습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 2Institute of Structural Biology, German Research Center for Environmental Health
Published 1/06/2017
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Biochemistry

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Zalewski, J. K., Heber, S., Mo, J. H., O'Conor, K., Hildebrand, J. D., VanDemark, A. P. Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins. J. Vis. Exp. (119), e54886, doi:10.3791/54886 (2017).

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Abstract

Introduction

X 선 결정학을 통해 구조 결정은 현대 생물학의 모든 분야에 근본적인 기여를했다; 생활을 지원들이 다양한 상황에서 서로 상호 작용하는 방식 거대 분자의 원자보기를 제공하는 단계; 질병 및 제공하는 기회가 합리적으로 질병을 치료하는 약물을 설계하는 원인이 메커니즘을 이해하기 위해 우리를 허용한다. 결정학 긴 고분자 구조를 결정하는 지배적 인 실험 기술되고, 현재 구조 데이터베이스 (www.rcsb.org)의 89.3 %를 차지 하였다. 이 기술은 매우 높은 해상도의 가능성 등 많은 장점을 가지고하는 크기의 넓은 범위, 상대적으로 쉬운 데이터 수집 및 고분자 용매뿐만 아니라 리간드와 상호 작용하는 방법을 시각화 할 수있는 기회 거대 분자를 시각화 할 수있는 능력.

재조합 단백질 발현 1, 2, 끝까지 마음에있는 수많은 기술 향상에도 불구하고형 치수 (3),이 시스템 (4), 결정 공정에있어서 가장 큰 장애물을 생성하는 데 사용되는 분자 생물학 회절 품질의 결정을 성장할 수있는 능력 남아있다. 이것은 큰 꼬인 코일 도메인을 포함하는 단백질에 대해 특히 사실이었다. 모든 아미노산의 많은 5 % 정도가이 매우 일반적인 구조 기능 칠하고, 코일 - 코일 5,6 내에서 발견되는 것으로 추정, 아직이 단백질은 종종 정화 및 구형 단백질 8-10을보다 구체화하기가 더 어렵되었습니다 . 이는 상기 꼬인 코일 도메인은 종종 따라서 올바르게 종종 결정화 해로운 비정형 또는가요 서열의 포함을 피하기 위하여 중요한 이러한 도메인의 경계를 예측하는 더 큰 단백질의 컨텍스트 내에서 발견 된 사실에 의해 악화된다.

여기에 우리가 결합 개념적 틀을 제시 웹 기반의 계산은 experimenta와 분석구조 연구, 어떻게 준비하고 결정화 시도하기 전에 단백질 시료의 특성을하기위한 단백질 단편 (들)을 선택하는 방법 : 벤치에서 리터 데이터는 결정 과정의 초기 단계를 포함 통해 안내 사용자에게 도움이됩니다. 우리는 큰 코일 코일 도메인을 포함하는 두 단백질에 대한 우리의 분석에 초점을 Shroom (SHRM)과의 Rho 키나제 (바위). 둘은 꼬인 코일 도메인을 포함하고, 생물학적으로 중요한 11-16 착체를 형성하는 것으로 알려진 이러한 단백질을 선택 하였다. Shroom과의 Rho 키나아제 (록)을 각각 권취 코일의 200 ~ 680 잔기를 포함하는 것으로 예상되는 많은 부분이있는 구조적 특징 17-20되었다. 여기에 기재된 방법은 빠르게 결정화 의무가 될 것이다 감긴 코일 함유 단백질의 단편을 확인하는 유선형 흐름을 제공하지만, 기재된 기술은 쉽게 가장 단백질 또는 단백질 복합체하도록 또는 높은 처리량 approa를 통합하도록 변형 될 수있다CHES로 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 방법은 일반적으로 저렴하고, 거의 모든 환경 레벨에서 사용자에 의해 수행 될 수있다.

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Protocol

참고 : 개념적 프레임 워크 또는 워크 플로의도는 참조 용으로 그림 1에 설명되어 있습니다. 연산 또는 시퀀스 기반 예측, 단백질 발현과 정제, 생화학 적 특성 및 결정화 : 프로토콜은 네 개의 단계로 나눌 수있다. 도시 된 예는 Shroom SD2 도메인 및 / 또는 Shroom 록 착물을 분석하지만 어떤 단백질과 이용 될 수있다.

