiene simplemente evolved de décadas de investigación y ha tenido poco optimización del proceso real. Recientemente, Mundargi et al., 41 hizo una importante contribución a la labor en curso en este campo mediante la evaluación y optimización de una de las técnicas de extracción de la SEC con mayor frecuencia de forma sistemática.

En la primera sección de este estudio: pérdida de grasa de esporas se demuestra la utilización de procesamiento de acetona a 50 ° C durante 6 horas; procedimientos esporoplasma y de eliminación de intine se demuestran la utilización de procesamiento de ácido fosfórico 85% a 70 ° C durante 30 h; extenso lavado con agua, disolventes, ácido y la base se utiliza para demostrar la eliminación de contenidos sporoplasmic residuales; y SEC secado se demuestra utilizando secado por convección y secado en horno de vacío. En la tercera sección, SEC carga de vacío se demuestra utilizando la carga de vacío de una proteína modelo, la albúmina de suero bovino (BSA), seguido de BSA-carga-SEC lavado y liofilización. En la cuarta sección, el deteración de la eficiencia de encapsulación de BSA se demuestra utilizando la centrifugación, la sonda de ultrasonidos, rayos UV y Vis / espectrometría.

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Protocol

1. Extracción de sporopollenin exina Cápsulas (SEC) de L. Las esporas clavatum

Nota: El proceso de extracción SEC implica un polvo inflamable (L. Clavatum), ácidos corrosivos calientes y disolventes inflamables, por lo tanto, el equipo de protección personal adecuado (gafas, mascarilla, guantes, bata de laboratorio), la evaluación de riesgos aprobado el uso y disposición de productos químicos autorizados por el personal de laboratorio es esencial.

  1. Spore Desengrasante
    1. Preparar un reflujo configuración en una campana de extracción mediante el uso de un condensador de vidrio, sistema de circulación de agua, y baño de agua (Figura 1).
    2. Pesar 100 g L. esporas clavatum sin crear polvo y alejado de cualquier fuente de ignición.
      Nota: Las esporas usadas aquí fueron obtenidos comercialmente (Ver Lista de Materiales).
    3. esporas de transferencia lentamente a una politetrafluoroetileno 1 L (PTFE) matraz de fondo redondo con una varilla de agitación magnética.
    4. Añadir 500 ml de acetona a las esporas en elmatraz de PTFE y agitarlo suavemente para formar una suspensión homogénea.
    5. Colocar el matraz de PTFE en el conjunto de baño de agua a 50 ° C y conectar con el condensador de reflujo.
    6. Realizar reflujo en acetona durante 6 horas con agitación a 200 rpm y luego se deja enfriar a temperatura ambiente.
    7. Se filtró la suspensión utilizando un papel de filtro al vacío y recoger las esporas desgrasadas en grandes placas de Petri de vidrio (15 cm de diámetro).
    8. Se secan las esporas a temperatura ambiente (campana de humos), cubriendo con papel de aluminio con orificios para la evaporación del disolvente.
  2. acidolysis
    1. Preparar 85% (v / v) de ácido fosfórico con agua desionizada (DI) y la transferencia de esporas secas desgrasados ​​a un matraz PTFE 1 L.
    2. Añadir 500 ml de ácido fosfórico (85% v / v) a las esporas desgrasados.
    3. Colocar el matraz en un conjunto de PTFE baño de agua a 70 ° C y conectar con el condensador de reflujo.
    4. Realizar suave reflujo (70 ° C) en ácido fosfórico durante 30 horas y se dejafresco a temperatura ambiente.
    5. Diluir la suspensión mediante el uso de agua DI 500 ml cálido y recoger las SEC por filtración al vacío utilizando papel de filtro.
    6. La transferencia de la SEC a un vaso de precipitados de vidrio de 3 l para realizar una serie de lavados.
  3. Lavado SEC
    1. Poner el vaso de vidrio de 3 l que contenía los CEE en una campana de humos.
    2. Añadir (50 ° C) agua DI 800 ml caliente a las SEC con agitación suave durante 10 minutos.
    3. Se filtra la suspensión mediante el uso de papel de filtro y una filtración al vacío puesta a punto.
    4. Recoger la SEC en un vaso de vidrio limpio de 3 litros.
    5. Repita los pasos 1.3.1. a 1.3.4. cinco veces.
    6. Añadir 600 ml de acetona caliente (45 ° C) para las SEC con agitación suave durante 10 minutos.
    7. Recoger las SEC por filtración en vacío y transferir los segundos para una limpieza vaso de vidrio de 3 l.
    8. Repita los pasos 1.3.6. y 1.3.7. utilizando 600 ml calientes (50 ° C) de ácido clorhídrico 2 M.
    9. Repita los pasos 1.3.6. y 1.3.7. utilizando 600 ml hot (50 ° C) de hidróxido de sodio 2 M.
    10. Repita los pasos 1.3.1 y 1.3.4 de ocho veces.
    11. Repita los pasos 1.3.6. y 1.3.7. utilizando 600 ml calientes (45 ° C) de acetona.
    12. Repita los pasos 1.3.6. y 1.3.7. utilizando 600 ml calientes (45 ° C) de etanol.
    13. Repita los pasos 1.3.6. y 1.3.7. utilizando 800 ml calientes (50 ° C) de agua DI.
    14. La transferencia de las SEC limpias a los seis grandes placas de Petri de vidrio y seca en una campana de extracción a temperatura ambiente durante 24 horas para eliminar todo el contenido de agua.
    15. Se secan las SEC en un horno de vacío a 60 ° C y 1 mbar de vacío durante 10 horas o hasta peso constante.
    16. Recoger la SEC seca y transferir a una botella de polipropileno.
    17. Almacenar la SEC en un armario seco.

