Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse

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Biochemistry

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Summary

Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von Koregulierung Wechselwirkung Proteine ​​etabliert unter Verwendung der LC-MS / MS-System.

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Tsuchiya, M., Karim, M. R., Matsumoto, T., Ogawa, H., Taniguchi, H. A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55077, doi:10.3791/55077 (2017).

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Abstract

Introduction

Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Funktionen. Als solche haben diese Wechselwirkungen wurden in Signaltransduktion in Verbindung gebracht; Proteintransport durch Zellmembranen; Zellstoffwechsel; und mehrere Kernprozesse, einschließlich der DNA - Replikation, DNA - Schäden zu reparieren, Rekombination und Transkription 1, 2, 3, 4. Identifizierung der Proteine ​​in dieser Wechselwirkungen beteiligt ist daher von entscheidender Bedeutung, unser Verständnis dieser zellulären Prozesse voranzutreiben.

Immunopräzipitation (IP) ist eine validierte Technik verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu analysieren. Ist , um die Identifizierung von co-immunpräzipitiert Proteine, Massenspektrometrie häufig 5 verwendet zu erleichtern, 6, 7, 8,9. ein bekanntes Mitglied einer Protein-Komplex mit einem Antikörper von Targeting ist es möglich, den Proteinkomplex zu isolieren und seine unbekannten Komponenten über Massenspektrometrie-Analyse, um anschließend zu identifizieren. ARIP4 (Androgen - Rezeptor-interacting protein 4), eine Transkriptions coregulator, in Wechselwirkung mit der Kernrezeptorproteine, um seine Zielpromotoren in einer kontextabhängig 9, 10 zu aktivieren oder zu unterdrücken . ARIP4 interagierende Proteine ​​mit Hilfe der LC-MS / MS-System, um besser auf die Transkriptionsregulationsmechanismen verstehen diese Kernfaktoren regeln, beschreiben wir ein umfassendes Verfahren zur Reinigung und zu identifizieren.

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Protocol

1. Transfection

  1. Samen HEK293 - Zellen in 100-mm - Kulturplatten (2 x 10 6 Zellen / Schale). Kultur die Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 100 ug / ml Streptomycin und 100 Einheiten / ml Penicillin. Inkubieren der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C.
  2. Am nächsten Tag Transfizieren der Zellen mit 10 ug FLAG-markiertes Plasmid ARIP4 40 ul Transfektionsreagenz Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers 11.

2. Protein Extraction

  1. Etwa 36 Stunden nach der Transfektion, waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS und die Zellen ernten mit einem Schaber. Übertragen Sie die Zellen in einer 1,5 mltube und zentrifugiert es bei 8000 × g für 2 min bei 4 ° C. Aspirat der Überstand und Zellpellet in 5x der Pelletvolumen von 0,4 M KCl-Puffer (Hochsalzpuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x Protease - Inhibitor - Cocktail). Drehen, um die Mischung für 20 min bei 4 ° C.
  2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 17.700 g für 10 min bei 4 ° C.
  3. Den Überstand (Ganzzellextrakt) in ein neues 2-ml - Röhrchen und fügen 3x das Anfangsvolumen von 0 M KCl - Puffer (Verdünnungspuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM β-Mercaptoethanol, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail).
  4. Führen Sie eine weitere Zentrifugation (17.700 × g für 10 min bei 4 ° C) und den Überstand (Gesamtzellextrakt) in ein neues 2-ml-Tube.

3. Immunoprecipitation

  1. Während der Zentrifugation (2.4), wasche 50 ul anti-FLAG Perlen mit PBS, 0,1 M Glycin-Hydrochlorid, und dann wurde 1 M Tris-Hydrochlorid, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 0,1 M KCl Puffer (Puffer mit niedrigem Salz: 20 mM Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, 5 mM MgCl2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM b-Mercaptoethanol, Inhibitorcocktail 1x Protease). Die Zentrifugation für diesen Waschvorgang wird bei 2.000 xg für 1 min bei 4 ° C durchgeführt wird.
  2. Mischungs 50 ul FLAG Kügelchen mit den Ganzzellextrakte und drehen vorsichtig die Mischung 4 h bei 2-4 ° C (1% des gesamten Zellextrakts aus Schritt 2.4 auch bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung aufbewahrt werden sollte, als Eingang).
  3. Übertragung der Probe auf ein Mikrozentrifugensäule (Schwerkraft drop). Halten Sie die Durchfluss in einem 1,5-ml-Röhrchen, einfrieren mit flüssigem Stickstoff, und speichern Sie sie bei -80 ° C (überprüfen Sie die Proteinwerte sowohl der Eingangs- und Durchfluss Western-Blot-Analyse unter Verwendung).
  4. 1 ml 0,1 M KCl-Puffer (Puffer mit niedrigem Salz) die FLAG-Perlen (Schwere Tropfen) zu waschen.
  5. Wiederholen Sie Schritt 3.4 mindestens vier weitere Male (insgesamt fünf Waschungen).