1. 코일 코일 도메인 경계의 전산 예측을 생성하는 웹 기반 도구를 설립

  1. 순서 동족체의 진화 다양한 세트를 수집합니다.
    1. www.uniprot.org로 이동하여 상단 검색 창에 Shroom를 입력합니다.
    2. 선택 순서는 옆 가입 번호에 체크 박스를 선택하여 다운로드합니다. 스타와 함께 시퀀스는 Uniprot 검토 시퀀스를 나타내며, 일반적으로 더 신뢰할 수 있습니다. 모든 순서가 완전하고 정확하도록주의하십시오.
    3. 선택의 절감다운로드 버튼을 클릭하여 equences.
    4. 그 Clustal-오메가 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 사용하여 Shroom 시퀀스의 컬렉션을 맞 춥니 다. 제출 밀어 다음 Shroom의 시퀀스 파일을 선택하려면 "찾아보기"버튼을 클릭합니다.
    5. 정렬이 완료되면 "정렬 파일 다운로드"버튼을 클릭합니다.
    6. (파일에서 | | 입력 정렬 파일) Jalview를 사용하여 1.1.5에서 발생하는 여러 서열 정렬을 엽니 다. (| 퍼센트 아이덴티티 컬러) 신분으로 새로운 정렬 창, 색상 내에서.
  2. 이차 구조 예측, 유연한 또는 무질서 시퀀스의 예측을 계산하고, 관심있는 단백질 (들) 내에서 코일 코일 영역을 예측했다.
    1. 코일 - 코일 예측을 계산하기 위해, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi로 이동합니다. 복사 시퀀스 상자에 순서를 붙여 넣기하고 제출을 클릭합니다.
      참고 :이 분석은 COMP하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다LETE. Shroom 서열이 상당히 크기 때문에 상기 서열은 웹 서버의 크기 제한에 맞도록 1,000 미만 아미노산의 블록으로 분할 될 필요가있다. Shrm2를 분석 할 때,이 부분은 코일 - 코일 영역을 포함하는 공지 된 SHRM SD2 도메인을 포함 같이 1000 C 말단 아미노산을 사용하는 것이 권장된다. 다른 단백질이 분석을 반복 할 때, 가능한 경우 전장 단백질 서열을 사용하도록 권장한다. 그 옵션을 선택하지 않으면, 공지 된 생화학 적 또는 기능적 데이터에 기초하여 시퀀스를 가능한 가장 큰 단편을 사용하거나 해부.
    2. 코일 - 코일 예측을 계산하기 위해, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi로 이동합니다. 복사 시퀀스 상자에 순서를 붙여 넣기하고 제출을 클릭합니다.
  3. Shroom 시퀀스의 하나의 포괄적 인 주석으로 1.2.2에 단계 1.1의 결과를 결합합니다.
    참고 : 매우 또한 어떤 및 모든 관련 전을 포함하도록 권장된다nformation이는 문헌 또는이 단계에서 단백질의 기능 또는 정제에 대한 다른 소스에서 얻을 수있다.
  4. 이 포괄적 인 주석 시퀀스를 이용하여, 보존을 극대화하려는 단백질의 도메인 경계 (또는 가능한 경계가 일련의) 예측 무질서 또는가요 서열의 양을 최소화하면서 구조적 특징을 예측 하였다. 공지 된 경우, 생성 된 단백질은 관심의 기능 특성을 보유한다.

제 1 절에서 확인 된 도메인 경계 2. Express 및 Purify는 단백질

주 :이 구역의 목적은 제 1 항에서 생성 된 가상 도메인 경계를 선별 신속하고 용이하게 정량 분석의 시리즈를 사용하는 것이다.

