Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni

Neuroscience

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Summary

Questo protocollo descrive ricostruzioni su larga scala di popolazioni neuronali selettivi, etichettati dopo l'infezione retrograda con esprimendo un virus della rabbia modificato marcatori fluorescenti, e le analisi di cluster indipendente, imparziale che consentono la caratterizzazione completa delle metriche morfologiche tra sottoclassi neuronali distinti.

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Bragg, E. M., Briggs, F. Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations. J. Vis. Exp. (120), e55133, doi:10.3791/55133 (2017).

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Abstract

Questo protocollo delinea le ricostruzioni su larga scala di neuroni in combinazione con l'uso di cluster indipendente e imparziale analisi per creare un'indagine completa delle caratteristiche morfologiche osservate in una popolazione neuronale selettiva. La combinazione di queste tecniche costituisce un nuovo approccio per la raccolta e l'analisi dei dati neuroanatomici. Insieme, queste tecniche consentono di larga scala, e quindi più completo, il campionamento delle popolazioni neuronali selettivi e stabilire metodi quantitativi per la descrizione imparziali classi neuronali morfologicamente unici all'interno di una popolazione.

Il protocollo descrive l'uso di virus della rabbia modificato per etichettare selettivamente i neuroni. G-cancellato atti virus della rabbia come tracciante retrogrado seguenti iniezione stereotassica in una struttura di destinazione cerebrale di interesse e serve come veicolo per l'erogazione e l'espressione di EGFP in neuroni. Un gran numero di neuroni sono infettate con questotecnica e di esprimere la GFP per tutta la loro dendriti, la produzione di "Golgi-like" riempimenti completi dei singoli neuroni. Di conseguenza, il metodo di analisi retrograda virus-mediata migliora le tecniche di tracciamento retrogrado tradizionali a base di coloranti con la produzione di riempimenti intracellulari completi.

I singoli neuroni ben isolate che abbracciano tutte le regioni della zona del cervello in fase di studio sono selezionati per la ricostruzione al fine di ottenere un campione rappresentativo di neuroni. Il protocollo delinea le procedure per ricostruire corpi cellulari e completare i modelli arborizzazione dendritiche di neuroni marcati che abbracciano molteplici sezioni di tessuto. dati morfologici, comprese le posizioni di ogni neurone all'interno della struttura del cervello, vengono estratti per ulteriori analisi. funzioni di programmazione standard sono stati utilizzati per eseguire gruppo indipendente analisi e valutazioni cluster basato su metriche morfologiche. Per verificare l'utilità di queste analisi, valutazione statistica di un perfo cluster analysisconfermate su 160 neuroni ricostruite nel nucleo reticolare del talamo del talamo (TRN) del macaco è stato fatto. Sia la cluster analysis originale e le valutazioni statistiche svolte qui indicano che i neuroni TRN sono separati in tre sottopopolazioni, ognuno con caratteristiche morfologiche uniche.

Introduction

Neuroanatomy è uno dei fondamenti delle neuroscienze 1 e recente interesse "connectomics" ha rinnovato entusiasmo per la comprensione della diversità morfologica delle popolazioni neuronali e le connessioni tra i neuroni specifici 2. Metodi per l'etichettatura e neuroni ricostruendo hanno notevolmente migliorato con le recenti innovazioni, tra cui genetica e virus-mediata circuito di tracciamento approcci 3, 4, consentendo studi morfologici più complete delle popolazioni neuronali 5. Oltre a miglioramenti nella etichettatura singoli neuroni, sono anche emerse tecniche di analisi quantitativa dei dati che consentono di classificazione indipendente e imparziale dei neuroni in sottopopolazioni distinte in base a dati morfologici 5, 6. Queste tecniche imparziali sono un miglioramento su più traditional metodi di classificazione qualitativi che sono stati lo standard nel settore per più di un secolo. L'obiettivo di questo studio è quello di delineare, passo dopo passo, la combinazione di etichettatura virus-mediata di neuroni all'interno di una popolazione selettivo, ricostruzioni su larga scala di un campione globale di questi neuroni, e l'analisi quantitativa dei dati basata su cluster indipendente con valutazione statistica. Grazie alla combinazione di questi metodi, delineiamo un nuovo approccio verso la raccolta e l'analisi dei dati neuroanatomici da facilitare la campionatura completa e imparziale la classificazione dei tipi di neuroni morfologicamente unici all'interno di una popolazione neuronale selettiva.

Come esempio di questi metodi, descriviamo la nostra analisi di una vasta popolazione di neuroni all'interno di un singolo settore del nucleo reticolare del talamo (TRN) del macaco. Questi dati provengono da uno studio preliminare 7. Metodi per l'etichettatura selettivamente i neuroni TRN proiettano al Latera dorsalil genicolato nucleo del talamo (dLGN) con iniezione chirurgica del virus della rabbia modificato codifica EGFP 4, 8 (vedi tabella di specifici materiali / attrezzature, fila 2) sono delineati. Questo virus della rabbia modificato manca il gene che codifica una proteina essenziale cappotto, eliminando movimento trans-sinaptica del virus. Una volta che il virus entra terminali degli assoni nel sito di iniezione, si comporta come un tracciante tradizionale retrograda con l'importante vantaggio di guidare espressione EGFP durante l'intero arborization dendritica dei neuroni infettati 5, 9, 10. Di conseguenza, questo virus della rabbia G-cancellato può essere utilizzato per infettare selettivamente etichettare qualsiasi popolazione neuronale dopo l'iniezione e trasporto retrogrado.

