Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for Identifikation af flere fosforyleringer af Intrinsically Disordered Proteiner

1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally
Published 12/27/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

En af de vigtigste udfordringer i sundhedsvæsenet i det 21. århundrede er neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers sygdom (AD). Tau er et microtubulus-associeret protein, der stimulerer mikrotubulus (MT) formation. Tau er lige så involveret i flere neurodegenerative sygdomme, såkaldte tauopatier, hvoraf de mest kendte er AD. I disse lidelser, er Tau selvstændige aggregater i parrede spiralformede filamenter (PHF'er) og fundet ændret mange rester af posttranslationelle modifikationer (PTMS) såsom fosforylering 1. Phosphorylering af Tau-protein er impliceret i både regulering af dets fysiologiske funktion af MT stabilisering og patologisk tab af funktion, der kendetegner AD neuroner.

Endvidere Tau-protein, når de integreres i PHF'er i syge neuroner, er uvægerligt hyperphosphoryleret 2. I modsætning normal tau, der indeholder 2-3 phosphatgrupper, den hyperphosphoryleret Tau i PHF'er indeholder 5 til 9 Phosphate gruppe 3. Hyperphosphorylering af Tau svarer både til en stigning på støkiometri på nogle steder og til fosforylering af yderligere lokaliteter, der kaldes patologiske steder af phosphorylering. Dog eksisterer overlapning mellem AD og normale voksne mønstre af fosforylering trods kvantitative forskelle i niveau 4. Hvor specifikke phosphoryleringsbegivenheder indflydelse funktion og dysfunktion af Tau stort set ukendt. Vi tilstræber at dechifrere Tau regulering af PTMS på det molekylære niveau.

For at uddybe forståelsen af ​​de molekylære aspekter af Tau, vi skulle tage fat tekniske udfordringer. For det første, Tau er i sig selv uordnet protein (IDP) når de er isoleret i opløsning. Sådanne proteiner mangler veldefineret tredimensionel struktur under fysiologiske betingelser og kræver særlige biofysiske metoder til at studere deres funktion (er) og strukturelle egenskaber. Tau er et paradigme for den voksende klasse af internt fordrevne, ofte forbundet medpatologier såsom neurodegenerative sygdomme, dermed øge interessen for at forstå de molekylære parametre der indgår deres funktioner. For det andet karakterisering af Tau-phosphorylering er en analytisk udfordring, med 80 potentielle phosphoryleringssteder langs sekvensen af ​​den længste 441 aminosyre Tau isoform. Et antal antistoffer er blevet udviklet mod phosphorylerede epitoper Tau og anvendes til påvisning af patologisk Tau i neuroner eller hjernevæv. Phosphoryleringsbegivenheder kan finde sted på mindst 20 lokaliteter er omfattet af prolin-rettet kinaser, de fleste af dem i tæt nærhed i Proline-rige region. Den kvalitative (hvilke websteder?) Og kvantitative (hvad støkiometri?) Karakterisering er svært selv af de seneste MS-teknikker 5.

NMR-spektroskopi kan anvendes til at undersøge uordnede proteiner, som er meget dynamiske systemer udgøres af ensembler af konformerer. Høj opløsning NMR spektroskopi var ansøged at undersøge både strukturen og funktionen af ​​tau-proteinet. Desuden kompleksiteten af Tau s phosphorylering profil førte til udviklingen af molekylære værktøjer og nye analysemetoder anvendelse af NMR til identifikation af phosphoryleringssteder 6 - 8. NMR som en analysemetode muliggør identifikation af Tau phosphoryleringssteder i en global måde, visualisering af alle enkelt-site modifikationer i et enkelt eksperiment, og kvantificering af omfanget af phosphat inkorporering. Dette punkt er vigtigt, da selv fosforylering undersøgelser om Tau bugne i litteraturen, har de fleste af dem er udført med antistoffer, hvilket giver en høj grad af usikkerhed om komplet profil af phosphorylering og dermed den sande betydning af de enkelte phosphoryleringsbegivenheder. Rekombinante kinaser herunder PKA, Glycogen-syntase kinase 3β (GSK3p), cyklin-afhængige kinase 2 / cyclin A (CDK2 / CYCA), cyklin-afhængig kinase 5 (CDK5) / p25 handleivator protein, ekstracellulært-signal-reguleret kinase 2 (ERK2) og mikrotubuli-affinitet-regulerende kinase (MARK), som viser fosforylering aktivitet mod Tau, fremstilles i en aktiv form. Desuden er Tau-mutanter, der muliggør frembringelse af specifikke tau-protein-isoformer med velkarakteriserede phosphorylering mønstre anvendes til at dechifrere phosphorylering kode Tau. NMR-spektroskopi anvendes derefter til karakterisering enzymatisk modificerede Tau prøverne 6 - 8. Selvom in vitro-phosphorylering af Tau er mere udfordrende end pseudo-fosforylering såsom ved mutation af udvalgte Ser / Thr til glutaminsyre (Glu) rester, denne tilgang har sine fordele. Faktisk kan hverken de strukturelle virkninger eller interaktion parametre fosforylering altid efterlignes af glutaminsyrer. Et eksempel er den turn motiv observeret omkring phosphoserin 202 (pSer202) / phosphothreonin 205 (pThr205), som ikke er gengivet med Glu mutationer 9.