  1. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 상기 그의 -mRuby2-XH2 플라스미드 내의 프레임에 원하는 코딩 서열을 갖는 발현 플라스미드를 생성 (벡터 맵 A의도 3 참조차 추가 세부 사항).
  2. 18-24 시간 동안 실온에서 autoinduction 매체 1 BL21 (DE3) 대장균 또는 다른 적합한 발현 균주를 사용하여 각각의 발현 플라스미드의 테스트 발현 수준.
    1. 예컨대 여기 온 (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial 같은 세포와 함께 또는 강력한 변환 프로토콜을 사용하여 지시 다음 발현 플라스미드뿐만 아니라, BL21 (DE3)에 빈 플라스미드 제어 변환 -변환/).
    2. 새롭게 변형 플레이트에서 하나의 식민지를 선택하고 34 μg의가 / ㎖ 카나마이신과 하룻밤 원성 국물에서 37 ° C (LB) 미디어에서 5 ml의 스타터 문화를 성장.
    3. 다음 날, 문화 펠렛 신선한 (LB)와 펠렛을 씻어
    4. 34 μg의 / ㎖ 카나마이신과 autoinduction 미디어 50ml로 한 스타터 문화를 추가합니다. 문화가 실내 온도 37 ° C의 하나에 포화로 성장 할 수 있습니다. 일반적으로 18 ~ 24 시간 ~에 대한 성장한다.
    5. 펠렛의 세포s와 정제에 무기한 전에 -80 ° C에서 생성 된 세포 펠렛을 동결.
    6. 가장 효율적으로 원하는 융합 단백질을 생산하는 균주를 결정하기 위해 각 식의 변형 및 SDS-PAGE에 의해 빈 벡터 제어에서 전체 세포 추출물을 비교합니다. 그의 -mRuby2-Shroom SD2 융합 단백질의 경우, 50 분 ~ 나 염료 프론트 겔 (22)의 하단에 도달 할 때까지 180 V에서 10 % SDS-PAGE 젤을 실행.
    7. 쿠마 블루와 얼룩 젤은 각 균주 (23) 내 총 세포 단백질을 시각화합니다.
  3. 성공적으로 mRuby2 융합 단백질을 발현 각 변형에 대한 초기 친 화성 크로마토 그래피 단계를 수행합니다. 일반적으로 단백질은 4 ℃에서 정제로 변경된 조건에서 혜택을하지 않는 정제, 실온에서 2.3.2-2.3.7 단계를 수행합니다.
    1. 단계 2.2.5에서 해동 세포 펠렛.
    2. 용해 완충액 (10 % 글리세롤, 500 mM의 염화나트륨, 40 ml의 1.5 각 세포 펠렛을 재현 탁mM의 이미 다졸, 20 mM 트리스 pH8.0, 1 mM의 베타 - 머 캅토 에탄올). 적절한 프로테아제 억제제로 세포 용해 완충액을 보완.
    3. 10 ㎎ / ㎖의 리소자임 30 μl를 첨가하고 20 분 동안 실온에서 배양한다. 악기에 대한 지침을 다음 초음파 처리가 사용된다.
    4. 불용성 물질 또는 unlysed 세포를 펠렛 14,000 XG에 30 분 동안 테이블 위에 원심 분리기에서 1.5 ML 튜브와 원심 분리기로 전송합니다. SDS-PAGE를 통해 후속 분석을위한 뜨는 및 펠렛을 모두 저장합니다.
    5. 니켈 NTA 구슬 100 ㎕와 가용성 분획을 배양, 니켈 친 화성 정제를 수행합니다. 비드 믹스 수회 반전 5-10 분 동안 수용성 분해물과 비드 인큐베이션.
    6. 구슬을 펠렛 탁상 원심 분리기에서 30 초 동안 800 XG에 원심 분리기. 비 특정 오염 물질을 청소 용해 버퍼와 펠렛을 3-5 회 세척하여이 작업을 수행합니다.
    7. 용해 완충액으로 비드로부터 용출 루비 융합 단백질 일 보충M 이미 다졸.
    8. 위의 "신속하고 더러운"정제 그의-mRuby2 - Shroom 단백질의 동작을 비교 SDS-PAGE를 사용합니다.

3. 특성화 단백질 샘플 유리한 속성을 가진 사람들을 식별하는

  1. 루비 융합 단백질의 농도를 측정 한 후, 천연 PAGE 겔 (24) 상에 융합 단백질의 1-5 μg의 로딩하여 샘플의 균질성을 평가하기 위해 280 nm에서 분광 광도계 세트를 사용. 175 V.에서 140 분 동안 4 ° C에서 10 % 기본 PAGE 젤을 실행
    1. 이미지 mRuby - 태그 융합이 분석에서 마이그레이션하는 경우 관찰, 형광 시각화 장착 이미 저를 사용하여 원시 PAGE.
      참고 :이 단백질이 가능성이 집계 아니라에 붙어 융합 단백질을 관찰하기 위해주의해야합니다. 형광 화상 카메라를 사용할 수없는 경우, 하나는 종종 시각화 할 수 있습니다 루비의 이미지 농축 샘플은 검은 빛 아래 또는 자외선 상자 단백질 태그.
  2. 안정적으로 접힌 도메인을 식별하기 위해 제한된 단백질 분해를 수행합니다. 0.025 %의 서브 틸리 A의 5 μL와 / ~ 1 밀리그램에서 ml에 루비 SHRM SD2 융합의 95 μl를 품다
    1. 의 시점에서, 반응 샘플을 0, 0.5, 2, 5, 15, 60 및 120 분, 각 시점에 대한 반응을 10 μl를 제거하고, 15 % 아크릴 아미드 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 통해 반응의 진행을 시각화 .
    2. 단계 2.2.7에서와 같이 쿠마 블루로 염색하고, 단백질 분해 효소 저항성 종을 식별 할 수 있는지 여부를 평가합니다.
  3. 용액에서 이들 단백질의 전체적인 동작의 종합 평가로 부분 정제 mRuby2-Shroom 융합 단백질의 정제 효율 동작 천연 PAGE에서 제한된 단백질 분해 데이터를 통합.
    1. 적절한 기능 분석을 사용할 수있는 경우 (선택 사항),이 시점에서 활동을 확인합니다.

4. 코일 코일 SD2의 높은 품질 크리스탈을 생산Shroom에서 도메인

주 : 단백질이 일반적으로 상이한 온도에서 정제로부터 4 ° C 유익하지 않는 한 4.1 내의 모든 단계가 실온에서 수행된다.

  1. 발현 및 정제 잠재력의 대략적인 추정치로 50 ml의 성장을 사용하여 완전히 정제 된 시료의 5 ~ 20 mg의 달성을 목표로 mRuby2 - Shroom SD2의 대규모 식을 수행합니다. 일반적으로 배양이 L은 적절한 출발 물질을 제공한다. 10 분 동안 8,000 XG에 원심 분리하여 성장 펠렛 세포 후.
    1. 용해에 대한 리소자임을 사용하는 경우, 고정 된 세포 펠렛 그램 당 분해의 1 ~ 2 mL의 사용 이전 용해 완충액에 2 L의 성장 펠렛을 재현 탁. 또한, ~ 8 ㎖ / g 펠릿에 재현 탁은 균질 또는 프렌치 프레스를 사용하는 경우. 30 분 동안 30,000 XG에서 원심 분리를 통해 세포 파편 펠렛.
    2. 일괄 니켈 NTA 수지를 사용하여 10 ㎖ 4.1.1에서 가용성 획분을 결합한다. 적절한 중력 컬럼에 부어언 바운드 단백질이 떨어져 배출 할 수 있습니다.
    3. 워시 1 M의 NaCl로 보충 된 용해 완충 용액으로 세척 한 다음 용해 완충액 40 ㎖, 3-5 회 수지 등을들 수있다.
    4. 80 mM의 이미 다졸 보충 용해 완충액 40ml를 씻을 수지.
    5. 1 M 이미 다졸을 첨가 용해 완충액 40 mL로 루비 Shroom 융합 단백질을 용출시켰다. 수동 4-10 ml의 분획으로 용출 된 단백질을 분별.
    6. 10 % SDS-PAGE를 사용하여 루비 Shroom 융합 단백질을 포함하는 분획을 확인합니다.
    7. 8 % 글리세롤, 250 mM의 염화나트륨, 15 mM의 이미 다졸, 20 mM 트리스 pH8.0로 (일반적으로 2-4 분수) 적절한 분획을 투석, 1 MM의 β-ME, 6-8 kDa의 MWCO 투석 튜브를 사용하여. 융합 단백질의 모든 25 ~ 50 mg을위한 TEV 단백질 분해 효소의 1 밀리그램을 추가합니다. 천천히 교반하면서 실온에서 밤새 투석.
    8. 반복 니켈 친 화성 정화는 4.1.2 단계를 반복합니다. 4.1.6합니다. 그분의 10 -mRuby2가 결합 상태로 유지됩니다 동안 Shroom SD2 도메인은 이제 언 바운드 분수에 남아 있어야수지와는 용출 분획에서 발견 될 것이다. 쿠마 파란색이 사용하는 12 % SDS-PAGE의 얼룩을 확인합니다.
    9. 8 % 글리세롤, 100 mM의 염화나트륨, 5 mM의 베타 - 머 캅토 에탄올 버퍼 밤새 20 mM 트리스 pH를 8.0로 Shroom SD2 도메인을 함유하는 분획을 투석.
    10. FPLC를 사용하여 음이온 교환 크로마토 그래피 (25)를 수행하고, 0.1 ~ 1.0 M의 NaCl에서의 NaCl 구배로 용출. 12 % SDS-PAGE를 사용하여 분수를 분석합니다.
    11. 스핀 농축하여 (10 kDa의의 MWCO 또는 더 큰 단백질이 연구되고있다)에 따라, 12 % SDS-PAGE를 통해 피크 분획을 분석 ~ 0 ㎎ / ㎖ 후 크기 배제 크로마토 그래피 (26)을 수행하는 피크 분획을 농축시켰다.
    12. 풀 피크 분획 및 20 mM 트리스 pH를 8.0의 50 mM의 NaCl, 2 % 글리세롤로 투석 한 MM의 β-ME 및 / ㎖ 종래 결정화는 10 mg의 농축시킨다.
      선택 :이 단계의 농도로 5 μl의 샘플을 제거 1, 2, 5 및 10 ㎎ / ㎖ 시료 농축 과정 중에.이 단계에서 샘플의 행동을보고 각 샘플의 기본 페이지 로딩 2-5 μl를 실행합니다.
  2. 결정화 실험을위한 최적의 단백질 농도를 식별하기 위해 12의 조건의 작은 배열을 화면. 이러한 조건의 조성은도 7에 기재되어있다.
    1. 기상 확산법, 피펫을 이용하여 결정화 실험을 수행, 24- 웰 앉아 드롭 결정화 트레이를 사용하여 초기에 잘 용액 1 μL와 커버 슬립에 단백질 샘플 1 μl를 포함 방울 이어 별도 웰에 12 조건 각각 500 μL . 이 기술에 대한 추가 정보는 27을 참조하십시오.
    2. 신속 명확한 테이프로 트레이를 밀봉 및 진동 무료 적당한 온도 제어 된 환경에 트레이를 이동합니다. 다를 수 있습니다 사용 온도,하지만 4 °의 C, 16 ° C, 20 ° C는 매우 일반적이다.
    3. 다음 3 일 동안 트레이에 방울을 검사100X 배율까지에서 현미경을 사용하여 AYS. 3 일 기간의 말기에, 석출 (투명한) 광 침전, 호우 (브라운), 또는 결정을 포함하지 않는 각 드롭 점수. 적절한 단백질 농도 이하 6 무거운 강수량이 포함되어야합니다.
    4. 4.2에 명시된 단백질 농도를 사용하여, 시판의 결정화 스크린 다양한 화면. 또한 상품의 에러를 최소화하는 동안, 액체 핸들링 로봇 또는 결정화의 사용은 크게이 프로세스의 속도. 이것은 사용자가 하나의 샘플을 더 조건을 선별 할 수 있도록, 그리고 훨씬 적은 단백질을 필요로한다.
    5. 체계적으로 이전 24 잘 선별 트레이를 사용하여 결정화 드롭 내에서 각 변수를 변화시킴으로써 넓은 화면에서 확인 된 초기 조건을 개선합니다.

