Nass- und Trockenlabortechniken Die Kombination der Kristallisation von Large Coiled-Coil-Proteine ​​enthalten, zu Führer

1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 2Institute of Structural Biology, German Research Center for Environmental Health
Published 1/06/2017
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Biochemistry

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Zalewski, J. K., Heber, S., Mo, J. H., O'Conor, K., Hildebrand, J. D., VanDemark, A. P. Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins. J. Vis. Exp. (119), e54886, doi:10.3791/54886 (2017).

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Abstract

Introduction

Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie hat zu allen Bereichen der modernen Biologie fundamentale Beiträge geleistet; eine atomare Ansicht der Makromoleküle bieten, die das Leben unterstützen und wie sie miteinander in einer Vielzahl von Kontexten interagieren; ermöglicht es uns, die Mechanismen zu verstehen, die Medikamente entwickeln zu behandeln Krankheit rational Krankheit und Bereitstellung von Möglichkeiten führen zu. Kristallographie ist seit langem die dominierende experimentelle Technik für makromolekulare Struktur zu bestimmen und derzeit einen Anteil von 89,3% der Strukturdatenbank (www.rcsb.org). Diese Technik hat viele Vorteile, einschließlich des Potenzials für eine sehr hohe Auflösung, die Fähigkeit, Makromoleküle zu visualisieren mit einer breiten Palette von Größen, relativ einfache Datenerfassung, und die Möglichkeit, sich vorzustellen, wie das Makromolekül mit Lösungsmittel sowie Liganden in Wechselwirkung tritt.

Trotz zahlreicher technologischer Verbesserungen in der rekombinanten Proteinexpression 1,2, purifizierung 3 und Molekularbiologie diese Systeme 4, das größte Hindernis in der kristallographischen Verfahren zur Erzeugung verwendet wird, bleibt die Fähigkeit Beugungs Kristalle zu züchten. Dies war vor allem für Proteine, die große Coiled-Coil-Domänen enthalten. Es wurde geschätzt , dass bis zu 5% aller Aminosäuren innerhalb Coiled-Coils 5,6, so dass dies eine sehr häufige Strukturmerkmal 7 gefunden werden, doch sind diese Proteine sind oft schwierig zu reinigen und zu kristallisieren als globuläre Proteine 8-10 . Dies wird weiter durch die Tatsache verstärkt, dass Coiled-Coil-Domänen oft im Rahmen eines größeren Proteins gefunden werden, deshalb richtig, die Grenzen dieser Domänen Vorhersage ist kritisch, um die Aufnahme von unstrukturierten oder flexible Sequenz zu vermeiden, die für die Kristallisation oft nachteilig ist.

Hier präsentieren wir einen konzeptionellen Rahmen kombiniert webbasierte Berechnungsanalysen mit Experimental Daten aus der Bank, führen den Benutzer durch den Anfangsstadien der kristallographischen Prozess zu helfen, einschließlich: wie Proteinfragment auszuwählen (e) für Strukturuntersuchungen, und wie die Vorbereitung und Proteinproben vor der Kristallisation Versuche charakterisieren. Wir konzentrieren unsere Analyse auf zwei Proteine ​​große Coiled-Coil-Domänen enthält, Shroom (SHRM) und Rho-Kinase (Rock). Diese Proteine wurden ausgewählt , da sie beide Coiled-Coil - Domänen enthalten und sind dafür bekannt , eine biologisch relevanten Komplex 11-16 zu bilden. Shroom und Rho-Kinase (Rock) vorhergesagt werden ~ 200 und 680 Reste von Coiled-Coil enthalten jeweils viele Teile davon wurden strukturell 17-20 gekennzeichnet. Das hier beschriebene Verfahren stellt einen optimierten Workflow schnell Fragmente von Coiled-Coil-haltiges Protein zu identifizieren, die für die Kristallisation geeignet sein wird, aber die beschriebenen Techniken können leicht für die meisten Protein oder Protein-Komplexe oder modifiziert angepasst werden Hochdurchsatz approa einzuarbeitenChes als verfügbar. Schließlich sind diese Verfahren im allgemeinen nicht teuer und können durch Nutzer an nahezu allen Erfahrungsstufen durchgeführt werden.