2. Caracterización de los SEC

  1. Realizar electrónica de barrido análisis microscópico 41 utilizando esporas y SEC producidos en diferentes etapas.
  2. Realizar análisis elemental 41 utilizando esporas y SEC producidos en diferentes etapas. rery todas las muestras a 60 ° C durante al menos 1 hora antes del análisis elemental y calcular el contenido de proteína usando por ciento de nitrógeno, con un factor de multiplicación de 6,25. 11 obtener resultados utilizando mediciones por triplicado para cada muestra.
  3. Realizar un análisis de las propiedades micromeritic usando un analizador de partículas imagen dinámica. 41
  4. Analiza no procesado, procesado, y los SEC FITC-BSA-cargados mediante microscopía confocal de barrido láser. 41

3. biomacromolécula encapsulación por vacío Cargando Técnica

  1. Preparar 1,2 ml de 125 mg / ml solución de albúmina de suero bovino (BSA) usando agua DI y la transferencia a un tubo de polipropileno de 50 ml.
  2. Pesar 150 mg de los CEE y la transferencia a la solución de BSA.
  3. Vortex el tubo durante 10 min para formar una solución homogénea.
  4. Cubrir el tubo con papel de filtro.
  5. Transferir el tubo a un matraz liofilizador y secar durante 4 horas con vacío a 1 mbar.
  6. Realice los pasos 3.1a 3,5. para tres lotes independientes.
  7. Recoger la SEC cargadas con BSA y eliminar los aglomerados mediante el uso de un mortero.
  8. La transferencia de las SEC BSA-cargados a un tubo de 50 ml y añadir agua DI 2 ml para eliminar el residuo de BSA.
  9. Recoger las SEC por centrifugación a 4.704 xg durante 5 minutos y descartar el sobrenadante.
  10. Repetir el lavado con agua DI vez.
  11. Cubrir el tubo que contiene los SEC cargadas con BSA utilizando papel de filtro.
  12. La transferencia de los segundos para un congelador (-20 ° C) y congelar durante 1 hora.
  13. Liofilizar la SEC durante 24 horas y guardar en un congelador hasta su posterior caracterización.
  14. Preparar las SEC placebo sin BSA utilizando el mismo procedimiento que en los pasos 3.1. a 3.13.
  15. Preparar las SEC cargados FITC-BSA usando el mismo procedimiento que en los pasos 3.1. a 3.13.

4. Determinación de la eficiencia de encapsulación

  1. Pesar 5 mg de BSA SEC-cargadas en tubos de 2 ml de polipropileno.
  2. Añadir 1,4 ml fosfate solución salina tamponada de pH 7,4 (PBS) y agitar durante 5 min.
  3. Sonda sonicar la suspensión a 40% de amplitud durante 3 ciclos de 10 seg.
  4. Se filtra la solución con un filtro de 0,45 micras de polietersulfona (PES).
  5. Realice el mismo procedimiento que en los pasos 4.1. a 4,4. utilizando los SEC placebo.
  6. Medir la absorbancia a 280 nm utilizando un placebo como blanco.
  7. Cuantificar la cantidad de BSA encapsulado utilizando una curva estándar de BSA (200 a 1.000 g / ml) en PBS. 42

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Representative Results

Proceso de extracción optimizada para sporopollenin exina Cápsulas

El L. extracción clavatum SEC se logró mediante tres pasos principales: (1) degradación de grasa usando acetona; (2) La acidolisis usando ácido fosfórico al 85% (v / v); y (3) Amplia lavado SEC uso de disolventes. El flujo del proceso de extracción SEC simplificado se presenta en la Figura 1 A -. I Brevemente, el proceso implica una etapa de desgrasado con reflujo de acetona durante 6 horas a 50 ° C y las esporas desgrasados se secaron durante la noche en una campana de humos para eliminar residual acetona. Las esporas desgrasados ​​se sometieron a acidolisis usando ácido fosfórico durante 30 horas. Durante acidólisis la mayoría de los materiales sporoplasmic se disuelven y luego se retira durante la etapa de filtración a vacío. Con el fin de eliminar los materiales residuales sporoplasmic una extensa serie de etapas de lavado usando solventes, ácido, Se lleva a cabo base, y agua. Los SEC se secaron inicialmente a temperatura ambiente durante 24 hr y se secó adicionalmente a 60 ° C y 1 mbar de vacío durante 10 horas para eliminar los disolventes residuales y la humedad.

Como se muestra en la Figura 1, todas las etapas de extracción a la SEC se realizaron en una campana de humos con un aviso de peligro. Durante la extracción SEC, aproximadamente el 70% de pérdida de masa se observa debido a la eliminación de materiales sporoplasmic y nuestros datos es coherente con los informes existentes de la producción de SEC limpios e intactos. 7, 19,20,29 El proceso simplificado de la etapa inicial de desengrasado hasta el producto final se completa en aproximadamente 5 días y el proceso se puede escalar fácilmente hasta un 1 kg de laboratorio de lote escala con los controles de seguridad adecuadas.

Pasos de encapsulación que utilizan los CEE se presentan en la Figura 1 J - M, éstos son ventajosos debido a ser sencillos pasos sin involving disolventes orgánicos agresivos o que requieran fuerzas de cizallamiento mecánicas. 7 Nuestros experimentos implican encapsulación 150 mg de SEC y un volumen de solución de carga suficiente para su absorción por las SEC. La carga en estas SEC está limitada por la solubilidad del compuesto en disolventes acuosos u orgánicos seleccionados, y la carga se puede conseguir por cualquiera de los tres métodos de carga: pasiva, la compresión, y la carga de vacío. Sin embargo, la carga de vacío proporciona relativamente más alta de encapsulación de compuestos. 7, 19,20

Las caracterizaciones físico-químicas de sporopollenin exina Cápsulas

Para determinar la limpieza de SEC producidos utilizando el proceso simplificado presentado en la Figura 1, la superficie y la sección transversal morfología, propiedades micromeritic, y la composición elemental se examinaron en las diferentes etapas del proceso de extracción SEC. Como se muestra enLa figura 2, las imágenes de SEM indican esporas intactas con una microestructura única, y antes de la transformación, se observaron orgánulos sporoplasmic a escala micrométrica en la imagen de la sección transversal. Con desgrase de esporas y el tratamiento alcalino no se observaron cambios morfológicos y estructurales además de la ruptura de los orgánulos sporoplasmic.