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Representative Results

이 시스템에서 이용되는 흐름을 도시 한 도면도 1에 도시 된 세 개의 주요 단계를 포함한다. 시퀀스의 전산 분석은 관심있는 꼬인 코일 단백질의 도메인 경계에 대한 가설을 개발하는데 이용된다. Shrm2 SD2 도메인 주석 분석의 예는도 2에 도시되어있다. 이 도면에서, 목표 Shroom가 SD2라는 골격 레귤레이터의 C 말단에 보존 된 도메인 가능한 도메인 경계를 식별 할 수 있었다. 이 분석에서 가상 도메인 경계의 세 가지 세트의 결정화를위한 최고의 후보로서 끝내 C- 말단 근처 전체 보존 SD2 또는 최소한의 단편에 걸쳐있는 꼬인 코일 조각을 함유하는 생성 된이었다. 시퀀스 분석에서 확인 된 후보자는 신속하게 (그림 3) FO mRuby2와 단백질의 융합을 사용하여 작은 규모에서 테스트효율적인 분석을 r에. 대표적인 소규모 (문화 50 ㎖) 두에서 정제를 그의 10 -mRuby2 태그가 단백질이 그림 4에 표시됩니다. 이 도면에서, 불용성 단백질의 동작은, 그 가용성 대응 비교하여 명백하다. 제대로 발현 또는 불용성 단백질 융합체 용이하고 신속하게 식별된다. 제한된 단백질 분해에 의해 단백질 단편의 생화학 적 분석은 설명되거나 분리 및 정제 Shroom SD2 도메인으로 루비 시스템 시들어하여 단편의 다양한도 5에 도시되어있다. 도 5a에서, 마우스 SHRM SD2 두 가지 변형은도 3 # 2, # 1을 실온에서 30 분 동안 (0-1.0 %)로 프로테아제의 농도 구배를 사용하여 분해 된 가상 도메인 경계에 대응. 이 두 효과 적당한 효소 농도 작은 제품의 호스트로 분해 하였다. 그림 5B는 샘을 보여줍니다전자 실험은 초파리 SHRM SD2에서 가상의 경계 # 3를 사용하여 수행. 이 단백질은 결정화 않았고, 구조 (19)를 설명 하였다. 위의 프로토콜에서 생성 된 루비 융합을 검사 할 때 단백질 분해 분석도 유용 할 수 있습니다. 도 5c 인간 Shrm2 SD2 (1427년부터 1610년까지)와 루비 융합 단백질에 도시 된 바와 같이 표시된 시점 실온에서 비특이적 프로테아제 서브 틸리 고농도 (0.025 %)로 분해 하였다. 여기에 루비와 SHRM의 링커는 즉시 예상되는으로 절단되었다. 또한, 부 제품 두 프로테아제 민감한 영역이 단백질을 지시하고있다, 그러나, 2 분 내에 생성 된 분해 생성물은 실제로 매우 안정한 단백질을 나타내는 실험의 나머지 부분에 걸쳐 대부분 온전하게 남아 형성 하였다.