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Protocol

HINWEIS: Ein Diagramm des konzeptionellen Rahmens oder Workflow ist in Abbildung 1 als Referenz beschrieben. Das Protokoll kann in vier Stufen unterteilt werden: Rechen oder Sequenz basiert Prognosen, Proteinexpression und -reinigung, biochemische Charakterisierung und Kristallisation. Die gezeigten Beispiele analysieren Shroom SD2 Domänen und / oder Shroom-Rock-Komplexe, sondern kann mit jedem Protein verwendet werden.

1. Verwenden Sie etablierte Web-basierte Tools Computational Vorhersage der Coiled-Coil-Domänengrenzen generieren

  1. Sammeln Sie ein Evolutionarily Diverse Set Sequence Homologe.
    1. Zum www.uniprot.org und geben Sie in Shroom in der oberen Suchleiste.
    2. Wählen Sie Sequenzen, indem Sie das Kästchen neben ihrer Zugangsnummer zum Download bereit. Sequenzen mit einem Sternchen zeigen Sequenzen von Uniprot prüft und sind in der Regel zuverlässig. Achten Sie darauf, dass alle Sequenzen vollständig und genau sind.
    3. Speichern Sie die ausgewählten sequences durch den Download-Button klicken.
    4. Richten Sie die Sammlung von Shroom Sequenzen unter Verwendung von Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Klicken Sie auf die Schaltfläche "Durchsuchen" die Datei mit den Shroom Sequenzen auswählen und dann auf Senden drücken.
    5. Nachdem die Ausrichtung abgeschlossen ist, klicken Sie auf "Download Alignment File" Taste.
    6. Öffnen Sie die Ausrichtung mehrerer Sequenz erzeugt in 1.1.5 mit Jalview (Datei | Eingang Alignment | Aus Datei). Im Rahmen des neuen Ausrichtungsfenster, Farbe durch Identität (Farbe | Prozent Identity).
  2. Berechnen Vorhersagen der Sekundärstruktur, Vorhersage der flexible oder ungeordneten Sequenz und vorhergesagte Coiled-Coil-Regionen innerhalb des Proteins (e) von Interesse.
    1. Zum http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, Coiled-Coil-Prognosen zu berechnen. Kopieren Sie die Sequenz in der Sequenz Box und klicken Sie auf Absenden.
      HINWEIS: Bei dieser Analyse ein paar Stunden in Anspruch nehmen kann complete. Da Shroom Sequenzen ziemlich groß sind, müssen die Sequenzen können innerhalb des Größenbeschränkung des Webservers zu passen in Blöcken von weniger als 1000 Aminosäuren gespalten werden. Wenn Shrm2 Analyse, wird empfohlen, dass die C-terminale 1.000 Aminosäuren verwendet werden, wie in diesem Abschnitt die SHRM SD2-Domäne enthält, die Coiled-Coil-Regionen enthalten, ist bekannt. Wenn diese Analyse mit anderen Proteinen zu wiederholen, wird empfohlen, die in voller Länge Proteinsequenzen, wenn möglich zu verwenden. Wenn das nicht möglich ist, verwenden Sie das größte Fragment möglich oder die Sequenz sezieren basierend auf bekannten biochemischen oder funktionellen Daten.
    2. Zum http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, Coiled-Coil-Prognosen zu berechnen. Kopieren Sie die Sequenz in der Sequenz Box und klicken Sie auf Absenden.
  3. Kombinieren Sie die Ergebnisse der Schritte 1.1 bis 1.2.2 in eine einzige umfassende Kommentierung der Shroom Sequenz.
    HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, auch auf alle relevanten i umfassennformation, dass aus der Literatur oder anderen Quellen über die Proteinfunktion oder Reinigung in diesem Stadium zu entnehmen.
  4. Unter Verwendung dieses umfassenden kommentierten Sequenz vorherzusagen Domänengrenzen (oder eine Reihe von möglichen Grenzen) für das Protein, versuchen Erhaltung zu maximieren und die vorhergesagte strukturelle Merkmale, während die Menge von ungeordneten oder flexible Sequenz minimieren. Wenn bekannt ist, sollte das resultierende Protein der funktionellen Eigenschaften von Interesse behalten.

