चूहे में लगातार दौरे रोधगलितांश के histological मात्रा

1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg
Medicine

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Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. N. Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats. J. Vis. Exp. (118), e54914, doi:10.3791/54914 (2016).

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Abstract

Introduction

रोधगलन (एमआई) दुनिया भर में मौत और विकलांगता का एक प्रमुख कारण है। कोरोनरी हृदय रोग का मुख्य कारण है; एमआई ischemia ऐसे रोड़ा के रूप में कोरोनरी घटनाओं के लिए लगातार से यह परिणाम है। reperfusion पहले 6 घंटा के भीतर नहीं किया जाता है, जब ischemia अपरिवर्तनीय दौरे नेक्रोसिस लाती है। रोगियों में, एमआई के लक्षण वर्णन के नैदानिक लक्षण, electrocardiography, बायोमार्कर, इकोकार्डियोग्राफी, एमआरआई इमेजिंग के प्लाज्मा स्तर के आकलन सहित विभिन्न नैदानिक उपकरण, पर निर्भर करता है, और histological विश्लेषण करती है 1। तीव्र और जीर्ण एमआई कोरोनरी रोड़ा के समय के दौरे नेक्रोसिस रिश्तेदार के समय के अनुसार चोट के दो अलग-अलग चरणों के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं। तीव्र चरण, पहले 7 दिनों के दौरान होने वाली है, cardiomyocytes की हानि, व्यापक सूजन, और fibroblasts की भर्ती के साथ जुड़ा हुआ है। उप तीव्र चरण, हृदय के ऊतकों और एक निशान के गठन के उपचार की विशेषता होती है1 और बीच 4 - 6 सप्ताह। रोधगलितांश, निलय दीवार thinning, और वेंट्रिकल फैलने का विस्तार पुरानी चरण की विशेषताएँ। बाएं वेंट्रिकल की व्यापक remodeling उत्तरोत्तर गंभीर दिल की विफलता 2 में परिणाम है।

एमआई स्थायी बाईं पूर्वकाल उतरते धमनी (लाड) बंधाव से प्रेरित पुरानी रोधगलन के मानक कृंतक मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। कोरोनरी संयुक्ताक्षर mimics कोरोनरी रोड़ा। रोधगलितांश के आकार के संयुक्ताक्षर की साइट पर निर्भर करता है। एक कृंतक मॉडल में दौरे इस्कीमिक चोट की विशेषता प्रतिष्ठित ऐसे ट्रोपोनिन रूप बायोमार्कर प्लाज्मा स्तर, का उपयोग किया जाता रहा और टी 3, इकोकार्डियोग्राफी, एमआरआई, और ऊतक विज्ञान 4,5। Biomarker स्तरों cardiomyocyte मौत की हद के साथ सहसंबद्ध होते हैं। इकोकार्डियोग्राफी बाएं निलय समारोह हानि क्षेत्रीय दीवार गति असामान्यताओं से उत्पन्न मूल्यांकन करता है। इसके अलावा, गैर इनवेसिव इमेजिंग तकनीक, ऐसे एमआरआई या उच्च संकल्प के रूप में, कम छिड़काव और व्यवहार्य मायोकार्डियम, और दीवार पतले होने के साथ निशान क्षेत्र की मात्रा इकोकार्डियोग्राफी, दीवार गति में कमी के आकलन के लिए अनुमति देते हैं। एल.वी. आयाम रोधगलितांश आकार के सही मूल्यांकन की अनुमति है। अंत में, व्यवहार्य और मृत मायोकार्डियम की मात्रा का ठहराव काटा दिल के histological वर्गों के विशिष्ट दाग का उपयोग कर पोस्टमार्टम किया जा सकता है और रोधगलितांश आकार (आईएस) के सत्यापन की अनुमति देता है। एक अन्य महत्वपूर्ण विशेषता रोधगलितांश विस्तार सूचकांक (ईआई) 6 का मूल्यांकन है। ईआई पहले 3 दिनों के भीतर transmural रोधगलितांश और शुरू होता है के साथ जुड़ा हुआ है। ईआई दीवार मोटाई में एक प्रगतिशील कमी, एल.वी. गुहा आकार में वृद्धि हुई है, और एल.वी. आकार में परिवर्तन के फलस्वरूप द्वारा होती है।