4. Elution

  1. Die Säule in ein 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren es bei 2000 × g für 1 min; die Perlen trocknen.
  2. Verschließen Sie die Unterseitedie Kolumne.
  3. Werden 50 & mgr; l (gleich dem Volumen von FLAG beads) von 0,1 M Glycin-HCl (pH 2,5).
  4. Schütteln Sie die Mischung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  5. Platzieren Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren es bei 2.000 × g für 1 min.
  6. Die eluierte Lösung wird mit 10 ul 1 M Tris-HCl (pH 8,0) neutralisiert; gut mischen durch Pipettieren oder durch eine Wirbelmaschine.

5. Alkylierungs- und Trypsinisierung

  1. Zugabe von 50 ul 100 mM NH 4 HCO 3, 10 & mgr; l CH 3 CN und 2 ul Dithiothreitol zum Gemisch (112 ul Gesamtvolumen).
  2. Inkubieren der Probe für 30 min bei 56 ° C.
  3. Die Probe wird bei Raumtemperatur für 10 min.
  4. Zugabe von 10 & mgr; l 333 mM Iodacetamid zur Probe und Inkubieren im Dunkeln für 30 min bei 37 ° C.
  5. Zugabe von 10 & mgr; l Trypsin (33 ng / ul) zu dem Gemisch und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.

  1. Nach über Nacht Trypsinierung, transportieren das Endprodukt zu einem LC-MS / MS - Anlage oder an einem Drittlabor Massenspektrometrie zur Analyse 12.

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Representative Results

Wir identifizierten ein starkes ARIP4 Signal, etwa 160 KDa, sowie diejenigen eines Mock Probe Kontrolle und mehrere andere unbekannte Proteine (Abbildung 1). LC-MS / MS - Analyse sowohl die ARIP4 komplexe Peptide und die potentiellen Peptid - Cofaktoren in der Fraktion von FLAG - Kügelchen (Tabelle 1) identifiziert. p62 (Sequestosome1), einem bekannten ARIP4 Cofaktor 11 wurde in der Analyse (Tabelle 1) identifiziert, die 11 um die Wirksamkeit dieses Systems bestätigt. Wir haben auch viele andere zuvor berichtet Proteine ​​identifiziert, die mit ARIP4 interagieren. Auf diese Weise Sumo2 10 und DryK 13 wurden über die LC-MS / MS - Analyse nachgewiesen. ARIP4 Peptide wurden auch die LC-MS / MS-Analyse identifiziert wurde, was darauf hindeutet, dass die IP von hoher Qualität war. Insgesamt ist die LC-MS / MS-Technik ein mächtiges Werkzeug, das verwendet werden kann, unbekannte nukleare Ereignisse Link zu identifizierened an Protein-Protein-Wechselwirkungen. Voll massenspektrometrischen Ergebnisse werden auf Anfrage zur Verfügung.

Abbildung 1
Abbildung 1: Reinigung von ARIP4 Komplexe. Silberfärbung von FLAG-Epitop-tagged ARIP4 (ARIP4-F) exprimiert in HEK293-Zellen und Immunpräzipitation mit einem FLAG-spezifischen Antikörper. Gereinigte Proteine ​​wurden unter Verwendung von Gelelektrophorese aufgetrennt und mit einer Silberfärbung sichtbar gemacht. Als Kontrolle wurde eine mock Reinigung an HEK293-Zellen durchgeführt, die keine exogene Proteine ​​exprimieren, hat. Molekulargewichtsstandards sind auf der linken Seite gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1
Tabelle 1: identifizierun neuartiger ARIP4 Bindungsproteine. FLAG Perlen an gereinigten Protein-Komplexe gebunden wurden durch Trypsin-basierte Verdauung gespalten. Diese Proteine ​​wurden anschließend LC-MS / MS-Analyse identifiziert. Die LC-MS / MS-Daten wurde mit der Swiss-Prot-Datenbank und MASCOT Software analysiert. Die Zahl der Peptide und die Identität dieser Proteine ​​gezeigt. Nur Proteine ​​mit signifikanten MASCOT Scores (p <0,05), wurden ausgewählt.