2. Express und Entschlacken Proteine ​​mit den Domänengrenzen der in Abschnitt 1

HINWEIS: Das Ziel dieses Abschnitts ist es, eine Reihe von schnellen und leicht quantifizierbar Assays zu verwenden hypothetische Domänengrenzen in Abschnitt 1 erzeugt zu screenen.

  1. Standard - Molekularbiologie - Techniken innerhalb des His 10 -mRuby2-XH2 Plasmid ein Expressionsplasmid mit der gewünschten Codierungssequenz in Rahmen erzeugen (Figur 3 für die Vektorkarte ein Sehennd weitere Details).
  2. Test - Expressionsniveaus für jedes Expressionsplasmids BL21 (DE3) E. coli oder einem anderen geeigneten Expressionsstamm in Autoinduktion media 1 bei Raumtemperatur für 18-24 Stunden verwendet wird .
    1. Trans Expressionsplasmide sowie eine leere Plasmidkontrolle in BL21 (DE3) nach den Anweisungen, die mit den Zellen geliefert wurde, oder unter Verwendung von robusten Transformationsprotokoll, wie das hier (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -Transformation/).
    2. Von der frisch transformierten Platte, eine einzige Kolonie holen und eine 5 ml Starterkultur bei 37 ° C über Nacht in LB-Medium (LB) Medien mit 34 & mgr; g / ml Kanamycin wachsen.
    3. Am folgenden Tag, Pellet, das die Kultur und Waschen des Pellets mit frischen LB.
    4. Fügen Sie die Starterkultur zu 50 ml Autoinduktion Medien mit 34 & mgr; g / ml Kanamycin. Erlauben die Kultur bis zur Sättigung wachsen entweder bei Raumtemperatur oder 37 ° C. Typischerweise wachsen für ~ 18-24 Std.
    5. Pellet-Zelles und frieren die resultierenden Zellpellets bei -80 ° C auf unbestimmte Zeit vor der Reinigung.
    6. Vergleichen Gesamtzellextrakten aus jeder Expressionsstamm und dem leeren Vektor Kontrolle durch SDS-PAGE die Belastung zu bestimmen, die am wirksamsten für das Fusionsprotein gewünscht erzeugt. Für seine 10 -mRuby2-Shroom SD2 Fusionsproteine, führen 10% SDS-PAGE - Gelen bei 180 V für ~ 50 min oder bis die Farbstofffront erreicht den Boden des Gels 22.
    7. Stain Gel mit Coomassie - Blau in jedem Stamm 23 gesamt zelluläre Proteine sichtbar zu machen.
  3. Führen Sie eine anfängliche Affinitätschromatographieschritt auf jeden Stamm, die erfolgreich mRuby2-Fusionsprotein exprimiert. Typischerweise führen Reinigung 2.3.2-2.3.7 bei Raumtemperatur die Schritte, es sei denn, das Protein aus veränderten Bedingungen wie Reinigung bei 4 ° C profitieren.
    1. Thaw Zellpellets aus Schritt 2.2.5.
    2. Resuspendieren jedes Zellpellet in 1,5 ml Lysispuffer (10% Glycerin, 500 mM NaCl, 40mM Imidazol, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM beta-Mercaptoethanol). Ergänzen Sie die Lyse-Puffer mit Protease-Inhibitoren als angemessen.
    3. Zugabe von 30 ul 10 mg / ml Lysozym und Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur. Beschallen Sie die Anweisungen für das Gerät verwendet wird.
    4. Transfer in ein 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugiert in einer Tischzentrifuge 30 Minuten bei 14.000 xg unlösliches Material oder nicht-lysierten Zellen zu pelletieren. Speichern Sie beide Stand und Pellet für die nachfolgende Analyse über SDS-PAGE.
    5. Führen Nickelaffinitätsreinigung, die lösliche Fraktion, die mit 100 & mgr; l Ni NTA-Kügelchen inkubiert. Inkubieren der Kügelchen mit löslichen Lysat für 5-10 min, mehrfaches Umdrehen Perlen zu mischen.
    6. Zentrifuge bei 800 × g für 30 Sekunden in einer Tischzentrifuge um die Kügelchen zu pelletieren. Folgen Sie dieser durch das Pellet 3-5 Mal mit Lysepuffer Waschen nicht-spezifische Verunreinigungen zu reinigen.
    7. Elute Rubin-Fusionsprotein aus den Perlen mit Lysepuffer ergänzt mit 1M Imidazol.
    8. Verwenden SDS-PAGE, das Verhalten von His-mRuby2-Shroom Proteine ​​in der "quick and dirty" Reinigung oben zu vergleichen.