आदेश उपन्यास उपचार के चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए - विशेष रूप से, सेल, matrices के आधार पर पुनर्योजी रणनीतियों, और कृन्तकों में एमआई के जीन डिलीवरी-सही आकलन सर्वोपरि महत्व का है।जब इल्लों से भरा हुआ मांसपेशियों के स्तर पर प्राप्त एक भी पार अनुभाग पर मापा जाता है, IS आकार बड़ा परिवर्तनशीलता कि लाड बंधाव निम्नलिखित रोधगलितांश विकास में मौजूद होने के कारण पक्षपातपूर्ण हो सकता है; सर्वोच्च रोधगलितांश तो occulted किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, निर्धारित एमआई आकार करने के लिए और अधिक सटीक तरीके चूहों 7-9 या चूहों 10 के लिए वर्णित किया गया है। फिर भी, है, सही एल.वी. remodeling या उपचारात्मक प्रेरित कटौती (या preventions) remodeling के यों के लिए अपर्याप्त है। दरअसल, आमतौर पर कुल एल.वी. मात्रा का एक प्रतिशत दिल के पार वर्गों पर मूल्यांकन के रूप में व्यक्त किया जाता है। हालांकि इस पद्धति तीव्र एमआई के लिए मान्य है, एल.वी. दीवार remodeling के दौरान होने वाली के thinning रहता तहत मूल्यांकन 11,12। रोधगलितांश आकार और संरचनात्मक परिवर्तन की एक पूरी morphometric मात्रा का ठहराव ऐसे endocardial और epicardial लंबाई और व्यास, साथ ही रोधगलितांश और स्वस्थ क्षेत्रों के रूप में कई मापदंडों, यों चाहिए। हम एक पद्धति appr का वर्णनoach सही एक पुरानी चूहे मॉडल में एमआई और remodeling आकलन करने के लिए।

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Protocol

सभी जानवरों को पशु की देखभाल पर यूरोपीय कन्वेंशन के अनुपालन में मानवीय देखभाल प्राप्त किया। सर्जिकल प्रक्रियाओं के राज्य पशु चिकित्सा कार्यालय, फ़्राइबर्ग, स्विस फेडरल पशु चिकित्सा कार्यालय, स्विट्जरलैंड द्वारा अनुमोदित की अनुमति प्राप्त करने के बाद स्विस पशु संरक्षण कानून के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।

1. हार्ट कटाई

नोट: सभी शल्य हस्तक्षेपों isoflurane संज्ञाहरण के तहत किया गया था। प्रयासों पशु पीड़ा कम करने के लिए किए गए थे। विशेष रूप से, सभी जानवरों को 0.1 मिलीग्राम / किलो buprenorphine पूर्व संज्ञाहरण के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्राप्त किया। रोधगलन शामिल करने के लिए शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल पहले से कहीं और 13 में वर्णित किया गया है।

  1. संज्ञाहरण (intubated पशु, 2.5% isoflurane, उचित संज्ञाहरण पंजा चुटकी पलटा द्वारा की पुष्टि की) के तहत एक myocardially infarcted जानवर पर एक sternotomy प्रदर्शन करना।
    1. त्वचा की मांसपेशियों को काटने और तब तक जानवर खोलेंशल्य कैंची के साथ। बाईं और दाईं तरफ पसलियों में कटौती, और फिर छाती को हटा दें।
    2. adhesions पिछले सर्जरी (लाड बंधाव) के बाद शेष निकालें। महाधमनी कट और दिल को हटा दें। 1 एम KCl (पीबीएस में) में ऊतक रखो, और फिर पीबीएस के साथ इसे धो लें।