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Discussion

Effiziente Transfektion ist wichtig, ein erfolgreiches Ergebnis mit diesem Protokoll zu erhalten. Dementsprechend empfehlen wir Western-Blot-Analyse unter Verwendung der immunpräzipitierten FLAG-markierten Protein-Spiegel zu bestimmen. Dieser Schritt ermöglicht es Benutzern, zu überprüfen, ob ihre Protein von Interesse richtig überexprimiert und darüber hinaus, dass die IP wurde erfolgreich durchgeführt. FLAG-markierte Proteinspiegel sollte auch vor der Massenspektrometrie-Analyse überprüft werden.

Ein Mock Probe sollte als Negativkontrolle verwendet werden, um ein falsch positives Ergebnis zu vermeiden, den Erhalt und den Hintergrund von der wahren Wechselwirkungen zu unterscheiden. Außerdem, wenn menschliche Proteine zu studieren, Experimente sollte in einer relativ sauberen Umgebung (beispielsweise ein Reinraum) durchgeführt , um eine Kontamination zu vermeiden. Obwohl ein Proteinextraktionspuffer mit einer hohen Salzkonzentration (0,3-0,4 M) können gelegentlich Kernproteine ​​zu extrahieren, ein IP-Puffer mit einem 0,1-0,15 M Salzkonzentration verwendet werden, die meistenzehn empfohlen. Dies ermöglicht es dem IP Verfahren ohne Protein-Protein-Wechselwirkungen stören, um fortzufahren. Um das Hintergrundsignal zu minimieren, magnetische Kügelchen können für das Reinigungsverfahren verwendet werden. Es ist auch wichtig, um die Zelllyse Bedingungen zu optimieren, um falsch-positive Ergebnisse zu reduzieren.

Die Bedeutung des Verfahrens in dieser Studie im Vergleich zu anderen Techniken , beschrieben (beispielsweise in Gel - Digestion-basierten einzelnes Protein identification) 5, 10, 11 ist , dass es Benutzern LC-MS / MS - Analyse für das Hochdurchsatz - Identifizierungs ausführen können von Protein-Wechselwirkungen zwischen Kern Cofaktoren und deren Bindungspartner. Transkriptionale Genregulation ist stark abhängig von der Zusammenarbeit von sequenzspezifischen DNA-Bindungsproteinen. Dementsprechend oft Transkriptionsfaktoren, die mit einer Vielzahl von Co-Faktoren interagieren, um die Zielgenexpression zu verändern. th erefore, zum besseren Verständnis der zellulären Ereignisse, die diese Transkriptionsmechanismen regeln, Transkriptions Partner zu identifizieren, die Zielproteinaktivität fördern von höchster Bedeutung ist. Unsere Methode ermöglicht es Benutzern, schnell mutmaßliche Kern Cofaktoren über ihre Transkriptionsfaktor von Interesse zu identifizieren und weiter verbessert unser Verständnis der Transkriptionsregulationsmechanismen.

FLAG-Peptid kann auch anstelle einer 0,1 M Glycin-HCl-Lösung (pH 2,5) während des Elutionsverfahren verwendet werden. Wenn jedoch diese Modifikation verwendet wird, der pH-Wert des Puffers verwendet, um die Peptide FLAG verdünnen sollten überwacht werden. 3x FLAG Peptide sollten auch die Proteine ​​aus den FLAG Perlen zu eluieren verwendet werden. Dementsprechend sollte eine Lösung mit einem relativ hohen pH-Wert verwendet werden, um die FLAG Peptide unter diesen veränderten Bedingungen zu verdünnen. Es ist auch entscheidend für die Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben zu vermeiden, um die richtigen Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erhalten.

t "> Gelegentlich die Optimierung der Trypsinierung Verfahren auch zur Verbesserung der Genauigkeit der Ergebnisse der Protein-Interaktionsscreening erforderlich sein kann. Obwohl die LC-MS / MS-Verfahren ein Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen dem Kern zu identifizieren Proteine, eines ihrer Einschränkungen ist , dass es nicht genauen Details bezüglich der Montage des Proteinkomplexes liefert. Komplexstabilität zu verbessern, chemische Behandlungen Vernetzungs 14 verwendet werden können. Als ein alternatives Verfahren, Kapillarelektrophorese-MS / MS ist auch nützlich 15 .

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) nacalai tesque 03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220
Micro Bio-Spin Columns BIO-RAD 732-6204

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References

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