in vitro phosphorylering med rekombinant ERK2 kinase præsenteres. ERK2 aktiveres ved phosphorylering af mitogenaktiveret proteinkinase / ERK-kinase (MEK) 10 - 12 år. Ud over fremstilling af modificerede, isotopisk mærkede Tau-protein, er NMR-strategi, der anvendes til identifikation af PTMS beskrevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af 15N, 13C-Tau (figur 1)

  1. Transform pET15b-Tau rekombinant T7-ekspressionsplasmid 13,14 i BL21 (DE3) kompetente Escherichia coli bakterieceller 15.
    BEMÆRK: cDNA kodende for den længste (441 aminosyrerester) Tau isoform klones mellem Ncol og Xhol-restriktionssteder i pET15b plasmid
    1. Bland forsigtigt 50 pi kompetente BL21 (DE3) -celler, som danner 1-5 x 10 7 kolonier pr ug plasmid-DNA, med 100 ng plasmid-DNA i et 1,5 ml plastrør.
      BEMÆRK: Codon-brug optimeret bakteriestammer for eukaryot cDNA ekspression ikke er afgørende for at producere humant tau.
    2. Placer celleblandingen på is i 30 minutter og derefter varmechok i 10 sekunder ved 42 ° C. Glasset anbringes tilbage på is i 5 min og tilsæt 1 ml stuetemperatur LB (Luria-Bertani) medium. Inkubér den bakterielle suspension ved 37 ° C i 30 minutter under svagagitation.
  2. Spred anvendelse af en podning loop 100 pi cellesuspension jævnt på en agarplade af LB-medium indeholdende 100 ug / ml ampicillin antibiotikum.
  3. Inkubér udvælgelse plade i 15 timer ved 37 ° C.
  4. Hold udvælgelsen pladen ved 4 ° C, indtil videre til kultur trin, i højst 2 uger ca.
    BEMÆRK: en glycerolstamopløsning bakteriekultur (50% glycerol), opbevaret ved -80 ° C, kan fremstilles til at starte kulturen på et senere tidspunkt.
  5. Tilsæt 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100x MEM vitamin supplement, 1 ml 100 mg / ml ampicillin til 1 I autoklaveres M9 salte (6 g Na 2 HPO 4, 3 g KH 2 PO 4 , 0,5 g NaCl).
    BEMÆRK: Et hvidt bundfald vil danne ved tilsætning af CaCl2 opløsning til M9 salte, der hurtigt forsvinder.
  6. Opløse 300 mg 15 N, 13 C-komplet medium, 1 g af 15NH4Cl og 2 g 13 C6 glucose i 10 ml M9-medium. Filter-sterilisere isotopen opløsning under anvendelse af et 0,2 um filter, direkte i M9-medium.
  7. Suspendere anvendelse af en podning løkke én koloni af pET15b-Tau transformerede bakterier fra udvælgelsen plade i 20 ml LB-medium suppleret med 100 ug / ml ampicillin.
  8. Inkubér podede medium ved 37 ° C i ca. 6 timer.
  9. Måle optisk densitet ved 600 nm (OD600) på 1 ml af en ti-fold fortynding af bakteriekultur i en plastik spektrometer kuvette.
    BEMÆRK: Turbiditet af bakteriekulturen svarende til OD600 på 3,0-4,0 indikerer, at mætning vækstfase nås.
  10. Der tilsættes 20 ml af den mættede LB kultur til 1 I M9 vækstmedium suppleret med ampicillin (100 ug / ml slutkoncentration), i 2 L Erlenmeyer plast forvirret dyrkningskolbe.
  11. Placer dyrkningskolbe i en programmerbar inkubator indstillet til 10 °C og 50 rpm. Programmere inkubator for at skifte til 200 rpm og 37 ° C tidligt om morgenen den næste dag.
  12. Mål OD 600 på 1 ml bakteriekultur i en plastik spektrometer cuvette Der tilsættes 400 pi 1 M IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid) stamopløsning (holdt ved -20 ° C), når OD600 når en værdi på ca. 1,0 til inducere ekspressionen af rekombinant Tau-protein.
  13. Fortsæt inkubation ved 37 ° C i yderligere 3 timer. Indsamle de bakterielle celler ved centrifugering ved 5000 xg i 20 min.
  14. Frys den bakterielle pellet ved -20 ° C. Hold frosset indtil rensningstrin, i en længere periode, hvis nødvendigt.