2. ऊतक तैयारी

  1. एक एक्रिलिक चूहे दिल मैट्रिक्स में longitudinally infarcted दिल में डाल दिया। 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. मैट्रिक्स एक आड़ा के साथ एक रेजर ब्लेड का उपयोग सीधे दिल में कटौती। प्रत्येक टुकड़ा सुनिश्चित 2 मिमी मोटी है। , हर दिल (remodeling के स्तर के आधार पर) के लिए 7 स्लाइड - लगभग 5 कट इस व्यवस्थित नमूना कहा जाता है।
  3. इस चरण में, 2,3,5-triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला प्रदर्शन वैकल्पिक है (दिल स्लाइस आधार करने वाली शीर्ष की ओर रुख रखने के लिए)।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए पीबीएस में 1% टीटीसी में सेते हैं। 1 घंटा 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) में यह सेते हैं। betwee वर्गों रखो2 n मिमी spacers के साथ दो गिलास प्लेट और 15x बढ़ाई पर एक कैमरा के साथ मिलकर एक stereological माइक्रोस्कोप के साथ तस्वीरें ले लो।
      सावधान! Paraformaldehyde विषैला होता है।
  4. स्लाइड ठंड (1 सेंट विकल्प)
    1. एक प्लास्टिक मोल्ड (10 x 10 x 5 मिमी) cryotomy के लिए मध्यम (इष्टतम काटने के तापमान, अक्टूबर) बढ़ते के साथ में प्रत्येक स्लाइड रखो, उन्मुखीकरण बनाए रखने (अनुभाग के शीर्ष उन्मुख पक्ष मोल्ड के तल पर नीचे जगह)। 15 मिनट - तरल नाइट्रोजन 10 के लिए ठंडा करने के तहत 2-methylbutane वाष्प के साथ ब्लॉक रुक। अंत में, -80 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक की दुकान।
  5. Paraffinization (2 एन डी विकल्प)
    1. 4% पीएफए ​​में कैसेट embedding में प्रत्येक स्लाइड (कैसेट के तल पर नीचे अनुभाग के शीर्ष उन्मुख पक्ष रखकर उन्मुखीकरण बनाए रखने) और फिर 24 घंटे के लिए रखें। यह एक ऊतक प्रोसेसर मशीन रात भर में रखो।
      1. 2 घंटे के लिए इथेनॉल में 70% यह सेते हैं। एतान में यह सेते2 घंटे के लिए 95% राजभाषा। 3 घंटे के लिए इथेनॉल में 100% यह सेते हैं। 4 घंटे के लिए XYLOL में यह सेते हैं। 5 घंटे के लिए (एक ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर पिघला हुआ) पैराफिन में यह सेते हैं। अंत में, पैराफिन में हर दिल स्लाइड embedding द्वारा ब्लॉक बनाने।

3. मेसन-Goldner Trichrome धुंधला

  1. (: 5 माइक्रोन मोटाई) या एक cryostat -18 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट के साथ अक्टूबर ब्लॉक से (मोटाई: 7 माइक्रोन) एक मैनुअल microtome साथ पैराफिन ब्लॉकों से ऊतक वर्गों बनाओ।
  2. (- 4 स्लाइड प्रति आड़ा वर्गों 3) मेसन-Goldner साथ trichrome धुंधला (अनुबंध देखें) प्रत्येक चूहे के लिए हर दिल हिस्से से एक स्लाइड दाग।
    नोट: आयल वर्गों के लिए इस कदम से शुरू करें।
    1. एक ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड पिघला। एक धूआं हुड के तहत, 10 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार XYLOL में उन्हें deparaffinize। 3 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, और आसुत जल में उन्हें rehydrate।
      नोट: cryosection के लिए इस कदम से शुरूएस।
    2. उन्हें Bouin समाधान में रात भर ठीक करें। 15 मिनट - तो फिर, उन्हें 10 के लिए नल का पानी चलाने में कुल्ला। उन्हें आसुत पानी में कुल्ला। 3 मिनट के लिए मेयर के hematoxylin में उन्हें सेते हैं।
    3. स्लाइड्स निकालें और 5 मिनट के लिए आसुत जल में उन्हें छोड़ दें। फिर, 5 मिनट के लिए एसिड Fuchsin-रक्तवर्ण रंग में उन्हें सेते हैं। 1 मिनट के लिए 1% एसिटिक एसिड में उन्हें कुल्ला।
    4. अगले, 1 मिनट के लिए phosphomolybdic एसिड ऑरेंज जी में उन्हें सेते हैं। 1 मिनट के लिए 1% एसिटिक एसिड में उन्हें कुल्ला, 10 मिनट के लिए हल्के हरे रंग में उन्हें सेते हैं, और 1 मिनट के लिए 1% एसिटिक एसिड में उन्हें कुल्ला।
    5. उन्हें 70% इथेनॉल (30 सेकंड), 95% इथेनॉल (30 सेकंड), और 100% इथेनॉल (5 मिनट) में निर्जलीकरण। ऊतक वर्गों पर एक राल बढ़ते मध्यम की एक बूंद रखो, उन्हें coverslips के साथ कवर किया, और उन्हें सूखी।