보완 방법은 기본 페이지의 분석가를 사용하여 표시됩니다그림 6에 있습니다. SHRM 내의 지정된 점 돌연변이를 포함하는도 6A에서 루비 태그 인간 SHRM SD2 (1427-1610)뿐만 아니라 단백질은 기본 PAGE에 의해 분석된다. 결정화되지 않는 세 가지 돌연변이가 극적으로 다른 동작을하는 동안,이 실험에서 (결정체를 형성) 야생형 단백질은 두 개의 별개의 대역으로 달린다. 이 시스템은 또한 단백질 복합체에 유용 할 수 있다는 것을 보여주기 위해 Shroom 락 단지의 다양한 그림 6B의 기본 PAGE로 분석 하였다. 이 경우, 인간 Shrm2 SD2 동일한 프래그먼트 (1427년부터 1610년까지)은 인간 락 다른 조각이 이용되는 동안, 분석을 명확하게하는 데 사용되었다. 이 방법은 단지 락 700-906과 746-906은 여러 종을했다 더럽혀진, 덜 균일이었다 이용하여 형성하는 것이 좋습니다. 결정을 형성하기 위해 많은 주했다 양론 있지만, 788-906을 사용하는 단지는하지 극적이기는하지만, 개선하고,이 종은 결정화 할 수 있었다tained 록 단백질을 분해. 834-913 락을 사용하여 생성 된 착물은 겔상의 단일하고 균일 한 종을 형성하고 용이 밤새 결정화. 도 7은 결정화 실험에서는 단백질 시료의 동작에 알리는 데 사용되는 일반적인 결정화 조건의 집합을 나타내고, 임의의 단백질과 일반적으로 이용 될 수있다. 이상적으로, 명확하고 침전 조건의 혼합을 얻을 수 있습니다. 많은 조건에서 침전 것과 낮은 단백질 농도 또는 단백질 용해성을 촉진 버퍼링 조건 표기 동안 침전물을 형성하지 않는 단백질을 고농도 이상의 버퍼링 엄격한 조건을 요구한다.

그림 1
그림 1 : 다이어그램 워크 플로우. 계산 서열 분석 및 생화학의 통합을 나타내는 일반화 된 다이어그램도메인 경계를 서술하고 결정화 단백질 조각을 식별하기위한 포괄적 인 전략으로 다른 젖은 실험실 기술. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : Shroom에서 코일 코일 SD2 도메인에 대한 주석이 서열 분석. 계산의 오버레이 CLUSTAL 오메가에 의해 생성 Jalview (단계 1.1) 내에서의 서열 동일성에 의해 착색 다중 서열 정렬을 포함하여 Shroom SD2 도메인에 대해 분석한다. 또한 이차 구조, 무질서 시퀀스 예측하고 Shroom SD2 도메인의 코일 코일 예측 (단계 1.2) 예측 포함되어 있습니다. 관찰 경계 및 이차 구조이기 때문에 가상 도메인 경계 (130 단계) 표시된다이후 결정 분석 (19)에 의해 계시 된 요소입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 그의 10 -mRuby2 - 발현 시스템의 다이어그램. (A) 도식 발현 벡터 그의 10 -mRuby2-XH2 벡터가이 연구에 사용 하였다. 이 벡터의 다중 클로닝 부위의 (B) 다이어그램. 단백질 코딩 서열은 일반적으로 BamHI 및 EcoRI로 복제 사이트를 통해이 벡터에 삽입된다. mRuby2 단백질의 극단적 인 C 말단이 빨간색으로 표시되면, TEV 단백질 분해 효소 절단 부위는 브라켓과 빨간색 삼각형으로 표시 절단의 위치로 표시됩니다. mRuby2와 TEV 사이트 사이의 링커 서열은 시안에 나타낸다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 두 mRuby2의 대표적인 소규모 정제를 융합 단백질 태그. (A) 박테리아 배양 발현 루비 SHRM SD2 또는 불용성 공지 무관 루비 융합 단백질 샘플 화상이 묘사된다. 루비 태그가없는 단백질을 발현 별도의 문화 비교를 위해 표시됩니다. 수용성 루비 SHRM SD2의 시각화를 보여주는 (B) 30 분 동안 30,000 XG에 용해하고 원심 분리 다음 위의 이미지화 된 문화에서 가용성 분획. 결합 후 니켈 NTA 구슬 (C) 이미지 및 루비 SHRM SD2가에 고정되고 있음을 나타내는 이후의 세척 단계구슬. (D)는 단계 2.3.6 및 2.3.7에 기재된 바와 같이 세척 및 용출 단계의 샘플 효과적으로 열을 용출 80 mM의 이미 다졸의 존재하면서 루비 SHRM SD2 융합체가 수지에 결합 된 유지 보여 1 M 이미 다졸 용출 버퍼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 다른 Shroom 단백질에서 후보 SD2 도메인의 제한 단백질 분해. 다양한 Shroom 단백질에서 4 SD2 도메인의 비교. (AB)가 표시된 SHRM SD2 단편은 SDS-PAGE로 분석 1.0 % 0 내지 프로테아제 트립신 농도 구배 결과와 함께 배양 하였다. 그 단백질 조각 위트의 관계시간은 가상의 경계가 표시됩니다. 프로토콜에 기재된 시간 경과 방법을 사용하여 그의 10 -mRuby2-Shroom SD2 융합 단백질의 제한된 단백질 분해 소화 (C) SDS-PAGE 분석. 반응물을 0.025 % 실온에서 트립신 일어났다. 루비와 Shroom SD2 사이의 링커의 소화는 신속하고 내부 통제 역할을합니다. 그의 10 -mRuby2-Shroom SD2 융합 단백질 - 정화 및 공동 추정 된 분해물 (*)가 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : 기본 젤을 사용하여 단백질의 행동의 변화를 관찰. (A) - mRuby2 Shroo의 속성을 변경하는 돌연변이의 효과를 보여주는 10 % 네이티브 PAGEm SD2. SD2 내에서 지정된 점 돌연변이가 비정상적인 이동 패턴의 범위를 표시하면서 이러한 조건에서 SHRM SD2는 두 개의 분리 된 밴드로 실행됩니다. (B) 락의 다른 버전을 사용하여 형성 및 기본 PAGE에 의해 분석 Shroom SD2 락 복합체의 비교. Shroom SD2와 바위 키나제의 지시 조각 (두 코일 코일 단백질) 사이의 단지는 기본 PAGE에 의해 해결되었다. 결정을 빠르게 결정화하지만 많은 주 록 834-913 함유 복합 후 락 788-906 함유 복소 얻어졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 7 : 결정화 빠른 차 화면. (A) 일반적인 결정화 공동의 빠른 화면nditions 결정화 실험에서는 단백질 시료의 거동을 평가하기 위해 사용된다. 단순한 스코어 행렬 (B)로서는, 결정화 방울을 평가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 설명 된 프로토콜은 사용자가 자신의 결정을 용이하게하기 위해 큰 꼬인 코일 단백질 내에 도메인 경계를 식별 할 수 있도록 설계된다. 프로토콜은 잠재적 도메인 경계의 시리즈를 생성하는 예측 계산 및 다른 소스로부터의 데이터의 다양한 전체적인 결합에 의존한다. 이러한 신속하고 저렴하고, 또한 이러한 초기 가설을 수정하는 데 사용되는 생화학 실험 세트 다음에 있습니다. 이 방법을 사용하여, 사용자는 신속하게 바람직하지 않다 전위 단백질 단편을 제거 할 수 있고 이에 의해 결정을 얻는 전망을 개선 나은 후보에 대한주의를 집중한다.