2. Oprensning af 15 N, 13C-Tau (figur 2)

  1. Autoklave kation-udveksling (CEX) rensning buffere ved 121 ° C under 15 psi i 20 min. Opbevar buffere ved 4 ° C.
  2. Optø den bakterielle cellepellet og resuspender grundigt i 45 mlekstraktionsbuffer CEX A buffer (50 mM NaPi pH 6,5, 1 mM EDTA) frisk suppleret med protease inhibitor cocktail 1x (1 tablet) og DNAseI (2.000 enheder).
  3. Forstyrre den bakterielle celler ved anvendelse af en højtrykshomogenisator ved 20.000 psi. 3-4 passerer er nødvendige. Centrifuger ved 20.000 xg i 40 min for at fjerne uopløseligt materiale.
  4. Varm bakteriecelleekstrakt i 15 minutter ved 75 ° C ved anvendelse af et vandbad.
    BEMÆRK: der observeres et hvidt bundfald efter et par minutter.
  5. Centrifuger ved 15.000 xg i 20 minutter og holde supernatanten indeholdende varmestabile Tau-protein.
  6. Opbevares ved -20 ° C indtil den følgende oprensningstrin, hvis nødvendigt.
  7. Udfør en kationbytningskromatografi på en stærk CEX-harpiks pakket som en 5 ml bed-søjle under anvendelse af en hurtig protein-væskekromatografi (FPLC) (figur 3 A).
    1. Indstil flow til 2,5 ml / min.
    2. Ækvilibrere kolonnen i CEX En buffer
    3. Læg 60-70 ml heated-ekstrakt indeholdende Tau under anvendelse af en prøve pumpe, eller alternativt pumpe A, afhængigt af systemet. Opsaml gennemløbet til analyse for at verificere, at Tau-protein effektivt binder til harpiksen (se 2.8).
    4. Vask harpiksen med CEX En buffer indtil absorbansen ved 280 nm er tilbage til baseline værdi.
    5. Eluer Tau fra søjlen ved anvendelse af en tre-trins NaCl-gradient fås ved gradvis forøgelse af CEX B-buffer (CEX En buffer med 1 M NaCl). Program FPLC som følger: første trin af gradienten til 25% CEX B-buffer i 10 søjlevolumener (CV) for at nå 250 mM NaCl, andet trin til 50% CEX B-buffer i 5 CV at nå 500 mM NaCl og tredje trin til 100% CEX B-buffer i 2 CV at nå 1 M NaCl. Opsaml 1,5 ml fraktioner under elueringstrin.
  8. Analyser 10 pi af fraktionerne opsamlet under elueringen trin ved SDS-PAGE (12% SDS-acrylamidgel) og Coomassie-farvning (Figur 3 A) 16. Check påsætningstrinnet på søjlen samt ved anazing 10 pi af gennemstrømningen.
  9. Vælg fraktionerne indeholdende Tau og samle disse fraktioner til det næste trin.
  10. Udfør en buffer udveksling på Tau-holdige samlede fraktioner (Figur 3 B).
    1. Ækvilibrer en afsaltning søjle af 53 ml G25 harpiks pakket leje (26 x 10 cm) i 50 mM ammoniumbicarbonat (flygtig puffer) under anvendelse af et FPLC-system.
    2. Indstillede strømningshastighed til 5 ml / min. Injicer Tau prøven på søjlen via en 5 ml injektion loop. Saml fraktioner svarende til toppen absorption ved 280 nm.
    3. Gentag injektion 3-4 gange, afhængigt af mængden af ​​den oprindelige CEX pool.
  11. Beregne mængden af ​​oprenset Tau-protein ved hjælp af toparealet af kromatogrammet ved 280 nm (1 mg Tau svarer til 140 mAU * ml).
    BEMÆRK: ekstinktionskoefficient på Tau-protein ved 280 nm er 7.550 M -1 cm-1. Tau indeholder ingen Trp rester.
  12. Pool alle Tau fraktioner.
  13. Aliquot prøven i rør indeholdende svarende til 1 til 5 mg Tau. Vælg disse rør, således at volumenet af opløsningen er lille sammenlignet med volumenet af røret (for eksempel 5 ml opløsning i et 50 ml rør).
  14. Hulle de-låg ved hjælp af en nål. Frys Tau prøver ved -80 ° C.
  15. Lyofiliseres Tau prøver. Lyofiliseret Tau-protein kan opbevares ved -20 ° C i længere tid.

3. In vitro Phosphorylering af 15 N-Tau

  1. Opløs 5 mg lyofiliseret Tau i 500 pi phosphorylering buffer (50 mM Hepes · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
  2. Tilføj 2,5 mM ATP (25 pi 100 mM stamopløsning holdes ved -20 ° C), 1 mM DTT (1 pi 1 M stamopløsning holdes ved -20 ° C), 1 mM EGTA (2 pi af en 0,5 M stamopløsning opløsning), 1x protease inhibitor cocktail (25 pi af en 40x stock opnået ved at opløse 1 tablet i 1 ml phosphorylering puffer) og 181; M aktiveret His-ERK2 (250 pi i bevaring buffer 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl og 10% glycerol, opbevaret ved -80 ° C) i et totalt prøvevolumen på 1 ml.
    BEMÆRK: Den aktiverede His-ERK2 kan fremstilles in-house 5,8 ved phosphorylering med MEK-kinase.
  3. Inkuber 3 timer ved 37 ° C.
  4. Opvarmes prøven ved 75 ° C i 15 min for at inaktivere ERK kinase.
  5. Centrifuger ved 20.000 xg i 15 min. Indsamle og holde supernatanten.
  6. Afsalte proteinet prøven i 50 mM ammoniumbicarbonat anvendelse af en søjle af 3,45 ml G25 harpiks pakket leje (1,3 x 2,6 cm), som er egnet til en 1 ml prøve.
  7. Køre en 12% SDS-PAGE 16 med 2,5 pi af proteinprøven at kontrollere både sin integritet og effektiv phosphorylering (figur 4).
  8. Lyofilisere phosphoryleret tau prøven. pulveret ved -20 ° C opbevares.

