Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour l'identification des phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées

1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally
Published 12/27/2016
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Biochemistry

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Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

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Abstract

Introduction

L' un des principaux défis de la santé au 21 e siècle , sont des maladies neurodégénératives telles que la maladie d' Alzheimer (MA). Tau est une protéine associée aux microtubules qui stimule microtubules (MT) la formation. Tau est également impliqué dans plusieurs maladies neurodégénératives, soi-disant tauopathies, dont le plus connu est AD. Dans ces troubles, Tau auto-agrégats en filaments hélicoïdaux appariés (PHF) et se trouve modifié sur de nombreux résidus de modifications post - traductionnelles (PTM) , tels que la phosphorylation 1. La phosphorylation de la protéine Tau est impliquée à la fois dans la régulation de sa fonction physiologique de la stabilisation MT et la perte pathologique de la fonction qui caractérise les neurones AD.

En outre, la protéine Tau, lorsqu'ils sont intégrés dans les PHF dans des neurones malades, est invariablement hyperphosphorylée 2. Contrairement à Tau normale qui contient 2-3 groupes phosphate, le Tau hyperphosphorylée en PHF contient 5 à 9 phosphatgroupes E 3. Hyperphosphorylation de Tau correspond à la fois à une augmentation de la stoechiométrie à certains sites et de la phosphorylation des sites supplémentaires qui sont appelés des sites pathologiques de phosphorylation. Cependant, le chevauchement existe entre AD et modèles adultes normaux de phosphorylation, en dépit des différences quantitatives dans le niveau 4. Quelle est la spécificité des événements de phosphorylation fonction d'influence et le dysfonctionnement de Tau reste largement inconnu. Notre objectif est de décrypter la réglementation Tau par PTM au niveau moléculaire.

Pour approfondir la compréhension des aspects moléculaires de Tau, nous devons relever les défis techniques. Tout d'abord, Tau est une protéine intrinsèquement désordonnés (IDP) lorsque isolé en solution De telles protéines manquent structure tridimensionnelle bien définie dans des conditions physiologiques et nécessitent des méthodes particulières biophysiques pour étudier leur fonction (s) et les propriétés structurelles. Tau est un paradigme pour la classe croissante des personnes déplacées, souvent trouvé associé àpathologies telles que les maladies neurodégénératives, ce qui augmente l'intérêt de comprendre les paramètres moléculaires qui sous-tendent leurs fonctions. En second lieu, la caractérisation de la phosphorylation de tau est un défi analytique, avec des 80 sites potentiels de phosphorylation le long de la séquence la plus longue isoforme Tau 441 acides aminés. Un certain nombre d'anticorps ont été développés contre des épitopes de la protéine tau phosphorylée et sont utilisés pour la détection de tau dans les neurones pathologique ou le tissu cérébral. les événements de phosphorylation peuvent avoir lieu sur au moins 20 sites ciblés par les kinases de proline dirigée, la plupart d'entre eux dans la proximité de la région riche en proline. Le qualitative (quels sites?) Et quantitative (ce stoechiométrie?) La caractérisation est difficile , même par les plus récentes techniques MS 5.

spectroscopie RMN peut être utilisée pour étudier des protéines qui sont hautement désordonnés des systèmes dynamiques constitués d'ensembles de conformères. spectroscopie RMN à haute résolution a été applied pour étudier la structure et la fonction de la protéine Tau. En outre, la complexité du profil de phosphorylation de Tau a conduit au développement d'outils moléculaires et de nouvelles méthodes d' analyse par RMN pour l'identification des sites de phosphorylation 6 - 8. RMN comme méthode d'analyse permet d'identifier des sites de phosphorylation de tau de manière globale, la visualisation de toutes les modifications à site unique en une seule expérience, et la quantification de l'étendue de l'incorporation de phosphate. Ce point est essentiel, car bien que les études de phosphorylation sur Tau abondent dans la littérature, la plupart d'entre eux ont été réalisées avec des anticorps, laissant un grand degré d'incertitude sur le profil complet de phosphorylation et donc l'impact réel des événements de phosphorylation individuels. y compris les kinases PKA recombinants, glycogène synthase kinase 3β (GSK3), la kinase dépendante de la cycline 2 / cycline A (CDK2 / CycA), la kinase dépendant de la cycline 5 (CDK5) / p25 acteprotéine ivator, extracellulaire régulée par un signal kinase 2 (ERK2) et microtubules affinité régulation kinase (MARK), qui présentent une activité de phosphorylation vers Tau, peuvent être préparés sous une forme active. En outre, les mutants Tau qui permettent de générer des isoformes de protéines Tau spécifiques avec des motifs de phosphorylation bien caractérisés sont utilisés pour déchiffrer le code de phosphorylation de Tau. Spectroscopie RMN est ensuite utilisée pour caractériser des échantillons Tau enzymatiquement modifiés 6 - 8. Bien que la phosphorylation in vitro de Tau est plus difficile que pseudo-phosphorylation , par exemple par mutation de Ser / Thr choisi en acide glutamique (Glu) des résidus, cette approche a ses mérites. En effet, ni les chocs, ni interaction paramètres structurels de phosphorylation peuvent toujours être imitées par les acides glutamique. Un exemple est le motif de tour observé autour phosphosérine 202 (pSer202) / 205 phosphothréonine (pThr205), qui ne sont pas reproduits avec des mutations Glu 9.

dans la phosphorylation in vitro par ERK2 kinase recombinante est présentée. L' ERK2 est activé par la phosphorylation par la protéine kinase activée par mitogene / ERK kinase (MEK) 10-12. En plus de la préparation de la modification, de la protéine Tau marqué isotopiquement, la stratégie utilisée pour l'identification RMN du PTM est décrite.