3. Charakterisieren Protein Probe zu identifizieren Diejenigen mit vorteilhaften Eigenschaften

  1. Verwenden Sie ein Spektrophotometer Satz bei 280 nm , die Konzentration des Ruby - Fusionsproteins zu messen und zu beurteilen , dann die Homogenität der Probe von 1-5 ug Fusionsprotein auf einer nativen PAGE - Gel 24 geladen werden . Führen Sie den 10% Native PAGE-Gel bei 4 ° C für 140 min bei 175 V.
    1. Bild der native PAGE einen Imager ausgestattet Fluoreszenz sichtbar zu machen, zu beobachten, wo die mRuby-markierte Fusion in diesem Test wandert.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, Fusionsprotein zu beobachten, die in der auch dieses Protein stecken wird wahrscheinlich aggregiert. Wenn ein Fluoreszenz-Imager nicht verfügbar ist, kann man oft zu visualisieren und Bild konzentriert Proben von Ruby markierte Protein unter einem schwarzen Licht oder mit einem UV-Licht-Box.
  2. Führen Sie begrenzte Proteolyse stabil gefaltet Domänen zu identifizieren. Inkubiere 95 & mgr; l von Ruby-SHRM SD2 Fusion bei ~ 1 mg / ml mit 5 ul 0,025% Subtilisin A.
    1. Probieren Sie die Reaktion zu den Zeitpunkten 0, 0,5, 2, 5, 15, 60 und 120 min, Entfernung 10 & mgr; l aus der Reaktion für jeden Zeitpunkt und die Visualisierung des Fortschritts der Reaktion über SDS-PAGE mit 15% Acrylamid-Gel .
    2. Fleck mit Coomassie-Blau, wie in Schritt 2.2.7 und zu bewerten, ob eine Protease resistente Arten identifiziert werden kann.
  3. Integrieren Sie Daten aus der Reinigungsleistung, Verhalten in native PAGE und begrenzte Proteolyse auf den teilweise gereinigten mRuby2-Shroom-Fusionsproteine ​​in eine umfassende Beurteilung des Gesamtverhalten dieser Proteine ​​in Lösung.
    1. (Optional) Wenn eine geeignete Funktionstest zur Verfügung steht, an dieser Stelle für die Tätigkeit überprüfen.

4. Herstellung hochwertiger Kristalle der Coiled-Coil-SD2Domain von Shroom

HINWEIS: Alle Schritte im Abschnitt 4.1 werden bei Raumtemperatur durchgeführt, es sei denn, das Protein aus der Reinigung bei einer anderen Temperatur profitieren würden, in der Regel 4 ° C.

  1. Mit den 50 ml Wucherungen als grobe Schätzung der Expression und Reinigung Potenzial, führen in großem Maßstab Ausdrücke von mRuby2-Shroom SD2 mit dem Ziel, eine 5-20 mg vollständig gereinigte Probe. Typischerweise 2 l Kultur bietet ausreichend Ausgangsmaterial. Nach dem Wachstum Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 8.000 xg für 10 min.
    1. Resuspendieren des Pellets aus dem 2 L Wachstum in Lysepuffer wie zuvor, unter Verwendung von ~ 2 ml Lyse pro Gramm gefrorene Zellpellet Lysozym zur Lyse bei Verwendung. Alternativ resuspendieren bei ~ 8 ml / g Granulat, wenn ein Homogenisator oder Französisch drücken Sie. Pelletierung von Zelltrümmern durch Zentrifugieren bei 30.000 xg für 30 min.
    2. Batch binden, um die lösliche Fraktion aus 4.1.1 10 ml Ni-NTA-Harz verwendet wird. Gießen in entsprechende Schwerkraftsäuleund erlauben ungebundenen Proteine ​​abfließen.
    3. Wasch 3-5 mal mit 40 ml Lysepuffer gefolgt von einer Waschung mit Lysepuffer ergänzt auf 1 M NaCl-Harz.
    4. Wasch Harz mit 40 ml Lysepuffer mit 80 mM Imidazol ergänzt.
    5. Eluieren die Rubin-Shroom Fusionsprotein mit 40 ml Lyse-Puffer auf 1 M Imidazol ergänzt. fraktionieren manuell das eluierte Protein in 4-10 ml Fraktionen.
    6. Bestätigen Fraktionen, die Rubin-Shroom-Fusionsprotein unter Verwendung von 10% SDS-PAGE.
    7. Dialysieren geeigneten Fraktionen (typischerweise die Fraktionen 2-4) in 8% Glycerin, 250 mM NaCl, 15 mM Imidazol, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-ME, unter Verwendung von 6-8 kDa MWCO-Dialyseschlauch. 1 mg TEV-Protease für jede 25-50 mg Fusionsprotein. über Nacht bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren Dialysiere.
    8. Wiederholen Nickelaffinitätsreinigung Schritte 4.1.2. 4.1.6. Die Shroom SD2 Domäne sollte nun in der ungebundenen Fraktion bleiben , während der Seine 10 -mRuby2 wird gebunden bleibendas Harz und wird in den Elutionsfraktionen gefunden werden. Bestätigen Sie diese mit 12% SDS-PAGE-Färbung mit Coomassie-Blau.
    9. Dialysieren enthaltenden Fraktionen Shroom SD2 Domäne in 8% Glycerin, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM beta-Mercaptoethanol-Puffer über Nacht.
    10. Führen Sie Anionenaustauschchromatographie 25 eine FPLC mit und Elution mit einem NaCl - Gradienten von 0,1 bis 1,0 M NaCl. Analysieren Fraktionen unter Verwendung von 12% SDS-PAGE.
    11. Verwendung eines Spin - Konzentrator (MWCO von 10 kDa oder mehr in Abhängigkeit von dem Protein untersucht), Konzentrat Peakfraktionen auf ~ 0 mg / ml, und dann Chromatographie Größenausschluss durchzuführen 26, Analysieren Peakfraktionen mittels 12% SDS-PAGE.
    12. Pool Peakfraktionen und dialysiert in 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% Glycerin, 1 mM β-ME und konzentriert, um 10 mg / ml vor der Kristallisation.
      Optional: Bei diesem Schritt entfernen 5-ul-Proben bei Konzentrationen von 1, 2, 5 und 10 mg / ml im Verlauf der Probe zu konzentrieren.Ausführen eines nativen PAGE Lade 2-5 & mgr; l jeder Probe in diesem Schritt auf das Verhalten der Probe zu betrachten.
  2. Bildschirm ein kleines Feld von 12 Bedingungen für eine optimale Proteinkonzentration für Kristallisationsversuche zu identifizieren. Die Zusammensetzung dieser Bedingungen ist in Abbildung 7 beschrieben.
    1. Mit 24-Well-Drop-Kristallisation Schalen sitzen, führen Kristallisationsversuche die Dampfdiffusionsverfahren unter Verwendung Pipettieren 500 ul jedes der 12 Bedingungen in getrennten Vertiefungen von Tropfen gefolgt, die zunächst 1 ul gut Lösung enthalten und 1 ul Proteinprobe auf den Deckgläsern . Bitte beachten Sie 27 für weitere Informationen zu dieser Technik.
    2. Schnell versiegeln Sie das Fach mit durchsichtigem Klebeband und das Fach auf eine geeignete Temperatur kontrollierten Umgebung bewegen, die vibrationsfrei ist. Die verwendete Temperatur kann variieren, aber 4 & deg; C, 16 ° C und 20 ° C sind durchaus üblich.
    3. Untersuchen Sie die Tropfen in den Böden in den nächsten 3 days ein Mikroskop mit bis zu 100-facher Vergrößerung verwendet wird. Am Ende der 3-Tage-Frist, Score jeden Tropfen wie die kein Niederschlag (klar), leichte Niederschläge, starke Niederschläge (braun), oder Kristalle. Eine geeignete Proteinkonzentration sollte nicht mehr als 6 schwere Ausfällungen enthalten.
    4. Unter Verwendung der Proteinkonzentration in 4.2 identifiziert, Bildschirm, um eine breite Palette von im Handel erhältlichen Kristallisations Bildschirme. Die Verwendung eines Liquid-Handling-Roboters oder Kristallisation beschleunigt stark diesen Prozess, während auch Fehler in den Tropfen zu minimieren. Es erfordert viel weniger Protein als auch, so dass der Benutzer mehrere Bedingungen mit einer einzigen Probe zu screenen.
    5. Verbesserung der Anfangsbedingungen von breiten Bildschirmen identifiziert, indem sie systematisch jede der Variablen innerhalb des Kristallisationstropfen unterschiedlicher Verwendung von 24-Well-Screening-Tabletts wie zuvor.

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Representative Results

Ein Diagramm , das den Workflow in diesem System verwendet darstellt , ist in Abbildung 1 gezeigt und umfasst drei Hauptphasen. Computational Analyse der Sequenz verwendet wird, um Hypothesen über die Domänengrenzen der Coiled-Coil-Protein von Interesse zu entwickeln. Ein Beispiel eines kommentierten Analyse der Shrm2 SD2 Domäne ist in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Diagramm wurde das Ziel möglich Domänengrenzen für eine konservierte Domäne am C-Terminus des Zytoskelett-Regler zu identifizieren Shroom SD2 bezeichnet. Aus dieser Analyse wurde drei verschiedene Sätze von hypothetischen Domänengrenzen wurden Coiled-coil-Fragmente erzeugt enthalten, die den gesamten konservierten SD2 oder minimal-Fragmente in der Nähe des C-Terminus überspannt, die als die besten Kandidaten für die Kristallisation endete. Kandidaten aus der Sequenzanalyse identifiziert werden dann in kleinen Maßstab unter Verwendung einer Protein - Fusion mit mRuby2 (Figur 3) schnell getestet for effiziente Analyse. Representative kleinem Maßstab (50 ml Kultur) Aufreinigungen von zwei His 10 -mRuby2-tagged Proteine werden in Abbildung 4 dargestellt. In dieser Figur ist das Verhalten eines unlöslichen Proteins leicht offensichtlich im Vergleich zu seinem Gegenstück löslich. Unzureichend exprimieren, oder unlösliche Proteinfusionen sind einfach und schnell auf diese Weise identifiziert. Biochemische Analysen der Proteinfragmente durch limitierte Proteolyse sind in Figur 5 für eine Vielzahl von Fragmenten gezeigt , um die Ruby - System beschrieben , oder mit isolierten und gereinigten Shroom SD2 Domänen welken verwenden. In 5A sind zwei Varianten von Maus SHRM SD2 entsprechend hypothetischen Domänengrenzen # 2 und # 1 in Figur 3 wurden mit einem Gradienten von Proteasekonzentration von verdaut unter Verwendung (0-1,0%) für 30 min bei Raumtemperatur. Beide wurden in eine Vielzahl von kleineren Produkten bei moderaten Enzymkonzentrationen effektiv abgebaut. 5B zeigt die same Experiment durchgeführt hypothetische Grenze # 3 von Drosophila SHRM SD2 verwenden. Dieses Protein hat kristallisieren und seine Struktur wurde 19 beschrieben. Proteolytische Analyse kann auch nützlich sein, wenn aus dem Protokoll, wie oben erzeugt Rubin-Fusionen zu untersuchen. Wie in 5C gezeigt ist , wurde ein Rubin - Fusionsprotein mit humanem Shrm2 SD2 (1427 bis 1610) mit einer hohen Konzentration (0,025%) der nicht-spezifischen Protease Subtilisin bei Raumtemperatur für die angegebenen Zeitpunkten verdaut. Hier ist der Linker zwischen Ruby und SHRM wurde sofort gespalten wie zu erwarten wäre. Zusätzlich wurden Nebenprodukte angibt, die dieses Protein gebildet hat zwei anderen Protease-sensitive Regionen jedoch die Abbauprodukte, die innerhalb von 2 min hergestellt wurden, für den Rest des Experiments weitgehend intakt blieb das Protein anzeigt, ist eigentlich recht stabil.