Per eseguire un'analisi completa di una specifica popolazione neuronale, è importante campionareun'ampia distribuzione dei neuroni all'interno della popolazione. Poiché la tecnica di etichettatura virus-mediata produce completa intracellulare, "Golgi-like" riempie di molti neuroni con assoni nel sito di iniezione virus, è possibile ricostruire un campione molto ampio di neuroni nella misura massima di una struttura cerebrale. Inoltre, poiché il virus della rabbia modificato è così efficace a infettare ed etichettatura gran numero di neuroni, è possibile ricostruire centinaia di neuroni per animale. Procedure di campionamento 160 neuroni tutto il settore visivo del TRN 11 per generare un campione completo di dLGN sporgenti neuroni TRN sono delineati. Il processo di ricostruzione neuroni individuali utilizzando un sistema di ricostruzione neurone compreso un microscopio, fotocamera e software di ricostruzione è descritto. Anche descritto sono metodi per determinare le posizioni di singoli neuroni all'interno di una struttura del cervello (in questo caso all'interno del TRN) e per verificare il virus iniezione site dal volume e all'interno di una struttura (in questo caso all'interno del dLGN) utilizzando ricostruzioni contorno volumetriche. I passaggi per esportare i dati morfologici ed eseguire gruppo indipendente analisi basate su metriche morfologiche misurati per ogni neurone sono delineati. Ci sono limitazioni per metodi di clustering e ci sono anche una varietà di diversi algoritmi di clustering disponibili. Di conseguenza, sono descritte le opzioni ei vantaggi di alcuni degli algoritmi più comunemente usato. L'analisi dei cluster non prevede la verifica statistica della unicità dei cluster. Pertanto, passaggi aggiuntivi sono delineati verificare raggruppamento ottimale nonché le relazioni tra i dati morfologici all'interno e tra cluster. Metodi statistici per la valutazione cluster per il set di dati TRN per confermare che i neuroni TRN sono raggruppati in tre gruppi unici basato su 10 parametri morfologici indipendenti sono descritte.

Così, delineando passi per selettivamente l'etichettatura, Ricostruendo, e l'analisi dei dati morfologici da una specifica popolazione neuronale, si descrivono i metodi per quantificare le differenze morfologiche tra i neuroni all'interno di una popolazione. risultati precedenti di tipi neuronali distinti all'interno del settore visivo del TRN scimmia macaco sono confermate con separati metodi di valutazione statistica. Insieme, ci auguriamo che queste tecniche saranno ampiamente applicabile a set di dati neuroanatomiche e aiutare a stabilire la classificazione quantitativa della diversità delle popolazioni neuronali attraverso il cervello.

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Protocol

Nota: Il tessuto esaminato in questo studio è stato preparato come parte di uno studio separato 5. Pertanto, tutti i metodi sperimentali che prevedono l'uso di animali sono stati descritti in dettaglio nella sezione Metodi sperimentali di Briggs et al. (2016). Tutte le procedure che coinvolgono gli animali condotti come parte dello studio preliminare sono stati approvati dai comitati cura degli animali e uso istituzionale. sono descritti brevemente di seguito nelle sezioni 1 La procedura per l'iniezione del virus nel dLGN e l'elaborazione istologica del tessuto cerebrale - 2.

1. Stereotassica Iniezione

  1. Eseguire tutte le procedure chirurgiche in un ambiente sterile usando tecniche asettiche. Steam-sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici di metallo, garze e materiale drappeggio in autoclave. Sterilizzare tutti materiali che potrebbero essere danneggiati da vapore con la sterilizzazione chimica (per esempio ossido di etilene).
  2. Indurre e mantenere l'anestesia in base al animale- e prequisiti specifici ROTOCOLLO.
    1. Per l'iniezione di virus nelle scimmie, indurre l'anestesia con ketamina (10 mg / kg) e mantenere gli animali in anestesia chirurgica complete con isoflurano (1-3% inalato in ossigeno) monitoraggio scaduto CO 2, ECG, frequenza respiratoria, e la temperatura costantemente e periodicamente verifica per il tono della mascella per garantire la corretta profondità dell'anestesia.
  3. Posizionare animale in un telaio stereotassico per stabilizzare la posizione della testa e per consentire l'uso di coordinate stereotassica per localizzare la struttura di iniezione di interesse (ad es dLGN). Se la misurazione risposte visive, posto collirio (1% occhio atropina scende se la dilatazione della pupilla è desiderata, altrimenti collirio soluzione salina) e poi le lenti a contatto in entrambi gli occhi per prevenire la secchezza. Se non misurare le risposte visive, posizionare pomata oftalmica negli occhi.
  4. Effettuare una incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto e ritrarre la pelle ei muscoli.
  5. Secondo stereotassica coordinate per la struttura di interesse (dLGN) in uno hemisphere, fare una piccola craniotomia.
  6. Abbassare gradualmente un elettrodo di registrazione (ad esempio tungsteno o platino / iridio elettrodo (vedi Tabella di specifici materiali / attrezzature, riga 3) fissata ad una micromanipolatore che è posizionato manualmente) attraverso la craniotomia nel cervello. Bassa impedenza (<1 MW) e leggermente più spesso (~ 250 micron di diametro) elettrodi possono essere utilizzati per penetrare la dura, se desiderato.
  7. Registrare la posizione del manipolatore in superficie corticale e nel punto in cui vengono misurate risposte visive. risposte visive sono udibili, tempo-locked risposte neuronali alla luce balenò negli occhi con un oftalmoscopio o piccolo LED / torcia elettrica.
  8. Determinare la posizione e lo spessore del dLGN notando posizioni manipolatore all'inizio, metà e fine risposte visive e sottraendo la posizione della superficie corticale da questi valori. Registrare la profondità per ciascun sito di iniezione progettato all'interno del dLGN.
    NOTA: Operazi simileres possono essere usate per localizzare strutture non visivi utilizzando appropriati stimoli sensoriali. Inoltre, i sistemi di registrazione / iniezione accoppiato può essere utilizzato anche per indirizzare le strutture cerebrali piccoli.
  9. Una volta che sono noti località iniezione ottimali, rimuovere l'elettrodo di registrazione e inserire un pipetta di iniezione (pipetta di vetro o siringa) nella stessa posizione stereotassica ed inferiore alla profondità appropriata per ogni iniezione, iniziando con il sito di iniezione più profonda e procedendo alla superficiale, in attesa di almeno 1 minuto dopo l'iniezione prima di cambiare la posizione degli elettrodi. pipette di vetro con diametro esterno di ~ 50 micron possono ridurre il riflusso del virus rispetto alle punte siringa (~ 200 micron di diametro).
  10. L'utilizzo di un sistema di iniezione (vedi Tabella di materiali specifici / Equipmen t, fila 4), picospritzer o pompa a siringa, iniettare piccoli volumi (1 - 5 ml, fare riferimento alle istruzioni del produttore per le procedure di iniezione) del virus della rabbia modificato su più (3 - 10) Depthsad una velocità di ~ 100 nL / min all'interno della struttura di destinazione (dLGN). Nota: penetrazioni di iniezione separati possono essere realizzati in strutture bersaglio più grandi (ad esempio scimmia dLGN). Regolare il volume di iniezione totale in base alle dimensioni struttura obiettivo.
  11. Pausa almeno 5 minuti prima di ritrarre la pipetta di iniezione. Quando la pipetta di iniezione viene rimosso, riempire la craniotomia con materiale protettivo (pezzo di osso colla in luogo, applicare la cera osso o Gelfoam), poi suturare il muscolo e pelle di nuovo insieme.
  12. Somministrare analgesici (ad esempio, ketoprofene) e gli antibiotici prima della fine di un intervento chirurgico e monitorare animale continuamente fino a quando animale è ambulatoriale.
  13. Per almeno 3 giorni e fino a 10 giorni dopo l'intervento, il monitoraggio degli animali quotidianamente per garantire suture siano pulite, asciutte, e intatta e animale non mostra segni di dolore o fastidio. Somministrare analgesici e antibiotici ogni giorno, come richiesto. Inizia edilizia sociale di animali post-chirurgica dopo animale ha pienamente recuperato da un intervento chirurgico.
  14. </ Ol>

    2. Tissue raccolta, sezionamento e colorazione

    1. Consentire 7 - 14 giorni per il trasporto retrogrado di virus, quindi euthanize l'animale per overdose di soluzione di eutanasia (per esempio Euthasol) e profumato l'animale transcardially con 0,1 M tampone fosfato salino, 4% paraformaldeide, quindi paraformaldeide 4% con il 10% di saccarosio.
    2. Rimuovere il cervello (vedi 12 per i passaggi analoghi in un modello di roditore) e il luogo in 20 - 30% di saccarosio con paraformaldeide al 4% in 0.1 M tampone fosfato e conservare in frigorifero per 1 - 2 giorni.
    3. Quando il cervello ha toccato il fondo del contenitore, rimuoverlo e tagliare il tessuto in blocchi contenenti la regione del cervello con neuroni retrogrado etichettati (es corteccia visiva) e la struttura porta di iniezione (es dLGN). Tagliare gli stessi blocchi di tessuto dall'emisfero non per iniezione - queste serviranno come sezioni di controllo. Per ottenere risultati ottimali, iniziare le procedure istologiche immediately sul tessuto appena sezionato.
    4. Sezione di tessuto coronale con uno spessore di 50 micron per sezione con un microtomo di congelamento (vedi tabella di specifici materiali / attrezzature, riga 5).
    5. Macchiare tutte le sezioni per l'attività del citocromo ossidasi (vedi Tabella di materiali specifici / Attrezzature, righe 5 - 8) Per visualizzare strati corticali e strutture sottocorticali 13. Nota: Le sezioni possono essere memorizzati durante la notte in un frigorifero in risciacquo finale dopo la macchia citocromo ossidasi.
    6. Etichettare tutte le sezioni con un anticorpo primario contro la GFP (1: 1000 diluizione, ~ 12 ore di incubazione, si veda la Tabella di specifici materiali / attrezzature, fila 9) seguito da un anticorpo secondario che corrisponde al host primario e contrassegnati con biotina 5 (1: 500 diluizione 2 - 4 h di incubazione, vedi Tabella di specifici materiali / attrezzature, riga 10). Si raccomanda di incubare le sezioni in una notte anticorpo secondario.
    7. Sezioni Label con un complesso avidina / biotina poi reagiscono con DAB e perossido di macchiare in modo permanente tutti i neuroni marcati 5.
    8. Montare le sezioni su vetrini Subbed e lasciare asciugare per una notte.
    9. Sezioni sgrassare utilizzando una serie di alcol e xilene risciacqui quindi coprire slittamento 14.

    3. Ricostruzione neuronale

    NOTA: Tutte le ricostruzioni di esperimenti originali sono stati realizzati utilizzando un sistema di ricostruzione dei neuroni costituito da un microscopio (vedi tabella di specifici materiali / attrezzature, riga 14), fotocamera collegata (vedi Tabella di specifici materiali / attrezzature, riga 13), e il software di ricostruzione pacchetto (vedi tabella di materiali specifici / Attrezzature, righe 11 - 12). Software-assistita ricostruzione neuronale permette la visualizzazione dei vetrini di tessuto sovrapposti con disegni basati su computer di processi neuronali. È importante sottolineare che il software digitalizza ricostruzione morfologicaDati zione in tre dimensioni, che permette l'estrazione di informazioni morfologiche specifiche posizioni. Il programma di estrazione di dati associati (vedi Tabella di specifici materiali / attrezzature, riga 12) consente l'estrazione di un ricco set di dati morfologici di ogni ricostruzione salvato.

    1. Mettere una diapositiva nel supporto vetrino da microscopio e concentrarsi su una singola sezione di interesse utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (ad es 2X o 10X). Assicurarsi che l'immagine della telecamera è visibile nella vista software posizionando correttamente l'otturatore della fotocamera.
    2. Scegliere neuroni marcati all'interno della struttura cerebrale di interesse (ad es TRN) che sono ragionevolmente isolato per ricostruire inequivocabilmente tanto del arborization dendritica possibile. Preferibilmente scegliere neuroni se il corpo cellulare è completamente all'interno di una singola sezione al fine di catturare la più grande estensione di ogni corpo cellulare e stimare con precisione la sua area e rotondità. Utilizzare 10X obiettivo microscopio per identificare cellule Body nella sezione casa.
    3. Una volta che un ben colorato, ben isolato-neurone viene identificato, aggiungere la sezione "casa" che contiene il corpo cellulare alla sezione Manager facendo clic sul pulsante "Nuova sezione". Inserire il numero di sezioni da includere (raccomandare 2 - 3 sezioni per cominciare). Assegnare un spessore della sezione di 50 micron quando richiesto (vedere il punto 2.3).
    4. Tracciare i contorni delle strutture cerebrali pertinenti nella sezione casa contenente il corpo cellulare. Utilizzare il 2X obiettivo / ingrandimento per il contorno tracciato.
      1. In primo luogo, selezionare "Contorno" dal menu a discesa sulla barra degli strumenti superiore e quindi selezionare il tipo di contorno dal menu a discesa (ad esempio "LGN" o "TRN").
      2. Tracciare contorni della struttura di destinazione (es TRN) così come le strutture adiacenti, se desiderato, facendo clic sui punti lungo il contorno con il mouse come strumento tiraggio.
      3. Selezionare "Chiudi Contour" facendo clic destro del mouse e selezionando questa opzionedal menu per completare e racchiudere ogni contorno tracciato.
    5. Posizionare un marcatore al centro della struttura di destinazione facendo clic sul simbolo marcatore desiderato sulla barra degli strumenti a destra e poi cliccando sul punto desiderato nella ricostruzione per posizionare il marcatore in quella posizione. Utilizzare lo stesso tipo di marcatore per contrassegnare il centro della struttura bersaglio in tutte le ricostruzioni.
    6. Una volta che i contorni sono completi, tracciare il contorno del corpo cellulare utilizzando 40 - 60X obiettivi / ingrandimento. Per fare ciò, prima selezionare "Neuron" dal menu a discesa sulla barra degli strumenti superiore e quindi selezionare la struttura neurone per tracciare, in questo caso "Cell Corpo". Successivo tracciare il corpo cellulare come in 3.4.
    7. Posizionare un marcatore stile diverso al centro del corpo cellulare, seguendo la procedura descritta in 3.5.
    8. Tracciare tutti i dendriti che iniziano al corpo cellulare.
      1. In primo luogo, selezionare "Dendrite" dal menu a discesa. Poi tracciare ogni dendrite a partire dalla CdA cellularey e utilizzando il mouse come strumento tiraggio. Assicurarsi di regolare la profondità Z tutto il tracciato per catturare con precisione l'angolo e la direzione del dendrite.
      2. Posizionare un nodo in ogni nodo lungo il dendrite facendo clic destro del mouse e selezionando "biforcano nodo" o "triforcazione nodo" dal menu a discesa. Utilizzare 40 - 60X obiettivo / ingrandimento per tutte le ricostruzioni dendriti.
      3. Alla fine di ogni dendrite, fare clic con il mouse e selezionare "Fine" dal menu a discesa.
    9. Identificare terminazioni dendritiche che possono continuare nella sezione adiacente e portare questi a fuoco al appropriata z approfondita l'immagine al microscopio a. Includere i principali punti di riferimento nelle vicinanze, come i vasi sanguigni o facilmente riconoscibili i modelli dendriti o fasci l'immagine al microscopio a.
      1. Ridurre l'ingrandimento di 20X o 10X sul microscopio (scegliere l'ingrandimento che permette la visualizzazione più grande punto di riferimento), e prendereuna foto del immagine al microscopio utilizzando una macchina fotografica digitale (ad esempio telefono cellulare, tablet) tenuto in mano allo schermo del computer.
    10. Spostare alla sezione adiacente della diapositiva e allineare i contorni della sezione precedentemente tracciato con i confini del dLGN e TRN nella nuova sezione.
    11. Ritorno il campo di vista per la zona del corpo cellulare (basato su contorni e grandi punti di riferimento) e portare l'ingrandimento indietro fino a 10 - 20X.
    12. Utilizzare la foto delle terminazioni dendrite dalla sezione precedentemente tracciata per aiutare ad allineare le terminazioni con l'inizio dei dendriti nella nuova sezione.
      1. Per ruotare il tracciato e spostarlo per allineare dendriti, utilizzare lo strumento freccia per selezionare la ricostruzione, tasto destro del mouse e selezionare "Sposta" dal menu a discesa.
      2. In alternativa, utilizzare lo strumento "Match" per abbinare terminazioni dendritiche a inizi. Selezionare lo strumento Partita dalla barra degli strumenti superiore e, quando richiesto, fare clic sul finalenella ricostruzione e il corrispondente punto di prosecuzione nell'immagine. Ripetere per 3 o più finali.
    13. Una volta che il tracciato della sezione precedente è allineato con i dendriti nella nuova sezione, assicurarsi che la nuova sezione corrispondente viene selezionata nel gestore sezione facendo clic sulla sezione corrente. Oppure, aggiungere una nuova sezione alla sezione Manager, come sopra descritto in 3.3, regolando la profondità Z e la posizione di ogni sezione nuova rispetto alla sezione d'origine e impostando ogni spessore di sezione 50 mm (vedi punto 2.3).
    14. Aumentare l'ingrandimento di 40 - 60X e tracciare le continuazioni dendrite cliccando col tasto destro del mouse sulla fine del dendrite dalla ricostruzione e selezionando "Aggiungi a porre fine" dal menu a discesa, quindi tracciare il dendrite utilizzando il mouse come disegnare strumento. Seguire richiesta di specificare se continuazione è nella nuova sezione.
    15. Seguire dendriti attraverso almeno 3 sezioni adiacenti (uno su ciascun lato della sezione di casa) a seguito di passaggi 3,8-3,15. Aggiungere alla ricostruzione fino almeno 3 sezioni totali sono tracciati per il neurone o finché i dendriti non possono più essere seguite o trovato. Tracciare i contorni delle sezioni limitrofe seguito i passaggi precedenti, se lo si desidera.

    4. indipendente Clustering

    Nota: Gruppo indipendente di analisi consentono analisi imparziali di grandi insiemi di dati, multi-dimensionali che altrimenti potrebbero essere difficili da visualizzare e, soprattutto, fornire una valutazione quantitativa della diversità morfologica. Una piattaforma di programmazione matriciale è molto utile per l'analisi di set di dati multi-dimensionali e consente sofisticate manipolazioni di dati e analisi statistiche. Le funzioni elencate nei punti 4 - 6 sono definiti nella piattaforma di programmazione elencati nella tabella di specifici materiali / attrezzature, riga 15.

    1. Estrarre i dati morfologici da ogni singolo ricostruzione neuronale utilizzando un extprogramma raction associata al sistema di ricostruzione dei neuroni (vedi tabella di materiali specifici / Attrezzature, righe 11 - 12).
      1. In primo luogo, scegliere i dati morfologici desiderati per ogni ricostruzione tra cui: le informazioni di contorno, le informazioni marcatore, dati morfologici del corpo cellulare e arborizzazione dendritica, ecc.
      2. Dal menu a discesa Modifica nella barra degli strumenti superiore, selezionare "Seleziona tutti gli oggetti". Quindi selezionare "Analisi struttura ramificata" dal menu a discesa Analysis nella barra degli strumenti in alto e cliccare sulla scheda e selezionare le opzioni di analisi desiderate in ogni scheda.
      3. Estrarre tutti i dati desiderati facendo clic sul pulsante "OK" nella finestra di analisi e salvare in un formato foglio di calcolo facendo clic destro sulle finestre di uscita e selezionando "Esporta in Excel".
    2. Compilare un foglio di calcolo Master (vedi Tabella di specifici materiali / attrezzature, riga 16), in cui ogni variabile morfologica / meTric è rappresentata da una singola osservazione numerica per neurone. In questo foglio di master, tenere un registro di identificatore riga per ogni neurone.
    3. Verificare che tutte le variabili incluse nel cluster analysis (es metriche morfologiche) sono indipendenti l'uno dall'altro. Ad esempio, il numero di nodi sarà correlata con il numero di rami in un arborization dendritica e assonale. Di conseguenza, solo una di queste due variabili dovrebbero essere inclusi in un cluster analysis.
    4. Assicurarsi che ogni misura contiene una osservazione per tutte le variabili, vale a dire ogni neurone (di misura), deve avere un punto di dati (osservazione) corrispondente ad ogni metrica morfologica (variabile). Se le osservazioni di una particolare variabile (per esempio, lunghezza assone) sono carenti per un sottoinsieme di neuroni, questa variabile (lunghezza assone) non può essere incluso nell'analisi cluster.
    5. Organizzare i dati sul foglio di calcolo master in una singola matrice in cui ogni riga rappresenta un neurone e each colonna contiene dati numerici per ciascuna metrica morfologica (Figura 1). Ad esempio, un insieme di dati di cui 100 neuroni per i quali vi sono osservazioni per 5 variabili indipendenti sarebbe rappresentato da una matrice 100 x 5 (riga per colonna). Non è necessario includere qualsiasi identificazione di ogni neurone all'interno della matrice - l'indice di riga servirà come identificatore univoco di ogni neurone. Ci dovrebbe essere anche senza lacune o s "nan" nella matrice. Salvare la matrice come una singola variabile (ad esempio, dati = [100 x 5 matrice]; vedi file di codice supplementare per il codice di esempio).
    6. Scegliere un algoritmo per calcolare le distanze tra i punti che rappresentano singoli neuroni in uno spazio n-dimensionale, dove n è definito dal numero di variabili. La funzione 'pdist' permette flessibilità nel calcolo distanze tra neuroni. Il calcolo della distanza di default è la distanza euclidea ed è stato utilizzato in precedenza per le analisi simili di morphologica neuronalel dati 5, 6.
    7. Con il tra-neurone allontana uscita della funzione 'pdist', utilizzare la funzione di 'linkage' per formare gruppi. Anche in questo caso, sono disponibili diverse opzioni di clustering. Il metodo di Ward e la distanza baricentro hanno dato risultati simili nelle analisi di set di dati morfologici 5, 6.
    8. Se lo si desidera, utilizzare la funzione 'Kmeans' come un approccio di clustering alternativa al 'pdist' e funzioni 'linkage'. '' Kmeans comuni utilizza squadrati distanza euclidea per calcolare distanze tra neuroni e quindi la distanza baricentro per assegnare cluster.
    9. Per visualizzare un albero di cluster gerarchica, utilizzare la funzione 'dendrogramma' sull'uscita dell'operazione 'linkage'. Questa funzione ha un valore predefinito che limita la visualizzazione a 30 misurazioni, ma può essere sovrascritto specificando il numero di misure (<em> ad esempio i neuroni) visualizzati. Il dendrogramma illustra le distanze di collegamento sul l'asse y per ciascuno dei neuroni, identificato dal loro indice di riga sul asse x.
      NOTA: Le uscite di 'linkage' e 'dendrogramma' non definiscono il numero ottimale di cluster. L'uscita di '' Kmeans non assegna misure ai cluster, ma non verifica se questi gruppi sono ottimali. confronti statistici separate e la verifica di raggruppamento ottimale possono essere eseguiti (vedi sotto).

    5. Verifica dei Clustering

    Nota: Come indicato in precedenza, l'analisi cluster stesso non fornisce direttamente una valutazione statistica dei se i cluster illustrati nel dendrogramma cluster siano unici e rappresentativo del campione. I metodi per la verifica cluster dal dendrogramma sono stati proposti 15, tuttavia questi non forniscono verifica statistica di raggruppamento ottimale. Ci sono multimetodi PLE per verificare il clustering ottimale.

    1. Metodo 1: Valutare il clustering:
      1. Utilizzare la funzione '' evalclusters specificando il metodo di calcolo cluster, come ad esempio 'Kmeans' o 'legame'. Una gaussiana il risultato del modello miscela può anche essere valutata (vedi punto 5.2; vedere file di codice supplementare per il codice di esempio).
      2. Specificare il criterio di valutazione da una serie di opzioni (ad esempio 'CalinskiHarabasz' - per la descrizione delle opzioni di criterio, consultare il menu Guida in linea, alla ricerca di "evalclusters").
      3. Specificare un intervallo di numeri di cluster ottimali per testare (es [1: 6] per verificare se 1, 2, 3, 4, 5, o 6 cluster sono ottimali).
        Nota: L'uscita di 'evalclusters' è un numero ottimale di cluster dato l'algoritmo di clustering e il criterio specificato.
    2. Metodo 2: gaussiana modello mistura di clustering:
      NOTA: miscela gaussiana modello di clustering Algorithms (MGM) supporre che le osservazioni per ogni variabile provengono da una miscela di distribuzioni gaussiana che definiscono ogni cluster putativo, ognuno con la propria media e covarianza. Il GMM quindi utilizza un algoritmo em assegnare probabilità a posteriori ad ogni misurazione, indicando la probabilità di appartenere ad uno specifico cluster 16.
      1. Implementare una GMM utilizzando la funzione 'fitgmdist' inserendo il numero putativo di cluster osservabili nei dati. In alternativa, per evitare l'assegnazione a priori il numero di cluster, utilizzare analisi delle componenti principali (PCA) con una serie di diversi numeri di cluster ottimale utilizzando la procedura descritta qui (vedi file di codice supplementare per il codice di esempio).
      2. Utilizzare la funzione 'PCA' sulla matrice dei dati originali e salvare i punteggi dei componenti principali come uscita.
      3. In un ciclo a partire da 1 e passando attraverso un numero di cluster ottimali putativi, usare thfunzione 'fitgmdist' e sui punteggi dei componenti principali e generare MGM per ogni numero di cluster ottimali putativi.
      4. Valutare ogni GMM esaminando la probabilità negativo registro, Akaike criterio di informazione, e di Bayes criterio di informazione. Il GMM con i criteri più bassi è ottimale.
      5. Se lo si desidera, verificare se i valori medi per ogni cluster sono significativamente differenti quando il numero di cluster è ottimale (mezzi di ogni cluster sono memorizzati nel "mu" uscita di ciascun GMM).

    6. Analisi statistica dei dati in cluster

    1. Una volta che il numero ottimale di cluster è determinato utilizzando il clustering gerarchico e valutata, tornare i dati originali, i neuroni separati in gruppi, e determinare quali parametri morfologici contribuiscono al raggruppamento di neuroni in classi uniche.
    2. Ordinare i dati metrici morfologici originali, che i neuroni sono raggruppati in base alla assegnazione cluster. Per esaminare le relazioni tra i dati morfologici tra neuroni (per tutti i neuroni o per i neuroni separati in cluster), eseguire la regressione lineare si adatta a 2 e 3 vie comparazioni delle osservazioni metriche morfologiche. Questi attacchi possono essere stimati utilizzando la funzione di 'forma' e valutati utilizzando la funzione 'fitlm', in cui la bontà di uscite adatte comprendono R 2 e p valori per attacchi di regressione.
    3. Per esaminare le relazioni statistiche tra i neuroni in ogni cluster, utilizzare non parametrico due campioni (Wilcoxon rank test-sum) o multipla-campionari di confronti (ANOVA), a seconda del numero di cluster. È importante sottolineare che l'uso di più campioni ANOVA assicura che i valori p sono corretti per confronti multipli.

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Representative Results

Abbiamo dimostrato in precedenza che le ricostruzioni su larga scala di neuroni all'interno di una popolazione selettivo sta seguendo iniezione fattibile del virus della rabbia modificato nel dLGN 5. Recentemente, lo stesso tessuto è stato utilizzato per ricostruire 160 neuroni nel settore visivo del TRN (Bragg et al, in revisione;. Figure 2A-B) seguendo le fasi metodologiche dettagliate qui sopra descritti. Nello studio TRN, tre gruppi unici di neuroni TRN stati identificati sulla base di un'analisi indipendente grappolo di 10 metriche morfologiche: zona del corpo cellulare, corpo rotondità cellulare, mediale-laterale posizione rispetto al centro del TRN posizione dorso-ventrale all'interno del TRN , numero di alberi dendritiche, distanza media dendritiche ai nodi, la lunghezza media di 3 ° e dendriti di ordine superiore, angolo medio di 1 st dendriti ordine, angolo medio fase del arborizzazione dendritiche totale, e deviazione angolare del aTal arborizzazione dendritica. Neuroni TRN sono stati distribuiti in modo equivalente questi tre gruppi (Figura 2C). confronti statistici separate di tutti i 10 parametri morfologici attraverso i neuroni nei tre gruppi hanno prodotto differenze statisticamente significative tra i cluster per tutti, ma due dei parametri morfologici inclusi nell'analisi cluster originale. Pertanto, sulla base del dendrogramma albero gerarchico generato dal cluster analysis (Figura 2C) ed i confronti statistici distinti di metriche morfologiche attraverso cluster, neuroni TRN sono classificati in tre gruppi unici.

In questo studio, abbiamo espressamente voluto applicare metodi statistici per valutare separatamente cluster determinati con una cluster analysis. Il dataset TRN dallo studio preliminare è stato valutato per stabilire se i tre ammassi osservati erano ottimali. grappolo supplementare separata analisi, vale a dire PCA e GMM clustraggio, sono stati effettuati per verificare i metodi di clustering precedenti (Figura 1). Tre risultati importanti separatamente verificare l'analisi dei cluster precedente. In primo luogo, quando il metodo di analisi dei cluster originale è stata valutata utilizzando la funzione '' evalclusters specificando la funzione di 'linkage' per generare cluster, il numero ottimale di cluster è stato di 3, corrispondenti alla conclusione originale sulla base della struttura gerarchica dendrogramma (Figura 2C). In secondo luogo, PCA è stata eseguita sulla matrice dati originali di 10 parametri morfologici per 160 neuroni TRN come un mezzo alternativo di raggruppamento neuroni basati su contributi di metriche morfologiche. Tre MGM sono stati generati, assumendo i neuroni TRN sono stati raggruppati in 1, 2, o 3 gruppi unici. La probabilità di registro negativo (NLL) e Akaike criterio di informazione (AIC) ha prodotto il più basso, e quindi più informativo, i valori ed entrambi i valori sono ottimali quando la GMM ha usato 3 grappoli per descrivere i dati morfologici TRN (Figure 3). In terzo luogo, il raggruppamento GMM-based è stata valutata separatamente utilizzando la funzione 'evalclusters' e il numero ottimale di cluster è stato 3. Così osservazioni dell'albero dendrogramma gerarchico, i confronti statistici dei parametri morfologici attraverso i neuroni separati in tre gruppi, PCA e GMM- il clustering basate, e le valutazioni separate di ogni metodo di clustering (linkage e GMM), tutto ha prodotto lo stesso risultato che i neuroni TRN sono perfettamente separati in 3 gruppi sulla base dei 10 parametri morfologici utilizzati.

Figura 1
Figura 1: Formato dati. Matrice Esempio dati con n righe corrispondenti al numero di neuroni e m = 5 colonne corrispondenti al numero totale di variabili indipendenti includere nel cluster analysis (non includono intestazioni in matrici di dati).


Figura 2: Clustering indipendente di 160 TRN neuroni. A. Sinistra, fotografia di singola sezione coronale attraverso la dLGN di un animale, macchiato per l'attività del citocromo ossidasi di visualizzare gli strati dLGN e contro GFP di visualizzare iniezione virus. La freccia indica regioni dense neuroni TRN retrogrado etichettati. Orientamento sezione segue la bussola dorso-ventrale / mediale-laterale (DV / ML) qui sotto e barra della scala rappresenta 500 micron per tutti i pannelli in A. Secondo da sinistra, contorno contorni di dLGN (rosso) e TRN (marrone) per tutte le sezioni contenenti iniezione virus (contorni neri). Stelle gialle indicano i centri al sito di iniezione. Orientamento e Scala bar come in A. Terzo da sinistra, 3-d rendering di contorni e al sito di iniezione, l'orientamento e le barre di scala come in A. A destra, le mappe di luoghi di ricostruiti Neuroni TRN, codice colore in base alla assegnazione del cluster (C) all'interno di un unico contorno TRN aggregato (marrone). Orientamento e Scala bar come in A. B. Sinistra, contorni complessivi di TRN (nero) e dLGN (grigio) con 5 neuroni TRN ricostruiti colori caldi per raffreddare in base alla loro posizione di medio-laterale all'interno del TRN. Orientamento secondo la bussola DV / ml in, barra della scala rappresenta 500 micron. A destra, fotografie degli stessi neuroni 5 TRN con barre di scala in tinta che rappresenta 100 micron. C. Gerarchica albero dendrogram seguente cluster analysis che illustra distanze di collegamento tra i neuroni 160 TRN ricostruiti sulla base di 10 parametri morfologici indipendenti. Tre gruppi illustrate in blu, verde e rosso. Tutte le porzioni di questa figura sono adattati dai dati inclusi in Bragg et al. (in revisione).lank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: cluster di valutazione. Terreno di due differenti valori di criterio, log negativo verosimiglianza (NLL, rosso) e Akaike criterio di informazione (AIC, blu) generato da tre MGM assumendo 1, 2, o 3 grappoli. MGM con 3 cluster forniscono i valori più bassi criterio.

Supplemental file di codice: il codice di esempio, scritto in un linguaggio compatibile con Matlab, per effettuare l'analisi dei cluster su una matrice esempio dati seguita da una valutazione cluster utilizzando PCA e GMM si avvicina. Clicca qui per scaricare il file.

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Discussion

studi neuroanatomici sono rimasti un pilastro di neuroscienze e recente interesse connectomics e le relazioni struttura-funzione ha rinnovato entusiasmo per la caratterizzazione morfologica dettagliata delle popolazioni di neuroni selettivi. Tradizionalmente, gli studi neuroanatomici hanno fatto affidamento su classificazioni qualitative di neuroni in classi morfologicamente distinte di neuroni definiti da neuroanatomisti esperti. Con i progressi nelle tecniche per la ricostruzione neuroni e l'estrazione dei dati morfologici, è ora possibile utilizzare più sofisticati e quantitativi metodi di analisi dei dati per classificare le classi neuronali morfologicamente distinte in modo imparziale. In questo studio, i metodi passo-passo sono delineati per 1) etichettatura selettivamente centinaia di singoli neuroni utilizzando metodi di marcatura retrograda virus-mediata; 2) ricostruire sistematicamente centinaia di singoli neuroni per formare un campione globale e quindi rappresentativo di neuroni all'interno di un popolazione selettivo; e 3) il clustering indipendente analizza con valutazione statistica per determinare i cluster ottimali di neuroni all'interno di una popolazione selettivo in base a metriche morfologiche. Questi metodi di analisi sono verificati mediante l'applicazione di diversi metodi di clustering a un set di dati esistente di neuroni TRN e dimostriamo basano su tre distinti metodi di valutazione che i neuroni TRN sono ottimamente raggruppati in tre sottopopolazioni morfologicamente distinte.

Un grande vantaggio dei protocolli descritti in questo studio è la loro flessibilità. Il virus della rabbia G-cancellato è stato efficace nel guidare l'espressione EGFP in centinaia di neuroni retrogrado etichettati dopo l'iniezione in una struttura di destinazione. Lo stesso ceppo virus della rabbia è altrettanto efficace in diverse specie, tra cui macachi 5, 9, furetti (Hasse & Briggs, in revisione), e roditori 7,"> 8. Pertanto, virus della rabbia modificato può essere utilizzato per etichettare selettivamente i completi modelli arborization dendritiche di qualsiasi popolazione di neuroni in seguito a iniezione in una struttura di destinazione. Si consiglia colorazione anticorpale contro GFP seguita da DAB reazione / perossido perché questo provoca colorazione permanente etichettati neuroni e permette sezioni di tessuto per essere visualizzati sotto un microscopio senza l'ausilio di microscopia a fluorescenza (che sbianca etichetta fluorescente con esposizione più lunghi). Tuttavia, metodi di colorazione alternativi sono disponibili e / o di fluorescenza possono essere visualizzati direttamente se desiderato. un vantaggio di misurare fluorescenza grezza è che diversi virus espressione di molecole fluorescenti differenti mappa possono essere combinati, ad esempio per determinare se i neuroni proiettano a più strutture bersaglio cerebrali. Inoltre, le operazioni descritte sopra possono essere applicati a tutti i dati morfologici disponibili (per esempio assoni e dendriti) per consentire Morpho sempre più robustoclassificazione logica dei neuroni. E 'anche importante notare che piccole quantità di virus della rabbia può anche essere iniettato per generare etichettatura rada retrograda, che potrebbe essere vantaggioso per ricostruzioni di assoni oltre a dendriti.

Un ulteriore vantaggio dei metodi di analisi descritti in questo studio è che diversi approcci di clustering differenti possono essere utilizzati e confrontati. Ad ogni passo della cluster analysis, sono disponibili per calcolare le distanze tra neuroni nello spazio dei parametri, nonché diversi algoritmi per generare cluster diverse opzioni. Inoltre, più metodi di valutazione sono disponibili. Quest'ultimo è particolarmente utile come mezzo per verificare raggruppamento ottimale, come descritto nella sezione Risultati rappresentativa. Indubbiamente, algoritmi aggiuntivi per la generazione di cluster e per valutare il clustering ottimale sarà disponibile come il campo si muove in avanti. Insieme, questi metodi di analisi continueranno a improve approcci quantitativi nel campo della neuroanatomia e migliorare la robustezza dei risultati.

Vi è un crescente interesse per l'automazione di ricostruzioni neuronali perchè ricostruzioni di mano dei singoli neuroni marcati sono in termini di tempo, richiedono formazione ed esperienza, e sono ancora un po 'soggettivo. Perché ricostruzioni neuronali automatici basati su computer sono ancora soggette a errori, i dati neuroanatomici a base di microscopia elettronica sono ancora analizzati da persone (vedi ad esempio 17). Tuttavia, è probabile che automatizzato ricostruzione neuronale sarà disponibile nel prossimo futuro. Automatizzata ricostruzione neuronale richiederà ancora più controllo sulla fine analisi dei dati, in tal modo il raggruppamento di analisi e metodi di valutazione descritti qui diventerà ancora più importante in quanto il campo continua ad avanzare tecnologicamente.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare il Dott. Ed Callaway e Marty Usrey per averci permesso di utilizzare il tessuto preparato come parte di uno studio preliminare e Libby Fairless e Shiyuan Liu per un aiuto con ricostruzioni neuronali. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH (NEI: EY018683) e la Fondazione Whitehall.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SADΔG-EGFP E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten FHC UEPSGGSE1N2M Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II Drummod Scientific 3-000-204, 110V Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome Thermo Scientific
DAB Sigma Aldrich D5905-50TAB 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C Sigma Aldrich C2037-100MG
Catalase Sigma-Aldich C9322-5G
Rabbit anti-GFP Life Technologies/Thermo Fisher #A-11122  Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit Vector Laboratories #BA-1000 Secondary antibody
Neurolucida System  MicroBrightField Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer MicroBrightField Data export software
Microfire Camera  Optronics 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope Nikon Instruments Inc. Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab The MathWorks Inc.  Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel Microsoft Spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cajal, S. R. y Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. Maloine. (1911).
  2. Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
  3. Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
  4. Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
  5. Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
  6. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
  7. Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525, (5), 1273-1290 (2017).
  8. Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
  9. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
  10. Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
  11. Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
  14. Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
  15. Thorndike, R. L. Who belongs in the family? Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
  16. Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
  17. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).

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