La Figura 3 muestra imágenes de SEM de SEC después de acidolisis usando ácido fosfórico a diversos puntos de tiempo de 5 h a 30 h. Estos resultados apoyan que acidolysis para un máximo de 30 horas ofrece SEC intacta y limpia desprovistos de materiales sporoplasmic. Con el fin de confirmar material proteínico residual, análisis elemental CHN 29 se realizó y los datos se presentan en la Figura 4. Estos resultados proporcionan una guía para elegir la mejor condición de procesamiento para lograr SEC limpios e intactos. En el caso de SEC desgrasada y tratado con álcali, no proteináceo sustancialse observa la eliminación de material. Sin embargo, con acidolisis usando ácido fosfórico, la mayoría de los materiales proteicos se retira en 30 horas y no más allá de reducción se observó al aumentar el tiempo de proceso de hasta 120 horas. Los datos elemental es coherente con los informes anteriores sobre el procesamiento extendida de los SEC 7,11 y con los SEC comerciales.

Propiedades Micromeritic se analizaron por análisis de partículas imagen dinámica (DIPA) y los resultados se presentan en la Figura 5. Estos resultados apoyan la distribución de tamaño uniforme de SEC después de acidolisis para un máximo de 30 h, con un tamaño de 31,0 ± 2,2 micras. Por el contrario, la integridad estructural de la SEC disminuye con acidolysis prolongada y comienza a causar la fragmentación significativa de las SEC más allá de las duraciones de tratamiento 30 hr.

La Figura 6 muestra los datos SEM y DIPA para SEC producidos con solamente acidólisis proprocesamiento usando ácido fosfórico durante 30 horas. Estos resultados confirman que después de la etapa de desgrasado, acidolysis produjo SEC limpios e intactos con una distribución de tamaño uniforme de 32,5 ± 2,7 micras. Acidólisis de sólo SEC tienen un contenido de proteína residual de tan sólo 0,15 ± 0,0%, como se determina en relación con el contenido de% de nitrógeno, 11 que es comparable a SEC producidos por álcali y acidólisis tratamiento como se discutió anteriormente y con los informes anteriores. 7

La microencapsulación usando sporopollenin exina Cápsulas

Con el fin de demostrar el uso de L. SEC clavatum producidos utilizando el proceso de acidólisis de sólo, los experimentos de microencapsulación se realizaron con BSA como proteína modelo. La carga en SEC se logró mediante el uso de una técnica de carga de vacío usando 150 SEC mg y 1,2 ml de 125 mg / ml de BSA. Figura 7 muestra el im CLSMedades de los SEC antes y después del procesamiento acidolysis solamente y con FITC-BSA encapsulado. Los datos indican que la autofluorescencia SEC no tratados exposición debido a la presencia de componentes esporoplasma dentro de la cavidad de esporas. Sin embargo, después de la elaboración acidolysis-solamente, todos los contenidos sporoplasmic se eliminan lo que resulta en una cavidad interior vacío. Sorprendentemente, después de la encapsulación de FITC-BSA, fluorescencia verde se observa dentro de la SEC, lo que confirma la encapsulación de la proteína modelo en SEC. 19,20,41

Además, para investigar los cambios morfológicos y propiedades micromeritic de BSA-cargados SEC, SEM y análisis DIPA se llevaron a cabo y los datos se presentan en la Figura 8. Las imágenes SEM confirman la presencia de microcrestas intactos y limpios después de BSA carga. Además, no se observaron cambios sustanciales en el diámetro, circularidad, y relación de aspecto después de BSA carga en SEC. Estos datos son consiste delnt con informes anteriores sobre la encapsulación de fármacos que utilizan los SEC. 7,10

Para cuantificar la cantidad de BSA encapsulado, BSA fue extraída de 5 mg de SEC cargadas con BSA, y los datos se presentan en la Tabla 1. Los datos indican 0,170 ± 0,01 g de BSA de carga por gramo de SEC. En general, el SEM, DIPA, CLSM, y cuantificación de BSA por análisis espectrográfico, confirman la encapsulación con éxito de BSA en L. SEC SEC clavatum y estabilidad morfológica.

Figura 1
Figura 1. Proceso de Simplificación Extractor de L. Clavatum sporopollenin exina Cápsulas (SEC). (A) las esporas no tratadas. (B) Spore desgrasado utilizando un reflujo configuración a 50 ° C durante 6 hr. (C) de filtración de disolventes y recoger ion de esporas desgrasados. (D) Secado de esporas desgrasados a temperatura ambiente. (E) acidólisis Spore en matraz de PTFE usando 85% (v / v) de ácido fosfórico a 70 ° C durante 30 hr. de filtración (F) de ácido usando filtración al vacío puesta a punto. lavado (G) SEC utilizando una serie de agua, ácidos, bases y solventes etapas de lavado. (H) de secado SEC usando estufa de vacío a 60 ° C y 1 mbar de vacío durante 10 horas. (I) intacto, limpio y se secó SEC como un producto final. (J) la mezcla de solución de SEC y BSA. (K) la homogeneización de la solución de SEC y BSA. (L) de vacío de carga de BSA en SEC. SEC (M) BSA-cargados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Análisis de microscopía electrónica de barrido de L. clavatum esporas durante las diferentes etapas de tratamiento de pre-ácido. (A) esporas no tratadas que muestran orgánulos celulares sporoplasmic y biomoléculas. (B) esporas tratadas con acetona mostrando interrumpieron contenidos sporoplasmic. (C) y (D) tratado con álcali esporas que muestran la eliminación de contenidos sporoplasmic y intine capa celulósica interna arrugada. Adaptado de 41 y usada con permiso de Scientific Reports. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Análisis de microscopía electrónica de barrido de L. Las esporas clavatum durante las diferentes etapas de ÁcidoEl tratamiento de 5 a 30 hr (A - D). Respectivamente, 5, esporas tratadas con ácido 10, 20, y 30 hr que muestran la microestructura externa intacta y la cavidad interna limpia. Adaptado de 41 y usada con permiso de Scientific Reports. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Contenido de proteínas de esporas y sporopollenin exina Cápsulas (SEC). El contenido de proteína después de varias etapas de tratamiento. Los datos representados son un promedio de mediciones por triplicado con desviación estándar (n = 3). Adaptado de 41 y usada con permiso de informes científicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande of esta figura.

Figura 5
Figura 5. Análisis dinámico de imágenes de partículas (DIPA) de esporas y sporopollenin exina Cápsulas (segundos) en diversas etapas de tratamiento columnas (A - C). Son, respectivamente, el tratamiento pre-ácido, tratamiento ácido, y SEC intactas. Las parcelas son gráficos representativos de diámetro SEC, la circularidad, relación de aspecto, y el gradiente de borde. Adaptado de 41 y usada con permiso de Scientific Reports. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) y Imaging Análisis de partículas dinámico (DIPA) de 30 hr AcidolySEC-sis única sporopollenin exina Cápsulas (SEC). (A) que muestra la microestructura externa intacta y limpia cavidad interna. (B) gráficos representativos de diámetro SEC, la circularidad y relación de aspecto. Adaptado de 41 y usada con permiso de Scientific Reports. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. Microscopía confocal de barrido láser (CLSM) Análisis de sporopollenin exina Cápsulas (SEC) antes y después del tratamiento y BSA encapsulación. La primera fila representa esporas no tratadas que muestran orgánulo celular sporoplasmic y autofluorescencia biomolécula. La segunda fila representa 30 segundos acidolysis de sólo hr con una cavidad interior vacío. La tercera fila representa FITC-BSA cargadoen los SEC acidolysis de sólo 30 hr. (Las barras de escala son 10 micras). Adaptado de 41 y usada con permiso de Scientific Reports. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8
Figura 8. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) y Imaging Análisis de partículas dinámico (DIPA) Caracterización de cargadas con BSA sporopollenin exina Cápsulas (segundos). Imágenes (A) de SEM de los SEC BSA-cargado. (B) Los gráficos representativos de diámetro cargado SEC-BSA, la circularidad, relación de aspecto, y el gradiente de borde. Adaptado de 41 y usada con permiso de Scientific Reports. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Material BSA carga por lote (125 mg / ml) BSA en 5 segundos mg (mg) Cantidad de BSA cargado (g por g de segundos) esporas no tratadas 0,6 ml 0.654 ± 0.05 0,131 ± 0,01 SEC 1,2 ml 0.831 ± 0.05 0,170 ± 0,01

Tabla 1. La encapsulación de albúmina de suero bovino (BSA) en no tratados esporas y SEC. Volumen de solución de BSA utiliza para cargar por lotes de 150 mg de esporas sin tratar '' o 'segundos'. Los datos representados son un promedio de los lotes por triplicado con desviación estándar (n = 3). Adaptado de 41 y usada con permiso de informes científicos.

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Discussion

En este trabajo, un análisis sistemático de la extracción de la SEC L. esporas clavatum se presenta y este informe muestra que es posible producir cápsulas de mayor calidad mientras que también el logro de una simplificación significativa de la pre-existente protocolo utilizado comúnmente. 11 En contraste con el protocolo existente que requiere una alta temperatura del proceso (180 ° C) y una larga duración del proceso (7 días), 11 la corriente de la optimización de proceso de extracción de SEC se centra principalmente en la reducción de la temperatura y la duración de la etapa de acidólisis.

Los tratamientos desengrasantes alcalinos y proporcionan una eliminación mínima de material sporoplasmic a partir de esporas. Sin embargo, acidolysis de 5 horas a 120 horas retira la máxima cantidad de material sporoplasmic. Los resultados indicaron que la duración y la temperatura de procesamiento total podría reducirse drásticamente de técnicas convencionales, 11 y que sólo 30 horas en temperatura moderada (70° C) ácido fosfórico proporciona las cápsulas de óptima calidad. Además, más allá de 30 acidólisis hr, se encontró que la SEC comenzó a fracturarse y se observó un aumento significativo de fragmentos de partículas, lo que sugiere que todo el lote de SEC puede ser exhibiendo una reducción en la integridad estructural general. Además, hay que señalar que L. clavatum se considera que comprende sporopollenin comparativamente robusta, 2 y que puede ser necesario ajustar para otras especies de polen las condiciones de proceso específicas que participan en este protocolo, tales como, concentración de ácido, la temperatura y / o la duración de hidrólisis,.

Se demostró que la producción de SEC mediante el uso de ácido fosfórico acidólisis de sólo (85% v / v) durante 30 hr rendimientos SEC limpios e intactos. 41 Los datos confirman que acidólisis es el paso crucial en la producción de SEC. Finalmente, se utilizaron los ácido-sólo SEC para la encapsulación de BSA y se observó un alto grado de carga. La carga wcomo alcanzado con la aplicación de un vacío, con lo que se altera la presión interna de la cavidad SEC para dibujar con fuerza la solución de BSA en las cápsulas vacías. Nanocanales (dia 15 -. 20 nm), que han sido previamente identificadas en las paredes exina de L. Clavatum, 7 Deje que la solución entre en la gran cavidad interna. Después de la carga, las cápsulas se lavaron y se secaron en un liofilizador para dar un polvo de flujo libre.

Uniformidad del tamaño y las características morfológicas son factores importantes para evaluar la calidad de un material de encapsulación satisfactoria. La uniformidad del tamaño y la morfología observada intacto de SEC cargado-BSA confirmaron el uso potencial de la SEC acidólisis de sólo procesado para aplicaciones de microencapsulación.

Estos resultados son importantes para la producción industrial a gran escala de SEC y para estimular mayor interés en las aplicaciones potenciales de SEC en la microencapsulación de los medicamentos,proteínas, péptidos, suplementos alimenticios, nutracéuticos, y cosméticos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

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