En Protein Forberedelse Metode til High-throughput Identifikation af proteiner Samspil med en Nuclear Cofactor Brug LC-MS / MS-analyse

* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi har etableret en fremgangsmåde til oprensning af coregulatoriske interaktion proteiner ved anvendelse af LC-MS / MS-system.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tsuchiya, M., Karim, M. R., Matsumoto, T., Ogawa, H., Taniguchi, H. A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55077, doi:10.3791/55077 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Protein-protein interaktioner spiller en vigtig rolle i mange biologiske funktioner. Som sådan er disse interaktioner blevet impliceret i signaltransduktion; protein transport over cellemembraner; cellemetabolisme; og adskillige nukleare processer, herunder DNA-replikation, DNA beskadigelse reparation, rekombination og transkription 1, 2, 3, 4. Identifikation af proteiner involveret i disse interaktioner er derfor afgørende for at fremme vores forståelse af disse cellulære processer.

Immunpræcipitering (IP) er en valideret teknik, der anvendes til at analysere protein-protein-interaktioner. For at lette identifikationen af co-immunpræcipiteret proteiner, er massespektrometri ofte brugt 5, 6, 7, 8,9. Ved at målrette en kendt medlem af et proteinkompleks med et antistof, er det muligt at isolere protein-kompleks og efterfølgende identificere sine ukendte komponenter via massespektrometrianalyse. ARIP4 (androgen receptor-interagerende protein 4), en transskriptionel coregulator, interagerer med nukleare receptorproteiner for at aktivere eller undertrykke sit mål initiativtagere i en kontekst-afhængig måde 9, 10. For bedre at forstå de transkriptionelle reguleringsmekanismer for disse nukleare faktorer, beskriver vi en omfattende metode til at rense og identificere ARIP4 interagerende proteiner ved hjælp af LC-MS / MS-system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transfektion

  1. Seed HEK293-celler i 100 mm dyrkningsplader (2 x 10 6 celler / skål). Dyrke cellerne i Dulbeccos modificerede Eagles medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 100 ug / ml streptomycin, og 100 enheder / ml penicillin. Inkubér cellerne i en fugtig inkubator ved 5% CO2 og 37 ° C.
  2. Den næste dag, transfektion cellerne med 10 ug FLAG-mærket ARIP4 plasmid hjælp 40 pi transfektionsreagens i overensstemmelse med producentens anvisninger 11.

2. Protein Extraction

  1. Omkring 36 timer efter transfektion vaskes cellerne med iskold PBS og høste cellerne med en skraber. Overfør cellerne i et 1,5 mltube og centrifugere det ved 8000 xg i 2 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 x pellet volumen 0,4 M KCI puffer (puffer med højt saltindhold: 20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 0,4 M KCI, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x protease inhibitor cocktail). Rotere blandingen i 20 minutter ved 4 ° C.
  2. Centrifugeres røret ved 17.700 xg i 10 min ved 4 ° C.
  3. Overfør supernatanten (helcelle-ekstrakt) til et nyt 2 ml rør og tilsæt 3x det oprindelige volumen af 0 M KCI puffer (Fortyndingsbuffer: 20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-mercaptoethanol, 1x protease inhibitor cocktail).
  4. Udføre en anden centrifugering (17.700 x g i 10 minutter ved 4 ° C) og overføre supernatanten (helcelleekstrakt) til et nyt 2 ml rør.

3. Immunpræcipitation

  1. Under centrifugering (2.4), vask 50 pi anti-FLAG perler med PBS, 0,1 M glycin-hydrochlorid, og derefter 1 M Tris-hydrochlorid, efterfulgt af vask to gange med 0,1 M KCl-buffer (lav salt buffer: 20 mM Tris- HCI (pH 8,0), 0,1 m KCI, 5 mM MgCI2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptoethanol, 1x protease inhibitor cocktail). Den centrifugering i denne vaskeproces udføres ved 2.000 x g i 1 min ved 4 ° C.
  2. Bland 50 pi FLAG perler med hel-celle ekstrakter og rotere forsigtigt blandingen i 4 timer ved 2-4 ° C (1% af hele celler ekstrakt fra trin 2.4, bør også holdes ved -80 ° C til fremtidig brug som input).
  3. Overfør prøven til et mikro spinkolonne (tyngdekraft dråbe). Hold gennemløbet i et 1,5 ml rør, fryse den anvendelse af flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C (kontrollere protein niveauer af både input og gennemstrømning anvendelse af Western blot-analyse).
  4. Der tilsættes 1 ml 0,1 M KCI-puffer (lav salt buffer) at vaske FLAG perler (tyngdekraft dråbe).
  5. Gentag trin 3.4 mindst fire gange mere (i alt fem gange vask).

