Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos

Neuroscience

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Summary

Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de poblaciones neuronales selectivas, etiquetadas después de la infección retrógrada con un virus de la rabia modificado expresan marcadores fluorescentes, y analiza, racimo imparcial independiente que permiten la caracterización completa de las métricas morfológicas entre subclases neuronales distintas.

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Bragg, E. M., Briggs, F. Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations. J. Vis. Exp. (120), e55133, doi:10.3791/55133 (2017).

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Abstract

Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de las neuronas en combinación con el uso de la agrupación independiente e imparcial análisis para crear un estudio exhaustivo de las características morfológicas observadas entre una población neuronal selectiva. La combinación de estas técnicas constituye un enfoque novedoso para la recogida y análisis de datos neuroanatómicos. En conjunto, estas técnicas permiten a gran escala, y por lo tanto más amplio, el muestreo de poblaciones neuronales selectivos y establecer métodos cuantitativos para describir imparciales clases neuronales morfológicamente únicos dentro de una población.

El protocolo se describe el uso de virus de la rabia modificado para etiquetar selectivamente las neuronas. G-elimina actos virus de la rabia como un trazador retrógrado tras la inyección estereotáxica en una estructura cerebral diana de interés y sirve como un vehículo para el suministro y la expresión de EGFP en las neuronas. Un gran número de neuronas están infectadas usando estetécnica y expresar GFP a través de sus dendritas, la producción de rellenos "Golgi" completos de las neuronas individuales. Por consiguiente, el método de rastreo retrógrado mediada por virus mejora sobre las técnicas tradicionales de rastreo retrógrado con base de tinte mediante la producción de rellenos intracelulares completas.

Individuales neuronas bien aisladas que abarcan todas las regiones de la zona del cerebro en estudio se seleccionan para la reconstrucción con el fin de obtener una muestra representativa de las neuronas. El protocolo describe los procedimientos para reconstruir los cuerpos celulares y completar los patrones de arborización dendrítica de neuronas marcadas que abarcan múltiples cortes de tejido. Los datos morfológicos, incluyendo posiciones de cada neurona dentro de la estructura del cerebro, se extraen para su posterior análisis. funciones de programación estándares se utilizaron para llevar a cabo agrupación independiente de análisis y evaluaciones de racimo basados ​​en métricas morfológicas. Para comprobar la utilidad de estos análisis, la evaluación estadística de un análisis de conglomerados performado en 160 neuronas reconstruidas en el núcleo reticular del tálamo del tálamo (TRN) del macaco fue hecho. Tanto el análisis de conglomerados original y las evaluaciones estadísticas realizadas aquí indican que las neuronas TRN se dividen en tres subpoblaciones, cada una con características morfológicas únicas.

Introduction

Neuroanatomía es uno de los fundamentos de la neurociencia 1 y el interés reciente en "conectómica" ha renovado el entusiasmo para la comprensión de la diversidad morfológica de poblaciones neuronales y las conexiones entre las neuronas específicas 2. Los métodos para el etiquetado y la reconstrucción de las neuronas han mejorado en gran medida con las innovaciones recientes, incluyendo el trazado de circuito y genética mediada por virus enfoques 3, 4, lo que permite estudios morfológicos más amplios de poblaciones neuronales 5. Además de las mejoras en el etiquetado de las neuronas individuales, técnicas de análisis de datos cuantitativos también han surgido que permiten la clasificación independiente e imparcial de las neuronas en distintas subpoblaciones en base a los datos morfológicos 5, 6. Estas técnicas son imparciales una mejora sobre más TRADICIONAl métodos cualitativos de clasificación que han sido la norma en el campo durante más de un siglo. El objetivo de este estudio es describir, paso a paso, la combinación de etiquetado mediada por virus de las neuronas dentro de una población selectiva, reconstrucciones a gran escala de una muestra amplia de estas neuronas, y el análisis de datos cuantitativos basados ​​en la agrupación independiente evaluación estadística. Mediante la combinación de estos métodos, se describe un nuevo enfoque hacia la recopilación y el análisis de los datos neuroanatómicos para facilitar la toma de muestras completa y una clasificación no sesgada de tipos neuronales morfológicamente únicos dentro de una población neuronal selectiva.

Como ejemplo de estos métodos, se describe el análisis de una gran población de neuronas dentro de un solo sector del núcleo reticular talámico (TRN) del mono macaco. Estos datos son de un estudio previo 7. Métodos para marcar selectivamente las neuronas TRN que se proyectan hacia el latera dorsall geniculado núcleo del tálamo (dLGN) mediante inyección quirúrgica del virus de la rabia modificado que codifica la EGFP 4, 8 (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 2) se describen. Este virus de la rabia modificada carece del gen que codifica una proteína de la cubierta esencial, la eliminación de movimiento trans-sináptica del virus. Una vez que el virus entra en terminales de los axones en el sitio de inyección, que actúa como un trazador retrógrado tradicional con la ventaja importante de dirigir la expresión de EGFP en toda la arborización dendrítica completa de las neuronas infectadas 5, 9, 10. Por consiguiente, este virus de la rabia eliminado G-puede ser utilizado para infectar y etiquetar cualquier población neuronal después de la inyección y transporte retrógrado selectivamente.