Ein komplementärer Ansatz wird native PAGE analys gezeigt mitin Figur 6 ist. In 6A, Rubin-markierte menschliche SHRM SD2 (1427-1610) sowie Protein mit den angegebenen Punktmutationen innerhalb SHRM enthalten , werden durch native PAGE analysiert. In diesem Experiment wurde die Wildtyp-Protein wird als zwei unterschiedliche Banden (die Kristalle bildet), während die drei Mutanten, die nicht kristallisieren dramatisch unterschiedliches Verhalten haben. Um zu zeigen , dass das System auch nützlich auf Proteinkomplexe werden können, eine Vielzahl von Shroom-Rock - Komplexe wurden durch native PAGE in 6B analysiert. In diesem Fall wurde das gleiche Fragment von menschlichem Shrm2 SD2 (1427 bis 1610) verwendet, um die Analyse zu verdeutlichen, während unterschiedliche Fragmente des menschlichen Fels verwendet wurden. Dieser Ansatz vorgeschlagen, dass Komplexe mit Rock-700-906 und 746-906 mehrere Arten hatten, waren schmierig und weniger homogen. Komplexe 788-906 wurden verbessert, wenn auch nicht dramatisch verwendet wird, und diese Art konnte kristallisieren, obwohl Kristalle viele Wochen in Anspruch nahm zu bilden und conenthaltenen abgebaut Rock-Protein. Komplexe erzeugt Rock-834-913 mit bildeten eine einzige und einheitlichere Spezies auf dem Gel und leicht über Nacht kristallisiert. 7 zeigt eine Reihe von gemeinsamen Kristallisationsbedingungen , die auf das Verhalten der Proteinprobe in Kristallisationsversuche verwendet werden , um zu informieren, und kann im Allgemeinen mit jedem Protein verwendet werden. Idealerweise wird eine Mischung aus klar und Fällungsbedingungen erhalten werden. Proteine, die keine Niederschläge bilden erfordern hohe Konzentrationen oder strengerer Pufferbedingungen während diejenigen, die in vielen Bedingungen fällen sollte bei einer niedrigeren Proteinkonzentration oder mit Pufferbedingungen verwendet werden, die Proteinlöslichkeit zu fördern.