4. Eluering

  1. Kolonnen anbringes i et 1,5 ml rør og centrifugeres den ved 2000 xg i 1 min; perlerne tørrer.
  2. Cap bunden afkolonnen.
  3. Tilføj 50 pi (svarende til volumen af ​​FLAG perler) 0,1 M glycin-HCl (pH 2,5).
  4. Ryst forsigtigt blandingen i 10 minutter ved stuetemperatur.
  5. Kolonnen anbringes i et nyt 1,5 ml rør og centrifugeres den ved 2000 xg i 1 min.
  6. Den eluerede opløsning neutraliseres med 10 pi 1 M Tris-HCI (pH 8,0); bland godt ved pipettering eller ved anvendelse af en vortex-maskine.

5. Alkylering og trypsinisering

  1. Tilsæt 50 pi 100 mM NH4 HCO 3, 10 pi CH3CN, og 2 pi af dithiothreitol til blandingen (112 pi totalvolumen).
  2. Prøven inkuberes i 30 minutter ved 56 ° C.
  3. Anbring prøven ved stuetemperatur i 10 min.
  4. Tilsæt 10 pi 333 mM iodacetamid til prøven og inkuber det i mørke i 30 minutter ved 37 ° C.
  5. Tilsæt 10 pi trypsin (33 ng / pi) til blandingen, og inkuber det natten over ved 37 ° C.

  1. Efter natten trypsinisering, transportere det endelige produkt til en LC-MS / MS facilitet eller til en tredjepart massespektrometri laboratorium til analyse 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi identificerede en stærk ARIP4 signal, omkring 160 KDa, såvel som dem af en mock prøve kontrol og flere andre ukendte proteiner (figur 1). LC-MS / MS-analyse identificeret både ARIP4 komplekse peptider og de potentielle peptid cofaktorer inden den del af FLAG perler (tabel 1). P62 (Sequestosome1) blev en kendt ARIP4 cofaktor 11 identificeret i analysen (tabel 1), hvilket bekræfter effekten af dette system 11. Vi identificerede også mange andre tidligere rapporterede proteiner, der interagerer med ARIP4. På denne måde blev Sumo2 10 og DryK 13 detekteres via LC-MS / MS-analyse. ARIP4 peptider blev også identificeret ved anvendelse af LC-MS / MS-analyse, hvilket tyder på, at IP var af høj kvalitet. Samlet, LC-MS / MS teknik er et kraftfuldt værktøj, der kan anvendes til at identificere ukendte nukleare hændelser linked til protein-protein interaktioner. Fuld massespektrometriske resultater vil være tilgængelige efter anmodning.

figur 1
Figur 1: Oprensning af ARIP4 komplekser. Sølv farvning af FLAG epitop-mærket ARIP4 (ARIP4-F), udtrykt i HEK293 celler og immunopræcipitation med en FLAG-specifikt antistof. Oprensede proteiner blev løst under anvendelse af gelelektroforese og visualiseret med en sølvfarve. Som en kontrol blev en mock oprensning udført på HEK293-celler, som ikke udtrykte eksogene proteiner. Molekylvægtstandarder er vist til venstre. Klik her for at se en større version af dette tal.

tabel 1
Tabel 1: Identification af Novel ARIP4 proteiner. FLAG perler bundet til oprenset protein komplekser blev dissocieret med trypsin-baserede fordøjelse. Disse proteiner blev efterfølgende identificeret ved hjælp af LC-MS / MS-analyse. LC-MS / MS-data blev analyseret under anvendelse af Swiss-Prot database og MASCOT software. er vist antallet af peptider og identiteten af ​​disse proteiner. Kun proteiner med signifikante MASCOTs scoringer (p <0,05) blev udvalgt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Effektiv transfektion er afgørende for at opnå et vellykket resultat med denne protokol. Derfor anbefaler vi at bruge Western blot-analyse for at bestemme de immunopræcipiterede FLAG-mærkede protein niveauer. Dette trin giver brugerne mulighed for at kontrollere, at deres protein af interesse er korrekt overudtrykt og desuden, at IP blev udført med succes. FLAG-mærket protein niveauer bør også kontrolleres forud for massespektrometri analyse.

En mock prøve bør anvendes som en negativ kontrol for at undgå at få et falsk positivt resultat, og at skelne baggrunden fra sande interaktioner. Desuden, når studere humane proteiner, bør udføres forsøg i et relativt rent miljø (f.eks, et rent rum) for at undgå forurening. Selvom et protein ekstraktionsbuffer med en høj saltkoncentration (0,3-0,4 M) kan lejlighedsvis anvendes til at ekstrahere kerneproteiner, en IP-buffer med en koncentration 0,1-0,15 M salt er de fleste afti anbefales. Dette tillader IP fremgangsmåden for at fortsætte uden at afbryde protein-protein interaktioner. For yderligere at minimere baggrundssignalet, kan der anvendes magnetiske kugler til oprensningsprocessen. Det er også vigtigt at optimere cellelysis betingelser for at reducere falsk-positive resultater.

Betydningen af den beskrevne i denne undersøgelse i forhold til andre teknikker fremgangsmåde (fx i gel fordøjelse-baserede enkelt protein identifikation) 5, 10, 11 er, at det tillader brugere at udføre LC-MS / MS-analyse for højkapacitetsidentifikation af protein-interaktioner mellem nukleare cofaktorer og deres bindingspartnere. Transkriptionel genregulering er stærkt afhængig af samarbejdet mellem sekvens-specifikke DNA-bindende proteiner. Følgelig transkriptionsfaktorer ofte interagere med en lang række co-faktorer til at ændre målgenekspression. th erefore, bedre at forstå de cellulære begivenheder for disse transkriptionelle mekanismer, der identificerer transkriptionelle partnere, der fremmer målet protein aktivitet er altafgørende. Vores metode giver brugerne mulighed for hurtigt at identificere formodede nukleare cofaktorer via deres transskription faktor af interesse og yderligere forbedrer vores forståelse af transkriptionelle reguleringsmekanismer.

FLAG-peptid kan også anvendes i stedet for en 0,1 M glycin-HCI-opløsning (pH 2,5) under elueringsprocessen. Men hvis denne modifikation anvendes, bør overvåges pufferens pH anvendes til fortynding FLAG peptider. 3x FLAG peptider bør også anvendes til at eluere proteiner fra FLAG perlerne. Derfor bør en opløsning med en relativt høj pH anvendes til at fortynde FLAG peptider under disse ændrede betingelser. Det er også afgørende at undgå gentagen nedfrysning og optøning af prøverne for at opretholde de korrekte protein-protein-interaktioner.

t "> Lejlighedsvis optimering af trypsinisering proces kan også være påkrævet for at øge nøjagtigheden af ​​resultaterne af protein-interaktion screening. Selvom LC-MS / MS-metode er et værktøj, der kan anvendes til at identificere interaktioner mellem nuklear proteiner, en af sine begrænsninger er, at det ikke giver præcise detaljer om samlingen af proteinkomplekset. for at øge kompleks stabilitet, kemisk tværbinding behandlinger kan anvendes 14. som en alternativ metode, kapillarelektroforese-MS / MS er også nyttig 15 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) nacalai tesque 03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220
Micro Bio-Spin Columns BIO-RAD 732-6204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6, (6), e1000807 (2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12, (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304, (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7, (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296, (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422, (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102, (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8, (4), 61430 (2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11, (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20, (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71, (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24, (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11, (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32, (8), 1175-1188 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics