Quantificação histológico de miocárdio crônico infarto em ratos

1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg
Medicine

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Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. N. Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats. J. Vis. Exp. (118), e54914, doi:10.3791/54914 (2016).

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Abstract

Introduction

O infarto do miocárdio (MI) é uma das principais causas de morte e incapacidade em todo o mundo. A doença cardíaca coronária é a causa principal; MI resulta de isquemia consecutiva a eventos coronarianos, como a oclusão. Quando reperfusão não é realizada dentro do primeiro 6 horas, isquemia induz necrose miocárdica irreversível. Em pacientes, o caracterização de MI conta com diferentes ferramentas de diagnóstico, incluindo sinais clínicos, eletrocardiograma, avaliação dos níveis plasmáticos de biomarcadores, ecocardiograma, imagiologia de ressonância magnética, e histológica 1. MI aguda e crónica são classificados como duas fases diferentes da lesão de acordo com a temporização da necrose do miocárdio em relação ao momento da oclusão coronária. A fase aguda, ocorrendo durante os primeiros 7 dias, está associada com a perda de cardiomiócitos, inflamação extensiva, e o recrutamento de fibroblastos. A fase sub-aguda, caracterizada por a cura do tecido cardíaco e a formação de uma cicatriz, ocorreentre 1 e 4 - 6 semanas. Expansão do infarto, afinamento da parede do ventrículo, e dilatação do ventrículo caracterizar a fase crônica. Remodelação extensa do ventrículo esquerdo resulta progressivamente de insuficiência cardíaca grave 2.

MI induzida pelo permanente anterior esquerda artéria descendente (LAD) ligadura representa o modelo de roedor padrão de infarto crônico do miocárdio. Os imita ligadura coronária oclusão coronária. O tamanho do enfarte depende do local da ligadura. Caracterização de lesão isquémica do miocárdio em um modelo de roedor é classicamente realizada utilizando os níveis plasmáticos de biomarcadores, como a troponina I e T 3, ecocardiograma, ressonância magnética, e histologia 4,5. níveis de biomarcadores são correlacionados com a extensão da morte de cardiomiócitos. Ecocardiografia avalia a esquerda comprometimento da função ventricular resultante de anormalidades de movimento de parede regional. Além disso, técnicas de imagem não invasivos, como a ressonância magnética ou de alta resoluçãoecocardiografia, permitir a avaliação da redução do movimento da parede, o volume da área da cicatriz com diminuição da perfusão e miocárdio viável, eo afinamento da parede. dimensões do VE permitir a avaliação precisa do tamanho do infarto. Finalmente, a quantificação do miocárdio viável e mortos podem ser post-mortem realizados usando manchas específicas de secções histológicas de corações colhidas e permite a verificação do tamanho do enfarte (IS). Outra característica importante é a avaliação do índice de expansão do enfarte (EI) 6. A EI é associado com o infarto transmural e começa nos primeiros 3 dias. A EI é caracterizada por uma redução progressiva da espessura da parede, um aumento no tamanho da cavidade do VE, e consequentes alterações na forma do LV.

A fim de avaliar a eficácia terapêutica de novos tratamentos - em particular, as estratégias baseadas em células regenerativas, matrizes, e o gene de avaliação de entrega precisas de MI em roedores é de importância primordial.Quando medido em uma única seção transversal obtida ao nível dos músculos papilares, o tamanho é pode ser tendenciosa, devido à grande variabilidade que existe no desenvolvimento do infarto seguinte ligadura LAD; o enfarte apex pode ser, em seguida, ocultado. Importante, as metodologias mais precisas para o tamanho determinado MI têm sido descritos para ratinhos ou ratos 7-9 10. No entanto, é insuficiente para quantificar com precisão remodelação LV ou reduções induzidas terapeuticamente (ou prevenções) da remodelação. Com efeito, este modo é geralmente expressa como uma percentagem do volume total do VE avaliada em secções transversais do coração. Embora este método é válido para infarto agudo do miocárdio, o afinamento da parede do LV que ocorre durante a remodelação permanece sub-avaliada 11,12. A quantificação morfométrica completa do tamanho do infarto e mudanças estruturais devem quantificar vários parâmetros, tais como comprimentos do endocárdio e epicárdio e diâmetros, bem como enfarte e áreas saudáveis. Nós descrevemos um aprox metodológicaoach para avaliar com precisão MI e remodelação em um modelo de rato crônica.