Con el fin de realizar un análisis exhaustivo de una población neuronal específica, es importante tomar muestras deuna amplia distribución de las neuronas dentro de la población. Debido a que la técnica de etiquetado mediada por virus produce intracelular completa, "Golgi-like" llena de muchas neuronas con axones en el sitio de la inyección del virus, es posible reconstruir una muestra muy grande de las neuronas dentro de la extensión completa de una estructura cerebral. Además, debido a que el virus de la rabia modificado es tan eficaz en infectar y etiquetado de un gran número de neuronas, es posible reconstruir cientos de neuronas por animal. Los procedimientos para el muestreo de 160 neuronas en todo el sector visual de la TRN 11 con el fin de generar una muestra completa de dLGN proyectan neuronas TRN se describen. Se describe el proceso de reconstrucción de las neuronas individuales utilizando un sistema de reconstrucción de las neuronas incluyendo un microscopio, cámara y software de reconstrucción. También se describen métodos para determinar las posiciones de las neuronas individuales dentro de una estructura del cerebro (en este caso dentro de la TRN) y para verificar el virus de la inyección sitel volumen de correo y la ubicación dentro de una estructura (en este caso dentro de la dLGN) usando reconstrucciones volumétricas de contorno. Pasos para exportar los datos morfológicos y realizar agrupación independiente de análisis basados ​​en métricas se describen morfológicos medidos para cada neurona. Existen limitaciones en los métodos de agrupamiento y también hay una variedad de diferentes algoritmos de agrupación disponibles. En consecuencia, se describen estas opciones y las ventajas de algunos de los algoritmos más comúnmente utilizados. El análisis de conglomerados no proporciona una verificación estadística de la singularidad de las agrupaciones. Por lo tanto, los pasos adicionales se describen para verificar la agrupación óptima, así como las relaciones entre los datos morfológicos dentro ya través de las agrupaciones. Métodos estadísticos para evaluar las agrupaciones para el conjunto de datos TRN para confirmar que las neuronas TRN se agrupan en tres grupos únicas basadas en 10 mediciones morfológicas independientes están descritas.

Por lo tanto, delineando los pasos para el etiquetado de forma selectiva, La reconstrucción, y el análisis de datos morfológicos de una población neuronal específica, se describen los métodos para la cuantificación de las diferencias morfológicas entre las neuronas dentro de una población. hallazgos previos de tipos neuronales distintas dentro del sector de la visual de la TRN mono macaco se confirman con métodos distintos de evaluación estadística. Juntos, esperamos que estas técnicas serán ampliamente aplicable a conjuntos de datos neuroanatómicos y ayudar a establecer la clasificación cuantitativa de la diversidad de las poblaciones neuronales a través del cerebro.

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Protocol

Nota: El tejido examinado en este estudio se preparó como una parte de un estudio separado 5. Por lo tanto, todos los métodos experimentales sobre la utilización de los animales se han descrito en detalle en la sección Métodos Experimentales de Briggs et al. (2016). Todos los procedimientos con animales llevados a cabo como parte del estudio previo fueron aprobados por los Comités de Cuidado de Animales y el uso institucional. Los pasos para la inyección de virus en el dLGN y el procesamiento histológico de tejido cerebral se describen brevemente a continuación en las secciones 1 - 2.

1. inyección estereotáxica

  1. Realizar todos los procedimientos quirúrgicos en un entorno estéril utilizando técnicas asépticas. Vapor-esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos metálicos, material de gasa y drapeado en autoclave. Esterilizar todos los materiales que puedan ser dañados por el vapor mediante esterilización química (por ejemplo, óxido de etileno).
  2. Inducir y mantener la anestesia según animal- yp-ROTOCOLO requisitos específicos.
    1. Para la inyección de virus en los monos, inducir la anestesia con ketamina (10 mg / kg) y mantener animales bajo anestesia quirúrgica completa con isoflurano (1-3% inhalado en oxígeno) de vigilancia expirado CO 2, EKG, la tasa de respiración, y la temperatura de la comprobación continua y periódicamente el tono de la mandíbula para asegurar la profundidad anestésica adecuada.
  3. Lugar de los animales en un marco estereotáxico para estabilizar la posición del cabezal y para permitir el uso de coordenadas estereotáxica para localizar la estructura inyección de interés (por ejemplo dLGN). Si la medición de las respuestas visuales, gotas para los ojos lugar (gotas para los ojos de atropina 1% si se desea la dilatación de la pupila, de lo contrario las gotas oftálmicas de suero salino) y luego las lentes de contacto en ambos ojos para evitar la sequedad. Si no medir las respuestas visuales, colocar ungüento oftálmico en los ojos.
  4. Hacer una incisión en la línea media del cuero cabelludo y retraer la piel y los músculos.
  5. Según estereotáxica coordenadas de la estructura de interés (dLGN) en una hemisphERE, hacer una pequeña craneotomía.
  6. Poco a poco bajar un electrodo de registro (por ejemplo tungsteno o electrodo de platino / iridio (véase la Tabla de materiales específicos / Equipo, fila 3) fijada a un micromanipulador que se coloca manualmente) a través de la craneotomía en el cerebro. impedancia más baja (<1 MW) y ligeramente más grueso (~ diámetro 250 micras) electrodos pueden ser utilizados para penetrar la dura, si se desea.
  7. Registrar la posición del manipulador en la superficie cortical y en el punto donde se miden las respuestas visuales. respuestas visuales son audibles, el tiempo de bloqueo de las respuestas neuronales a la luz brilló en los ojos con un oftalmoscopio o pequeño LED / linterna.
  8. Determinar la ubicación y el espesor de la dLGN observando las posiciones del manipulador en el inicio, medio y final de las respuestas visuales y restando la posición de la superficie cortical de estos valores. Registrar las profundidades para cada sitio de inyección diseñada dentro del dLGN.
    NOTA: procedi similaresres se pueden usar para la localización de estructuras no visuales mediante el uso de los estímulos sensoriales apropiadas. Además, los sistemas de grabación / inyección acoplado también se pueden utilizar para dirigirse a estructuras cerebrales pequeños.
  9. Una vez que se observaron las ubicaciones óptimas de inyección, retire el electrodo de registro y colocar una pipeta de inyección (pipeta de vidrio o jeringa de inyección) en la misma posición estereotáxica e inferior a la profundidad apropiada para cada inyección, comenzando con el sitio de inyección más profunda y de proceder a la menos profunda, esperar al menos 1 minuto después de la inyección antes de cambiar la posición del electrodo. pipetas de vidrio con un diámetro exterior de ~ 50 micras pueden reducir el reflujo de virus que las puntas de jeringa (~ 200 micras de diámetro).
  10. El uso de un sistema de inyección (véase la Tabla de materiales específicos Equipmen t, fila 4 /), Picospritzer, o bomba de jeringa, inyectar pequeños volúmenes (1 - 5 mu L; se refiere a las instrucciones del fabricante para los procedimientos de inyección) del virus de la rabia modificado más de múltiple (3 - 10) profundidadesa una velocidad de ~ 100 nL / min dentro de la estructura de destino (dLGN). Nota: las penetraciones de inyección diferentes se pueden hacer en estructuras diana más grandes (por ejemplo, mono dLGN). Ajustar el volumen total de inyección según el tamaño de la estructura de destino.
  11. Pausa al menos 5 min antes de retraer la pipeta de inyección. Cuando se retira la pipeta de inyección, llenar la craneotomía con material protector (piece hueso pegamento en su lugar, aplicar la cera de hueso o espuma de gel), a continuación suturar el músculo y la piel de nuevo juntos.
  12. Administrar analgésicos (por ejemplo, ketoprofeno) y antibióticos anteriores al final de la cirugía y monitorear los animales continuamente hasta que los animales es ambulatorio.
  13. Durante al menos 3 días y hasta 10 días después de la cirugía, el seguimiento de los animales diariamente para asegurar suturas estén limpios, secos, e intacto y animal no muestra signos de dolor o malestar. Administrar analgésicos y antibióticos diarios según se requiera. Comience viviendas sociales de animales post-quirúrgico después de animal se ha recuperado totalmente de la cirugía.
  14. </ Ol>

    2. La recolección de tejidos, seccionamiento y tinción

    1. Permitir a 7 - 14 días para el transporte retrógrado de virus, a continuación, la eutanasia al animal por sobredosis de solución de eutanasia (por ejemplo Euthasol) y perfunden el animal transcardially con solución salina tamponada de fosfato 0,1 M, 4% de paraformaldehído, y luego 4% de paraformaldehído con 10% de sacarosa.
    2. Retire el cerebro (véase la sección 12 para los pasos análogos en un modelo de roedor) y el lugar en el 20 - 30% de sacarosa con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M y refrigerar por 1 - 2 días.
    3. Cuando el cerebro ha hundido hasta el fondo del recipiente, y eliminar y cortar el tejido en bloques que contienen la región del cerebro con las neuronas marcadas de forma retrógrada (por ejemplo, la corteza visual) y la estructura objetivo inyección (por ejemplo dLGN). Cortar los mismos bloques de tejido del hemisferio no inyectada - éstos servirán como secciones de control. Para obtener los mejores resultados, comenzar procedimientos histológicos immediately sobre el tejido recién seccionada.
    4. Sección de tejido coronal con un espesor de 50 micras en la sección utilizando un micrótomo de congelación (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 5).
    5. Manchar todas las secciones de la actividad de la citocromo oxidasa (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, filas 5 - 8) para visualizar las capas corticales y estructuras subcorticales 13. Nota: Las secciones se pueden almacenar durante la noche en un refrigerador en el enjuague final después de la tinción de citocromo oxidasa.
    6. Etiquetar todas las secciones con un anticuerpo primario frente a GFP (dilución 1: 1.000, ~ 12 h de incubación; véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 9) seguido de un anticuerpo secundario que coincida con el huésped primario y etiquetados con biotina 5 (dilución 1: 500 , 2 - 4 h de incubación; véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 10). Se recomienda incubar las secciones en el anticuerpo secundario durante la noche.
    7. Secciones de etiquetas con un complejo de avidina / biotina y luego reaccionan con DAB y peróxido para manchar de forma permanente todas las neuronas marcadas 5.
    8. Montar las secciones en portaobjetos de vidrio subbed y dejar secar durante la noche.
    9. Defat secciones utilizando una serie de alcohol y xileno enjuagues continuación, cubre-14.

    3. Reconstrucción neuronal

    NOTA: Todas las reconstrucciones de los experimentos originales se hicieron usando un sistema de reconstrucción de las neuronas compuesto por un microscopio (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 14), cámara adjunta (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 13), y el software de reconstrucción paquete (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, filas 11 - 12). reconstrucción neuronal asistida por software permite la visualización de diapositivas de tejidos superpuestos con dibujos basados ​​en ordenador de procesos neuronales. Es importante destacar que, el software digitaliza recons morfológicación de datos en tres dimensiones, lo que permite la extracción de la información morfológica específica de la posición. El programa de extracción de datos asociados (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 12) permite la extracción de un amplio conjunto de datos morfológicos de cada reconstrucción salvado.

    1. Coloque una diapositiva en el soporte de portaobjetos de microscopio y se centran en una sola sección de interés utilizando un objetivo de bajo aumento (por ejemplo, 2X o 10X). Asegúrese de que la imagen de la cámara es visible en la vista del software posicionando correctamente el obturador de la cámara.
    2. Elija neuronas marcadas dentro de la estructura del cerebro de interés (por ejemplo TRN) que se aisló razonablemente con el fin de reconstruir sin ambigüedad como gran parte de la arborización dendrítica como sea posible. Preferentemente elegir neuronas si el cuerpo de la célula está completamente dentro de una única sección con el fin de capturar la mayor medida de cada cuerpo de la célula y con precisión estimar su área y redondez. Utilice 10X objetivo del microscopio para identificar células Body en la sección de hogar.
    3. Una vez que se identifica un bien manchado, bien aislado de las neuronas, agregue la sección de "casa" que contiene el cuerpo de la célula a la gerente de la sección haciendo clic en el botón "Nueva Sección". Introduce el número de secciones para incluir (se recomienda 2 - 3 secciones para empezar). Asignar un espesor de corte de 50 micras cuando se le solicite (véase el paso 2.3).
    4. Seguir la pista a los contornos de las estructuras cerebrales relevantes en la sección de hogar que contiene el cuerpo de la célula. Usa el objetivo 2X / cambio de tamaño para el seguimiento del contorno.
      1. En primer lugar, seleccione "Contorno" en el menú desplegable que aparece en la barra de herramientas superior y luego seleccione el tipo de contorno en el menú desplegable (por ejemplo, "LGN" o "TRN").
      2. Seguir la pista a los contornos de la estructura diana (por ejemplo TRN), así como las estructuras adyacentes, si se desea, haciendo clic en puntos a lo largo del contorno con el ratón como herramienta de sorteo.
      3. Seleccione "Cerrar contorno", haga clic en el ratón y seleccionar esta opciónen el menú para rellenar y adjuntar cada contorno trazado.
    5. Coloque un marcador en el centro de la estructura de destino haciendo clic en el símbolo de marcador deseado en la barra de herramientas a la derecha y luego haciendo clic en la ubicación deseada en la reconstrucción para colocar el marcador en ese lugar. Utilice el mismo tipo de marcador para marcar el centro de la estructura objetivo en todas las reconstrucciones.
    6. Una vez que los contornos son completos, trazar el contorno del cuerpo celular utilizando 40 - 60X objetivos / ampliación. Para ello, primero seleccione "Neurona" en el menú desplegable que aparece en la barra de herramientas superior y luego seleccionar la estructura de la neurona para rastrear, en este caso "célula del cuerpo". A continuación trazar el cuerpo de la célula como en 3.4.
    7. Coloque un marcador estilo diferente en el centro del cuerpo celular, siguiendo los pasos descritos en el punto 3.5.
    8. Rastrear todas las dendritas que comienzan en el cuerpo de la célula.
      1. En primer lugar, seleccione "dendrita" en el menú desplegable. A continuación, el seguimiento de cada dendrita a partir de la DBO celularY y utilizando el ratón como herramienta de sorteo. Asegúrese de ajustar la profundidad z a lo largo del trazado para capturar con precisión el ángulo y la dirección de la dendrita.
      2. Coloque un nodo en cada punto de ramificación a lo largo de la dendrita, haga clic en el ratón y seleccionando la opción "Nodo se bifurcan" o "Trifurcating nodo" en el menú desplegable. Utilice 40 - 60X objetivo / ampliación para todas las reconstrucciones de las dendritas.
      3. Al final de cada una de las dendritas, haga clic con el ratón y seleccione "Terminar" en el menú desplegable.
    9. Identificar las terminaciones dendríticas que es probable que continúe en la sección adyacente y traer estos enfocar a la profundidad z apropiada la imagen de microscopio en. Incluir los principales puntos de referencia cercanos, como los vasos sanguíneos o los patrones fácilmente reconocibles dendritas o haces de la imagen de microscopio en.
      1. Reducir la magnificación de 20X a 10X o en el microscopio (elegir el lente de aumento que permite mayor visualización de punto de referencia), y tomaruna foto de la imagen del microscopio con una cámara digital (por ejemplo, teléfono celular, tableta) de mano a la pantalla del ordenador.
    10. Mover a la sección adyacente en la diapositiva y alinee los contornos de la sección previamente trazado con los límites de la dLGN y TRN en la nueva sección.
    11. Devolver el campo de visión para el área general del cuerpo celular (basado en los contornos y las atracciones más importantes) y traer de vuelta la magnificación de hasta 10 - 20X.
    12. Utilizar la foto de las terminaciones de las dendritas de la sección previamente trazado para ayudar en la alineación de las terminaciones con los inicios de las dendritas en la nueva sección.
      1. Para girar el trazado y moverlo para alinear las dendritas, utilice la herramienta de flecha para seleccionar la reconstrucción, haga clic derecho y seleccionar "Mover" en el menú desplegable.
      2. Como alternativa, utilice la función "ajuste" para que coincida con terminaciones dendríticas a inicios. Seleccione la herramienta de ajuste de la barra de herramientas superior y cuando se le solicite, haga clic en el finalen la reconstrucción y el punto de continuación correspondiente de la imagen. Repita durante 3 o más terminaciones.
    13. Una vez que el trazado de la sección anterior está alineada con las dendritas de la nueva sección, asegúrese de que la nueva sección correspondiente se selecciona en el administrador de la sección haciendo clic en la sección actual. O bien, añadir una nueva sección a la gerente de la sección, como se describió anteriormente en el punto 3.3, el ajuste de la profundidad z y la posición de cada sección nueva con respecto a la sección de hogar en consecuencia y establecer cada sección espesor de 50 mm (véase el paso 2.3).
    14. Aumentar la ampliación a 40 - 60X y rastrear las continuaciones de las dendritas haciendo clic con el ratón en el extremo de la dendrita de la reconstrucción y seleccionando la opción "Añadir a Ending" en el menú desplegable, a continuación, trazando la dendrita utilizando el ratón como una llamar la herramienta. Siga indicador para especificar si es la continuación en la nueva sección.
    15. Siga las dendritas a través de al menos 3 secciones adyacentes (uno a cada lado dela sección principal) Pasos después de 03.08 a 03.15. Añadir a la reconstrucción hasta por lo menos 3 secciones totales se trazaron para la neurona o hasta que las dendritas ya no pueden ser seguidos o que se encuentran. Trazar los contornos de las secciones vecinas siguiendo los pasos anteriores, si se desea.

    4. La agrupación independiente

    Nota: agrupación independiente analiza habilitar análisis imparciales de conjuntos de datos grandes, multi-dimensionales que de otra manera podrían ser difíciles de visualizar y, sobre todo, proporcionar una evaluación cuantitativa de la diversidad morfológica. Una plataforma de programación basada en matriz es bastante útil para el análisis de conjuntos de datos multidimensionales y permite manipulaciones de datos sofisticados y análisis estadísticos. Las funciones enumeradas en los pasos 4 - 6 se definen en la plataforma de programación que figuran en la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 15.

    1. Extraer los datos morfológicos de cada reconstrucción neuronal uso individual de un extraction programa asociado con el sistema de reconstrucción de las neuronas (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, filas 11 - 12).
      1. En primer lugar, elegir los datos morfológicos deseados para cada reconstrucción incluyendo: información de contorno, información de marca, los datos morfológicos del cuerpo celular y arborización dendrítica, etc.
      2. En el menú desplegable Editar en la barra de herramientas superior, seleccione "Seleccionar todos los objetos". A continuación, seleccione "Análisis de la estructura ramificada" del menú desplegable Analysis en la barra de herramientas superior y haga clic en cada ficha y seleccionar las opciones de análisis deseados en cada ficha.
      3. Extraer todos los datos deseados haciendo clic en el botón "OK" en la ventana de Análisis y guardar en un formato de hoja de cálculo haciendo clic derecho en las ventanas de salida y seleccionando la opción "Exportar a Excel".
    2. Compilar una hoja de cálculo maestra (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 16) en la que cada variable morfológica / metric está representado por una única observación numérico por neurona. En esta hoja de cálculo Maestro, mantener un registro del identificador de fila para cada neurona.
    3. Verificar que todas las variables incluidas en el análisis de conglomerados (por ejemplo, las métricas morfológicas) son independientes entre sí. Por ejemplo, el número de nodos se correlaciona con el número de ramas en una arborización dendrítica o axonal. En consecuencia, sólo una de estas dos variables se deben incluir en un análisis de conglomerados.
    4. Asegúrese de que cada medición contiene una observación para cada variable, es decir, cada neurona (medición), debe tener un punto de datos (observación) correspondiente a cada métrica morfológica (variable). Si las observaciones para una variable en particular (por ejemplo, la longitud del axón) son insuficientes para un subconjunto de neuronas, esta variable (longitud axón) no puede ser incluido en el análisis de agrupamiento.
    5. Organizar los datos en la hoja de cálculo maestra en una sola matriz en la que cada fila representa una neurona y EACh columna contiene datos numéricos para cada métrica morfológica (Figura 1). Por ejemplo, un conjunto de datos que incluye 100 neuronas para la que existan observaciones para 5 variables independientes estaría representada por una matriz de 100 x 5 (fila por columna). No es necesario incluir ningún tipo de identificación para cada neurona dentro de la matriz - el índice de fila servirá como el identificador único de cada neurona. También debe haber espacios o s "NaN" en la matriz. Guardar la matriz como una sola variable (por ejemplo, datos = [100 x 5 matriz], véase Código Suplementario del archivo de código de ejemplo).
    6. Elija un algoritmo para calcular distancias entre puntos que representan las neuronas individuales en un espacio n-dimensional, donde n se define por el número de variables. La función 'pdist' permite flexibilidad en el cálculo de las distancias entre las neuronas. El cálculo de la distancia predeterminada es la distancia euclídea y se ha utilizado previamente para análisis similares de morphologica neuronall Características 5, 6.
    7. Con el entre-neurona se distancia salida de la función 'pdist', utilice la función de "vinculación" para formar racimos. Una vez más, múltiples opciones de agrupamiento están disponibles. El método de Ward y la distancia centroide han arrojado resultados similares en los análisis de conjuntos de datos morfológicos 5, 6.
    8. Si lo desea, utilice la función '' KMeans como un enfoque alternativo al agrupamiento 'pdist' y las funciones de "vinculación". '' KMeans emplea Distancia euclídea al cuadrado para calcular distancias entre las neuronas y luego la distancia centroide para asignar grupos.
    9. Para visualizar un árbol jerárquico de conglomerados, utilizar la función 'dendrograma' en la salida de la operación de "vinculación". Esta función tiene una configuración predeterminada que limita la visualización para 30 mediciones, pero se puede modificar optando por el número de mediciones (<em> por ejemplo, neuronas) que se muestran. El dendrograma ilustra las distancias de enlace en el eje y para cada una de las neuronas, identificados por su índice de fila en el eje x.
      NOTA: Las salidas de "vinculación" y "dendrograma 'no definen el número óptimo de las agrupaciones. La salida del '' no KMeans asignar mediciones de racimos, pero no prueba si estos grupos son óptimas. comparaciones estadísticas separadas y verificación de la agrupación óptima se pueden realizar (véase más adelante).