Abbildung 1
Abbildung 1: Diagramm Workflow. Ein allgemeines Diagramm der Integration von Rechensequenzanalyse darstellt und biochemische undandere nasse Labortechniken in eine umfassende Strategie für die Domänengrenzen Abgrenzen und Proteinfragmente zur Kristallisation zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Kommentierte Sequenzanalyse für die Coiled-Coil - SD2 Domäne von Shroom. Eine Überlagerung von Computeranalysen für die Domäne Shroom SD2, einschließlich einer Ausrichtung mehrere Sequenz erzeugt durch CLUSTAL Omega und gefärbt durch Sequenzidentität innerhalb Jalview (Schritt 1.1). Auch sind vorhergesagt enthalten Sekundärstruktur, ungeordneten Reihenfolge Prognosen und Coiled-Coil-Vorhersagen des Shroom SD2 Domain (Schritt 1.2). Hypothetische Domänengrenzen (Schritt 1.3) angegeben, wie die beobachteten Grenzen und Sekundärstruktur sindElemente wie 19 durch anschließende Strukturanalyse ergab. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Seine 10 -mRuby2-Expressionssystem. (A) Schematische Darstellung des Expressionsvektors His 10 -mRuby2-XH2 Vektor in dieser Studie verwendet. (B) Schematische Darstellung der Mehrfachklonierungsstelle von diesem Vektor. Protein codierende Sequenzen werden typischerweise in diesen Vektor durch BamHI und EcoRI-Klonierungsstellen eingefügt. Die extreme C-Terminus des Proteins mRuby2 in rot dargestellt wird, wird die TEV-Protease-Spaltungsstelle mit Klammern und mit der Spaltungsstelle als rotes Dreieck gezeigt angezeigt. Eine Linkersequenz zwischen dem mRuby2 und der TEV-Website wird in Cyan dargestellt.Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Repräsentative kleine purifications von zwei mRuby2 tagged Fusionsproteinen. (A) Ein Bild von Proben der Bakterienkultur Ausdruck Rubin SHRM SD2 oder ein nicht verwandtes Protein Rubin Fusions sein unlösliches bekannt sind abgebildet. Eine separate Kultur ein Protein ohne Rubin-Tag ausdrückt, wird zum Vergleich gezeigt. (B) Die lösliche Fraktion aus den Kulturen oben abgebildet wurden nach Lyse und Zentrifugation bei 30.000 xg für 30 min, die Visualisierung von löslichen Rubin SHRM SD2 zeigt. (C) Bild der Ni-NTA - Kügelchen nach der Bindung und anschließende Waschschritte anzeigt , dass Ruby-SHRM SD2 immobilisiert wird aufdie Perlen. (D) Die Proben von Wasch- und Elutionsschritte wie in den Schritten 2.3.6 und 2.3.7 zeigen , dass die Rubin SHRM SD2 Fusion an das Harz gebunden bleibt , während in Gegenwart von bis zu 80 mM Imidazol und effektiv die Säule aus eluiert mit 1 M Imidazol Elutionspuffer. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Begrenzte Proteolyse von Kandidaten SD2 Domänen aus verschiedenen Shroom Proteinen. Ein Vergleich von vier SD2 Domänen aus verschiedenen Shroom Proteinen. (A und B) Die angegebenen SHRM SD2 - Fragmente wurden mit einem Konzentrationsgradienten der Protease Trypsin 0-1,0% , und die durch SDS-PAGE analysierten Ergebnisse inkubiert. Die Beziehung dieser Proteinfragment Witzh die hypothetischen Grenzen angegeben. (C) SDS-PAGE - Analyse von begrenzten proteolytischen Verdau von His 10 -mRuby2-Shroom SD2 Fusionsprotein den zeitlichen Verlauf Verfahren in dem Protokoll beschrieben ist . Die Reaktion erfolgte mit 0,025% Trypsin bei Raumtemperatur. Verdau der Linker zwischen Ruby und Shroom SD2 ist schnell und dient als interne Kontrolle. Eine vermutete Abbauprodukt , das zusammen mit dem entschlackt Seine 10 -mRuby2-Shroom SD2 - Fusionsprotein (*) gekennzeichnet . Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6: Beobachten Veränderungen in der Protein Verhalten mit nativen Gel. (A) 10% Native PAGE die Wirkung einer Mutante zeigt , dass die Eigenschaften von mRuby2-Shroo ändertm SD2. Unter diesen Bedingungen SHRM SD2 läuft als zwei diskrete Banden, während angegebenen Punktmutanten im SD2 eine Reihe von anomalen Migrationsmuster anzuzeigen. (B) Ein Vergleich der Shroom SD2-Rock - Komplexe mit unterschiedlichen Versionen von Rock - und analysiert durch native PAGE gebildet. Komplexe zwischen Shroom SD2 und die angegebenen Fragmente von Rock-Kinase (beide Coiled-Coil-Proteine) wurden durch native PAGE aufgelöst. Die Kristalle wurden für den Komplex enthält, Rock-788-906 nach vielen Wochen erhalten, aber Komplex enthält Felsen 834-913 schnell kristallisiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

7
Abbildung 7: Schnell primären Bildschirm für die Kristallisation. (A) Eine schnelle Bildschirm gemeinsamer Kristallisation coBedingungen ausgebracht wird verwendet, um das Verhalten der Proteinprobe in Kristallisationsversuche zu bewerten. (B) Beispiele für die einfache Bewertungsmatrix Kristallisationstropfen zu beurteilen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21(DE3) Rosetta Emd Millipore 70954-3
BL21(DE3) Star ThermoFisher Scientific C601003
BL21(DE3) Codon Plus Agilent Technologies 230245
Lysozyme Spectrum Chemical Mfg Corp L3008-5GM
Ni-NTA resin Life Technologies 25216
SubtilisinA Spectrum Chemical Mfg Corp S1211-10ML
24 well Cryschem Plate Hampton research HR3-160
INTELLI-PLATE  96: Art Robbins Instruments 102-0001-03
PEG 3350 Hampton research HR2-591
PEG 8000 Hampton research HR2-515
PEG 400 Hampton research HR2-603
PEG 4000 Hampton research HR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2 Addgene 49089
Overnight Express Autoinduction System 1 Emd Millipore 71300
Lysogeny Broth powder ThermoFisher Scientific 12795027 

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References

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