4. Erhvervelse af NMR spektre (Figur 5)

  1. Opløseliggøre 4 mg lyofiliseret 15N, 13C ERK-phosphoryleret-Tau i 400 pi NMR-buffer (50 mM NaPi eller 50 mM deutereret Tris- D11 .Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA og 1 mM DTT).
  2. Tilsæt 5% D2O for felt låsning af NMR-spektrometer og 1 mM TMSP (3- (trimethylsilyl) propionsyre-2,2,3,3-d4-natriumsalt)) som intern NMR signal reference. Tilsæt 10 pi af en 40x stamopløsning af komplet proteaseinhibitorcocktail.
  3. Overfør prøven i en 5 mm NMR-rør ved anvendelse af en elektronisk sprøjte med en lang nål eller Pasteur pipette Luk NMR-rør ved hjælp af stemplet. Fjerne enhver luftboble fanget mellem stemplet og væske ved stemplet bevægelser.
  4. Placer NMR-rør i en spinner. Justere sin lodrette position i spinderen med den passende målestok for NMR probe hovedet anvendes, således at det meste af prøveopløsningen vil være inde NMR-spolen.
  5. Start luftstrømmen: klik lift in magneten kontrolsystemet vindue. Placer forsigtigt spinner med røret i luftstrømmen i toppen af ​​magneten boring den. Stop luftstrømmen (klik elevator) og lad røret ned på plads inde i sonden hovedet i magneten.
  6. Indstil temperaturen til 25 ° C (298 K).
  7. Udfør semi-automatisk indstilling og matchning af sonden hovedet for at optimere transmission. Skriv atmm på kommandolinjen.
  8. Lås spektrometer frekvens ved hjælp af D 2 O signal af prøven optaget på deuterium-kanalen. Klik lås i systemet vinduet magnet kontrol.
  9. Start shimning procedure for at optimere homogeniteten af ​​magnetfeltet ved positionen af ​​prøven. Skriv topshim gui på kommandolinjen for at åbne shim vinduet. Klik starte i shim vinduet. Kontrollér den resterende B0 standard variation værdi at kontrollere, at shims er optimale (mindre end 2 Hz er god).
  10. Kalibrer p1 parameter (længden af ​​en protonradiofrekvens puls i psek), som er nødvendig for at opnå en 90 ° drejning af proton spins. Sigt efter 360 ° puls under anvendelse af en 1D-spektrum af vandprotoner (figur 6).
  11. Juster frekvensforskydningen ved at indstille o1 parameter (i Hz) til proton vand frekvens i 1D-spektrum (figur 6).
  12. Start erhvervelse af en 1D protonspektret (puls sekvens med watergate sekvens for vand signal undertrykkelse, for eksempel zggpw5) for at kontrollere signaler fra prøven (figur 7). Tilpasse antallet af scanninger for at den relative proteinkoncentration. Skriv zg på kommandolinjen for at starte købet.
  13. Opsæt yderligere parametre til erhvervelse af en 2D [1 H, 15N] HSQC spektrum (puls sekvens hsqcetfpf3gpsi, figur 8-9).
    1. For en 15 N, 13C mærkede prøve, afkoble 13 C under 15 N indirekte evolution.
    2. en H (F2) og 15 N (F1) dimensioner.
      BEMÆRK: Tilpas antallet af erhvervelsen datapunkter til spektrometer feltet til at holde et tilsvarende antal Hz pr punkt og begrænse afkobling gange: Brug 3,072 point ved 900 MHz og 2.048 point ved 600 MHz, i 1H dimension.
    3. Optimer yderligere parametre i impulssekvenserne, svarende til forsinkelser, puls længder, offset frekvenser, effektniveauer. Type ased på kommandolinjen for at få vist alle parametre er relevante for eksperimentet.
  14. Indstil parametrene for erhvervelse af en 3D [1 H, 15N, 13C] HNCACB spektrum (puls sekvens hncacbgpwg3d, figur 10A) ved 600 MHz.
  15. Indstil parametrene for en 3D [1 H, 15N, 15N] HNCANNH eksperiment (puls sekvens hncannhgpwg3d) ved 600 MHz. Sæt antal point til 2048 i en H og 64og 128 punkter i de to 15 N dimensioner. Definer de spektrale bredder som 14, 25, 25 dele per million (ppm) centreret på 4,7, 119, 119 ppm i 1H, 15 N og 15 N dimensioner. Varigheden af ​​erhvervelsen med 16 scanninger er 1 dag og 22 timer.