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Protocol

1. Production de 15 N, 13 C-Tau (Figure 1)

  1. Transformer pET15b-Tau recombinante plasmide d' expression de T7 13,14 dans BL21 (DE3) , les cellules bactériennes d' Escherichia coli compétentes 15.
    REMARQUE: le codage de l' ADNc le plus long (441 résidus d'acides aminés) Tau isoforme est clone entre les sites de restriction Ncol et Xhol dans le plasmide pET15b.
    1. Mélanger doucement 50 ul de BL21 (DE3) compétentes cellules, formant 1-5 x 10 7 colonies par pg d'ADN de plasmide, avec 100 ng d'ADN plasmidique dans un tube en plastique de 1,5 ml.
      NOTE: Codon-utilisation optimisée des souches bactériennes pour l'expression de l'ADNc eucaryote ne sont pas indispensables pour produire Tau humaine.
    2. Placez le mélange de cellules sur la glace pendant 30 min, puis le choc thermique pendant 10 secondes à 42 ° C. Placer le tube de retour sur la glace pendant 5 minutes et ajouter 1 ml de la température ambiante LB (Luria-Bertani). Incuber la suspension bactérienne à 37 ° C pendant 30 min sous douceagitation.
  2. Se propager à l'aide d'une boucle d'inoculation de 100 ul de suspension cellulaire uniformément sur une plaque de gélose de milieu LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline antibiotique.
  3. Incuber la plaque de sélection pendant 15 heures à 37 ° C.
  4. Gardez la plaque de sélection à 4 ° C jusqu'à passer à l'étape de culture, pour un maximum de 2 semaines environ.
    REMARQUE: un stock de glycérol de culture bactérienne (50% de glycérol), stocké à -80 ° C, peut être préparé pour commencer la culture à un stade ultérieur.
  5. Ajouter 1 ml de 1 M MgSÛ4, 1 ml de 100 mM CaCl2, 10 ml 100x MEM vitamine complément, 1 ml 100 mg / ml d' ampicilline à 1 L de sels M9 autoclavées (6 g Na 2 HPO 4, 3 g de KH 2 PO 4 , 0,5 g de NaCl).
    NOTE: Un précipité blanc se forme lors de l' addition de la solution de CaCl2 aux sels M9 qui se dissipe rapidement.
  6. Solubiliser 300 mg de 15 N, 13 moyen C-complète, 1 g de 15NH4CI et 2 g de 6 13C - glucose dans 10 ml de milieu M9. Filtre-stériliser la solution d'isotopes utilisant un filtre de 0,2 um, directement dans le milieu M9.
  7. Suspendre l'aide d'une boucle inoculation une colonie de pET15b-Tau transformé les bactéries de la plaque de sélection dans 20 ml de milieu LB supplémenté avec 100 ug / ml d'ampicilline.
  8. Incuber le milieu inoculé à 37 ° C pendant environ 6 heures.
  9. Mesurer la densité optique à 600 nm (DO 600) sur 1 ml d'une dilution de dix fois de la culture bactérienne dans une cuve de spectromètre en plastique.
    REMARQUE: La turbidité de la culture bactérienne correspondant à une DO 600 de 3,0 à 4,0 indique que la phase de croissance de saturation est atteint.
  10. Ajouter 20 ml de la culture LB saturé à 1 L de milieu de culture M9 supplémenté avec de l'ampicilline (100 ug / ml de concentration finale) dans 2 L d'Erlenmeyer en matière plastique flacon de culture dérouté.
  11. Placer le flacon de culture dans un incubateur programmable réglé à 10 °C et à 50 tours par minute. Programmer l'incubateur pour passer à 200 tours par minute et 37 ° C au début de la matinée du lendemain.
  12. Mesurer la DO 600 sur 1 ml de culture bactérienne dans une cuve de spectromètre en plastique. Ajouter 400 ul de 1 M d' IPTG (les β-D-thiogalactopyranoside d' isopropyle 1) de la solution mère (conservés à -20 ° C) lorsque DO600 atteigne une valeur d'environ 1,0 à induire l'expression de la protéine recombinante Tau.
  13. Continuer l'incubation à 37 ° C pendant encore 3 h. Recueillir les cellules bactériennes par centrifugation à 5000 xg pendant 20 min.
  14. Congeler le culot bactérien à -20 ° C. Maintenir l'état congelé jusqu'à l'étape de purification, pendant une période prolongée si nécessaire.