많은 중요한 단계는 가상 도메인 경계의 초기 세트의 개발과 같은 결정의 제조와 같은 중요한 것도 있지만,이 기술 내에 존재하지 않는다. 이 단계는 정보 OB뿐만 아니라 계산 방법의 다양성을 포함를 사용할 때 문학이나 기능 데이터로부터 tained. 케어는 예측의에 정량적 신뢰 가치를 부여하는 장소에있는 방법은 없기 때문에 "최상"의 단일 솔루션에 이르기까지 즉시 연마하는 전략을 사용하지 않도록주의해야한다. 대신, 가장 신속하게 실험적으로 확인 될 필요가 가능한 도메인 경계의 작은 세트를 식별하는 방법으로 사용된다.

이 프로토콜을 분석 할 수있는 꼬인 코일 단백질의 특성은 상당히 광범위하다. 계산적 관점에서 코일 된 코일 예측의 강도는 20 개 아미노산 이하로 제한하고, 단계 1.2.1에서 언급 한 바와 같이, 꼬인 코일 영역보다 큰 1,000 아미노산 DISOPRED 분석을 위해 복수의 부분으로 분할 될 필요가있다. 우리는이 웹 서버에 의해 부과되고, 방법은 향후 업그레이드로 변경 될 수 있으므로 임시 나중에 제한을 볼 수 있습니다. 이후 생화학 적 분석은 다소 저하 될 수여러 가지이다. 먼저, 내부 루프 또는 시료 할 수있다 프로테아제에 민감한 영역이 실제보다 덜 안정적인 것으로 보인다. 프로테아제에 의해 루프를 절단 한하거나 흠집되어 안정적인 단백질은 여전히이 사용자가 모두 전략을 탐구하는 것이 좋습니다 이유입니다, 기본 페이지에서 안정적인 모습을 제공해야합니다. 천연 PAGE는 매우 긴 겔로 천천히 마이그레이션 또는 특정 충전 할 수 있기 때문에이를 완전히 겔로부터 반대 방향으로 실행하지만, 어느 때문에, 일부 단백질 어렵다. 이 경우, 상기 원시 PAGE 겔 시스템 상이한 버퍼링 조건을 탐색하는 것이 도움이 될 수있다.