4. रोधगलितांश आकार विश्लेषण

  1. एक stereomicroscope (15X बढ़ाई) पर प्रत्येक स्लाइड एक कैमरा के साथ मिलकर से एक छवि मोल। एक ही सेटिंग के साथ एक शासक की तस्वीरएस।
  2. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें रोधगलितांश, पट मोटाई, बाएं वेंट्रिकल (एल.वी.) गुहा क्षेत्र, रोधगलितांश क्षेत्र है, और एल.वी. ऊतक क्षेत्र का उपयोग कर के बीच में निशान मोटाई मापने के लिए।
    1. शासक के चित्र (चित्रा 1 ए) के साथ पैमाने पर सेट करें।
      1. माप का चयन करें तो सेट रूपांतरण कारक पर क्लिक करें। अंशांकन पट्टी पर एक लाइन ड्रा। सही तस्वीर पर क्लिक करें और समाप्ति अंशांकन पर क्लिक करें। नोट बार मूल्य, और फिर ठीक क्लिक करें।
    2. दाग दिल के चित्र (चित्रा 1 बी) से एल.वी. का चयन करें। एकाधिक खंड उपकरण का उपयोग करें। एल.वी. बिंदु से बिंदु का चयन करें, और फिर ठीक क्लिक करें कॉपी / कहीं भी पेस्ट।
    3. उपाय निशान और पट मोटाई एकल खंड माप उपकरण का उपयोग (चित्रा 1C
    4. स्वचालित रूप से एल.वी. गुहा, रोधगलितांश का पता लगाने, और एल.वी. क्षेत्रों आरजीबी मोड (चित्रा -1) में स्वत: क्षेत्र माप उपकरण का उपयोग।
      1. उपकरण पर क्लिक करें। सक्रिय करें केवल बॉर्डर्स और आरजीबी मोड में सन्निहित। अंत में, हित के क्षेत्र के अंदर क्लिक करें यह पता लगाने के लिए। यदि आवश्यक हो, परिशुद्धता उपकरण का उपयोग करें।
  3. एल.वी. क्षेत्र के लिए रोधगलितांश क्षेत्र के अनुपात के रूप रोधगलितांश आकार की गणना।
  4. [एल.वी. गुहा क्षेत्र / पूरे एल.वी. क्षेत्र] / [रोधगलितांश मोटाई / पट मोटाई], दोनों एल.वी. गुहा और एल.वी. ऊतक क्षेत्रों सहित पूरे क्षेत्र के साथ एल.वी.: इस प्रकार के रूप में विस्तार सूचकांक की गणना।
  5. इस प्रकार के रूप में अंत में, एक 'औसत' हर दिल के लिए गणना: [infarcted स्लाइड से विस्तार सूचकांक की औसत] * [infarcted स्लाइड्स की संख्या / स्लाइड की कुल संख्या]।