2. La purification du 15 N, 13 C-Tau (Figure 2)

  1. échangeuse de cations autoclave (CEX), des tampons de purification à 121 ° C sous 15 psi pendant 20 min. tampons Conserver à 4 ° C.
  2. Décongeler le culot de cellules bactériennes et remettre en suspension dans 45 ml soigneusementd'extraction CEX un tampon (50 mM de tampon NaPi pH 6,5, EDTA 1 mM) fraîchement additionné de 1x inhibiteur de protéase de cocktail (1) et les tablettes ADNase I (2000 unités).
  3. Perturber les cellules bactériennes en utilisant un homogénéisateur haute pression à 20 000 psi. 3-4 passes sont nécessaires. Centrifugeuse à 20.000 xg pendant 40 min pour éliminer la matière insoluble
  4. Chauffer l'extrait de cellule bactérienne pendant 15 minutes à 75 ° C en utilisant un bain d'eau.
    REMARQUE: un précipité blanc est observé au bout de quelques minutes.
  5. Centrifuger à 15000 xg pendant 20 minutes et de garder le surnageant contenant la protéine Tau stable à la chaleur.
  6. Conserver à -20 ° C jusqu'à l'étape suivante de purification, si nécessaire.
  7. Réaliser une chromatographie échangeuse de cations sur une résine de CEX forts en tant que colonne garnie de 5 ml de lit en utilisant une chromatographie liquide rapide des protéines système (FPLC) (figure 3 A).
    1. Régler le débit à 2,5 ml / min.
    2. Equilibrer la colonne dans CEX Un tampon
    3. Chargez le 60-70 ml heated-extrait contenant Tau en utilisant une pompe d'échantillonnage, ou encore la pompe A, en fonction du système. Recueillir l'écoulement pour l'analyse afin de vérifier que la protéine Tau est efficacement obligatoire à la résine (voir 2.8).
    4. Laver la résine avec CEX Un tampon jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm est de retour à la valeur de référence.
    5. Tau éluer de la colonne en utilisant un triple gradient de NaCl obtenu par augmentation progressive de la CEX tampon B (tampon A CEX avec 1 M de NaCl). Programme FPLC comme suit: première étape du gradient de tampon de 25% CEX B dans 10 volumes de colonne (CV) pour atteindre 250 mM de NaCl, deuxième étape à un tampon de 50% CEX B 5 CV pour atteindre 500 mM de NaCl, et une troisième étape à 100% de tampon CEX B en 2 CV pour atteindre 1 M de NaCl. Recueillir des fractions de 1,5 ml pendant les étapes d'élution.
  8. Analyser 10 ul des fractions recueillies au cours de l'étape d'élution par SDS-PAGE (gel de SDS-acrylamide à 12%) et de Coomassie (figure 3 A) 16. Vérifiez l'étape de chargement sur la colonne et par analyzing 10 pl de l'écoulement.
  9. Choisissez les fractions contenant Tau et mettre en commun ces fractions pour l'étape suivante.
  10. Effectuer un échange de tampon sur les fractions Tau contenant regroupées (Figure 3 B).
    1. Equilibrer une colonne de dessalage de résine lit 53 ml de G25 emballé (26 x 10 cm) en mM de bicarbonate d'ammonium 50 (tampon volatile) en utilisant un système FPLC.
    2. débit de Set à 5 ml / min. Injecter l'échantillon Tau sur la colonne par l'intermédiaire d'une boucle d'injection de 5 ml. Recueillir les fractions correspondant au pic d'absorption à 280 nm.
    3. Répéter l'injection de 3-4 fois, en fonction du volume du bassin initial CEX.
  11. Calculer la quantité de protéine tau purifiée en utilisant la zone de pic du chromatogramme à 280 nm (1 mg de Tau correspond à 140 mUA * ml).
    NOTE: Le coefficient de la protéine Tau d'extinction à 280 nm est 7,550 M -1 cm -1. Tau ne contient pas de résidus Trp.
  12. Piscine toutes les fractions Tau.
  13. aliquot l'échantillon dans des tubes contenant l'équivalent de 1 à 5 mg de Tau. Choisir ces tubes, de sorte que le volume de solution est faible par rapport au volume du tube (par exemple 5 ml d'une solution dans un tube de 50 ml).
  14. Percez des trous dans les bouchons de tube à l'aide d'une aiguille. Congeler des échantillons Tau à -80 ° C.
  15. échantillons Lyophiliser Tau. la protéine Tau lyophilisée peut être conservée à -20 ° C pendant de longues périodes de temps.

3. In Vitro Phosphorylation de 15 N-Tau

  1. Dissoudre 5 mg de Tau lyophilisée dans 500 pi de tampon de phosphorylation (50 mM Hepes KOH pH 8,0, 12,5 mM de MgCl2, 1 mM d' EDTA, 50 mM de NaCl).
  2. Ajouter mM ATP 2,5 (25 pi de solution mM 100 conservés à -20 ° C), 1 mM de DTT (1 pi de 1 M solution mère maintenue à -20 ° C), 1 mM d'EGTA (2 pi d'un stock de 0,5 M solution), inhibiteur de la protéase 1x cocktail (25 pl d'un 40x disponible obtenue en dissolvant 1 comprimé dans 1 ml de tampon de phosphorylation) et 181; M activé His-ERK2 (250 ul dans un tampon de conservation Hepes 10 mM, pH 7,3, 1 mM de DTT, 5 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl et 10% de glycerol, stocké à -80 ° C) dans un volume d'échantillon total de 1 ml.
    NOTE: L'activation His-ERK2 peut être préparé en interne 5,8 par phosphorylation avec la kinase MEK.
  3. Incuber 3 heures à 37 ° C.
  4. Chauffer l'échantillon à 75 ° C pendant 15 minutes pour inactiver la kinase ERK.
  5. Centrifugeuse à 20.000 xg pendant 15 min. Recueillir et conserver le surnageant.
  6. Dessaler l'échantillon de protéine dans 50 mM de bicarbonate d'ammonium en utilisant une colonne de résine lit 3,45 ml G25 emballé (1,3 x 2,6 cm), qui est adapté pour un échantillon de 1 ml.
  7. Exécuter un SDS-PAGE à 12% 16 avec 2,5 pi de l'échantillon de protéine pour vérifier à la fois son intégrité et sa phosphorylation efficace (figure 4).
  8. Lyophiliser l'échantillon Tau phosphorylée. Conserver la poudre à -20 ° C.

4. Acquisition de spectres RMN (Figurer 5)

  1. Solubiliser 4 mg de lyophilisé 15 N, 13 C ERK phosphorylée-Tau dans 400 tampon de RMN ul (mM NaPi 50 ou 50 mM deutérés tris- de .cl, pH 6,5, NaCl 30 mM, EDTA 2,5 mM et DTT 1 mM).
  2. Ajouter 5% de D 2 O pour le champ de verrouillage du spectromètre RMN et 1 mM de TMSP (3- (triméthylsilyl) sel de sodium de l' acide propionique 4-2,2,3,3-d)) en tant que référence interne RMN du signal. Ajouter 10 ul d'une solution 40x stock de complet cocktail d'inhibiteurs de la protéase.
  3. Transférer l'échantillon dans un tube RMN de 5 mm à l'aide d'une seringue électronique avec une longue aiguille ou d'une pipette Pasteur. Fermer le tube RMN en utilisant le piston. Enlevez toute bulle d'air emprisonné entre le piston et le liquide par des mouvements de piston.
  4. Placer le tube RMN dans un spinner. Ajuster sa position verticale dans le métier à filer avec le gabarit approprié pour la tête de la sonde de RMN utilisé, de telle sorte que la majeure partie de la solution d'échantillon sera à l'intérieur de la bobine RMN.
  5. Démarrez le flux d'air: cliquez ascenseur in la fenêtre du système de contrôle d'aimant. Placez délicatement le spinner avec le tube dans le flux d'air dans la partie supérieure de l'alésage de l'aimant. Arrêter le flux d'air (cliquez ascenseur) et laisser le tube descendre en place à l' intérieur de la tête de sonde dans l'aimant.
  6. Réglez la température à 25 ° C (298 K).
  7. Effectuer le réglage semi-automatique et adaptation de la tête de sonde pour optimiser la transmission de puissance. Tapez ATMM sur la ligne de commande.
  8. Verrouiller la fréquence du spectromètre à l' aide du signal D 2 O de l'échantillon enregistré sur le canal de deuterium. Cliquez verrouillage dans la fenêtre du système de contrôle de l' aimant.
  9. Démarrer la procédure de calage afin d'optimiser l'homogénéité du champ magnétique à la position de l'échantillon. Tapez topshim gui sur la ligne de commande pour ouvrir la fenêtre de shim. Cliquez sur Démarrer dans la fenêtre de shim. Vérifiez la valeur résiduelle de variation norme B0 pour vérifier que les cales sont optimales (moins de 2 Hz est bonne).
  10. Calibrer le paramètre p1 (longueur d'un protonimpulsion radiofréquence en microsecondes), ce qui est nécessaire pour obtenir une rotation des spins de protons de 90 °. Visez l'impulsion à 360 ° en utilisant un spectre 1D de protons de l' eau (figure 6).
  11. Ajuster le décalage en réglant le paramètre o1 (en Hz) de la fréquence du proton de l' eau dans le spectre 1D (figure 6) la fréquence.
  12. Commencer l' acquisition d'un spectre de proton 1D (séquence d'impulsions avec une séquence écluse pour la suppression du signal de l' eau, par exemple zggpw5) pour vérifier les signaux provenant de l'échantillon (figure 7). Adapter le nombre de balayages de la concentration relative des protéines. Tapez zg sur la ligne de commande pour démarrer l'acquisition.
  13. Mettre en place des paramètres supplémentaires pour l'acquisition d'une 2D [1 H, 15 N] spectre HSQC (séquence d' impulsions hsqcetfpf3gpsi, figures 8-9).
    1. Pour un 15 N, 13 C marqué échantillon, découpler 13 C au cours de l'évolution indirecte 15 N.
    2. 1 H (F2) et 15 N (F1) dimensions.
      REMARQUE: Adapter le nombre de points de données d'acquisition sur le terrain du spectromètre pour maintenir un nombre similaire de Hz par point et de limiter les temps de découplage: utiliser 3.072 points 900 MHz et 2048 points à 600 MHz, dans la 1 H dimension.
    3. Optimiser les paramètres supplémentaires dans les séquences d'impulsions, ce qui correspond à des retards, des longueurs d'impulsion, le décalage des fréquences, des niveaux de puissance. Type de elon sur la ligne de commande pour afficher tous les paramètres pertinents pour l'expérience.
  14. Définissez les paramètres pour l'acquisition d'une 3D [1 H, 15 N, 13 C] spectre HNCACB (séquence d'impulsions de hncacbgpwg3d, figure 10A) à 600 MHz.
  15. Définir les paramètres 3D [1 H, 15 N, 15 N] expérience HNCANNH (séquence d' impulsions hncannhgpwg3d) à 600 MHz. Réglez le nombre de points à 2048 dans le 1 H et 64et 128 points dans les deux 15 N dimensions. Définir les largeurs spectrales 14, 25, 25 parties par million (ppm) centré sur 4,7, 119, 119 ppm en 1 H 15 N et 15 N dimensions. Durée d'acquisition avec 16 balayages est de 1 jour et 22 heures.

5. Identification des sites Phosphorylation

  1. Les spectres de processus utilisant l'acquisition et la RMN de traitement logiciel.
    1. Effectuer une transformation de Fourier des données (figure 7). Type de pieds pour un spectre 1D, xfb pour un spectre 2D ou ft3d pour un spectre 3D, sur la ligne de commande.
    2. Phase et référence tous les spectres (figure 7C) en utilisant les fenêtres interactives.
  2. Identifier les résonances d'intérêt dans la 2D HSQC potentiellement correspondant aux résidus Ser et Thr phosphorylée (figure 9, boîte rouge).
  3. Plans d'extrait (c. -à- 2D 1 H- 13 C spectres) à partir dele spectre 3D 1 H- 15 N 13 C 15 N en utilisant les déplacements chimiques des résonances d'intérêt pour le 2D. Utiliser le curseur de dimension 2 (w2) pour sélectionner la fréquence 15 N correspondant au plan (W1-W3) à visualiser (figure 10B).
  4. Choisissez les fréquences de résonance de 'CA' et 13 C noyaux «CB» de la «i» et les résidus 'i-1' (ensemble plus faible des signaux par rapport à celles du résidu i) pour chaque [1 H, 15 N] résonance d'intérêt dans le spectre HNCACB 3D en cliquant sur la résonance, dans le menu du mode de pointeur trouver / ajouter de pointe, pour ajouter la valeur de décalage chimique dans un fichier de liste de pointe.
    1. Identifier le type de résidu i, pSer ou pthr, en comparant les changements chimiques dans la liste des pics à des valeurs connues de CA et CB changements chimiques de pSer et pthr 17.
    2. Identifier la présence d'un résidu Pro à la i + 1 position par une caractéristique supplémentaire +2 ppm changement of la valeur de décalage CA chimique 18.
    3. Comparer les valeurs de déplacement chimique des CA et CB résonnances correspondant au résidu i-1 à une table des déplacements chimiques prévus pour Tau résidus d'acides aminés 19 d'identifier la nature du résidu à la position i-1.
  5. Choisissez les fréquences de résonance de 15 N noyaux de la 'i' et 'i-1' résidus pour chaque résonance [1 H, 15 N] d'intérêt dans le spectre de HNCANNH.
  6. Comparer les valeurs 15 N de déplacement chimique à l'affectation de déplacement chimique de la protéine Tau 20 - 23.
  7. Comparer les dipeptides identifiées avec la séquence de Tau pour définir la mission spécifique de séquence.

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Representative Results

La figure 3A montre un pic majeur d'absorption à 280 nm observée au cours du gradient d'élution. Ce pic correspond à une protéine Tau purifiée comme on le voit sur le gel d'acrylamide au-dessus du chromatogramme. La figure 3B montre un pic d'absorption bien séparés à 280 nm et un pic de conductivité, en veillant à ce que le dessalage de la protéine est efficace. La figure 4 montre un gel de protéine de décalage observée par analyse SDS-PAGE 16 caractéristique de la phosphorylation des protéines multiples (comparer les pistes 2 et 3). La figure 6 montre une série de protons (1 H) Les spectres 1D avec l' augmentation des longueurs d'impulsion (en microsecondes). Pour régler la longueur de l'impulsion qui va faire tourner la magnétisation de spin 1 H à 90 °, une impulsion correspondant à une rotation de 360 ° est utilisée dans la pratique, car il est plus facile à étalonner en réduisant au minimum le signal. Le signal des protons de l'eau est nulle lorsque la longueur 360 ° d'impulsion est définie de manière adéquate. La valeur correspondant à un 36076; la rotation est alors divisée par 4. p1 dans cette expérience est de 10,5 microsecondes. Région élargie: La fréquence du signal résiduel est utilisé pour définir le paramètre de O1P (fréquence de décalage pour 1 H). La figure 7 montre une décroissance A. libre par induction (FID), visualisé pour faire en sorte qu'un signal RMN est détecté. La figure 7b. montre un spectre H 1D 1 avec une phase incorrecte, comme on le voit par les résonances qui apparaissent comme des pics asymétriques. Figure 7C montre un spectre H 1D 1 avec un bon rapport signal sur bruit, ce qui indique que les paramètres de base d'acquisition ont été correctement définis et un signal provenant de l'échantillon de protéines peuvent être détectées. La figure 8 montre 2D 1 H, 15 N HSQC spectres recombinant 15 N-Tau à 900 MHz; Figure 8A avec une bonne sensibilité et la résolution et la figure 8B. avec la détection de la protéolyse dans l'échantillon, comme on le voit par l'apparition du pe supplémentaireaks dans la (boîte bleue) du spectre. La figure 9 montre 2D 1 H, 15 N HSQC spectres de recombinant 15 N-Tau Figure 9A à 600 MHz, avec une bonne sensibilité , mais une résolution inférieure par rapport à la figure 8A. Figure 9B à 600 MHz, montre apparition de pics supplémentaires dans le spectre correspondant aux résidus phosphorylés (boîte rouge). La figure 9C à 900 MHz, présente des pics dans le spectre correspondant à des résidus phosphorylés (boîte rouge). La résolution est meilleure que sur la figure 9B. Figure 10 A montre des projections à partir du spectre RMN 3D utilisé pour évaluer une expérience réussie. La figure 10B montre un C plan 1 H- 13 extrait du 1 H- 15 N- 13 spectre C 3D avec une bonne intensité de signal permettant de détecter 13 signaux C des deux i et i-1 résidus.


Figure 1: Schéma des étapes principales de la production de la protéine recombinante et le marquage isotopique. À quelques pas de bactéries transformation à la production de protéines recombinantes sont décrites comme décrit au paragraphe 1 du protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: schéma des principales étapes de purification de la protéine recombinante Tau. À quelques pas de cellules bactériennes de lyse à la purification de protéines recombinantes sont décrites comme décrit dans le paragraphe 2 du protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandecette figure.

Figure 3
Figure 3: étapes de chromatographie liquide de protocole. (A) L' échange de cations Chromatographie fractionnement de l'extrait bactérien chauffé. L'absorbance à 280 nm, 260 nm et la conductivité correspondent respectivement aux lignes noires solides et en pointillés et la ligne pointillée rouge. 12% analyse SDS-PAGE des fractions collectées est montré au-dessus du chromatogramme. (B) dessalage de la protéine tau dans un tampon convenable pour une lyophilisation. La quantité de protéine Tau purifiée estimée à partir de la surface du pic (2260 mAU * ml) est de 16 mg de Tau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 Figure 4: 12% Analyse SDS-PAGE de Tau. Lane 1, marqueur de poids moléculaire; voie 2, 10 ug de Tau; couloir 3, 10 pg de ERK phosphorylée Tau. Tau, comme d'autres déplacés, fonctionne de façon anormale sur SDS-PAGE, à un poids moléculaire apparent d'environ 60 kDa au lieu de 46 kDa attendu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Schéma des étapes principales de préparation de l' échantillon RMN, l' acquisition de données de spectroscopie RMN et de traitement des données. Étapes de RMN préparation de l'échantillon à l'acquisition et le traitement des données sont décrites comme décrit au paragraphe 4 du protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6: Mise en place du paramètre p1 pour l' acquisition de données RMN. Ce paramètre est différent entre les échantillons et dépend principalement de la concentration en sel. Une courbe standard de nutation 1 H à 80% de H 2 O dans D 2 O est représenté. Les spectres à balayage simple avec un délai de recyclage de 30 secondes ont été recueillies et tracée horizontalement. L'impulsion (p1) a varié de 1 microsecondes à 55 microsecondes par pas de 1 microsecondes. En théorie, le signal doit être maximale pour une impulsion à 90 ° et égal à zéro pour une impulsion de 180 °. Cependant, dans la pratique, l'amortissement du rayonnement provoque l'asymétrie et la distorsion de phase des problèmes qui rendent difficile de déterminer les 90 ° ou 180 ° impulsions directement. Le deuxième point zéro correspond à une durée de 360 ​​° d'impulsion. La région élargie montre un signal résiduel pour un 360 ° impulsion qui est utilisée pour définir le paramètre de fréquence de O1P. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7: traitement des données RMN. (A) de précession libre de signal dans le domaine temporel. Spectres 1D à protons (B) résultant de la transformation de Fourier de la FID à partir du panneau A dans le domaine de fréquence , mais avec une phase incorrecte (PHC0 -206 °). (C) par étapes (PHC0 -113 °) et référencé (signal de TMSP à 0 ppm). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 8: 2D 1 H, 15 N HSQC spectres recombinant 15 N-Tau à 900 MHz. 3072 et 416 points de données d'acquisition ont été enregistrés en utilisant des largeurs spectrales de 14 et 25 ppm dans le 1 H (F2) et 15 N (F1) dimensions, respectivement. 16 balayages ont été enregistrés par incrément de F1, ce qui conduit à une durée de l'expérience de 4 h 30 min. (A) bon échantillon de Tau de qualité (B) échantillon de Tau dégradation montrant comme l'a révélé l'apparition de résonances supplémentaires dans une région particulière du spectre (champ élevé 1 H, faible champ 15 N), ici en boîte en bleu. Ce dernier échantillon a été préparé sans inhibiteurs de protéase. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9: 2D 1 H, 15N HSQC spectres de recombinaison 15 N-Tau. (A) Tau phosphorylée, 600 MHz le spectre (B) Tau phosphorylée, 600 MHz du spectre et (C) Tau phosphorylée, 900 MHz spectre. résonnances supplémentaires dans une région particulière du spectre, ici encadrés en rouge, sont observées dans les spectres Tau phosphorylée. Ces résonances qui correspondent à des protons amide (1 H- 15 N) , les corrélations des résidus REFP et Pseuil sont facilement trouvées dans la région d' environ 9,5 ppm à 8,5 pour 1 H et 117-125 ppm 15 N, en dehors de la majeure partie de la 1 H 15 N corrélations entre le spectre de Tau phosphorylée. (A et B) correspondent aux spectres acquis à 600 MHz, 2048 et 256 points de données à des largeurs spectrales de 14 et 25 ppm ont été enregistrées dans la 1 H (F2) et 15 N (F1) dimensions, respectivement.32 scans ont été utilisés, et la durée totale de l'acquisition était de 2 h 44 min et (C) à 900 MHz, 3072 et 416 points de données à des largeurs spectrales de 14 et 25 ppm ont été enregistrées dans la 1 H (F2) et 15 N ( F1) dimensions, respectivement. 48 scans ont été utilisés, et la durée totale de l'acquisition était de 6 h 37 min. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10
Figure 10: 3D 1 H, 15 N, 13 spectre RMN de C, les projections et les plans 2D extraites. 2048, 72, et 256 points de données ont été enregistrées dans la 1 H (F3), 15 N (F2), et 13 C (F1) dimensions, respectivement. Largeurs spectrales sont de 14, 25 et 61 ppm, centré sur 4,7, 119 et 41 ppm dans le 1 H,15 N et 13 C dimensions, respectivement. Durée de l'acquisition en utilisant 16 balayages est de 4 jours et 6 heures. Représentation (A) de cube correspondant à la transformée de Fourier jeu de données 3D d'un spectre de ERK phosphorylée Tau HNCACB obtenu à 600 MHz. 2D 1 H, 15 N et le 1 H, C 13 avions sont obtenues par projection des données 3D le long du 13 C et 15 N dimensions, respectivement. Le traitement des données et de représentation ont été effectuées en utilisant l'acquisition RMN et un logiciel de traitement. (B) 2D 1 H, 13 C plan extraite de la 3D 1 H, 15 N, 13 C RMN ensemble de données à un changement 15 N chimique de 121,8 ppm. Un zoom (à droite) centrée sur le 1 H déplacement chimique de 9,38 ppm montre les 13 CA et 13 CB résonnances des deux résidus i (pThr153) et i-1 (Ala152). La résonance 13 CB est aliasé en raison de la largeur des sfenêtre pectral. Représentation graphique et le pic de prélèvement ont été effectuées en utilisant le logiciel d'analyse de RMN. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Nous avons utilisé la spectroscopie RMN pour caractériser des échantillons Tau enzymatiquement modifiés. L'expression recombinante et purification décrit ici pour la pleine longueur de la protéine Tau humaine peuvent de même être utilisés pour produire des mutants Tau Tau ou domaines. Isotopiquement enrichi de protéines est nécessaire pour la spectroscopie RMN, ce qui nécessite l'expression recombinante. Identification des sites de phosphorylation nécessite l' affectation de résonance et une protéine doublement marquée 15 N, 13 C. Compte tenu du coût des isotopes, un bon rendement est requis dans l'étape d'expression recombinant. Le glucose est le facteur limitant pour la croissance bactérienne dans le milieu M9 donc la quantité de 13C - glucose 6 peut être augmentée jusqu'à 4 g par litre de milieu de culture pour améliorer le rendement. Ajout de moyennes et MEM vitamines complètes ne sont pas obligatoires, mais aident à stimuler la croissance et d'améliorer le rendement. Compte tenu du coût élevé du milieu marqué complet, ce produit est utilisé en tant que milieu de croissance supplément. La croissance bactérienne est lente dans un milieu M9. En général, les cultures bactériennes en utilisant les médias M9 supplémenté avec 3% complète temps de moyenne portée de l'induction après environ 4 heures d'incubation. Une DO600 de 1/6 à 1/8 est habituellement obtenu à la fin de la culture. Rendement attendu de la protéine Tau recombinante est d'environ 15 mg par litre de culture bactérienne. L'utilisation d'un incubateur programmable permet de programmer facilement la production de protéines, la collecte de la pastille bactérienne et le contrôle analytique de la production de protéines pendant les heures de travail par jour.

la concentration des échantillons est important d'obtenir un bon spectre de qualité. Un échantillon de Tau typique suffisant pour un spectre 2D contiendrait 1 mg dans 200 pi (soit 100 uM) de la protéine Tau. Pour un spectre 3D, d'au moins 200 uM dans 300 ul sont nécessaires, à condition que la tête de la sonde cryogénique est utilisée. L'accès à un spectromètre à haut champ, comme l'instrument de 900 MHz utilisée dans cette étude fournira un meilleur rapport signal-bruitet de réduire les contraintes sur la concentration de l' échantillon (figure 8). Étant donné que Tau est une grande protéine désordonnée, ses spectres de RMN sont caractérisés par un chevauchement de signal considérable, et un spectromètre de RMN à haut champ sera également le meilleur choix en termes de résolution (figure 8). Néanmoins, les résonances correspondant aux sites de phosphorylation sont dans une région distincte du spectre et sont faciles à détecter , même avec un spectromètre 600 MHz (comparer les figures 9B et 9C). En outre, en raison de sa nature désordonnée, la protéine Tau est sensible à la protéolyse (figures 8B).

Stérilisation des tampons est conseillé de limiter la dégradation Tau. Ajout d'inhibiteurs de protéase à l'échantillon RMN contribue à protéger contre la dégradation Tau pendant les périodes d'acquisition de données qui peut durer de quelques heures à plusieurs jours, en fonction de la séquence d'impulsions. Low pH (ie pH inférieur à 7,0) est nécessaire pour avoid échange trop rapide entre les protons de protéines et de protons de l'eau, ce qui conduit à signaler l'élargissement. pH de l'échantillon doit également être bien contrôlé pour garantir la reproductibilité des spectres. En effet, puisque les pKa de REFP et Pseuil sont proches du pH optimal pour la spectroscopie RMN, les déplacements chimiques des résidus phosphorylés sont très sensibles aux variations de pH. Ajustement du pH de l'échantillon de RMN peut être effectuée directement à l'aide d'un pH-mètre avec un pH de micro-électrode, adapté à de petits volumes. Tau est une protéine soluble et ne regroupe pas dans des conditions standard. Addition de polyanions tels que le sulfate d'héparine, et une incubation à 37 ° C peut initier l'agrégation dans les échantillons Tau. Dans ce cas, étant donné la nature solide des agrégats, la plupart des résonances dans le spectre RMN correspondant élargir au-delà de la détection. Même les échantillons de Tau phosphorylée ne agrègent pas dans les conditions décrites ici pour l'acquisition de données RMN.

Par rapport à l'analyse des anticorps, RMN fournit une ovue GLOBALE du PTM. La spectrométrie de masse peut également être utilisée pour identifier le motif de phosphorylation d'un échantillon de protéine. Le marquage isotopique est pas nécessaire pour cette technique, et les quantités d'échantillons nécessaires sont beaucoup plus petits. Cependant, la caractérisation d'une protéine avec de multiples phosphorylations, telles que Tau, reste difficile. phosphorylations adjacents produiront des peptides isobares dans les stratégies bottom-up d'identification. L'identification complète doit ensuite MS / MS séquençage des peptides obtenus par l'échantillon protéolyse. Un avantage de RMN consiste à la nature quantitative intrinsèque de cette technique. L'intensité d'un signal RMN peut être lié à la quantité du groupe chimique présent sur un site spécifique. On peut ainsi déterminer la proportion de modification chimique au niveau de chaque site. La plupart des progrès récents dans les applications MS ont cependant montré que l' analyse de la phosphorylation de tau multiple MS est réalisable 24, même d'une manière quantitative après la normalisation appropriée 25.

Ici, nous avons présenté Tau phosphorylation par ERK2 activée, mais la méthodologie peut être utilisée pour la phosphorylation avec d' autres kinases ainsi 6,7,26 - 28. Expériences cinétiques peuvent être réalisées, ce qui peut aider à définir la spécificité kinase vers un substrat de protéine 28-31. Des études de phosphorylation ne se limitent pas à des kinases recombinantes, et l' activité de la kinase d'extraits de cellules ou de tissus peuvent être analysés 6,32,28. Une évolution intéressante est l'utilisation de la RMN dans des cellules pour étudier des modifications in situ 33,34. A l' inverse, la RMN est également bien adapté pour traiter la spécificité de la phosphatase, comme l' a montré l' étude de la déphosphorylation de Tau phosphorylée par la phosphatase PP2A 35. spectroscopie RMN peut être appliquée à la caractérisation des inhibiteurs de la kinase en comparant le profil de phosphorylation du substrat protéique dans un spectre 2D en présence de l'esprit de composé inhibiteurh , le spectre émis à partir d' une expérience de contrôle 6.

L'intérêt d'utiliser la spectroscopie par RMN, par rapport aux techniques plus sensibles MS réside dans la large gamme d'applications exploitant le protocole décrit ici, plutôt que sur sa capacité d'analyse seul. Il a prouvé crucial d'identifier les sites de phosphorylation pour être en mesure de relier phosphorylations spécifiques avec des modifications structurales ou fonctionnelles qui ont été principalement étudiés par RMN. Spectroscopie RMN d'échantillons de Tau phosphorylée permet d'explorer l'impact structurel de la phosphorylation sur les deux structures secondaires locales transitoires et réarrangement global de l'ensemble dynamique de Tau modifié 36,37. Les aspects fonctionnels comprennent la régulation des deux interactions de Tau avec des partenaires protéiques 7,38,39 et l' agrégation par Tau phosphorylation 8. L'échantillon Tau phosphorylée caractérisé par RMN peut encore être utilisée pour déchiffrer les interactions phospho-dépendante, pourpar exemple avec des protéines 14-3-3 40 et machiné interaction protéine-protéine inhibiteurs de 41,42. RMN permet de définir site (s) d'interaction au niveau des résidus et de la dépendance de cette interaction sur la phosphorylation. En outre, la spectroscopie RMN de phosphorylée Tau est une méthode clé pour caractériser la cis proline: trans isomérase Pin1, une importante enzyme phospho-dépendante impliquée dans la régulation Tau 43-45. En outre, l' analyse de la phosphorylation par RMN peut être appliquée non seulement aux déplacés , mais aussi pour les protéines globulaires 46. Enfin, d' autres types de Tau PTM acétylation tels que 22,40,41 peuvent être étudiées par RMN. Les protocoles décrits ici se sont avérés cruciaux pour mieux comprendre la régulation fonctionnelle et structurelle de Tau dans des conditions physiologiques et pathologiques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

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References

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