여기에 제시된 연구의 초점이 큰 꼬인 코일 단백질에 함유되어 있지만,이 프로토콜은 거의 적응 거의 모든 단백질을 이용할 수있다. 구상 단백질의 기본 또한 이러한 pDomTHREADER 28 <같은 도메인 예측 소프트웨어 첨가 될/ SUP> 또는 DomPred (29)는 도메인 경계를 찾기 위해, 이러한 Phyre2 30 차 구조 예측은 서열 분석의 예측 능력을 향상시키기 위해. 또한,이 차 구조 예측 및 무질서한 예측을 수행하기위한 많은 가능한 알고리즘은, 추가 알고리즘을 포함하는 것이 유용 할 수있다. 구상 단백질은 종종 효소 활성 또는 대상 선택시 중요한 추가 정보를 제공하는 다른 기능 판독을 가지고있다. 또한, 중간 또는 높은 처리량 기술이 적절하게 통합 될 수있다. 예를 들어, 96 웰 형식으로 1 ~ 2 ㎖의 문화와 금속 친 화성 정제를위한 저렴한 시스템은 31 쉽게 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 최소한의 샘플을 사용하여 결정화 실험을 다수의 설정을위한 로봇의 사용은 일상되고 있지만, 로봇 시스템의 효율적인 작동을 잘 특성화 된 단백질 시료의 동작을 전제한다. 부가이 프로토콜에 알 수정 친 화성 태그의 다양한 샘플을 포함 할 수있다. 많은 다른 형광 태그를 사용할 수 있습니다, 또는 형광 태그가 필요하거나 도움이되지 않는 경우 히스, GST-, Thioredoxin-, Strep- 및 MBP- 가능한 옵션 수십 중입니다.

이 절차를 수행 할 때, 사용자는 mRuby2 태그 관심있는 사용자의 단백질에 미칠 수있는 영향을 염두해야한다. 다른 융합체의 다양한 태그를 사용하는 일화 여러 크로마토 그래피 단계를 통해 결합 된 나머지 mRuby2 때때로, 관심의 단백질에 매우 밀접하게 결합된다는 사실을 지원한다. 이 문제는 분명히 바람직하지 않다,하지만 의도하지 않은 루비 단지는 일반적으로 분리하고 크로마토 그래피 제거 할 수 있습니다. MBP (32)에 대해 관찰 된 바와 같이 이것은 보호자처럼 행동인지 불분명하다.

결정을 획득 한 후, 일반적으로 COI에 직면하고 여전히 많은 도전이있다이 프로토콜에 나와 있지 않은지도 코일 단백질. 가장 일반적인 불완전 격자 이방성 회절을 형성하는 하나의 회절 열악한 품질이다. 거기 이방성 회절 (33)을 지원하기 위해 대신에 공구가 있고, 이러한 일부 꼬인 코일 구조 (18, 20)을 해결하기위한 중요한왔다. 많은 결정 병리 따라서이 강화 된 회절 특성이 추가 결정 형태를 검색하는 것이 현명하다, 빨리 극복하기 불행하게도 어렵다. 이것은 조건의 수천의 로봇 심사에 의해 촉진된다. 대안 적 탈수 또는 34 시드 등의 회절 품질을 개선하기 위해 다양한 사후 - 결정화 기술이있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21(DE3) Rosetta Emd Millipore 70954-3
BL21(DE3) Star ThermoFisher Scientific C601003
BL21(DE3) Codon Plus Agilent Technologies 230245
Lysozyme Spectrum Chemical Mfg Corp L3008-5GM
Ni-NTA resin Life Technologies 25216
SubtilisinA Spectrum Chemical Mfg Corp S1211-10ML
24 well Cryschem Plate Hampton research HR3-160
INTELLI-PLATE  96: Art Robbins Instruments 102-0001-03
PEG 3350 Hampton research HR2-591
PEG 8000 Hampton research HR2-515
PEG 400 Hampton research HR2-603
PEG 4000 Hampton research HR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2 Addgene 49089
Overnight Express Autoinduction System 1 Emd Millipore 71300
Lysogeny Broth powder ThermoFisher Scientific 12795027 

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References

  1. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  2. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189, (1), 113-130 (1986).
  3. Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434, (7034), 795-798 (2005).
  4. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  5. Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252, (5009), 1162-1164 (1991).
  6. Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137, (1-2), 41-53 (2002).
  7. Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
  8. Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21, (1), 11-18 (2008).
  9. Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16, (11), 2472-2482 (2007).
  10. Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23, (24), 3403-3405 (2007).
  11. Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13, (24), 2125-2137 (2003).
  12. Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118, (Pt 22), 5191-5203 (2005).
  13. Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281, (29), 20542-20554 (2006).
  14. Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239, (7), 2078-2093 (2010).
  15. Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22, (6), 795-805 (2011).
  16. Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3, (9), 850-860 (2014).
  17. Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279, (8), 7098-7104 (2004).
  18. Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8, (12), e81075 (2013).
  19. Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23, (11), 2131-2142 (2012).
  20. Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6, (3), e18080 (2011).
  21. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
  22. Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28, (5), 815-820 (1967).
  23. Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48, (2), 617-620 (1972).
  24. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5, (17), 4338-4346 (2005).
  25. Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
  26. Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132, (1-2), 98-108 (2006).
  27. Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280, (24), 6456-6497 (2013).
  28. Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25, (14), 1761-1767 (2009).
  29. Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11, (12), 2814-2824 (2002).
  30. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10, (6), 845-858 (2015).
  31. Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66, (Pt 10), 1137-1142 (2010).
  32. Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312, (1), 79-93 (2001).
  33. Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (21), 8060-8065 (2006).
  34. Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, (Pt 9), 1173-1180 (2005).

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