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Protocol

Todos os animais receberam cuidados de acordo com a Convenção Europeia dos Animal Care. Os procedimentos cirúrgicos foram realizados em conformidade com a Lei de Protecção dos Animais Suíça depois de obter autorização do Serviço Veterinário do Estado, Fribourg, aprovado pelo Swiss Federal Veterinário, Suíça.

Colheita 1. Coração

NOTA: Todas as intervenções cirúrgicas foram realizadas sob anestesia isoflurano. Foram feitos esforços para diminuir o sofrimento animal. Em particular, todos os animais receberam uma injecção subcutânea de 0,1 mg / kg de buprenorfina pré-anestésica. O protocolo cirúrgico para indução de enfarte do miocárdio foi anteriormente descrito noutro local 13.

  1. Executar uma esternotomia sobre um animal myocardially infartada sob anestesia (animal entubado, 2,5% de isoflurano, a anestesia adequada confirmados pela pata pitada reflex).
    1. Abra o animal por o corte da pele e, em seguida, os músculoscom uma tesoura cirúrgica. Corte as costelas do lado esquerdo e direito, e em seguida, remover o peito.
    2. Retirar as adesões restantes após a cirurgia anterior (LAD ligadura). Cortar a aorta e remover o coração. Colocar o tecido em KCl 1 M (em PBS), e em seguida lavar com PBS.

2. Preparação do Tecido

  1. Colocar o coração infartado longitudinalmente em uma matriz de coração de rato acrílico. Mantê-lo a -20 ° C durante 1 h.
  2. Cortar o coração diretamente na matriz usando uma lâmina de barbear com uma transversal. Certifique-se de cada fatia é de 2 mm de espessura. Cortar aproximadamente 5-7 diapositivos para cada coração (com base no nível de remodelação); isso é chamado de amostragem sistemática.
  3. Neste passo, realizar a coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) é opcional (manter a orientação da base de fatias de coração-a-ápice).
    1. Incubar em 1% de TTC em PBS durante 50 min a 37 ° C. Incubar-lo em 4% de paraformaldeído (PFA) durante 20 min a 1 h. Coloque as seções between duas placas de vidro com espaçadores de 2 mm e tirar fotos com um microscópio estereológica acoplado com uma câmera de 15X de ampliação.
      CUIDADO! O paraformaldeído é tóxico.
  4. Deslize congelamento (1 opção st)
    1. Colocar cada lâmina em um molde de plástico (10 x 10 x 5 mm) com meio para cryotomy (temperatura de corte óptima, outubro) de montagem, manter a orientação (colocar o lado do vértice orientado da secção para baixo na parte inferior do molde). Congelar os blocos com vapores de 2-metilbutano em atmosfera de azoto líquido de arrefecimento para 10 - 15 min. Finalmente, armazenar o tecido a -80 ° C.
  5. Parafinização (2 opção nd)
    1. Colocar cada lâmina na incorporação de cassetes (manter a orientação, colocando o lado orientado para o vértice da secção para baixo na parte inferior da cassete) e, em seguida, em PFA a 4% durante 24 h. Coloque-o em uma noite máquina de processador de tecidos.
      1. Incubar-lo em etanol a 70% durante 2 h. Incubar em que etanol 95% durante 2 h. Incubar-lo em etanol a 100% durante 3 h. Incubar-lo em xilol durante 4 h. Incubar-lo em parafina (derretida a 60 ° C num forno), durante 5 h. Finalmente, fazer blocos, incorporando cada slide coração em parafina.