5. Identifikation af phosphoryleringssteder

  1. Proces spektre ved hjælp erhvervelse og behandling NMR software.
    1. Udfør en Fourier transformation af dataene (Figur 7). Type ft for en 1D spektrum, XFB for en 2D spektrum eller ft3d for en 3D-spektrum, på kommandolinjen.
    2. Fase og reference alle spektre (figur 7C) ved hjælp af interaktive vinduer.
  2. Identificer resonanser af interesse i 2D HSQC potentielt svarer til fosforylerede Ser og Thr-rester (Figur 9, rød boks).
  3. Ekstrakt flader (dvs. 2D 1H 13C-spektre) fra3D 1H 15 N- 13C-spektret under anvendelse af de 15 N kemiske skift af resonanser af interesse i 2D. Brug markøren af dimensionen 2 (w2) til at vælge de 15 N frekvens svarende til planet (w1-W3), der skal visualiseres (figur 10B).
  4. Pluk resonans frekvenser af 'CA' og 13 C kerner af den 'i' 'CB' og 'i-1' rester (svagere sæt af signaler i forhold til de af den i rest) for hver [1 H, 15N] resonans af interesse i HNCACB 3D spektrum ved at klikke på resonans, i menuen pegetilstand finde / tilføje peak, at tilføje det kemiske skift værdi i en top liste fil.
    1. Identificer i rest typen, Pser- eller PTHR, ved at sammenligne de kemiske skift i top listen med kendte værdier af CA og CB kemiske skift af Pser- og PTHR 17.
    2. Identificere tilstedeværelsen af ​​en Pro-rest ved i + 1 positionen af ​​en karakteristisk yderligere 2 ppm skift of CA kemisk skift værdi 18.
    3. Sammenligne værdier for kemiske skift for de CA og CB resonanserne svarende til i-1 rest til en tabel over kemiske skift forudsagt for Tau aminosyreresterne 19 at bestemme arten af remanensen ved i-1 position.
  5. Pluk resonansfrekvenser på 15 N kerner af den »i« og »i-1 'rester for hver [1 H, 15N] resonans af interesse i HNCANNH spektrum.
  6. Sammenlign de 15 N værdier for kemiske skift til det kemiske skift overdragelse af Tau-protein 20 -. 23
  7. Sammenlign identificerede dipeptider med Tau sekvens for at definere sekvensen konkrete opgave.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3A viser en væsentlig absorptionstop ved 280 nm observeret under elueringsgradient. Denne top svarer til oprenset Tau-protein som set på acrylamidgel ovenfor kromatogrammet. Figur 3B viser et godt adskilt absorptionstop ved 280 nm og toppen af ledningsevne, der sikrer, at afsaltning af proteinet er effektiv. Figur 4 viser proteingel-shift observeret ved SDS-PAGE-analyse 16 karakteristisk for multipel proteinphosphorylering (sammenlign bane 2 og 3). Figur 6 viser en serie af proton (1H) 1D spektre med stigende pulslængder (i psek). Til opsætning bruges længden af impulsen, som vil rotere 1H spin-magnetisering ved 90 °, en puls svarende til en 360 ° rotation i praksis, da det er lettere at kalibrere ved at minimere signalet. Signalet af vand- protoner er nul, når 360 ° puls længde er tilstrækkeligt defineret. Den værdi, der svarer til en 36076; rotation divideres derefter med 4. p1 i dette forsøg er 10,5 psek. Udvidede region: Frekvensen af resterende signal anvendes til at definere o1p parameter (frekvensforskydning for 1H). Figur 7 A. viser en fri induktion henfald (FID), visualiseret for at sikre, at der registreres et NMR-signal. Figur 7B. viser en 1D 1H spektrum med en forkert fase, som det ses af resonanser optræder som asymmetriske toppe. Figur 7C viser et 1D 1H-spektrum med godt signal-støj-forholdet, hvilket indikerer, at de grundlæggende erhvervelse parametre blev indstillet korrekt, og kan detekteres et signal fra proteinet prøven. Figur 8 viser 2D 1H, 15N-HSQC-spektre af rekombinant 15 N-Tau ved 900 MHz; Figur 8A med god følsomhed og opløsning og figur 8B. med påvisning af proteolyse i prøven, som det ses ved fremkomsten af ​​yderligere peaks i spektret (blå boks). Figur 9 viser 2D 1H, 15N-HSQC-spektre af rekombinant 15 N-Tau figur 9A ved 600 MHz, med god følsomhed, men mindre opløsning sammenlignet med fig 8A. Figur 9B ved 600 MHz, viser udseendet af yderligere toppe i spektret svarende til phosphorylerede rester (rød boks). Figur 9C ved 900 MHz, viser toppe i spektret svarende til phosphorylerede rester (rød boks). Opløsning er bedre end i figur 9B. Figur 10 A viser fremskrivninger fra 3D-NMR-spektret bruges til at evaluere en vellykket eksperiment. Figur 10B viser et 1H-13C plan ekstraheret fra 1H 15 N- 13C 3D spektrum med godt signal intensitet gør det muligt at detektere 13 C-signaler fra både I og I-1-rester.


Figur 1: Ordning af de vigtigste trin i rekombinant produktion protein og isotop mærkning. Skridt fra bakterier transformation til rekombinant protein produktion er skitseret som beskrevet i punkt 1 i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Ordning af de vigtigste trin i rekombinant Tau proteinoprensning. Skridt fra bakterieceller lysis til rekombinant protein oprensning er skitseret som beskrevet i punkt 2 i protokollen. Klik her for at se en større udgave afdette tal.

Figur 3
Figur 3: væskekromatografi trinnene protokol. (A) Kationbytterkromatografi fraktionering af det opvarmede bakterielle ekstrakt. Absorbansen ved 280 nm, 260 nm og ledningsevnen svarer til henholdsvis faste og stiplede sorte linjer og stiplede røde linje. 12% SDS-PAGE-analyse af de opsamlede fraktioner er vist over kromatogrammet. (B) Afsaltning af Tau-protein i en buffer der er egnet til lyofilisering. Mængden af ​​renset Tau protein estimeret ud fra den top, (2260 mAU * ml) er 16 mg Tau. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 Figur 4: 12% SDS-PAGE-analyse af Tau. Bane 1, molekylvægtmarkør; bane 2, 10 ug Tau; bane 3, 10 ug ERK-phosphoryleret tau. Tau, som andre IDP og kører i en anormal måde på SDS-PAGE, ved en tilsyneladende molekylvægt på ca. 60 kDa i stedet for den forventede 46 kDa. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Ordning af de vigtigste skridt for NMR prøveforberedelse, NMR erhvervelse spektroskopi data og databehandling. Skridt fra NMR prøveforberedelse til erhvervelse og behandling af data er skitseret som beskrevet i punkt 4 i protokollen. Klik her for at se et større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Opsætning af p1 parameter for NMR dataopsamling. Denne parameter er forskellig mellem prøver og er primært afhængig af saltkoncentrationen. En standard 1H nutationen kurven for 80% H2O i D2O er vist. Single-scan-spektre med en recirkulering forsinkelse på 30 sek blev opsamlet og afsat vandret. Pulsen (p1) blev varieret fra 1 mikrosekunder til 55 mikrosekunder i trin på 1 mikrosekunder. I teorien bør signalet være maksimal for en 90 ° puls og lig med nul for en 180 ° puls. Men i praksis, stråling dæmpning forårsager asymmetri og faseforvrængning problemer, som gør det vanskeligt at bestemme de 90 ° eller 180 ° impulser direkte. Det andet null point svarer til en 360 ° pulsvarighed. Det udvidede område viser en resterende signal for en 360 ° puls, der bruges til at definere o1p frekvens parameter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7: NMR databehandling. (A) Fri induktion signal henfald i tidsdomænet. 1D proton spektre (B) som følge af Fourier transformation af FID fra panel A i frekvensdomænet, men med forkert fase (PHC0 -206 °). (C) afviklet (PHC0 -113 °) og refereres (TMSP signal ved 0 ppm). Klik her for at se en større version af dette tal.

"/>
Figur 8: 2D 1H, 15N-HSQC-spektre af rekombinant 15 N-Tau ved 900 MHz. 3,072 og 416 erhvervelse datapunkter blev registreret ved anvendelse spektrale bredder på 14 og 25 ppm i 1H (F2) og 15 N (F1) dimensioner, henholdsvis. 16 skanninger blev registreret pr F1 tilvækst, hvilket fører til en varighed af eksperimentet af 4 timer 30 min. (A) god kvalitet Tau prøve (B) Tau prøve viser nedbrydning som afsløret ved fremkomsten af yderligere resonanser i et bestemt område af spektret (høj felt 1H, lav felt 15 N), her boxed i blåt. Denne sidste prøve blev fremstillet uden proteasehæmmere. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9
Figur 9: 2D 1H, 15N-HSQC-spektre af rekombinant 15 N-Tau. (A) ikke-phosphorylerede Tau, 600 MHz spektrum (B) phosphoryleret Tau, 600 MHz spektrum og (C) phosphoryleret Tau, 900 MHz spektrum. Ekstra resonanser i et bestemt område af spektret, her boxed i rød, observeres i phosphoryleret Tau spektre. Disse resonanser, som svarer til proton amid (1H 15N) korrelationer af Pser- og PTHR rester, er let visualiseres i området omkring 8,5 til 9,5 ppm for 1H og 117 til 125 ppm i 15 N uden for den største del af 1H, 15 N korrelationer af ikke-phosphoryleret Tau spektrum. (A og B) svarer til spektrene opnået ved 600 MHz, 2.048 og 256 datapunkter på spektrale bredder på 14 og 25 ppm blev registreret i 1H (F2) og 15 N (F1) dimensioner, henholdsvis.32 scanninger blev anvendt, og den samlede varighed af købet var 2 timer 44 min og (C) ved 900 MHz, 3.072 og 416 datapunkter på spektrale bredder på 14 og 25 ppm blev registreret i en H (F2) og 15 N ( F1) dimensioner, henholdsvis. 48 scanninger blev anvendt, og den samlede varighed af købet var 6 timer 37 min. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 10
Figur 10: 3D 1H, 15N, 13C NMR-spektrum, projektioner og udvundet 2D fly. 2.048, 72 og 256 datapunkter blev registreret i 1H (F3), 15 N (F2), og 13 C (F1) dimensioner, henholdsvis. Spektrale bredder er 14, 25 og 61 ppm, centreret på 4,7, 119 og 41 ppm i 1 H,15 N og 13 C-mål henholdsvis. Varighed af købet bruge 16 scanninger er 4 dage og 6 timer. (A) Cube repræsentation svarende til Fourier transformerede 3D datasæt af en HNCACB spektrum af ERK-phosphoryleret tau opnået ved 600 MHz. 2D 1H, 15N og 1H, er 13 C fly opnået ved projektion af de 3D data langs 13C og 15N dimension hhv. Databehandling og repræsentation blev udført ved hjælp af NMR erhvervelse og behandling software. (B) 2D 1H, 13C plan ekstraheret fra 3D-1H, 15N, 13C NMR datasæt på en 15 N kemisk skift af 121,8 ppm. En zoom (til højre) centreret på 1H kemiske skift af 9,38 ppm viser de 13 CA og 13 CB resonanser både rest i (pThr153) og i-1 (Ala152). Den 13 CB resonans er alias på grund af bredden af sRelativ spektralfordeling vindue. Grafisk repræsentation og peak plukning blev udført under anvendelse NMR-analyse software. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har brugt NMR spektroskopi til karakterisering enzymatisk modificerede Tau prøver. Den rekombinante ekspression og oprensning beskrevet her for det humane Tau-protein i fuld længde kan tilsvarende anvendes til fremstilling af mutante Tau eller Tau domæner. Isotopisk er nødvendig beriget protein til NMR-spektroskopi, hvilket nødvendiggør rekombinant ekspression. Identifikation af phosphoryleringssteder kræver resonans opgave og en 15 N, 13C dobbelt mærkede protein. Betragtning af omkostningerne ved isotoper, er godt udbytte kræves i rekombinant ekspression trin. Glucose er den begrænsende faktor for bakterievækst i M9-medium derfor mængden af 13C 6 glucose kan øges til 4 g per liter vækstmedium for at forbedre udbyttet. Tilsætning af komplette medium og MEM vitaminer er ikke obligatorisk, men bidrage til at stimulere væksten og forbedre udbyttet. I betragtning af den høje pris på det komplette mærkede medium, er dette produkt kun som et vækstmedium supplement. Bakterievækst er langsom i M9-medium. Generelt bakterielle kulturer under anvendelse M9-medium suppleret med 3% komplet medium rækkevidde på cirka induktion efter ca. 4 timer inkubation. En OD600 på 1,6-1,8 opnås sædvanligvis ved slutningen af dyrkningen. Forventet udbytte af rekombinant Tau protein er omkring 15 mg per liter bakteriekultur. Brugen af ​​en programmerbar inkubator gør det muligt at nemt planlægge protein produktion, indsamling af den bakterielle pellet og analytisk kontrol af protein produktion i arbejdstiden dag timer.

Prøvekoncentration er vigtigt at opnå en god kvalitet spektrum. En typisk Tau prøve tilstrækkelig for en 2D spektrum ville indeholde 1 mg i 200 pi (dvs. 100 uM) Tau protein. For et 3D spektrum, er mindst 200 pM i 300 pi påkrævet, forudsat at en kryogen probe hoved anvendes. Adgang til en høj-felt spektrometer, såsom 900 MHz instrument, der anvendes i denne undersøgelse vil give bedre signal-til-støjog reducere begrænsninger på koncentrationen prøve (figur 8). Eftersom Tau er et stort uordnet protein, dets NMR-spektre karakteriseret ved betydelig signal overlap, og en høj-felt NMR-spektrometer vil også være det bedste valg i forhold til opløsning (figur 8). Alligevel resonanserne svarende til phosphoryleringssteder er i et særskilt område af spektret og er lette at detektere selv med en 600 MHz spektrometer (Sammenlign fig 9 B og 9c). Desuden, på grund af sin uorganiseret karakter, tau-proteinet er følsomt for proteolyse (figurerne 8B).