    5. Verificación de Clustering

    Nota: Como se ha indicado anteriormente, el propio análisis de conglomerados no proporciona directamente una evaluación estadística de si los grupos ilustrados en el dendrograma de clúster son únicos y representativa de la muestra. Los métodos para la verificación de las agrupaciones de la dendrograma se han propuesto 15, sin embargo, estos no proporcionan una verificación estadística de la agrupación óptima. Hay múltiplesples métodos para la verificación de la agrupación óptima.

    1. Método 1: Evaluación de la agrupación:
      1. Utilice la función '' evalclusters especificar el método utilizado para el cálculo de las agrupaciones, tales como 'KMeans' o 'vinculación'. A la salida del modelo de mezcla gaussiana también puede evaluarse (véase el paso 5.2 a continuación, ver Código Suplementario del archivo de código de ejemplo).
      2. Especificar el criterio de evaluación de una serie de opciones (por ejemplo, 'CalinskiHarabasz' - para las descripciones de las opciones de criterio, consulte el menú de Ayuda, en busca de "evalclusters").
      3. Especificar un rango de números de racimo óptimas para poner a prueba (por ejemplo, [1: 6] para probar si 1, 2, 3, 4, 5, o 6 grupos son óptimo).
        Nota: La salida del 'evalclusters' es un número óptimo de las agrupaciones dado el algoritmo de agrupamiento y el criterio especificado.
    2. Método 2: Gaussian modelo de mezcla de la agrupación:
      NOTA: mezcla gaussiana modelo de clústeres Algorithms (MMG) asume que las observaciones para cada variable provienen de una mezcla de distribuciones gaussianas que definen cada supuesto grupo, cada uno con su propia media y covarianza. El MMG a continuación, utiliza un algoritmo de maximización de la expectativa para asignar probabilidades a posteriori de cada medición, lo que indica la probabilidad de pertenecer a un grupo específico 16.
      1. Implementar un MMG usando la función 'fitgmdist' introduciendo el número de putativo de clusters observables en los datos. Por otra parte, para evitar una asignación a priori del número de grupos, utilizar el análisis de componentes principales (PCA) con una serie de diferentes números de racimo óptimas utilizando los pasos descritos aquí (ver Código Suplementario del archivo de código de ejemplo).
      2. Utilice la función de PCA en la matriz de datos original y guardar las principales puntuaciones de los componentes como una salida.
      3. En un bucle a partir de 1 y pasando por algún número de agrupaciones óptimas putativos, usar THfunción e 'fitgmdist' en las principales puntuaciones de los componentes y generar microorganismos modificados genéticamente para cada número de agrupaciones óptimas putativos.
      4. Evaluar cada GMM mediante el examen de la probabilidad negativa de registro, el criterio de información de Akaike y el criterio de información de Bayes. El MMG con los criterios más bajas es óptima.
      5. Si se desea, probar si los valores medios para cada grupo son significativamente diferentes cuando el número de grupos es óptima (medios de cada grupo se almacenan en la salida "mu" de cada GMM).

    6. Análisis estadístico de datos en clúster

    1. Una vez que el número óptimo de las agrupaciones se determina utilizando la agrupación jerárquica y evaluado, volver a los datos originales, las neuronas separadas en grupos, y determinar qué parámetros morfológicos contribuyen a la agrupación de neuronas en clases únicas.
    2. Clasificar los datos métricos morfológicas originales, que las neuronas se agrupan de acuerdo a la asignación de clúster. Para examinar las relaciones entre los datos morfológicos través de las neuronas (para todas las neuronas o de neuronas separadas en grupos), realizar la regresión lineal se ajusta a 2 y 3 vías comparaciones de observaciones morfológicas métricas. Estos ataques pueden estimarse utilizando la función de "ajuste" y se evaluaron usando la función 'fitlm' en el que la bondad de ajuste incluye salidas R 2 y P valores para ajustes de regresión.
    3. Para examinar las relaciones estadísticas entre las neuronas en cada clúster, utilice no paramétrica de dos muestras (Wilcoxon la suma de rangos) o múltiple de muestra pruebas de comparaciones (ANOVA), dependiendo del número de grupos. Es importante destacar que, el uso de múltiples muestra ANOVAs asegura que los valores de p son corregidos para comparaciones múltiples.

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Representative Results

Hemos demostrado previamente que las reconstrucciones de gran escala de las neuronas dentro de una población selectiva es factible la inyección siguiente de virus de la rabia modificado en el dLGN 5. Recientemente, se utilizó el mismo tejido para reconstruir 160 neuronas en el sector visual de la TRN (Bragg et al, en opinión;. Figura 2A-B) siguiendo los pasos metodológicos detallados descritos anteriormente. En el estudio TRN, tres grupos particulares de neuronas TRN fueron identificados en base a análisis independiente grupo de 10 parámetros morfológicos: área del cuerpo celular, redondez cuerpo celular, medial-lateral posición con respecto al centro de la TRN, posición dorsal-ventral dentro de la TRN , número de árboles dendríticas, la distancia promedio dendríticas a los nodos, la duración media de y dendritas de orden superior, el ángulo promedio de 1 er orden dendritas, ángulo de fase media de la arborización dendrítica total y la desviación angular de la deTal arborización dendrítica. Neuronas TRN fueron distribuidos de forma equivalente entre estos tres grupos (Figura 2C). comparaciones estadísticas separadas de los 10 parámetros morfológicos través de las neuronas en los tres grupos produjeron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos para todos menos dos de los parámetros morfológicos incluidas en el análisis clúster original. Por lo tanto, basado en el dendrograma árbol jerárquico generado a partir del análisis de agrupamiento (Figura 2C) y las comparaciones estadísticas separadas de métricas morfológicas a través de las agrupaciones, las neuronas TRN se clasifican en tres grupos únicos.

En este estudio, hemos querido específicamente para aplicar métodos estadísticos para evaluar por separado las agrupaciones determinado con un análisis de conglomerados. Se evaluó el conjunto de datos TRN del estudio antes de determinar si los tres grupos observados fueron óptima. análisis de clúster adicional por separado, es decir, PCA y GMM clustering, se llevaron a cabo para verificar los métodos de agrupamiento anteriores (Figura 1). Tres principales resultados verifican por separado el análisis de agrupamiento previo. En primer lugar, cuando se evaluó el método de análisis de conglomerados original utilizando la función '' evalclusters especificando la función de "vinculación" para generar grupos, el número óptimo de las agrupaciones fue de 3, igualando la conclusión original basado en el dendrograma árbol jerárquico (Figura 2C). En segundo lugar, el PCA se realizó en la matriz de datos original de 10 indicadores morfológicos de 160 neuronas TRN como un medio alternativo de agrupar las neuronas basados ​​en las contribuciones de las métricas morfológicas. Tres MMG se generaron, suponiendo neuronas TRN se agruparon en 1, 2, o 3 grupos únicos. El logaritmo de verosimilitud negativa (LLN) y el criterio de información de Akaike (AIC) produjo el más bajo, y por lo tanto más informativo, los valores y ambos valores fueron óptimos cuando el GMM utiliza para describir grupos de 3 TRN datos morfológicos (Figure 3). En tercer lugar, el basado en la agrupación GMM se evaluó por separado utilizando la función '' evalclusters y el número óptimo de las agrupaciones era 3. De este modo observaciones del dendrograma árbol jerárquico, las comparaciones estadísticas de métricas morfológicas a través de las neuronas separadas en los tres grupos, PCA y GMM- basado en la agrupación, y las evaluaciones independientes de cada método de agrupación (vinculación y GMM), todos dieron el mismo resultado que las neuronas TRN se separan de forma óptima en 3 grupos partir de los 10 indicadores morfológicos utilizados.

Figura 1
Figura 1: Formato de datos. Ejemplo de matriz de datos con n filas que corresponden al número de neuronas y M = 5 columnas que corresponden al número total de variables independientes para incluir en el análisis de conglomerados (no se incluyen las cabeceras de la matriz de datos).


Figura 2: La agrupación independiente de 160 TRN neuronas. A. Izquierdo, fotografía de la sección coronal a través de la única dLGN de un animal, se tiñeron para la actividad de la citocromo oxidasa para visualizar capas dlgn y en contra de las buenas prácticas agrarias para visualizar la inyección de virus. La flecha indica las regiones densas de las neuronas TRN marcadas de forma retrógrada. Orientación sección sigue la brújula dorsal-ventral / medio-lateral (DV / ml) a continuación y barra de escala representa 500 micras para todos los paneles en A. Segundo por la izquierda, contorno contornos de dLGN (rojo) y TRN (marrón) para todas las secciones que contienen el virus de la inyección (contorno negro). estrellas amarillas indican los centros de la zona de inyección. Orientación y escala bares como en A. Tercero desde la izquierda, renders en 3D de contornos y lugar de la inyección, la orientación y las barras de escala como en una. Derecha, mapas de los lugares de reconstruyeron Neuronas TRN, un código de colores de acuerdo a la asignación de grupo (C) dentro de un mismo contorno TRN agregada (marrón). Orientación y escala bares como en A. B. Izquierda, contornos agregados de TRN (negro) y dLGN (gris) con 5 neuronas TRN reconstruidas de colores cálidos a fríos en función de su posición medial-lateral dentro de la TRN. Orientación de acuerdo con la brújula DV / ml en una, barra de escala representa 500 micras. Derecho, las fotografías de las mismas neuronas TRN con 5 barras de escala de color a juego que representa a 100 micras. C. dendrograma árbol jerárquico siguiente análisis de conglomerados que ilustra las distancias de enlace entre 160 neuronas TRN reconstruidos en base a 10 indicadores morfológicos independientes. Tres grupos ilustrados en azul, verde y rojo. Todas las partes de esta figura son una adaptación de las cifras incluidas en Bragg et al. (en revisión).lacio "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Evaluación de clústeres. Parcela de dos diferentes valores criterio, logaritmo de verosimilitud negativa (LLN, rojo) y el criterio de información de Akaike (AIC, azul) generado a partir de tres microorganismos modificados genéticamente, suponiendo 1, 2, o 3 grupos. MMG con 3 grupos proporcionan los valores criterio más bajas.

Archivo suplementario Código: Código de ejemplo, escrito en un lenguaje compatible con Matlab, para llevar a cabo el análisis de conglomerados en una matriz de datos de ejemplo seguido de evaluación de los módulos usando PCA y GMM se acerca. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Los estudios neuroanatómicos han seguido siendo un pilar de la neurociencia y la reciente interés en conectómica y relaciones estructura-función ha renovado entusiasmo por la caracterización morfológica detallada de las poblaciones neuronales selectivas. Tradicionalmente, los estudios neuroanatómicos han basado en las clasificaciones cualitativas de las neuronas en clases morfológicamente distintos de neuronas definidas por neuroanatomistas expertos. Con los avances en las técnicas para la reconstrucción de las neuronas y la extracción de datos morfológicos, ahora es posible utilizar métodos de análisis de datos más sofisticados y cuantitativos para clasificar las clases neuronales morfológicamente distintos de una manera imparcial. En este estudio, los métodos paso a paso se describen por 1) marcar selectivamente cientos de neuronas individuales utilizando métodos de marcaje retrógrado mediada por virus; 2) la reconstrucción sistemáticamente cientos de neuronas individuales para formar una muestra amplia y por lo tanto representativa de las neuronas dentro de una población selectiva; y 3) la agrupación independiente analiza con evaluación estadística para determinar las agrupaciones óptimas de neuronas dentro de una población selectiva basada en métricas morfológicas. Estos métodos de análisis se verifican mediante la aplicación de diferentes métodos de agrupamiento a un conjunto de datos existente de las neuronas TRN y demostramos basan en tres métodos de evaluación independientes que las neuronas TRN se agrupan de manera óptima en tres subpoblaciones morfológicamente distintos.

Una ventaja importante de los protocolos descritos en este estudio es su flexibilidad. El virus de la rabia eliminado G-ha sido eficaz en la conducción de la expresión de EGFP en cientos de neuronas marcadas de forma retrógrada después de la inyección en una estructura objetivo. La misma cepa de virus de la rabia es igualmente eficaz en múltiples especies, incluyendo monos macacos 5, 9, hurones (Hasse y Briggs, en revisión), y roedores 7,"> 8. De acuerdo con ello, virus de la rabia modificado se puede utilizar para etiquetar selectivamente los patrones de arborización dendrítica completas de cualquier población de neuronas después de la inyección en una estructura objetivo. Se recomienda la tinción de anticuerpo contra GFP seguida por la reacción / peróxido de DAB, porque esto causa manchas permanentes de etiquetados neuronas y permite secciones de tejido a ser visualizadas con un microscopio sin la ayuda de microscopía de fluorescencia (que blanquea marcador fluorescente con una exposición más larga). sin embargo, métodos de tinción alternativos están disponibles y / o fluorescencia se pueden visualizar directamente si se desea. una ventaja de la medición de fluorescencia cruda es que diferentes virus de expresión de diferentes moléculas fluorescentes de conducción se pueden combinar, por ejemplo, para determinar si las neuronas se proyectan hacia varias estructuras cerebrales objetivo. Además, los pasos descritos anteriormente se pueden aplicar a todos los datos morfológicos disponibles (por ejemplo, los axones y dendritas) para permitir morfo cada vez más robustaclasificación lógica de las neuronas. También es importante tener en cuenta que las cantidades más pequeñas de virus de la rabia también se pueden inyectar con el fin de generar etiquetado sparser retrógrado, lo que podría ser ventajoso para las reconstrucciones de los axones, además de dendritas.

Una ventaja adicional de los métodos de análisis descritos en este estudio es que varios enfoques diferentes de agrupamiento se pueden utilizar y se comparan. En cada paso en el análisis de conglomerados, diferentes opciones están disponibles para calcular las distancias entre las neuronas en el espacio de parámetros, así como diferentes algoritmos para generar clusters. Además, varios métodos de evaluación están disponibles. Esto último es especialmente útil como medio para verificar agrupamiento óptima, como se indica en la sección de resultados representativos. Sin lugar a dudas, los algoritmos adicionales para la generación de racimos y de evaluación de la agrupación óptima estará disponible cuando el campo se mueve hacia adelante. En conjunto, estos métodos de análisis continuarán Improcinco enfoques cuantitativos en el campo de la neuroanatomía y mejorar la robustez de los resultados.

Existe un creciente interés en la automatización de las reconstrucciones neuronales PORQUE reconstrucciones de mano de la etiqueta neuronas individuales son mucho tiempo, requieren una formación y experiencia, y son todavía un tanto subjetiva. Debido a que las reconstrucciones automáticas neuronales basados en computadoras siguen siendo propenso a errores, neuroanatomical datos basados en la microscopía electrónica están siendo analizados por las personas (véase, por ejemplo, 17). Sin embargo, es probable que la reconstrucción neuronal automatizado estará disponible en el futuro cercano. reconstrucción neuronal automatizado requerirá aún más control en el extremo de análisis de datos, por lo que analiza la agrupación y los métodos de evaluación descritos aquí será aún más importante que el campo sigue avanzando tecnológicamente.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a los Dres. Ed Callaway y Marty Usrey para permitirnos usar el tejido preparado como parte de un estudio previo y Libby Fairless y Shiyuan Liu para obtener ayuda con reconstrucciones neuronales. Este trabajo fue financiado por el NIH (NEI: EY018683) y la Fundación de Whitehall.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SADΔG-EGFP E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten FHC UEPSGGSE1N2M Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II Drummod Scientific 3-000-204, 110V Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome Thermo Scientific
DAB Sigma Aldrich D5905-50TAB 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C Sigma Aldrich C2037-100MG
Catalase Sigma-Aldich C9322-5G
Rabbit anti-GFP Life Technologies/Thermo Fisher #A-11122  Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit Vector Laboratories #BA-1000 Secondary antibody
Neurolucida System  MicroBrightField Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer MicroBrightField Data export software
Microfire Camera  Optronics 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope Nikon Instruments Inc. Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab The MathWorks Inc.  Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel Microsoft Spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cajal, S. R. y Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. Maloine. (1911).
  2. Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
  3. Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
  4. Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
  5. Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
  6. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
  7. Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525, (5), 1273-1290 (2017).
  8. Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
  9. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
  10. Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
  11. Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
  14. Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
  15. Thorndike, R. L. Who belongs in the family? Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
  16. Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
  17. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).

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