3. Masson-Goldner tricromo

  1. Fazer secções de tecido a partir de blocos de parafina com um micrótomo manual (espessura: 5 ^ M) ou a partir de blocos PTU com um criostato ajustado para -18 ° C (espessura: 7 mm).
  2. Manchar um slide de cada peça do coração para cada rato (3 - 4 secções transversais por slide) com Masson-Goldner tricromo (ver anexo).
    NOTA: Iniciar a partir deste passo para as seções de parafina.
    1. Derreter as lâminas a 60 ° C num forno. De acordo com um exaustor, eles Desparafinar duas vezes em xilol durante 10 minutos cada. Rehidratar-los em 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol, e água destilada, durante 3 minutos cada.
      NOTA: Iniciar a partir deste passo para o criocortes.
    2. Corrigi-los em Bouin solução durante a noite. Em seguida, lave-os em água corrente por 10 - 15 min. Lave-os em água destilada. Incubar-los em hematoxilina de Mayer por 3 min.
    3. Retirar as lâminas e deixá-los em água destilada durante 5 minutos. Em seguida, incubam-los em ácido fucsina-Ponceau durante 5 min. Lave-os em ácido acético a 1% durante 1 min.
    4. Em seguida, incubam-los em ácido fosfomolíbdico Orange G durante 1 min. Lave-os em ácido acético a 1% durante 1 min, incubar-las à luz corante verde durante 10 minutos, e lavá-los em ácido acético a 1% durante 1 min.
    5. Desidratar-os em 70% de etanol (30 seg), 95% de etanol (30 seg), e etanol a 100% (5 min). Coloque uma gota de um meio de montagem resinoso nas secções de tecido, cobri-los com lamelas, e deixe-os secar.

Análise Tamanho 4. Infarto

  1. Adquirir uma imagem de cada slide em uma lupa estereoscópica (15X de ampliação) acoplado com uma câmera. Fotografar uma régua com a mesma configuraçãos.
  2. Use software de análise de imagem para medir a espessura da cicatriz no meio do enfarte, a espessura do septo, área da cavidade do ventrículo esquerdo (VE), a área de enfarte e área de tecido do LV utilizando.
    1. Definir a escala com a imagem régua (Figura 1A).
      1. Clique em Medidas, em seguida, selecione Definir Fator de Conversão. Desenhar uma linha na barra de calibração. Botão direito do mouse sobre a imagem e clique sobre a calibração End. Observe o valor bar, e, em seguida, clique em OK.
    2. Escolha do LV a partir da imagem do coração coradas (Figura 1B). Use a ferramenta segmento múltipla. Selecione o ponto-a-ponto LV, e clique depois à direita Copiar / colar em qualquer lugar.
    3. Medir a espessura da cicatriz e do septo usando a ferramenta de medição único segmento (Figura 1C
    4. Detectar automaticamente o LV cavidade, enfarte, e áreas LV utilizando a ferramenta de medição de área automático no modo RGB (Figura 1D).
      1. Clique na ferramenta. Ative Só Fronteiras e Contígua no modo RGB. Finalmente, clique dentro da área de interesse para detectá-lo. Se necessário, use ferramentas de precisão.
  3. Calcular o tamanho do enfarte como a relação da área de enfarte e a área de LV.
  4. Calcular o índice de expansão da seguinte forma: [área da cavidade LV / toda a área LV] / [espessura enfarte / espessura do septo], com toda a área de LV incluindo tanto a cavidade do VE e áreas de tecido do LV.
  5. Finalmente, calcule uma "média" para cada coração como segue: [média de índice de expansão das lâminas infartados] * [Número de lâminas infartados / número total de slides].

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Representative Results

pós-LAD ligadura seis semanas, corações foram colhidas de ratos Lewis. secções de tecido de 2 mm foram obtidas a partir do vértice para a base. Um procedimento de coloração TTC foi realizada para visualizar a área de enfarte, que aparece em branco, eo miocárdio saudável, que aparece em vermelho (Figura 2). Dependendo do local de ligação da ADA, a dimensão do enfarte varia. Para grande MI, infartos transmurais foram observados a partir do vértice para a base (Figura 2A). Infartos menores apresentaram tecido infartado branco visível a partir do ápice para a mid-section do coração (Figura 2B). Para pequenos enfartes não-transmurais, tecido fibrótico foi observada em apenas uma ou duas secções do vértice (Figura 2C).

Finas seções 5 mícrons de cada fatia do coração foram cortadas e coradas com Masson-Goldner trichrome. Imagens de toda a secção transversal do coração eramadquirida sob um microscópio estereoscópico (Figura 3). tecidos saudáveis ​​apareceu em tecido vermelho e do conjuntivo no verde. A discriminação entre cada cor pode ser facilmente realizada com um software de análise de imagem.

As espessuras do enfarte e do septo, área da cavidade do ventrículo esquerdo e a área total do VE foram medidos e calculados para calcular o EI (Tabela 1). A EI foi calculado para cada seção. Dependendo do tamanho do coração, o número de secções variou de 5 a 7. Para cada coração, o EI é uma média do IE de cada secção. A EI variou 0-0,278 e revelou uma grande variedade de enfartes do miocárdio, com um CV de 58%. Em comparação, a média da percentagem de enfarte para a VE variou 0-0,241, com um CV de 54% (Tabela 1). O EI ea percentagem de enfarte foram significativamente correlacionados; uma análise não-paramétrica de Spearman proporcionado um coeficiente de correlação R-VAlue de 0,491 (p = 0,005) (Figura 4A). Para valores próximos EI, tais como 0,11 e 0,13, a percentagem de enfarte variou 5,8-24,1%.

a função cardíaca foi avaliada por ecocardiografia de alta resolução em 6 semanas pós-LAD ligadura em animais anestesiados e foi realizada uma vez antes da colheita coração. O EI calculado a partir quantificação histológica significativamente correlacionada com a EF. Uma análise não-paramétrica de Spearman fornecido um valor de R de -0,709 (p = 0,005) (Figura 4B).

figura 1
Figura 1. Passo-a-passo Ilustração do Uso do software de análise de imagem. delimitação automática de cor e comprimento incluídos os vários passos. Calibração A.: A escala da imagem foi criada. Uma imagem deuma régua foi tomada na mesma condição como a seção de coração. O comprimento da régua foi marcado para definir o factor de conversão de escala. A conversão de pixel para milímetros foi realizada. Selecção B. LV: O ventrículo direito foi cortada da imagem utilizando a ferramenta de seleção do software. C. LV medição da parede e do septo espessura: A ferramenta de medição única foi utilizada para quantificar distâncias. As barras de escala indicam a 3 mm. Quantificação D. Automatic área: delimitação automática de cores foi realizada no modo RGB. Auto-seleção foi realizada após seleccionar o modo de auto-seleção. seleção com base em cor pode ser modificado; o investigador realizada controle visual do tecido verde seleccionada e aumento ou diminuição da região seleccionada, se necessário. As barras de escala indicam a 3 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2
Figura 2. Coração cortes corados com TTC. secções de 2 mm do coração cheio foram coradas com TTC. miocárdio normal apareceram em tecidos fibróticos em vermelho e branco. Três corações com diferentes tamanhos de infarto são apresentados. A: grande infarto transmural, B: enfarte médio e C: pequeno enfarte. As barras de escala indicam a 3 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Secções coração coradas com Masson-Goldner Tricromio. seções 5 mícrons foram cortados de cada seção coração obtido 6 semanas pós-LAD ligadura. Staseções INED foram colocados sob um microscópio estereoscópico. Fotos das seções completos foram obtidos com 15X de ampliação. A imagem representativa, obtida ao nível dos músculos papilares (Seta para trás), mostra miocárdio normal em tecidos vermelhos e fibróticas em verde. A figura ilustra a delimitação cor automática com o software de análise de imagem, bem como o local em que a espessura do enfarte e do septo foram medidos (linhas pretas). As barras de escala indicam a 3 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Correlação entre a expansão Index (EI) eo percentual do enfarte relativos ao LV (A) ou a fração de ejeção (EF) (B). A regressão linear (linha preta) e 95% confideintervalos de NCE (linhas pontilhadas) são representados. O valor de r Spearman não paramétrica é relatado. A: A percentagem de infarto e EI significativamente correlacionados (r = 0,567; p = 0,003). O índice de expansão do infarto (EI) foi calculada como [área de LV cavidade / área inteira LV] / [espessura enfarte / espessura do septo]. Toda a área de LV foi medida como a cavidade do VE e área de tecido do LV. A percentagem do enfarte foi calculada como a área de tecido a área de tecido do LV / enfarte. B: A função avaliada em 6 semanas pós-LAD ligadura utilizando um ecocardiograma de alta resolução significativamente correlacionada com EI. Ambos os parâmetros foram significativamente correlacionados (r = -0,709; p = 0,005). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Mesa1: parâmetros medidos em Masson Goldner coradas secções do coração.

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Discussion

Passos críticos dentro do Protocolo

tecido fibrótico pode ser avaliada com precisão em um modelo de rato MI crónica utilizando amostragem sistemática do coração e imagem colhida análises dos cortes histológicos tricromáticas-manchado obtidos a partir da base para o ápice. Dois passos são particularmente importantes para implementação do protocolo de sucesso. Em primeiro lugar, o uso de KCl para a colheita coração permite que o músculo cardíaco a ser mantido num estado relaxado. Esta etapa é importante para comparações de dimensões de enfarte a partir de corações diferentes. Em segundo lugar, a fixação durante a noite da secção em solução de Bouin é fundamental para obter a coloração tricromo brilhante.

Modificações e resolução de problemas

Ausência de coloração pode ser devido a dificuldades durante a fixação da seção em solução de Bouin, tais como tempo de incubação reduzido ou expirado soluções Bouin. A coloração TTC é opcional e could ser utilizada para visualizar o tamanho do enfarte de um modo rápido, mas não quantitativo. É importante notar que TTC pode ser realizada pelo mesmo coração antes da inclusão em parafina, quer outubro ou.

Limitações da técnica

A presente abordagem permite escolher entre secções de coração embebidos em parafina e criopreservados e pode ser utilizado para a imunocoloração. No entanto, o coração completo tem de ser seccionado, e o tecido não pode ser usado para análise, tais como western blot ou RT-PCR para a proteína e a expressão do gene análises.

Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos

Uma vez que os procedimentos de quantificação e, em particular, o número de secções analisadas variam amplamente entre as investigações, que define o número mínimo de pontos necessários para se obter uma quantificação fiável é primordial. Takagawa et ai. 9 demonstraram que a fiabilidade é maximizada com um número mínimo de fatia coração 6 - 8 secções de todo o coração de um rato usando intervalos de 1 mm. No presente protocolo, 5 - 7 seções de todo o coração de rato foram obtidos quando se realiza de 2 mm de espessura de corte. Além disso, as secções de 2 mm são um padrão e tamanho usado com freqüência para a coloração TTC. Além disso, a amostragem sistémico é de aplicação simples e apresenta um aspecto periódica que permite a caracterização de todo o coração.

A partir de cada uma das fatias de 2 mm, secções 5-um foram cortadas e coradas. Para cada seção 5 mícrons, quantificação da espessura do septo, a espessura da cicatriz e comprimento, área total da cicatriz, a área total do VE, e da área da cavidade do VE foram realizadas, ea média de cada parâmetro foi calculado por animal. Nós usamos coloração Masson-Goldner de secções finas em vez de TTC coloração de secções de 2 mm para melhorar a precisão de ambos a detecção automática de cores ea avaliaçãode comprimentos. Com efeito, a coloração TTC é principalmente interessante para a fase precoce ou modelos reperfusão isquémica para a detecção de área em risco 8,14, em vez de para a fase crónica.

MI induzida por ligadura de LAD pode variar dependendo do local da ligadura. No modelo de enfarte crónico apresentado, o tamanho de ligação foi intencionalmente modificado para cada animal, e os resultados para várias condições do tamanho do enfarte e remodelação estavam presentes depois de 6 semanas. Por conseguinte, o calculado EI revelou uma vasta gama de enfartes do miocárdio e suportado a diferença observada na função cardíaca correlacionada com a EF. Quando extensa adelgaçamento do segmento enfartado ocorreu, a área do enfarte foi grandemente reduzida no caso de fibrose transmural. Nesta condição, que define o tamanho do enfarte por cálculo da área do tecido do enfarte em relação a todo o LV (expresso como uma percentagem do ventrículo esquerdo) seria fracamente avaliar a extensão do enfarte. A falta de Consideration para dilatação LV induzida pela remodelação e afinamento extrema da parede de enfarte do VE pode subestimar o tamanho do enfarte, enquanto um enfarte presente na ausência de desbaste de parede que sobre-estimar a dimensão do enfarte, tal como representado pelos valores fora da confiança de 95% intervalo. Esta lacuna poderia ser eliminado através do cálculo da EI.

Tem sido demonstrado que a mudança de forma do LV é positivamente correlacionada com o EI e desbaste de parede 15, 16. Embora EI pode ser um preditor da função LV, é importante enfatizar que a ecocardiografia e análises histológicas são métodos complementares para avaliar a infarto do miocárdio no nível funcional e do tecido, respectivamente. Ecocardiografia permite um estudo longitudinal, e análises histológica fornecer ensaios de ponto final fundamentais que permitem a quantificação adicional de morfologia do VE, como a espessura da parede.

Aplicações futuras ou chegar à popaer dominar esta técnica

A amostragem sistêmica de todo o coração e o cálculo do EI são de particular interesse quando se avalia MI crônica. Além disso, este método será adequado para a avaliação da eficácia do tratamento, em particular para novos tratamentos, tais como células e tratamentos que visam reduzir o tamanho do enfarte e remodelação da matriz à base de. quantificação confiável de expansão do infarto é de suma importância para comparações entre animais não-tratados e tratados, como ponto final análises histológicas impede a comparação do tamanho do infarto pré e pós-tratamento.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic rat heart matrix 2 mm 72-5015 Harvard Appartus
Inspira advanced volume controlled ventilator Harvard Apparatus 557058
Catheter Insyte 14 G BD 381267
O.C.T BDHA361603E VWR
TTC T8877-10G Sigma Aldrich
Mayer hematoxylin MHS32-1L Sigma Aldrich
Acid Fuchsin
CI 42685
F8129-50G Sigma Aldrich
Ponceau Xylidin
CI 16150
P2395-25G Sigma Aldrich
Orange G
CI 16230
O3756-100G Sigma Aldrich
Light green
CI 42095
L5382-25G Sigma Aldrich
KCl P9333-500G Sigma Aldrich
Xylol 10315083 HoneyWell
Ethanol absolute 10303990 HoneyWell
2-methylbutane M32631-1L Sigma Aldrich
Stereogical microscope SM2800 Nikon
Formaldehyde 99340 Reactolab
Embedding cassette K113.1 Carl Roth
Bersoft Image measurement Software Bersoft.com Licensed software

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References

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