면역 측정법에 대한 3 차원 종이 기반 미세 유체 장치의 제작

Published 3/09/2017
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Bioengineering

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Summary

우리는 구체적 방법은 면역 분석법의 개발에 사용하기위한 입체 종이 기반의 미세 유체 소자를 제작한다. 장치 어셈블리에 대한 우리의 접근 방식은 다층의 종류, 첨가제 제조입니다. 우리는 종이 기반 디바이스의 이러한 유형의 대표적인 결과를 제공하는 샌드위치 면역 분석을 보여준다.

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Fernandes, S. C., Wilson, D. J., Mace, C. R. Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays. J. Vis. Exp. (121), e55287, doi:10.3791/55287 (2017).

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Abstract

용지가 모세관 현상에 자율적 유체 심지. 소수성 장벽 용지를 패터닝함으로써, 유체의 이동을 제어 할 수 있고, 종이의 층 내에 지시. 또한, 패턴 종이의 여러 층을 적층하는 분석 및 생체 시료 분석법의 개발을 지원할 수있는 정교한 입체 미세 유체 네트워크를 만듭니다. 종이 기반 미세 유체 장치는 사용하기 쉽고, 휴대용, 저렴하고 작동 외부 장비를 필요로하지 않습니다. 그 결과, 그들은 포인트의 케어 진단을위한 플랫폼으로 큰 약속을 잡으십시오. 적절 유틸리티 및 종이 기반 분석 장치의 성능을 평가하기 위해, 적절한 방법은 그의 제조를 재현성 실험 설정에 적합한 배율로 확인하기 위해 개발되어야한다. 이 논문에서, 방법은 종이 기반 면역 분석에 사용할 수있는 일반적인 디바이스 구조에 대하여 설명한다 제조한다. 우리는 첨가제 필림의 양식을 사용g (다층 적층)을 패터닝 용지 패터닝 접착제의 다중 층을 포함하는 장치를 제조 하였다. 인간 융모 성 성선 자극 호르몬 (hCG의)에 대한 면역 이러한 입체 종이 기반의 미세 유체 장치의 적절한 사용을 입증 이외에도, 장치 오류가 발생할 수있는 제조 공정에있어서 오차가 논의된다. 우리는 제한된 리소스 설정을 위해 특별히 설계된 분석 애플리케이션의 개발에 다양한 유틸리티를 찾을 종이 기반 장치를 제조하는이 방법을 기대합니다.

Introduction

용지 제형 또는 등급의 범위로 조정하고 그 특성을 작용 화 될 수 있고, 모세관 위킹 또는 자율적으로 액체를 수송 할 수 널리 사용할 수있다. 용지가 소수성 물질을 패터닝하는 경우 (예를 들어, 포토 레지스트 (1) 왁스 또는 2) 유체의 위킹은 종이의 층 내에서 공간적으로 제어 할 수있다. 예를 들어,인가 된 수성 샘플은 용지 내에 저장된 화학적 및 생화학 시약과 반응 상이한 영역들로 지향 될 수있다. 이들은 종이 기반의 미세 유체 장치는 휴대용 저렴 분석적 분석법 3, 4, 5, 6, 7의 개발을위한 유용한 플랫폼으로 입증되었다. 종이 기반 미세 유체 장치의 응용 프로그램은 현장 진료 진단을 포함EF "> 8, 환경 오염 물질 9 모니터링, 위조 의약품 (10)의 감지 및 비편 재화 의료 (또는"원격 의료 ") 제한된 자원의 11 설정을 선택합니다.

패턴 종이의 여러 층이 인접 층 (즉, 아래 위 또는)에서 친수성 영역이 그 입구 및 출구에 연결 또는 독립 남아있을 수 있습니다 연속 유체 네트워크를 형성하기 위해 연결하는 통합 장치로 조립 될 수있다. (12) 각 층은 단일 장치에서 수행되는 시약 및 다중 분석법의 공간 분리를 가능하게하는 고유의 패턴을 포함 할 수있다. 얻어진 삼차원 미세 유체 소자뿐만 아니라 분석 시험 법을 사용하는 액체를 흡상 할 수있다 (예를 들면, 간 기능 (13) 및 작은 분자 (14)의 전기 화학적 검출을 시험), 그러나 그것은 또한 수 SUP포트 고기능화 다수의 전통적인 접근법 미세 공통 (예, 15 및 간단한 기계 밸브 (16)). 용지가 모세관 작용에 의해 체액을 심지 때문에 중요하게, 이러한 장치는 사용자로부터의 최소한의 노력으로 작동 될 수있다.

시약 종이 기반 장치의 3 차원 구조 내에 저장 될 수 있기 때문에, 복잡한 프로토콜은 장치 수성 샘플의 단일 첨가로 감소 될 수있다. 최근에는 패턴 층을 만드는 왁스 인쇄 기법을 이용하여 종이 기반 면역 분석법의 개발에 사용될 수있는 일반적인 3 차원 디바이스 구조를 도입 하였다. 적층의 장치 번호의 설계 관련 양태에서, 층의 조성, 상기 3 차원 미세 네트워크 제어 당 전체의 패턴을 사용하는 방법에 초점 (17) (18) 이러한 연구면역 측정법의 formance. 결과적으로, 우리는 면역 다중화 (19)의 신속한 개발을 용이하게하기 위해 이러한 디자인 규칙을 사용할 수 있었다. 이 논문에서, 인간 융모 성 성선 자극 호르몬 (hCG의, 임신 호르몬)을위한 이전에 개발 된 면역 17 우리 입체 종이 기반 면역의 조립 및 제조를 위해 개발 한 전략을 설명하기위한 일례로서 사용된다. 따라서, 우리는 디바이스보다는 분석의 개발의 조립 작업에 초점을 맞춘다.

hCG의 호르몬의 하나의 서브 유닛은 다음 샘플 또는 후속 시약의 비특이적 흡착을 제한하는 차단 된 고체 기판 상에 코팅 된 특정 캡쳐 항체를 검출하기 위해 사용되는 형식 인 샌드위치 면역 측정법에서는. 이 기판은 대부분 (효소 결합 면역 분석 또는 ELISA에 대한 예) 폴리스티렌 마이크로 웰 플레이트이다. 샘플은 다음이다우물에 첨가하고, 일정 시간 동안 배양시켰다. 엄격한 세척 후, hCG의 다른 소단위에 특이적인 항체를 첨가하고, 배양 허용된다. 이는 검출 항체가 측정 신호를 생성하기 위해 콜로이드 입자, 효소 또는 형광 물질에 접합 될 수있다. 잘 다시 이전 (예를 들면, 플레이트 리더를 사용하여)을 분석의 결과를 해석로 세척한다. 상업용 키트이 시간 소모적 인 다단계 공정에 의존하지만,이 단계의 모든 사용자에게 최소의 개입 종이 기반 마이크로 유체 장치를 빠르게 수행 할 수있다.

hCG의 면역에 사용 된 장치는 샘플 이외에, 접합체 저장소, 배양, 캡처 씻어 블롯 (도 1)에 사용되는 위에서 아래로, 여섯 활성층을 포함한다. 샘플 또한 층은 질적 여과지에서 이루어집니다. 이 액체 시료의 도입을 용이하게 공액 Laye의 상기 시약을 보호사용자가 환경이나 우발적 인 접촉에서 오염 연구. 공액 층 (질적 여과지)를 면역 대한 발색 시약 (예를 들어, 금 콜로이드 표지 항체)를 보유하고있다. 배양 층 (질적 여과지) 샘플이 다음 층, 포획 층에 도달하기 전에 시약과 분석 물질의 결합을 촉진하는 종이면 내에서 측 방향 이동 할 수있다. 캡처 층 (나일론 막) 재료에 흡착 된 분석에 대한 특정 리간드가 포함되어 있습니다. 분석이 완료된 후,이 층은 완성 된 면역 복합체의 시각화를 가능하게 드러난다. 세척 층 (정성 여과지는) 떨어진 오 층 (두께 크로마토 그래피 용지)에 캡처 층의 얼굴에서 무료 복합체 시약을 포함 초과 액체를 그립니다. ASSEM의 무결성을 유지 영구 접착제의 4 층 : 6 층의 패터닝 장치, 양면 접착 다섯 층에 의해 함께 유지된다채혈 장치와 이동식 접착제의 하나의 층은 포집 층의 면역의 결과를 검사하는 장치의 박리 용이하게한다.

이 원고의 목적을 위해, 우리는 hCG의 단지 음성 및 양성 대조 시료 사용 (0 MIU / ㎖ 및 81 MIU 각각 / ㎖)의 관계 전용 논의를 허용하는 지필 면역의 대표적인 결과를 제공 할 제조 방법 및 장치의 성능. 성공적으로 장치를 제조하는 방법을 보여 외에도 장치 또는 재생 불가능한 분석 결과의 오류가 발생할 수있는 여러 제조 에러를 강조. 이 원고에 설명 된 프로토콜과 논의는 종이 기반의 면역 설계 및 제조 방법에 대한 귀중한 통찰력을 가진 연구자를 제공 할 것입니다. 우리가 면역에 대한 우리의 데모를 집중하는 동안, 우리는 여기에 제시된 가이드 라인은 세 DIMEN의 제조에 크게 도움이 될 것으로 예상적인의 미세 유체 장치를 종이 기반.

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Protocol

종이 기반 미세 유체 장치 레이어 1. 준비

  1. 그래픽 디자인 소프트웨어 프로그램을 사용하여 종이, 나일론, 및 접착제 층을위한 패턴을 준비한다. 6 각 계층은 다른 패턴을 가질 수있다.
    패턴이 기능적 지필 면역 필요하지 않은 위치 맞춤 구멍을 포함 할 수 있지만, 입체 디바이스의 재생 가능한 제작을 지원 : 참고. 장치가 스트립, 또는 전체 시트로, 개별적으로 조립하는 경우이 구멍의 배치가 달라집니다. 패턴을 설계하는 데 사용되는 소프트웨어 프로그램은 패터닝 기술 (예, 포토 리소그래피, 왁스 인쇄 또는 절단)의 선택에 따라 달라질 수있다. 6
  2. 70 % (v / v)의 에탄올 및 물의 용액으로 작업 영역 스프레이. 깨끗한 종이 타월로 작업 영역을 닦습니다.

종이 레이어 2. 준비 : 샘플 추가, 복합체 저장, 배양 및 세척 레이어

  1. 큰 탁상 종이 커터를 사용하여 정성 여과지의 층을 준비합니다. 고체 잉크 (왁스) 프린터를 사용하여 패턴을 용이하게하기 위해 표준 용지 크기에 용지의 재고 시트를 잘라. 예를 들어, 하나의 460 X 570mm 2 시트는 US Letter 용지 (8.5 X 십일인치 2)의 4 장을 만들 수 있습니다. 오염을 최소화하기 위해 항상 깨끗한 장갑 용지를 처리합니다.
  2. 프린터 트레이에 크로마토 그래피 종이 낱장 용지를 넣습니다. 이전에 설계 레이어 (그림 1 참조) 인쇄합니다.
    참고 : 패턴이 자동 피드를 사용하여이 시트에 직접 인쇄 할 수 있습니다. 단지 종이 한 장을 용지 걸림을 방지하기 위해 한 번에 인쇄 할 수 있습니다. 모든 레이어를 들어, "강화"인쇄 설정을 사용합니다.

나일론 막 계층 3. 준비 : 캡처 레이어

  1. 탁상 종이 커터를 사용하여 시트 (7.5 X 십인치 2)에 나일론 막의 주식 롤을 잘라. 나일론 처리에 큰 관심을 가지고멤브레인 무결성을 유지하고 추출을 방지합니다. 나일론 막은 수분에 민감한만큼, 데시 케이 터 캐비닛에 사용하지 않는 재료를 보관합니다.
    참고 : 컷 시트는 US Letter 용지보다 좁은입니다. 나일론 막은 얇고 약하기 때문에, 직접 프린터에 의해 처리 지원을 필요로 할 수 없다. 자세한 사항은 아래에 설명되어 있습니다.
  2. 왁스 프린터를 사용하여 복사 종이 위에 포획 층 패턴을 인쇄하고이를 나일론 멤브레인의 위치 결정을위한 가이드 역할을하는 광 박스 테이프. 광 박스는 여러 층의 정렬을 돕는다.
  3. 복사 용지의 이전에 인쇄 된 용지에 복사 용지의 클린 시트를 놓습니다. 빛 상자에 종이의 깨끗한 시트 테이프가 아닌 테이프 두 장의 함께 할.
  4. 복사 용지의 깨끗한 부분에 나일론 막의 낱장 용지를 놓습니다. 막 복사 용지의 맨 아래 층의 인쇄 영역을 다루고 있는지 확인합니다. 깨끗한 시트 나일론 막을의 네 변을 테이프종이를 복사합니다.
    참고 : 인쇄 (예를 들어, 용지 걸림이나 왁스의 요철 인쇄)에 문제가되지 않도록 나일론 멤브레인이 평평하고 매끄러운 있는지 확인하십시오. 왁스 나일론 막을 복사 용지에 부착 된 테이프 상에 인쇄 될 수있다. 이 경우 인해 테이프 범위에 나일론이 불완전하게 패터닝 영역은 폐기해야합니다. 미래 제제, 나일론 막 대형 조각이 인쇄 오류를 방지 할 수있다.
  5. 수동 급지 프린터 트레이에 (여기에 부착 된 복사 용지에서 지원) 나일론 막 한 장을 넣습니다. 한 번에 나일론 막의 한 장을 인쇄 할 수 있습니다.
    참고 :이 패턴 화되지 않는 오점 층에 요구되는 준비 단계는 없습니다.

4. 인쇄 층에 소수성 장벽을 만들기

  1. 테이프 중력 대류 오븐에 배치 되어도 상기와 층 아래 가열 아크릴 프레임 상에 인쇄 층. 에 테이프 나일론 막 유지왁스 후까지 복사 용지의지지 시트가 용융되고, 소수성 장벽이 형성된다.
    주 : 아크릴 프레임이 1/2 맞춤형 레이저 절단 된 부분이다. ". 디바이스의 개수에 따라 두께의 아크릴 수지 2 개의 프레임 사이즈가 사용 된 제조되는 작은 프레임의 바깥 테두리 (11) 5/8 조치" X 2 3/4 ", 프레임의 내부 구멍 (10)이 측정 3/8"× 1 3/4 7/8 × 8 ", 및 상기 내부를". 큰 프레임의 바깥 테두리 (11)를 측정 5/8 " 프레임의 구멍 10 1/4 "X 7 7/8". 개방, 내부 공간도 용지의 전체 두께를 통해 왁스의 용융을 가능하게 측정합니다.
  2. 왁스 용지의 두께에 용융 될 때까지 30 초 동안 150 ℃ 오븐에서 층을 놓는다. 왁스는 그것을 뒤집 및 설계 결함 확인하여 용지의 두께를 침투했음을 확인합니다.
    주 : 강제 공기 오븐 또는 핫 플레이트는 고체 왁스 잉크를 용융하는데 사용될 수있다. 녹는 시간또는 온도는 가열 방식에 따라 달라질 수 있습니다.
  3. 아크릴 프레임에서 용지 및 나일론 막을 제거합니다. 또한, 복사 용지의지지 시트에서 나일론 막을 제거합니다.

접착층 (5)의 제조

  1. 설계 파일을 이용하여 로봇 나이프 플로터를 사용하여 접착 필름의 패턴 양면 판 이전 (단계 1.1)을 준비 하였다. 왁스 라이너의 시트를 사용하여 노출 된 접착 표면을 보호합니다.
    주 : 양면 접착제가 샘플이 연속적인 유체 통로로 층을 통과 할 수 있도록 구멍을 패터닝한다. 왁스 라이너 용이 접착제 제거, 절단 중에 오염 및 인열로부터 보호하는 역할을한다. 레이저 커터 또는 프레스도 접착 필름의 패턴 층에 사용될 수있다 죽는다.

접착제와 장치 레이어 6. 백업

  1. 70 % (v / v)의 에탄올 및 물의 용액으로 라이트 박스 스프레이. 깨끗한 종이 t으로 닦아owel.
  2. 테이프 인쇄 된면이 아래로 라이트 박스에 접착제로 백업 할 필요가 종이 또는 나일론 막의 패턴 층.
  3. 박리 한 접착제의 패턴 화 된 시트의 보호 라이너 측 종이 또는 나일론 막 층에 부착. 패턴의 적절한 정렬을 보장하기 위해 빛의 상자를 사용합니다. 함께 누릅니다. 보호 슬립에 부분적으로 조립 된 장치를 놓습니다.
    참고 : 보호 슬립들이 라미네이터 롤러에 접촉하지 않도록 보장함으로써 오염이나 손상으로부터 기기를 보호 적층 필름 후원의 접힌 부분입니다.
  4. 완전히 인접 층에서 공기의 주머니를 제거, 함께 접착 종이를 눌러 자동 라미네이터를 통해 생성 된 2 층 어셈블리를 전달합니다.
    주 : 상기 장치의 층들 사이에 공기 주머니 장치 무결성 및 누수시킴으로써 재현성 흡상을 방해 할 수있다.

복합체 L 7. 치료이전 장치 조립에 면역 측정법 용 시약에 이어

  1. 처리 될 친수성 영역이 프레임에 접촉 현탁되지 않도록 아크릴 프레임 상 테이프 복합 층.
  2. 접합체 층의 친수성 영역 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 100 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA), 2.5 μL를 추가한다. 이 2 분 후 5 분 동안 65 ° C에서 실온에서 건조하도록 허용합니다.
    참고 :이 볼륨이 논문의 영역을 적시기에 충분하다. BSA 용액 용지 및 시약은 샘플에서 재수 때 나노 입자의 방출을 용이하게하는 건조 공정 중에 콜로이드 성 나노 입자의 응집을 방지 할 수 있습니다.
  3. 안티 - β-hCG의 항체에 결합 5 OD 콜로이드 금 나노 입자의 5 μl를 추가하고, 건조 과정을 반복합니다.
    주 : 콜로이드 금 나노 입자의 농도의 단위는 종종 abso 의해 측정 된 광학 밀도 (OD)로 표현되는λ = 540 nm에서 rbance. 어떤 처리는 10 절에서 장치 조립하기 전에 심지 패드 필요하지 않습니다.

면역 측정법에 대한 이전 장치의 조립에 시약과 측면 채널 8. 치료

  1. 처리 될 친수성 영역이 프레임에 접촉 현탁되지 않도록 아크릴 프레임 상 측면 테이프 채널 층.
  2. 블로킹 제의 10 μL를 추가 (5 ㎎ / ㎖ 무 지방 우유, 0.1 % (v / v)로 1X PBS에 트윈 20) 좌우 채널을 처리한다. 동일한 건조 공정 (실온에서 2 분, 5 분 후, 65 ° C) 공액 층으로 반복한다.

이전 장치 조립에 면역 측정법 용 시약과 캡처 계층 9. 치료

  1. 처리 될 친수성 영역이 프레임에 접촉 현탁되지 않도록 아크릴 프레임 상 테이프 포획 층.
  2. 1 ㎎ / ㎖ 안티 α-hCG의 항체의 5 μL로 포집 층을 치료하고 허용샘플은 65 ° C에서 8 분간이어서 2 분 동안 실온에서 건조한다.
  3. 차단제의 2 μL를 추가 (5 ㎎ / ㎖ 무 지방 우유 0.1 % (v / v)의 1X PBS의 트윈 20). 캡처 층의 건조 과정을 반복합니다.
    참고 :이 금액은 너무 많은 차단제를 사용할 때 일어날 수있는 나일론 멤브레인의 기공을 폐색없이 서류 코트에 적합합니다.

10. 조립 3 차원 종이 기반 미세 유체 장치

  1. 광 박스에 제층을 테이프 (인쇄 된면이 위쪽으로 향하도록). 맞춤 구멍을 사용하는 경우, 휴대용 홀 천공 도구를 사용하여 다음 층에서 제거.
  2. 접착제를 노출 캡처 층의 뒷면에 보호 필름을 제거합니다. 가이드로 맞춤 구멍을 이용하여 세정 층 위에 포획 층을 맞추고. 함께 두 층을 누릅니다. 장치에 오염 또는 손상을 최소화하기 위해 친수성 영역을 만지지 마십시오. 핀셋 assemb을 돕기 위해 사용될 수있다LY.
  3. 접착제를 노출 배양 층의 뒷면에 보호 필름을 제거합니다. 캡처 층 위의 배양 층을 맞추고 함께 키를 누릅니다. 모든 활성 층이 조립 될 때까지 이러한 방식으로 레이어를 계속 추가합니다.
  4. 보호 슬립에 부분적으로 조립 된 장치를 놓고 단단히 함께 라미네이터를 사용하여 레이어를 부착합니다.
  5. 세정 층의이면에 보호 필름을 제거하고, 장치의 하부에 오 부착 층. 반복 적층 단계 10.4 입체 종이 기반의 미세 유동 장치의 조립을 완료한다. 조각이나 가위를 사용하여 완전히 조립 된 장치의 시트에서 장치를 잘라 원하는 번호.
    주 : 장치 전체 시트 장치의 스트립, 또는 하나의 장치는 유사한 방법을 사용하여 제조 될 수있다.

11. 종이 기반의 면역 수행

  1. 장치 위에 친수성 영역 시료 20 μL를 추가 (즉, t그는) 층을 샘플.
  2. 다음, 장치에 완전히 심지 (1 배 인산 완충 식염수에 0.05 % v / V를 트윈 20) 세척 버퍼의 15 μl를 추가 샘플 기다립니다. 세척 완충액의 첫번째 분취 량을 디바이스에 완전히 악인 후 세척 완충액의 제 15 μL 분취를 추가한다.
    주 : 세척 완충액 액체 방울이 용지의 표면에 메 니스 커스를 보여주는, 사라진 장치에 완전히 부정한 갖는다. 세척 완충액 번째 분취 완전히 장치 들어간 경우 분석은 완료된다.
  3. 상기 분석의 결과를 나타내 포획 층을 노출 핀셋을 사용하여 장치의 상위 3 층을 벗겨.
    1. 질적 색의 유무를 관찰하여 시험 결과를 해석한다. 대안 적으로, 결과를 정량화하고 내 강도 분포의 특징을 바탕 스캐너 사용의 화상 처리 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여 이미지 판독 층검출 영역. (20)

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Representative Results

입체 종이 기반 미세 유체 장치에서 재현 분석 성능을 얻기 장치 사이의 일관성을 보장하는 제조 방법에 의존한다. 이 목적을 향해, 우리는 제조 공정 및 재료를 고려 번호를 확인했으며, 종이 기반 면역 시연의 맥락에서 여기에 논의한다. 우리는 종이 기반의 미세 유동 장치 (도 2A) 내의 소수성 장벽을 형성하기 위해 왁스 인쇄 법을 사용한다. 이이 방법에만 널리 사용할 사무 장비에 의존하기 때문에, 이상적 완료 최소한 절차 단계를 필요로하고, 단백질의 흡착을 방해하거나 종이 섬유의 습윤성을 변경할 수있는 화학 물질 (예를 들어, 포토 레지스트)의 사용을 요구하지 않는다. 또한, 왁스 인쇄 반복 공연 기간 TI와 분석을 위해 중요하다 재현 치수와 유체 경로를 생성MES. 소수성 장벽을 형성 한 후, 접착 시트를 입체 장치 (도 2B)의 조립을 용이하게하는 층에인가된다. 점착 필름 층 (도 2c)의 배면에 추가 된 후에 면역 측정법에 필요한 시약을 적용 할 수있다. 여러 장치가 동시에 제조 될 수 있기 때문에이 방법은 학문적 인 실험실에서 제조 공정에 유용하다. 장치의 모든 층이 함께 적층되어 적층 (도 2d) 후에 면역 분석법 장치의 조립 공정이 완료된다. 우리는 분석을 시작하기 위해 샘플을 추가합니다. 이 예에서는, 샘플이 우리의 장치의 동작을 설명하고 분석의 재현성을 사용하여 수행되는 것으로, 버퍼 hCG의의 음성 및 양성 샘플을 포함 임신 테스트에 설정된 요 제어를 사용한다. 세척 버퍼의 두 분취가 순차적으로 추가됩니다. 세척 완충액의 최종 분취 완전히 장치를 입력하면분석이 완료된 것으로 간주됩니다. 상위 세 계층은 캡처 층 (그림 3A)를 나타 내기 위해 박리된다. 이 단계는 비가 역적으로 손상이 다시 사용될 수 없다는 것을 보장하는 장치. 육안 검사시 제외 또는 출력을 표시 할 수 있습니다 질적 컬러 판독에 종이 기반의 면역 결과의 완성. 이러한 결과의 객관성을 평판 스캐너 (도 3b)을 이용하여 획득 된 보정 전 영상에서 명백하다.

실패한 실험은 종종 그 중요성 실험의 분석이 성공적인 결과에 초점을 맞춘 경우, 그렇지 않으면 눈에 보이지 않는 될 수있는 특정 절차 단계를 강조 표시 할 수 있습니다. 우리는 면역 장애의 발생 입체 종이 기반의 미세 유체 소자의 제작 및 조립 에러에 세 보여 : (I)을 때때로, 장치 오류는 분석이 완료된 후까지 명백하지 않다. 예를 들어, MI배양 채널과 포획 영역을 포함하는 층간 salignment 사용자 (도 4a)에 의해 정성 신호의 잘못된 해석을 초래할 수 포지티브 신호에 불규칙 패턴의 현상이 발생할 수있다. 왁스가 충분한 양의 인쇄되지 않거나 용지의 전체 두께를 통해 완전히 용해 할 수없는 경우 (II) 후, 얻어진 소수성 장벽의 완전성이 손상 될 수있다. 이러한 장벽의 불완전 형성 위킹 제어의 손실이 발생하고 장치에서 누수로 이어질 것입니다. 예를 들어, 대신 층 내의 채널로 흐름을 봉쇄하는 반투과성 장벽 왁스 종이면의 다른 윅 유체 허용 할 것이다. 정의 된 채널이 없으면, 샘플 캡처 또는 세척 층에 도달하기 어렵다. 사용자는 크게 단축 분석 지속 시간으로 이러한 종류의 오류를 인식한다. 우리는 라에 붉은 식용 색소의 솔루션을 적용하여이 장치 고장을 보여그 왁스 패턴 YER는 전체 30 초 (그림 4B)에 대한 용융 할 수 없습니다. 이러한 층을 사용하는 면역 분석을 15 분의 예상 시간보다 분명하게 다르다 6 분에 "완료"하였다. (ⅲ) 장치의 제조에 고장이 수 완료하는 데 예상보다 시간이 오래 걸릴 분석 실험. 예를 들어, 잘못 장치 (도 4C)에 들어가는 샘플 또는 세척 완충액을 금지 할 수 인해 시약의 과량 (예컨대, 차단제 또는 콜로이드 골드)의인가에 접착제 또는 폐색 구멍을 잘랐다.

전반적으로, 우리의 제조 프로토콜은 학술 연구소에 유용 규모에 병렬로 다수의 종이 기반 미세 유체 장치를 제조하는 데 유용합니다. 35 음의 복제와 35 개의 긍정적 인 R : 우리는 hCG의 종이 기반 면역의 성능이 병렬로 (70) 분석을 수행하여이 방법을 사용하여 제조 보여eplicates. 이 증명의 목적을 위해, 우리는 우리의 장치의 디자인과 층 세트를 제조 접착제 종이의 층을 부착하고 장치의 행으로 시트를 잘라. 각 시트는 열 장치를 포함 7 행으로 절단 하였다. 이 층은 녹화 후 분석을 수행하는 데 필요한 시약으로 처리되는 더 작은 아크릴 프레임 상에 층들의 배치를 용이. 장치 준비의이 방법은 프로토콜의 메모에 좋습니다. 층의 처리에 따라, 디바이스 10의 스트립에 조립하고 적층시켰다. 최종 디바이스 제조 단계를 완료 한 후에, 디바이스 10의 스트립에 남아있는 시료를 각 장치에 첨가 하였다. 우리는 디바이스에 대한 0 % 실패율 우리 프로토콜을 사용하여 제조 관찰 하였다. 우리는 이러한 분석의 결과를 정량화하기 위해 오픈 소스 화상 처리 소프트웨어 (20)를 사용했다. 다수의 방법은 강도 DISTRIBUT을 분석 할 수 있지만이온 원형 스폿 (예를 들어, 직경 또는 선형 분포) (21)에서는 관심 영역으로서, 전체 검출 스팟을 사용하여 장치의 RGB 화상의 녹색 채널의 평균 강도를 측정한다. 17, 18, 19 우리는 그 다음 날 부정적인 데이터 (그림 3B)를 뺀 긍정과 부정 모두 분석의 측정을 정상화. 분석은 제외 샘플을 사용하여 수행하고 검정 3 % 양성 샘플을 사용하여 수행을 위해 우리는 1 %로 설정 한 각 데이터에 대한 변동 계수를 결정 하였다.

그림 1
그림 1 : 입체 종이 기반 장치의 개략도. 이 그림은 장치 내에 유체 통로를 정의 소수성 및 친수성 영역들뿐만 아니라 PATT를 도시함께 층을 보유 영구 및 이동식 접착제 받 습니 층. 각 층은 (는) 분석에서 수행하는 기능에 의해 표시된다. (두꺼운 종이 크로마토 그래피 : 크로마토 그래피 용지 블루 : 나일론 막을 녹색, 적색) 각 층의 적색, 청색 또는 녹색 개요 특정 층을 제조하는데 사용되는 재료를 나타낸다. 치수는 mm의 장치 내에서 각 영역에 대해 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 입체 종이 기반 미세 유체 장치에서 면역를 제작하는 데 사용되는 절차. 전면과 가열 전후 왁스 인쇄를 이용하여 패터닝 크로마토 그래피 용지의 뒷면 (A) 이미지. (B) 크로마토 종이 시트패턴 화 된 접착제의 필름 백업. (C) 패터닝먼트는 나일론 막을 스트립의 친수성 영역에 적용된. 가이드로 광 상자 맞춤 구멍을 사용하는 다층 디바이스의 스트립 (D) 어셈블리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 종이 기반 면역의 결과를 해석. (A) 종이 기반 장치의 상부 세 층은 분석의 결과를 포획 층을 노출하고 해석하도록 다시 박리된다. (B) hCG를위한 종이 기반 면역 성능의 그래픽 표시. 도시 된 결과 (35)는 각각 fo를 사용하는 복제 여기서 70 회 반복의 평균 동시에 수행hCG의의 양성 및 음성 샘플을 r에. 오차 막대는 데이터 세트의 표준 편차를 나타낸다. hCG의 면역 긍정적 (붉은 색)과 음극 (화이트 컬러) 결과를 묘사 보정, 대표 이미지는 해당 데이터 위에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 제조 오류의 예. (A)로 인해 포획 층 위에 좌우 채널의 어긋남으로, 포지티브 신호가 리드 아웃 영역의 작은 영역에 집중되어있다. A "젖은"원형 영역 (점선)을 포획 층 (왼쪽)와 오정렬 측면 채널 사이의 접촉에 기인하는 판독 영역의 오른쪽에 관찰 될 수있다. 양의 판독에의 이미지제대로 정렬 장치 (오른쪽)의 캡처 층. (B) 층의 두께에 걸쳐 왁스의 불완전한 용해 장치 내의 누출을 초래할 수있다. 식용 색소는 불완전하거나 완전히 형성된 소수성 장벽 층 샘플의 시각화를 지원하기 위해 솔루션에 추가되었습니다. (C) 잘못 절단 접착제 샘플의 유동을 정지 종이의 층 사이의 유체 네트워크를 차단할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 입체 종이 기반 미세 유체 장치를 제조. 회로도가 완료 입체 장치에 조립 및 패턴 종이를 여러 층의 적층을 나타낸다. 이 예에서, (70) 장치 C동시에 할. 접착제 및 정렬 홀 층 단순화 목적 회로도에서 제거되었다. 조립 후, 개별 장치가 제거 될 수 있고 분석에 사용 하였다. (: 크로마토 종이, 청색 : 나일론 막, 녹색 : 두꺼운 종이 크로마토 적색) 각 층의 적색, 청색, 녹색의 윤곽선은 특정 층을 제조하는데 사용되는 재료를 나타낸다. 12 X 28mm 2의 크기를 갖는 별도의 장치 (오른쪽)을 제외하고는 스케일 바 = 25 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

재현 가능한 제조 전략을 식별하는 분석 발달의 필수 성분이다. 22 우리 입체 종이 기반의 미세 유체 소자를 제작 순차 층별 접근법을 사용한다. (ⅰ) 다수의 물질에 대한 방법을 수정하지 않고 하나의 장치 구조에 혼입 될 수있다 : 종이 (23)의 한면에서, 다층 장치를 제조하는 접거나 접기 기법을 적용 이러한 방법과는 대조적으로, 24 첨가제의 제조는 다수의 장점을 제공한다 층의 인쇄 정렬 또는 조립체. (ⅱ) 패턴 화 된 접착 필름은 조립 공정에 통합 될 수있다. 이 필름은 인접 층을 부착하고, 접착제의 강도에 따라, 박리 및 내부 층의 평가를 가능하게하는 뒤집을 수 있습니다. 또한, 접착제의 필요성을 배제 입체 장치에 구조적 완전성을 제공 할바인더 (25) 클립이나 가공 엔클로저. 23 (ⅲ) US 레터 크로마토 용지 개별 시트 크게 실험실 규모의 제조의 처리량을 향상시킬 수있는 복제의 어레이 (도 5)을 수용 할 수있다. 복제 기술이 필요 다양한 실험 조건을 평가할 때 특히 유용하다. 이 방법에 의해, 70 입체 종이 기반 디바이스를 동시에 제조 할 수있다. (IV) 유사 다층 적층 방법은 결과적으로 이러한 입체 종이 기반의 미세 유체 장치의 번역을 제조 장벽을 낮춘다 (예를 들면, 의료 드레싱 및 경피 패치 상처) 보건 수많은 상용 제품의 대량 제조에 사용된다.

박리 및 조립을 용이하게하는 것 외에도, 접착제의 선택은 입체 유체 네트워크의 설계에 매우 중요하다. 광고, 접착 테이프 필름은 인접 층에 친수성 영역의 마스킹을 활성화 할 수 있습니다 종이의 층 사이에 추가 장벽 역할을 할 수 있습니다. 실제로, 접착제의 얇은 층을 사용하는 것이 바람직하다. 접착제 (예를 들면, 많은 양면 테이프)가 너무 두꺼우면, 그 간극이 종이 층 사이에 형성된 위킹 촉진하기에 너무 클 것이며 기능을 회복하기 위해 친수성 물질 (예를 들면, 셀룰로오스 분말)로 채워 져야한다. 이 추가 단계는 제조하기 복잡하고 일부 분석을 방해 할 수 사용 된 물질을 추가하면서 12는 이러한 갭 제어, 유체 압하 밸브의 제조에 유용한 기능이된다. 접착제 (15)는 다른 형태의 입체 종이 기반의 미세 유체 장치의 제조에 사용되어왔다. 스프레이 접착제는 각각 다른 층을 부착 할 수있는 간단한 방법을 제공한다. 이 방법을 사용하여 (26), 접착 재료는 모두 t 상에 균일하게 도포그는 용지의 소수성과 친수성 영역입니다. 이 방법의 장점은, 추가의 장비 (예를 들면, 나이프 플로터 나 레이저 절단기) 접착제 층에 대한 패턴을 설계 할 필요없는 점이다. 그러나, 접착제의 균일 한 분무 적용 조건은 사용하는 재료의 종류마다 실험적으로 결정되어야한다. 재료의 토포 그래피는 접착제 재 계면에 영향을 미칠 수 있고, 이상 분무 시간은 거친 표면을 위해 필요할 수있다. 또한, 유체 통로의 친수성 영역 상에 접착제를 분무하는 용지의 습윤성을 변화시켜 손상된 위킹 될 수있다. 대안 적으로, 스텐실 (27) 팔 스크린 인쇄의 사용은 직접 패터닝 종이 층 패턴 상에 접착제로 사용될 수있다.

입체 종이 기반의 미세 유체 장치의 개발을위한 두 가지 고려 사항은 물질의 선택 및 flui 설계되어DIC 네트워크. (I) 우리 위킹 속도, 습윤 강도, 두께 및 단백질 - 결합 능력에 기초 재료 및 재료의 조합을 선택한다. 분석법의 지속 시간이 반응물의 양에 영향을 미칠 수있는 위킹 속도 나 반응 층 내에 결합한다. 용지의 상이한 등급은 예를 들어,에 기초하여 요금을 위킹 특징, 종이, 그 기공률, 그 두께의 치료. 이 장치의 유효 위킹 속도를 증가시키기 위해 종이 다중 층을 사용할 수있다. 28 우수한 습윤 강도는 장치가 샘플로 포화 된 후 (예, 면역 분석법 박리) 처리를 요구 애플리케이션에 바람직하다. 너무 두껍거나 재료 패터닝 채널 (예를 들어, 포토 리소그래피)을 제조하는 다른 방법을 필요로 인한 취약성으로 상용 프린터를 통과 할 수 없다. 그러나 대조적으로, 두꺼운 재료는 일을 통해 유체를 그릴 오 층 (또는 싱크)에 이상적입니다전자 장치. 나일론 멤브레인 많은 등급 포획 영역에 비가 역적으로 단백질에 결합하는 능력에 차이가 발생할 수있는, 상업적으로 이용 가능하다. 대체 재료 (예를 들어, 대신 나일론 멤브레인의 니트로 셀룰로스)도 분석의 민감도에 영향을 미칠 수있는 능력을 결합에 영향을 줄 수있다. (ⅱ) 유체 네트워크의 설계에서 대칭의 사용은 삼차원으로 패터닝 장치 고유의 채널을 다중화 분석에 중요하다 (예를 들면, 동시에 충전)와 동일하게 동작 할 것을 보장한다. 19 대칭은 또한, 레이어 설계를 단순화 장치의 전체 시트를 조립시 레이어 정렬과 지원, 그리고 낭비를 최소화 할 수 있습니다. 장치 설계에 대한 수정은 분석의 성능에 영향을 미칠 수있다. 유체가 OU에 도달하기 전에 더 긴 거리에 비례 심지 때문에 예를 들어, 상기 배양 층에 좌우 채널의 길이를 증가시키는 것은, 상기 분석의 기간에 영향을 미칠 것이다tlet. 이 포획 층 위에 종래 고정화 바인딩 표시된 종의 비율을 증가시킬 수 있기 때문에 표적 생체 분자의 결합에 의존하는 애플리케이션에서 17 긴 분석 시간이 유리할 수있다.

결론적으로, 우리는 면역 분석법의 개발을 지원하는 입체 종이 기반의 미세 유체 소자를 제작하는 방법을 제시 하였다. 적층 장치를 생산하기 위해 부가적인 제조의 형식을 사용하는이 방법은 실험실 연구에 적합한 규모의 장치의 제작을 용이하게한다. 이 논문에 기재된 프로토콜은 종이 기반 면역 분석 장치 고유; 그러나 이러한 면역 왁스 인쇄 조립체와 관련된 절차를 기대할 층을 접착제를 패터닝 정렬 및 적층된다-다양한 입체 종이 기반의 미세 유체 소자의 구조로 용이하게 확장 될. 제조 방법의 이해 될 수 있습니다의료, 환경, 농업의 다양한 애플리케이션과 새로운 시점 관리 분석의 개발.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illustrator CC Adobe to design patterns for layers of paper and adhesive
Xerox ColorQube 8580 printer Amazon B00R92C9DI to print wax patterns onto layers of paper and Nylon
Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven Fisher Scientific 15-103-0509 to melt wax into paper
Artograph LightTracer Amazon B000KNHRH6 to assist with alignment of layers
Apache AL13P laminator Amazon B00AXHSZU2 to laminate layers together
Graphtec CE6000 Cutting Plotter Graphtec America CE6000-40 to pattern adhesive films
Swingline paper cutter Amazon B0006VNY4C to cut paper or devices
Epson Perfection V500 photo scanner Amazon B000VG4AY0 to scan images of readout layer
economy plier-action hole punch McMaster-Carr 3488A9 to remove alignment holes 
Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 Sigma Aldrich WHA1004917
Fisherbrand chromatography paper (thick)  Fisher Scientific 05-714-4 to function as blot layer
Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) Pall Corporation NBCHI3R to function as material for capture layer
removable/permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF021621 to facilitate peeling
permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF051521
wax liner FLEXcon FLEXMARK 80 D/F PFW LINER to assist with patterning adhesive
acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266  to fabricate frame
self-adhesive sheets Fellowes CRC52215 to use as protective slip
absolute ethanol VWR 89125-172 to sanitize work area
bovine serum albumin AMRESCO 0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls Fisher Scientific 22-071-066 to use as positive and negative samples
anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) Arista Biologicals  CGBCG-0701 to treat conjugate layer
goat anti-α-hCG antibody Arista Biologicals  ABACG-0500 to treat capture layer
10X phosphate buffered saline Fisher Scientific BP3991
Oxoid skim milk powder Thermo Scientific OXLP0031B
Tween 20 AMRESCO M147

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References

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