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Representative Results

छह सप्ताह के बाद लाड बंधाव, दिल लुईस चूहों से काटा गया। 2 मिमी ऊतक वर्गों शीर्ष से आधार को प्राप्त किया गया। एक टीटीसी धुंधला प्रक्रिया रोधगलितांश क्षेत्र है, जो सफेद में प्रकट होता है, और स्वस्थ मायोकार्डियम, (चित्रा 2) जो लाल रंग में दिखाई देता है कल्पना करने के लिए प्रदर्शन किया था। बालक की बंधाव की साइट पर निर्भर करता है, रोधगलितांश आकार बदलता है। बड़े एमआई के लिए, transmural दौरे आधार (2A चित्रा) के लिए शीर्ष से मनाया गया। छोटे दौरे सफेद infarcted ऊतक दिल (चित्रा 2 बी) के मध्य वर्ग को शीर्ष से दिखाई प्रस्तुत किया। छोटे गैर transmural दौरे के लिए, तंतुमय ऊतक सर्वोच्च (चित्रा -2) से केवल एक या दो वर्गों पर मनाया गया।

हर दिल टुकड़ा से पतला 5 माइक्रोन वर्गों में कटौती और मेसन-Goldner trichrome के साथ दाग रहे थे। दिल के पूरे पार अनुभाग के चित्र थे(चित्रा 3) एक stereomicroscope के तहत हासिल कर ली। स्वस्थ ऊतकों हरे रंग में लाल और संयोजी ऊतक में दिखाई दिया। प्रत्येक रंग के बीच भेदभाव को आसानी से एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है।

रोधगलितांश और पट, एल.वी. गुहा क्षेत्र और एल.वी. कुल क्षेत्रफल का मोटाई मापा और ईआई (तालिका 1) की गणना करने में गणना कर रहे थे। ईआई प्रत्येक अनुभाग के लिए गणना की गई। दिल के आकार पर निर्भर करता है, वर्गों की संख्या 7. 5 से विविध हर दिल के लिए, ईआई प्रत्येक खंड से ईआई के एक औसत है। ईआई 0 से 0.278 करने के लिए विविध और 58% की एक CV के साथ, दौरे दौरे की एक विस्तृत श्रृंखला का पता चला। इसकी तुलना में, एल.वी. को रोधगलितांश का प्रतिशत की औसत 0 से 0.241 करने के लिए विविध, 54% (तालिका 1) के एक CV के साथ। ईआई और रोधगलितांश का प्रतिशत काफी सहसंबद्ध थे; एक गैर पैरामीट्रिक स्पीयरमैन विश्लेषण एक सहसंबंध गुणांक आर-VA प्रदान की0.491 के लुए (पी = 0.005) (चित्रा 4 क)। इस तरह 0.11 और 0.13 के रूप में बंद ईआई मूल्यों के लिए, रोधगलितांश का प्रतिशत 5.8 से 24.1% करने के लिए विविध।

दिल समारोह anesthetized जानवरों पर 6 सप्ताह के बाद लाड बंधाव पर उच्च संकल्प इकोकार्डियोग्राफी द्वारा मूल्यांकन किया गया था और दिल की कटाई करने से पहले एक बार प्रदर्शन किया गया था। ईआई गणना की ऊतकीय मात्रा का ठहराव से एफई के साथ काफी सहसंबद्ध। एक गैर पैरामीट्रिक स्पीयरमैन विश्लेषण -0.709 (पी = 0.005) (चित्रा 4 बी) के एक आर मूल्य प्रदान की है।

आकृति 1
चित्रा 1. कदम-दर-कदम छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के उपयोग का चित्रण। स्वचालित रंग परिसीमन और लंबाई मापन के लिए कई कदम शामिल थे। कैलिब्रेशन: छवि के पैमाने स्थापित किया गया था। की एक तस्वीरएक शासक दिल खंड के रूप में एक ही हालत में लिया गया था। शासक की लंबाई पैमाने रूपांतरण कारक है परिभाषित करने के लिए चिह्नित किया गया था। मिलीमीटर पिक्सेल से रूपांतरण प्रदर्शन किया गया था। बी एल वी चयन: सही वेंट्रिकल सॉफ्टवेयर का चयन उपकरण का उपयोग तस्वीर से बाहर काट दिया गया। सी एल वी दीवार और पट मोटाई माप: एकल माप उपकरण दूरी यों इस्तेमाल किया गया था। स्केल सलाखों 3 मिमी संकेत मिलता है। डी स्वत: क्षेत्र मात्रा का ठहराव: स्वचालित रंग परिसीमन आरजीबी मोड में प्रदर्शन किया गया था। ऑटो-चयन ऑटो मोड चयन चयन करने के बाद किया गया था। रंग के आधार पर चयन संशोधित किया जा सकता है; अन्वेषक चयनित हरी ऊतक के दृश्य नियंत्रण प्रदर्शन किया और वृद्धि हुई है या आवश्यक के रूप में चयनित क्षेत्र में कमी आई है। स्केल सलाखों 3 मिमी संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्र 2
चित्रा 2. दिल धारा टीटीसी के साथ दाग। पूरे दिल से 2 मिमी वर्गों टीटीसी के साथ दाग रहे थे। स्वस्थ मायोकार्डियम सफेद में लाल और fibrotic ऊतकों में दिखाई दिया। अलग रोधगलितांश आकार के साथ तीन दिल प्रस्तुत कर रहे हैं। एक: बड़े transmural रोधगलितांश, बी: मध्यम रोधगलितांश, और सी: छोटे रोधगलितांश। स्केल सलाखों 3 मिमी संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. हार्ट धारा मेसन-Goldner Trichrome के साथ दाग। 5-माइक्रोन वर्गों हर दिल में 6 सप्ताह के बाद लाड बंधाव प्राप्त अनुभाग से काट रहे थे। स्टेडियमined वर्गों एक stereomicroscope के तहत रखा गया था। पूर्ण वर्गों के चित्र 15X बढ़ाई साथ प्राप्त किया गया। प्रतिनिधि चित्र, इल्लों से भरा हुआ मांसपेशियों (वापस तीर) के स्तर पर प्राप्त की, हरे रंग में लाल और fibrotic ऊतकों में स्वस्थ मायोकार्डियम पता चलता है। तस्वीर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ स्वत: रंग परिसीमन, साथ ही साइट है जिस पर रोधगलितांश और पट मोटाई मापा गया (काले लाइनों) को दिखाता है। स्केल सलाखों 3 मिमी संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. विस्तार सूचकांक (ईआई) और रोधगलितांश संबंधित का प्रतिशत के बीच सहसंबंध (ए) या इंजेक्शन फ्रैक्शन (एफई) (बी) एल.वी. करने के लिए। रेखीय प्रतिगमन (काला लाइन) और 95% विश्वासnce अंतराल (बिंदीदार रेखा) प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। गैर पैरामीट्रिक स्पीयरमैन आर मूल्य की सूचना दी है। एक: रोधगलितांश और ईआई का प्रतिशत काफी सहसंबद्ध (आर = 0.567; पी = 0.003)। रोधगलितांश विस्तार सूचकांक (ईआई) [एल.वी. गुहा क्षेत्र / पूरे एल.वी. क्षेत्र] / [रोधगलितांश मोटाई / पट मोटाई] के रूप में गणना की गई। पूरे एल.वी. क्षेत्र संयुक्त एल.वी. गुहा और एल.वी. ऊतक क्षेत्र के रूप में मापा गया था। रोधगलितांश का प्रतिशत एल.वी. ऊतक क्षेत्र / रोधगलितांश ऊतक क्षेत्र के रूप में गणना की गई। बी: समारोह में काफी ईआई के साथ सहसंबद्ध एक उच्च संकल्प इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग कर 6 सप्ताह के बाद लाड बंधाव पर आकलन किया। दोनों मानकों में काफी सहसंबद्ध थे (आर = -0.709; पी = 0.005)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका1: मेसन Goldner से सना हुआ हार्ट वर्गों पर मापा मापदंडों।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

Fibrotic ऊतक सही एक पुरानी एमआई चूहे काटा दिल और छवि के व्यवस्थित नमूने का उपयोग कर मॉडल में मूल्यांकन किया जा सकता तीन रंगो से सना हुआ ऊतकीय एपेक्स के लिए आधार से प्राप्त वर्गों के विश्लेषण करती है। दो चरणों के सफल कार्यान्वयन के प्रोटोकॉल के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, दिल कटाई के लिए KCl के उपयोग के हृदय की मांसपेशी एक आराम से राज्य में बनाए रखा जा सकता है। यह कदम विभिन्न दिल से रोधगलितांश आयामों की तुलना के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, Bouin समाधान में खंड के लिए रात भर निर्धारण उज्ज्वल trichrome धुंधला प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।

संशोधन और समस्या निवारण

धुंधला की अनुपस्थिति इस तरह कम ऊष्मायन समय के रूप में Bouin समाधान में खंड के निर्धारण के दौरान कठिनाइयों की वजह से हो या Bouin समाधान की समय सीमा समाप्त हो सकती है। टीटीसी धुंधला वैकल्पिक और Coul हैएक तेजी से लेकिन गैर मात्रात्मक रास्ते में रोधगलितांश आकार कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा घ। यह ध्यान रखें कि टीटीसी या तो अक्टूबर या पैराफिन में शामिल किए जाने से पहले ही दिल के लिए किया जा सकता है महत्वपूर्ण है।

तकनीक की सीमाएं

वर्तमान दृष्टिकोण एक आयल एम्बेडेड और क्रायो संरक्षित दिल वर्गों के बीच चयन करने के लिए और immunostaining के लिए इस्तेमाल किया जा सकता परमिट। फिर भी, पूरे दिल sectioned हो गया है, और ऊतक ऐसे पश्चिमी धब्बा या प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए आरटी पीसीआर के रूप में, आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व

क्योंकि मात्रा का ठहराव प्रक्रियाओं और, विशेष रूप से, विश्लेषण वर्गों की संख्या में व्यापक रूप से जांच के बीच, प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय मात्रा का ठहराव सर्वोपरि है आवश्यक वर्गों की न्यूनतम संख्या को परिभाषित करने के लिए अलग अलग। Takagawa टी अल। 9 प्रदर्शन किया है कि विश्वसनीयता 6 की एक न्यूनतम दिल टुकड़ा संख्या के साथ अधिकतम है - एक माउस 1 मिमी अंतराल का उपयोग करने का पूरे दिल के 8 वर्गों। वर्तमान प्रोटोकॉल में, 5 - पूरे चूहे दिल के 7 वर्गों जब 2 मिमी मोटी सेक्शनिंग प्रदर्शन कर प्राप्त किया गया। इसके अलावा, 2 मिमी वर्गों एक मानक और टीटीसी धुंधला के लिए अक्सर इस्तेमाल किया आकार के होते हैं। इसके अलावा, प्रणालीगत नमूना लागू करने के लिए सरल है और एक आवधिक पहलू यह है कि पूरे दिल के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है प्रस्तुत करता है।

2 मिमी स्लाइस में से प्रत्येक से, 5 माइक्रोन वर्गों में कटौती और दाग रहे थे। प्रत्येक 5 माइक्रोन अनुभाग के लिए, पट मोटाई, निशान मोटाई और लंबाई, कुल निशान क्षेत्र, कुल एल.वी. क्षेत्र है, और एल.वी. गुहा क्षेत्र की मात्रा का ठहराव प्रदर्शन किया गया, और प्रत्येक पैरामीटर की औसत प्रति पशु गणना की गई। हम नहीं बल्कि 2 मिमी वर्गों के टीटीसी धुंधला की तुलना में पतली वर्गों की मेसन-Goldner धुंधला इस्तेमाल किया दोनों स्वचालित रंग का पता लगाने और मूल्यांकन की सटीकता में सुधार करने के लिएकी लंबाई। दरअसल, टीटीसी धुंधला नहीं बल्कि पुरानी चरण के लिए की तुलना में जोखिम 8,14 पर क्षेत्र का पता लगाने के लिए प्रारंभिक चरण या इस्कीमिक reperfusion मॉडल के लिए ज्यादातर दिलचस्प है।

एमआई लाड बंधाव से प्रेरित संयुक्ताक्षर साइट के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। प्रस्तुत पुरानी रोधगलन मॉडल में, बंधाव आकार जानबूझकर प्रत्येक जानवर के लिए संशोधित किया गया था, और रोधगलितांश आकार और remodeling के विभिन्न स्थितियों के लिए परिणाम 6 सप्ताह के बाद उपस्थित थे। तदनुसार, गणना ईआई दौरे दौरे की एक विस्तृत श्रृंखला का पता चला है और अंतर एफई के साथ सहसंबद्ध दिल समारोह में मनाया समर्थन किया। जब infarcted खंड के व्यापक thinning हुई, रोधगलितांश का क्षेत्र बहुत transmural फाइब्रोसिस के मामले में कम हो गया था। इस हालत में, पूरे एल.वी. (एल.वी. के प्रतिशत के रूप में व्यक्त) के संबंध में रोधगलितांश ऊतक के क्षेत्र की गणना के द्वारा रोधगलितांश आकार को परिभाषित कमजोर रोधगलितांश की हद तक का मूल्यांकन होगा। सी की कमीremodeling प्रेरित एल.वी. फैलाव और रोधगलितांश एल.वी. दीवार के चरम पतले होने के लिए onsideration, के रूप में प्रतिनिधित्व मूल्यों से 95% आत्मविश्वास के बाहर रोधगलितांश आकार को नजरअंदाज कर सकते हैं, जबकि एक रोधगलितांश दीवार पतले होने के अभाव में वर्तमान रोधगलितांश आकार से अधिक-अनुमान होता है मध्यान्तर। इस कमी को ईआई की गणना के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है।

यह दिखाया गया है कि एल.वी. आकार परिवर्तन सकारात्मक ईआई और दीवार thinning 15, 16 के साथ जोड़ा जाता है। ईआई एल.वी. समारोह का एक कारक हो सकता है, यह है कि इकोकार्डियोग्राफी पर जोर देना महत्वपूर्ण है और ऊतकीय विश्लेषण के पूरक के तरीकों में क्रमश: कार्यात्मक और ऊतक स्तर पर दौरे रोधगलितांश आकलन करने के लिए कर रहे हैं। इकोकार्डियोग्राफी अनुदैर्ध्य अध्ययन की अनुमति देता है, और histological ऐसी दीवार मोटाई के रूप में मौलिक अंत बिंदु assays कि एल.वी. आकृति विज्ञान की अतिरिक्त मात्रा का ठहराव की अनुमति है, उपलब्ध कराने का विश्लेषण करती है।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश पीछेएर इस तकनीक में माहिर

पूरे दिल के प्रणालीगत नमूना और ईआई की गणना जब पुरानी एमआई का आकलन विशेष रुचि के हैं। , इस तरह के सेल और के रूप में उपन्यास उपचार, के लिए विशेष रूप से मैट्रिक्स आधारित उपचार है कि रोधगलितांश आकार और remodeling को कम करने के उद्देश्य इसके अलावा, इस विधि उपचार प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त हो जाएगा। के रूप में अंत बिंदु ऊतकीय विश्लेषण रोधगलितांश आकार पूर्व और बाद के उपचार की तुलना में बाधा रोधगलितांश विस्तार के विश्वसनीय मात्रा का ठहराव, गैर इलाज और इलाज जानवरों के बीच तुलना के लिए सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic rat heart matrix 2 mm 72-5015 Harvard Appartus
Inspira advanced volume controlled ventilator Harvard Apparatus 557058
Catheter Insyte 14 G BD 381267
O.C.T BDHA361603E VWR
TTC T8877-10G Sigma Aldrich
Mayer hematoxylin MHS32-1L Sigma Aldrich
Acid Fuchsin
CI 42685
F8129-50G Sigma Aldrich
Ponceau Xylidin
CI 16150
P2395-25G Sigma Aldrich
Orange G
CI 16230
O3756-100G Sigma Aldrich
Light green
CI 42095
L5382-25G Sigma Aldrich
KCl P9333-500G Sigma Aldrich
Xylol 10315083 HoneyWell
Ethanol absolute 10303990 HoneyWell
2-methylbutane M32631-1L Sigma Aldrich
Stereogical microscope SM2800 Nikon
Formaldehyde 99340 Reactolab
Embedding cassette K113.1 Carl Roth
Bersoft Image measurement Software Bersoft.com Licensed software

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References

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