Sterilisering af buffere tilrådes at begrænse Tau nedbrydning. Tilsætning af proteasehæmmere til NMR prøve hjælper med at beskytte Tau mod nedbrydning under datafangst perioder, der kan vare fra timer til dage, afhængig af pulsen sekvens. Lav pH (dvs. pH under 7,0) er forpligtet til at avOID for hurtigt udveksling mellem protein protoner og vandprotoner, hvilket fører til signal udvidelse. Prøve pH skal også være godt kontrolleres for at sikre reproducerbarhed af spektrene. Faktisk idet pKa-værdier af Pser- og PTHR er tæt på den optimale pH for NMR spektroskopi, kemiske skift af phosphorylerede rester er meget følsomme over for pH-variationer. Indstilling af pH af NMR-prøven kan foretages direkte ved hjælp af et pH-meter med en pH micro-elektrode, indrettet til små volumener. Tau er et opløseligt protein og ikke aggregerer i standardbetingelser. Tilsætning af polyanioner, såsom heparinsulfat, og inkubering ved 37 ° C kan initiere aggregering i Tau-prøver. I dette tilfælde, da den faste karakter af aggregaterne, de fleste af resonanser i den tilsvarende NMR-spektret udvide ud over detektion. Selv de phosphorylerede Tau prøver ikke samlet i de betingelser, der er beskrevet her til NMR dataopsamling.

Sammenlignet med antistof analyse, NMR tilbyder en oOverordnet forventes visning af PTMS. Massespektrometri kan også anvendes til at identificere phosphorylering mønster af en proteinprøve. Isotopmærkning er ikke nødvendigt for denne teknik, og de nødvendige prøvemængder er meget mindre. Imidlertid karakterisering af et protein med flere phosphoryleringer, såsom Tau, forbliver en udfordring. Tilstødende phosphoryleringer vil producere isobare peptider i bottom-up strategier for identifikation. Fuldstændig identifikation skal derpå MS / MS sekventering af peptiderne opnået ved prøven proteolyse. En fordel ved NMR består i den iboende kvantitative karakter af teknikken. Intensiteten af ​​et NMR-signal kan knyttes til mængden af ​​den kemiske gruppe til stede på et specifikt sted. Vi kan således definere andelen af ​​kemisk modifikation på hvert site. Den seneste udvikling i MS applikationer har imidlertid vist, at MS-analyse af Tau multipel fosforylering er mulig 24, selv i en kvantitativ måde efter korrekt normalisering 25.

Her præsenterede vi Tau phosphorylering af aktiveret ERK2, men metoden kan anvendes til phosphorylering med andre kinaser samt 6,7,26 - 28. Kan udføres kinetiske eksperimenter, som kan hjælpe til at definere kinase specificitet mod et protein substrat 28-31. Phosphorylering undersøgelser er ikke begrænset til rekombinante kinaser, og kinaseaktiviteten af celle- eller vævsekstrakter kan analyseres 6,32,28. En interessant udvikling er brugen af i-celle NMR til at studere in situ modifikationer 33,34. Omvendt NMR er også veltilpasset til at løse phosphatase specificitet, som blev vist ved at undersøge dephosphorylering af phosphoryleret tau af PP2A phosphatase 35. NMR-spektroskopi kan anvendes til karakterisering af kinaseinhibitorer ved at sammenligne phosphorylering profil proteinsubstratet i en 2D spektrum i nærvær af inhibitorforbindelse with spektret udstedt fra et kontrolforsøg 6.

Interessen for at anvende NMR-spektroskopi, sammenlignet med de mere følsomme MS-metoder, består i det store udvalg af applikationer, der udnytter protokollen beskrevet her, i stedet for på sin analytiske kapacitet alene. Det har vist sig afgørende at identificere phosphoryleringssteder at kunne knytte bestemte phosphoryleringer med strukturelle eller funktionelle ændringer, blev primært undersøgt ved hjælp af NMR. NMR spektroskopi af fosforylerede Tau prøver giver mulighed for at udforske den strukturelle konsekvenser af fosforylering på begge forbigående lokale sekundære strukturer og på den globale omlægning af den dynamiske ensemble af modificeret Tau 36,37. Funktionelle aspekter omfatter regulering af både interaktionen af Tau med protein partnere 7,38,39 og sammenlægning af Tau fosforylering 8. Det phosphorylerede Tau prøve karakteriseret ved NMR kan yderligere anvendes til at dechifrere phospho-afhængige interaktioner, foreksempel med 14-3-3 proteiner 40 og manipuleret protein-protein interaktion inhibitorer 41,42. NMR tillader definition af interaktion site (s) på restkoncentrationer, og i afhængighed af denne interaktion på phosphorylering. Derudover NMR-spektroskopi af phosphoryleret tau er en vigtig metode til at karakterisere prolin cis: trans isomerase PIN1, en vigtig phospho-afhængigt enzym involveret i Tau Regel 43 - 45. Desuden kan phosphorylering analyse ved NMR anvendes ikke blot til IDP men også til kugleformede proteiner 46. Endelig kan andre typer af Tau PTMS såsom acetyleringer 22,40,41 undersøges ved NMR. De her beskrevne protokoller har vist afgørende for bedre at forstå den funktionelle og strukturelle regulering af Tau i fysiologiske og patologiske tilstande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267, (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268, (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16, (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128, (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23, (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291, (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133, (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249, (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343, (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189, (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56, (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15, (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5, (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132, (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5, (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5, (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7, (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7, (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18, (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88, (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285, (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54, (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54, (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137, (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8, (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192, (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80, (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23, (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412, (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3, (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29, (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48, (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54, (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43, (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7, (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274, (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16, (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53, (18), 3020-3032 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats