イムノアッセイのための3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの作製

Published 3/09/2017
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Bioengineering

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Summary

我々詳細イムノアッセイの開発で使用するための三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスを製造する方法。装置アセンブリへの我々のアプローチは、多層の種類、添加剤の製造です。我々は、紙ベースのデバイスのこれらの種類の代表的な結果を提供するためのサンドイッチイムノアッセイを示します。

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Fernandes, S. C., Wilson, D. J., Mace, C. R. Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays. J. Vis. Exp. (121), e55287, doi:10.3791/55287 (2017).

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Abstract

紙は、毛細管現象による自律的に流体を発散します。疎水性の障壁で紙をパターニングすることによって、流体の輸送を制御することができ、紙の層内に向かいます。また、パターン化された紙の複数の層を積層することは、分析および生物分析アッセイの開発を支援することができる洗練された3次元マイクロ流体ネットワークを作成します。紙ベースのマイクロ流体デバイスは使いやすく、ポータブル、安価であり、かつ動作させるために外部機器を必要としません。その結果、彼らは、ポイントオブケア診断のためのプラットフォームとして非常に有望です。適切ユーティリティと紙ベースのデバイスの分析性能を評価するために、適切な方法は、その製造が再現可能な実験室の設定に適したスケールであることを確認するために開発されなければなりません。本稿では、紙ベースの免疫測定法に使用することができる一般的なデバイス構造を作製する方法が記載されています。私たちは、添加剤manufacturinの形式を使用しますG(多層積層体)は、パターン化された紙とパターン化接着剤の複数の層を含むデバイスを作製しました。ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)のための免疫測定法を用いてこれらの三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスの適切な使用を示すことに加えて、デバイスの故障をもたらすことができる製造工程における誤差が議論されています。私たちは、限られたリソースの設定のために特別に設計された分析アプリケーションの開発において広範な有用性を見出すであろう紙ベースのデバイスを製造するためのこのアプローチを期待しています。

Introduction

紙は、製剤または等級の範囲内で広く利用可能で調整するために、そのプロパティを官能化することができ、毛細管現象またはウィッキングによって自律的に流体を輸送することができます。紙は疎水性物質( 例えば 、フォトレジスト1またはワックス2)でパターン化されている場合、流体のウィッキングは、紙の層内に空間的に制御することができます。例えば、印加された水性サンプルは、紙の中に格納された化学的および生化学的な試薬と反応させるために、異なるゾーンの数に向けることができます。これらの紙ベースのマイクロ流体デバイスは、ポータブルで安価な分析アッセイ3、4、5、6、7の開発に有用なプラットフォームであることが実証されています。紙ベースのマイクロ流体デバイスのアプリケーションでは、ポイントオブケア診断を含みますEF "> 8、環境汚染物質のモニタリング9、偽造医薬品10、および非局在化医療(またはの検出「限られたリソースの設定11における遠隔医療」)。

パターン化された紙の複数の層は、その入口及び出口連結された、または独立したままにすることができる連続的な流体ネットワークを形成するように接続する親水性ゾーンの隣接層から( すなわち 、上または下)の集積装置に組み立てることができます。 12各層は単一のデバイス上で実行される試薬及び複数のアッセイの空間的分離を可能にするユニークなパターンを含むことができます。得られた3次元マイクロ流体デバイスだけでなく、分析的アッセイを可能にするために流体をウィッキングすることが可能である( 例えば 、肝機能は、13および小分子14の電気化学的検出をテストし)、それがSUPこともできますポート洗練された機能の数は、従来のマイクロ流体のアプローチに共通する( 例えば 、15および簡単な機械弁16)。紙は、毛管現象によって流体を発散するので重要なことには、これらのデバイスは、ユーザからの最小限の労力で操作することができます。

試薬は、紙ベースのデバイスの三次元構造内に格納することができるので、複雑なプロトコルは、デバイスへの水性サンプルの単一添加にすることができます。最近、我々は、パターン化層を作成するために、ワックス印刷技術を使用して紙ベースのイムノアッセイの開発に使用することができる一般的な3次元デバイスのアーキテクチャを導入しました。積層デバイス数の設計に関連する側面は、層の組成、及び3次元マイクロ流体ネットワーク制御全体のあたりのパターン使用方法に焦点を当てた17、18これらの研究イムノアッセイのフォーマンス。最終的に、我々は、多重化イムノアッセイ19の急速な発展を促進するために、これらの設計ルールを使用することができました。本稿では、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG;妊娠ホルモン)のために以前に開発されたイムノアッセイ17は、我々は、三次元の紙ベースのイムノアッセイの組立及び製造のために開発した戦略を説明するために例として使用されます。したがって、我々は、アセンブリと操作デバイスのではなく、アッセイの開発に焦点を当てます。

hCGを検出するために使用されるフォーマットであるサンドイッチイムノアッセイにおいて、ホルモンのサブユニットに特異的な捕捉抗体は、サンプルまたは後続の試薬の非特異的吸着を制限するためにブロックされている固体基板上にコーティングされます。この基板は、ほとんどの場合(酵素結合免疫吸着アッセイまたはELISAのために、例えば 、)ポリスチレンマイクロウェルプレートです。次いで、試料をありますウェルに添加し、一定期間インキュベートしました。厳密な洗浄の後、hCGの他のサブユニットに特異的な抗体を加え、インキュベートします。この検出抗体は、測定可能な信号を生成するために、コロイド粒子、酵素、または蛍光団に結合体化され得ます。ウェルを再び前( 例えば 、プレートリーダーを用いて)アッセイの結果を解釈するために洗浄されます。市販のキットは、この時間のかかる多段階プロセスに依存しているが、これらのステップをすべてのユーザーに最小限の介入で紙ベースのマイクロ流体デバイス内で迅速に行うことができます。

hCGの免疫測定法に使用される装置は、試料添加、共役ストレージ、インキュベーション、捕獲、洗浄、及びブロット( 図1)に使用される上から下に、6つの活性層を備えます。試料添加層を定性濾紙から作られます。これは、液体試料の導入を容易にし、共役レーに試薬を保護します環境やユーザによる偶然の接触による汚染からR。複合体層(定性濾紙)は、イムノアッセイ用の発色試薬( 例えば 、金コロイド標識抗体)を保持します。インキュベーション層(定性濾紙)は、サンプルが次の層、捕捉層に到達する前に試薬と検体の結合を促進するために、紙の平面内で横方向に移動することを可能にします。捕獲層(ナイロン膜)が材料に吸着し、分析物に特異的なリガンドが含まれています。分析が完了した後、この層は、完成した免疫複合体の可視化を可能にするために明らかにされます。洗浄層(定性ろ紙)が離れブロット層(厚さのクロマトグラフィー紙)への捕獲層の面から自由に共役試薬を含む過剰の流体を描画します。 ASSEMの完全性を維持する永続的な接着剤4の層:6層装置は、パターン、両面接着の5層によって一緒に保持されています採血装置およびリムーバブル接着剤の1層は、捕捉層にイムノアッセイの結果を検査する装置の剥離を容易にします。

本稿の目的のために、我々は関係の専用の議論を可能にする紙ベースの免疫測定法の代表的な結果を提供するためのhCG(それぞれ0 MIU / mLおよび81 MIU / mLで)のみ陰性および陽性対照サンプルを使用します製造方法及び装置の性能。成功したデバイスを製造する方法を示すことに加えて、我々は、デバイスまたは再生不可能なアッセイ結果の故障につながる可能性がいくつかの製造誤差を強調表示します。この原稿で詳述したプロトコルとの議論は、紙ベースのイムノアッセイを設計・製造されているどのように貴重な洞察を持つ研究者を提供します。私たちは、イムノアッセイに私たちのデモを集中しながら、我々は、本明細書に提示ガイドラインは3-DIMENの製造に広く有用であろうと予想していますsional紙ベースのマイクロ流体デバイス。

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Protocol

紙ベースのマイクロ流体デバイス層の調製

  1. グラフィックデザイン・ソフトウェア・プログラムを使用して、紙、ナイロン、および接着剤の層のためのパターンを準備します。 6各層は異なるパターンを有することができます。
    注:パターンは、機能紙ベースの免疫測定法のために必要とされていない位置合わせ穴を含むが、三次元デバイスの再現可能な製造を支援することができます。デバイスがストリップで、または完全なシートとして、個別に組み立てられている場合は、これらの穴の配置が異なります。パターンを設計するために使用されるソフトウェアプログラムは、パターニング技術( 例えば 、フォトリソグラフィー、ワックス印刷、または切断)の選択に基づいて変化し得ます。 6
  2. 70%(v / v)のエタノールおよび水の溶液で作業領域をスプレー。清潔なペーパータオルで作業領域を拭いてください。

紙層の調製:試料添加、共役ストレージ、インキュベーション、および洗浄レイヤー

  1. 大型卓上ペーパーカッターを用いて定性ろ紙の層を準備します。固体インク(ワックス)プリンタを使用してパターン形成を容易にするために、標準の用紙サイズに用紙のストックシートをカット。例えば、単一の460 X 570ミリメートル2シートは、USレター用紙(8.5×11インチ2)の4枚を作ることができます。汚染を最小限に抑えるために、すべての回で清潔な手袋をした紙を扱います。
  2. プリンタトレイにクロマトグラフィー紙のカット紙をセットします。印刷以前に設計された層( 図1を参照)。
    注:パターンは、自動送りを使用して、このシート上に直接印刷することができます。唯一の一枚の紙は、紙詰まりを避けるために、一度に印刷する必要があります。全ての層については、「拡張」の印刷設定を使用します。

ナイロン膜層の調製:キャプチャー・レイヤ

  1. (2 7.5×10インチ)卓上ペーパーカッターを使用してシート状にナイロン膜のストックロールをカットします。ナイロンの取り扱いに細心の注意を払いますその完全性を維持し、リッピングから保護するための膜。ナイロン膜は水分に敏感であるため、デシケーターキャビネット内の任意の未使用の材料を保管してください。
    注:カットシートは、USレター用紙よりも狭いです。ナイロン膜は薄くて壊れやすいので、直接プリンタで処理され、サポートを必要とすることはできません。詳細は後述します。
  2. ワックスのプリンタを使用して、コピー紙の上に捕獲層パターンを印刷し、それをナイロン膜の位置決めのためのガイドとして機能するライトボックスにテープで固定します。ライトボックスは、複数の層の位置合わせを助けます。
  3. コピー用紙の先に印刷されたシート上にコピー紙のクリーンシートを置きます。ライトボックスに紙のクリーンシート、テープではなく、テープ2枚一緒に行います。
  4. コピー用紙のクリーン片上にナイロン膜のカットシートを配置します。膜は、コピー用紙の最下層の印刷領域をカバーしていることを確認してください。テープクリーンシートにナイロン膜の四方コピー用紙の。
    注:印刷( 例えば 、紙詰まりやワックスの印字ムラ)に問題がないように、ナイロン膜が平滑であることを確認します。ワックスは、ナイロン膜は、コピー用紙に付着されたテープに印刷することができます。この問題が発生した場合、ナイロンが不完全に起因するテープ・カバレッジにパターン化された領域は破棄されるべきです。将来の調製のために、ナイロン膜のより大きな片をこの印刷エラーを回避するために使用することができます。
  5. 手差しプリンタートレイに(それに固定されたコピー用紙でサポートされている)ナイロン膜のシートをロードします。一度にナイロン膜の一枚だけを印刷します。
    注:それはパターン化されていないようブロット層のために必要な一切の調製工程は、ありません。

4.印刷層における疎水性の障壁を作成します

  1. 重力対流オーブン内に置いたときにテープ層の上下に均一な加熱のためにアクリルフレームに層を印刷しました。にテープで留めナイロン膜を保ちますワックスが溶融され、疎水性の障壁を形成した後まで、コピー紙の支持体シート。
    注:アクリルフレームは1/2のカスタムメイド、レーザー切断片である」。。厚手のアクリルプラスチック製造されるデバイスの数に応じて、2つのフレームサイズを使用したより小さなフレームの外枠は11 5/8を測定します」 ×2 3/4×1 3/4 "、およびフレームの内側の穴が10 3/8を測定する" "×8 7/8」。大きなフレームの外側の境界線は11 5/8を測定し」、および内部フレームの穴は "×7 7/8" 10 1/4を測定します。オープン、内部空間があっても、紙の厚さ全体にわたってワックスの融解を可能にします。
  2. ワックスは、紙の厚さに溶けるまで30秒間150℃のオーブンでレイヤーを配置します。ワックスはそれを裏返し、設計の欠陥をチェックすることによって、紙の厚さに浸透していることを確認してください。
    注:強制空気炉またはホットプレートは、固体ワックスインクを溶融するのに使用することができます。融解回または温度が加熱方法に依存して変化し得ます。
  3. アクリルフレームから紙やナイロン膜を削除します。また、コピー用紙の支持シートからナイロン膜を除去します。

接着剤層の5準備

  1. 以前に(ステップ1.1)を調製した設計ファイルを使用してロボットナイフプロッタを使用して接着フィルムのパターン両面シート、。ワックスライナーのシートを使用して、任意の露出した接着剤の表面を保護します。
    注:両面接着は、サンプルが連続流体経路などの層を通って流れることを可能にする穴でパターン化されるべきです。ワックスライナーが容易に接着剤から除去し、切断中の汚染および引き裂きから保護する働きをします。レーザーカッター、又はダイプレスはまた、接着フィルムのパターン層に使用することができます。

接着剤でデバイス層の6バッキング

  1. 70%(v / v)のエタノールおよび水の溶液でライトボックスを吹き付けます。きれいな紙トンで拭きますowel。
  2. テープ印刷面を下にしてライトボックスに接着剤で裏打ちする必要があり、紙またはナイロン膜のパターン層。
  3. 接着剤のパターンシートから保護ライナーの剥離片側と紙またはナイロン膜の層にそれを貼り付けます。パターンの適切な位置合わせを確実にするために、光ボックスを使用します。一緒に押します。保護スリップに部分的に組み立てられた装置を配置します。
    注:保護スリップは、彼らがラミネータローラーに接触しないことを確実にすることによって、汚れや破損からデバイスを保護するラミネートフィルムバッキングの折り返し部分です。
  4. 隣接層からの空気のいずれかのポケットを除去して、完全に一緒に接着剤と紙を押して、自動ラミネーターを通して得られた二層接合体を渡します。
    注:デバイスの層の間のエアポケットが漏れを引き起こすことによって、デバイスの整合性と発散性に優れた再現性を妨害することができます。

コンジュゲートLの7治療前装置アセンブリへの免疫アッセイのための試薬とのアヤ

  1. 親水性ゾーンが治療されるようなアクリルフレームにテープ複合体層は、フレームとの接触中に懸濁していません。
  2. 複合体層上の親水性領域に1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で100 mg / mlウシ血清アルブミン(BSA)2.5μLを加えます。それは2分間室温で乾燥した後、5分間65℃にすることを可能にします。
    注:このボリュームは、紙のゾーンを濡らすことだけで十分です。 BSA溶液は、紙や試薬がサンプルによって再水和されたときにナノ粒子の放出を容易にする、乾燥工程中に、コロイド状ナノ粒子の凝集を防止するのに役立ちます。
  3. 抗β-hCGの抗体に結合した5 ODコロイド金ナノ粒子の5μlを添加し、乾燥工程を繰り返します。
    注:コロイド状金ナノ粒子の濃度の単位はしばしばabsoにより測定される光学密度(OD)として表されますλ= 540 nmでrbance。いいえ処理はセクション10内のデバイスの組み立て前ウィックパッドのために必要とされません。

イムノアッセイ用の試薬と横方向チャンネルの8治療装置アセンブリの前に

  1. 親水性ゾーンが治療されるようなアクリルフレームにテープの横方向チャネル層は、フレームとの接触中に懸濁していません。
  2. エージェントブロッキングを10μl加える(5 mg / mlで無脂肪乳および0.1%の(v / v)の1×PBS中にTween 20)で横方向のチャネルを処理します。共役層として(5分間65℃で、次いで室温で2分と)同じ乾燥工程を繰り返します。

免疫アッセイのための試薬で捕獲層の9治療装置アセンブリの前に

  1. 親水性ゾーンが治療されるようなアクリルフレームにテープ捕獲層は、フレームとの接触中に懸濁していません。
  2. 1mg / mlの抗α-hCGの抗体の5μLで捕獲層を扱い、その後許可試料を65℃で8分間、続いて2分間室温で乾燥させます。
  3. ブロッキング剤の2μLを加える(5 mg / mlで無脂肪乳および0.1%(v / v)を1×PBS中のTween 20)。捕獲層のための乾燥工程を繰り返します。
    注:この量が多すぎるブロッキング剤を使用する場合に発生する可能性ナイロン膜の細孔を閉塞することなく紙、コートに適切です。

三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスの10議会

  1. ライトボックスに洗浄層をテープ(印刷面が上向きに)。位置合わせ穴を使用する場合、手持ち穴パンチツールを使用して、次の層から取り除きます。
  2. 接着剤を露出させるために捕獲層の裏面に保護フィルムを取り外します。ガイドとして位置合わせ穴を使用して洗浄層の上方捕獲層を合わせます。 2つの層を一緒に押します。デバイスへの汚染や損傷を最小限にするために親水ゾーンに触れないようにしてください。ピンセットassembを支援するために使用することができますLY。
  3. 接着剤を露出させるためにインキュベーション層の裏面に保護フィルムを取り外します。捕獲層の上にインキュベーション層を合わせ、それらを一緒に押します。すべてのアクティブな層が組み立てられるまで、このようにレイヤーを追加し続けます。
  4. 保護スリップに部分的に組み立てられた装置を置き、しっかりとラミネーターを使用して層を一緒に貼り付けます。
  5. 洗浄層の裏面に保護フィルムを取り外し、デバイスの底部にブロット層を貼り付けます。繰り返し積層工程10.4三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスの組み立てを完了する。切り取りストリップまたはハサミを用いて完全に組み立てられた装置のシートからデバイスの数を所望します。
    注:デバイスの完全なシート装置のストリップ、または単一のデバイスは、同様の手法を用いて調製することができます。

紙ベースのイムノアッセイを実行する11

  1. デバイスの上に親水ゾーンに20μlのサンプルを追加します( つまり 、トン彼は)層をサンプリングします。
  2. その後、装置内に完全に芯(1×リン酸緩衝生理食塩水で0.05%(v / v)のTween 20)で洗浄緩衝液15μLを追加するために、サンプルを待ちます。洗浄バッファーの最初のアリコートを装置内に完全に吸い上げた後、洗浄緩衝液の第二の15μlのアリコートを追加します。
    注:洗浄緩衝液は、液滴が紙の表面にはメニスカスを示さない、消えてしまったデバイスに完全に邪悪されています。洗浄緩衝液の第二のアリコートを完全に装置に入ったときにアッセイが完了する。
  3. アッセイの結果を明らかにするために、捕捉層を露出させるためにピンセットを使用してデバイスの三トップ層をはがし。
    1. 色の有無を観察することにより、定性的アッセイの結果を解釈します。あるいは、結果を定量化し、範囲内の強度の分布を特徴付けるために、デスクトップスキャナ用画像処理ソフトウェア又はアルゴリズムを用いて画像再生層検出ゾーン。 20

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Representative Results

3次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスで再現可能なアッセイ性能を得ることは、デバイス間の一貫性を保証する製造方法に依存しています。この目標に向かって、我々は、製造プロセスおよび材料の考慮事項の数を特定しており、紙ベースのイムノアッセイを実証するのコンテキストでそれらをここで議論します。私たちは、紙ベースのマイクロ流体デバイス( 図2A)内の疎水性の障壁を形成するために、ワックスの印刷方法を使用します。 2この方法は、それだけで広く利用可能なオフィス機器に依存しているため、理想的で完了するために、最小限の処理手順を必要とし、タンパク質吸着を妨害するか、紙の繊維の濡れ性を変化させる可能性がある化学物質( 例えば 、フォトレジスト)を使用する必要はありません。また、ワックスの印刷は、繰り返し演奏と持続時間tiのでアッセイのために重要である、再現可能な寸法の流体経路を作り出しますMES。疎水性の障壁を形成した後、接着剤シートは、三次元デバイス( 図2B)の組み立てを容易にするために、層に適用されます。接着フィルム層( 図2C)の後ろに追加された後、イムノアッセイに必要な試薬を適用することができます。多くのデバイスは、並行して調製することができるので、この手順は、学術研究室で製造プロセスのために有用です。免疫測定装置の組立工程は、( 図2D)、デバイスのすべての層が積層された後に完了し、一緒に積層されています。私たちは、アッセイを開始するためにサンプルを追加します。この例では、サンプルは、我々のデバイスの動作を実証するように、我々は、緩衝液中のhCGの負及び正のサンプルを含む妊娠検査のための尿の制御セットを使用して、アッセイの再現性は、それらを使用して行きました。洗浄緩衝液の2つのアリコートを順次添加します。洗浄緩衝液の最後のアリコートを、デバイスを完全に入ったらアッセイが完了したと見なされます。トップ3の層は、その後、捕獲層( 図3A)を明らかにするために剥離しています。デバイスが再使用できないことを保証するこのステップは、不可逆的に損傷。目視検査の際に正または負の出力を示すことができる定性的なカラー読み出しにおける紙ベースの免疫測定結果の完了。これらの結果の客観性は、フラットベッドスキャナ( 図3B)を使用して取得された未補正画像において明らかです。

失敗した実験では、多くの場合、その重要性実験の解析が成功した結果に焦点を当てているときに他の方法で知覚できない可能性のある特定の処理手順を強​​調表示することができます。私たちは、イムノアッセイの障害が発生する3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの製造および組立における3つのエラーを実証:時々(i)を、デバイスの障害は、アッセイが完了した後まで明らかではありません。例えば、MIインキュベーションチャネルおよび捕捉ゾーンを含む層との間にsalignmentは、ユーザー( 図4A)によって定性的な信号の誤解を招く可能性がある、正の信号で不規則なパターンの開発を引き起こす可能性があります。ワックスが十分な量で印刷されていないか、紙の全厚さを完全に溶融させていない場合(ii)は、得られる疎水性の障壁の完全性が損なわれる可能性があります。これらの障壁の不完全形成は、ウィッキングの制御の損失が発生し、デバイス内の漏れにつながります。たとえば、代わりに層内のチャネルへの流れを閉じ込めるの、半透過性ワックスの障壁は、流体が他の場所で紙の面で吸い上げることができます。定義されたチャネルがなければ、サンプルは、キャプチャまたは洗濯層に到達することはほとんどありません。ユーザーが大幅に短縮アッセイ継続時間としてこの種のエラーを知覚します。私たちは、ラに食紅の溶液を適用することによって、このデバイスの故障を実証しますそのワックスパターンヤーは完全な30秒( 図4B)のために溶融させていませんでした。このような層を用いた免疫は、15分の予想所要時間よりも明らかに異なる6分、中に「完了」しました。 (iii)の完了に予想以上の時間がかかるアッセイは、デバイスの製造に故障を示すことができます。たとえば、不適切なデバイス( 図4C)に入るからサンプルまたは洗浄バッファーを禁止することができ起因する試薬の過剰量( 例えば 、ブロッキング剤またはコロイド状金)の適用に接着剤または閉塞した細孔をカット。

全体的に、当社の製造プロトコルは、学術研究所のために有用である規模で並列に多数の紙ベースのマイクロ流体デバイスを製造するのに有用です。 35ネガティブ複製35正R:我々は、並列に70アッセイを行うことによって、この方法を用いて調製したhCGの紙ベースの免疫アッセイの性能を実証しますeplicates。このデモの目的のために、我々は、我々のデバイスの設計と層のセットを用意した接着剤と紙の層を貼り付け、その後、デバイスの列にシートをカット。各シートには、10のデバイスが含まれて7行、に切断しました。これは、層がテープとその後のアッセイを実行するのに必要な試薬で処理して小さいアクリルフレーム上の層の配置を容易にしました。デバイスの準備のこの方法は、プロトコルでのノートで提案されています。層の処理に続いて、デバイスは、10のストリップで組み立て、その後、積層しました。最終的なデバイスの製造工程が完了した後、デバイスは、10のストリップに残った試料を各装置に添加しました。我々は、我々のプロトコルを使用して製造されるデバイスのための0%の失敗率を観察しました。我々は、これらのアッセイの結果を定量化するためにオープンソースの画像処理ソフトウェア20を使用します。多くの方法は、強度distributを分析するために利用可能であるが円形のスポット( 例えば 、放射状または線形分布)21におけるイオン我々が関心領域として、全体の検出スポットを使用してデバイスのRGB画像のグリーンチャンネルからの平均強度を測定します。 17、18、19 我々は、次に生負のデータ( 図3B)を減算することにより正と負の両方のアッセイの測定値を正規化します。アッセイは陰性サンプルを用いて行い、アッセイのための3%陽性サンプルを使用して実施するために、我々は1%に設定した各データの変動係数を決定しました。

図1
図1:3次元の紙ベースのデバイスの概略図。この図は、装置内の流体の経路を定義する疎水性および親水性領域、ならびにPATTを示しています層を一緒に保持する恒久的かつ取り外し可能な接着剤の層をerned。それぞれの層は、それをアッセイで行う機能により標識されています。 (厚手のクロマトグラフィーペーパー:クロマトグラフィー紙、青:ナイロン膜、緑、赤)の各レイヤー上に、赤、青、または緑の輪郭は、その特定の層を製造するために使用される材料を示しています。寸法はmmで、デバイス内の各ゾーンに与えられています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスのイムノアッセイを製造するために使用される手順。 (A)加熱前後のワックス印刷を用いてパターンクロマトグラフィー用紙の表裏の画像を。 (B)クロマトグラフィー紙パターン化された接着剤のフィルムで裏打ちされました。 (C)治療は、パターン化されたナイロン膜のストリップの親水ゾーンに適用されます。ガイドとして光ボックスと位置合わせ穴を使用して、多層デバイスのストリップの(D)アセンブリ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:紙ベースの免疫アッセイの結果を解釈します。 (A)紙ベースのデバイスの上部3層は、捕捉層を露出させ、アッセイの結果を解釈するために戻って剥離します。 (B)のhCGのための紙ベースのイムノアッセイの性能のグラフ表示。示した結果は、35は、それぞれのfo使用される複製場所70の複製の平均を同時に行いますhCGの正と負のサンプルrを。エラーバーは、データセットの標準偏差を表します。 hCGの免疫から正(赤色)と負(白色)結果を示す補正されていない、代表的な画像は、それぞれのデータの上に示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:製造誤差の例。 (A)により捕捉層上の横方向チャネルのずれに、陽性シグナルは、読み出し領域の小領域に集中しています。 「ウェット」円形領域(破線)は、捕捉層(左)とのずれ横チャネルとの間の接触に起因する読み出し領域の右側に観察することができます。正の読み出し上の画像適切に整列装置(右)の捕捉層。 (B)層の厚さ全体にワックスの不完全な溶融は、デバイス内の漏れにつながることができます。食品着色料が不完全であるか、完全に形成された疎水性の障壁を有する層中の試料の可視化を支援するソリューションに追加されました。 (C)は、不適切な接着剤がサンプルの流れを停止させる紙の層の間に流体ネットワークを遮断することができる切断しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:3次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスを製造。概略的には、完成した三次元デバイスにアセンブリおよびパターン化紙の複数の層の積層体を示しています。この例では、70デバイスC同時に行うこと。接着剤とアライメント穴の層は、簡略化のために回路図から削除されました。組み立て後、個々のデバイスを除去することができるし、アッセイに使用しました。各層に、赤、青、緑の輪郭その特定の層(赤:青クロマトグラフィー紙、グリーンナイロン膜:厚クロマトグラフィー紙)を製造するために使用される材料を示しています。 12×28ミリメートル2の寸法を有する別の装置(右)、を除くスケールバー= 25ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

再現可能な製造戦略を識別することはアッセイ開発の必須成分です。 22は、我々は3次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスを製造するために、順次、層ごとのアプローチを使用します。 (ⅰ)複数の材料がする方法に変更することなく、単一のデバイス・アーキテクチャに組み込むことができます:紙23の単一のシートから多層デバイスを製造するための折り畳みまたは折り紙の技術を適用し、これらの方法とは対照的に、24添加剤の製造は、多くの利点を提供しています層の印刷、アライメント、またはアセンブリ。 (ii)のパターン化接着フィルムは、組立プロセスに統合することができます。これらのフィルムは、隣接する層を貼り付け、および、接着剤の強度に基づいて、剥離や内部層の評価を可能にするために、可逆的であることができます。また、接着剤は必要性を排除する三次元デバイスに構造的完全性を提供しますバインダー25クリップや機械加工エンクロージャ用。 23(ⅲ)USレタークロマトグラフィー紙の個々のシートは大幅に実験室規模製造のスループットを向上させることができる反復の配列、( 図5)を収容することができます。技術的反復を必要とする多数の実験条件を評価する場合に特に有益です。このアプローチにより、70三次元の紙ベースのデバイスを同時に製造することができます。 (IV)と同様の多層積層アプローチは結果的に、これらの三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスを変換する生産障壁を低下させる( 例えば 、ケア包帯および経皮パッチを創傷)医療における多数の市販製品の大量生産のために使用されます。

剥離及び組立を容易にすることに加えて、接着剤の選択は、3次元の流体ネットワークの設計に重要です。広告hesiveフィルムは、隣接する層に親水ゾーンのマスキングを有効にすることができ、紙の層の間に追加の障壁として機能することができます。実際には、接着剤の薄い層を使用することが望ましいです。接着剤は、( 例えば 、多くの両面テープ)厚すぎる場合には、紙の層の間に形成された隙間は、ウィッキングを促進するには大きすぎるだろうと機能を取り戻すために親水性物質( 例えば 、セルロースパウダー)で満たされている必要があります。 12この追加のステップは、製造し、使用される物質は、いくつかのアッセイを妨害する可能性が複雑になりますが、これらのギャップは、制御可能な、流体プッシュダウンバルブの生産のための便利な機能になります。接着剤15の他の形態は、三次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスの製造に使用されてきました。接着剤スプレーは、互いに層を固定するための簡単な方法を提供します。この方法を使用して26、接着材料は、両方のT上に均一に塗布されています彼の紙の疎水性および親水性の領域。この方法の利点は、追加の機器( 例えば 、ナイフプロッターまたはレーザーカッター)は、接着剤層のパターンを設計する必要がないことです。しかし、接着剤スプレーを均一に塗布するための条件は、使用する材料の種類ごとに実験的に決定されなければなりません。材料のトポグラフィーは、接着剤材料の界面に影響を与えることができ、より長いスプレー時間が粗い表面のために必要とされてもよいです。また、流体経路の親水性の区域に接着剤を噴霧すると、紙の濡れ性を変化させることによって障害ウィッキングをもたらすことができます。あるいは、8を印刷ステンシル27またはスクリーンを使用することは、パターン化された紙の層の上に直接パターン接着剤に使用されてもよいです。

3次元の紙ベースのマイクロ流体デバイスの開発のための2つの主要な考慮事項は、材料の選択とfluiのデザインですDICネットワーク。 (ⅰ)当社は、ウィッキングレート、湿潤強度、厚さ、およびタンパク質結合容量に基づいて材料および材料の組み合わせを選択します。アッセイの期間と時間試薬の量に影響を与えることができるウィッキング率は反応もしくは層内にバインドする必要があります。紙の異なるグレードは、例えば、に基づいて料金をウィッキングによって特徴付けられる、紙、その気孔率、その厚さの治療。デバイスの効果的なウィッキング速度を高めるために、紙の複数の層を使用することが可能です。 28良好な湿潤強度は、デバイスがサンプルで飽和された後( 例えば 、イムノアッセイを剥離)を取り扱う必要とするアプリケーションのために望ましいです。厚すぎるか、その材料がパターン化チャネル( 例えば 、フォトリソグラフィ)を生成するために別の方法が必要になります原因で脆弱性に商用プリンタを通過することはできません。しかし、対照的に、より厚い材料が目を通して流体を描画するためのブロット層(またはシンク)に理想的です電子装置。ナイロン膜の多くのグレードは、捕捉ゾーンに不可逆的にタンパク質に結合するそれらの能力が異なることができる、市販されています。材料置換( 例えば 、ニトロセルロースの代わりにナイロン膜)は、アッセイの感度に影響を与える可能性がある、結合能力に影響を与えることができます。 (ii)は、流体ネットワークの設計における対称性の使用は、3次元デバイスにパターニングユニークなチャネルが多重化アッセイのために重要である、( 例えば 、同時に満たされた)同じように動作することを保証します。 19対称性は、さらなる層の設計を簡素化し、デバイスの完全なシートを組み立てるときの層の配置を支援し、廃棄物を最小限に抑えることができます。デバイス設計の修正は、アッセイの性能に影響を与えることができます。流体がOUに到達する前に比例して、より長い距離を芯になるので、例えば、インキュベーション層の横チャネルの長さを増加させると、検定の継続時間に影響を与えますtlet。それは、捕捉層に固定化前に結合した、標識された種の割合を増加させることができるので、17標的生体分子の結合に依存するアプリケーションでは、より長い検定時間が有利であり得ます。

結論として、我々は、免疫アッセイの開発を支援三次元紙ベースのマイクロ流体デバイスを製造する方法を提示しています。多層デバイスを製造するために添加剤の製造のタイプを使用して、この方法は、実験室での研究に適しているスケールでのデバイスの製造を容易にします。この原稿に記載されているプロトコルは、紙ベースの免疫アッセイ装置に特異的です。しかし、我々は、これらのイムノアッセイワックス印刷のアセンブリに関連する手順を期待する層を、接着剤をパターニング合わせて、および積層は-ます多数の3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスのアーキテクチャに容易に拡張できます。製造方法の理解がつながることができます医療、環境、農業における幅広いアプリケーションを持つ新しいポイントオブケアアッセイの開発に。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illustrator CC Adobe to design patterns for layers of paper and adhesive
Xerox ColorQube 8580 printer Amazon B00R92C9DI to print wax patterns onto layers of paper and Nylon
Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven Fisher Scientific 15-103-0509 to melt wax into paper
Artograph LightTracer Amazon B000KNHRH6 to assist with alignment of layers
Apache AL13P laminator Amazon B00AXHSZU2 to laminate layers together
Graphtec CE6000 Cutting Plotter Graphtec America CE6000-40 to pattern adhesive films
Swingline paper cutter Amazon B0006VNY4C to cut paper or devices
Epson Perfection V500 photo scanner Amazon B000VG4AY0 to scan images of readout layer
economy plier-action hole punch McMaster-Carr 3488A9 to remove alignment holes 
Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 Sigma Aldrich WHA1004917
Fisherbrand chromatography paper (thick)  Fisher Scientific 05-714-4 to function as blot layer
Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) Pall Corporation NBCHI3R to function as material for capture layer
removable/permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF021621 to facilitate peeling
permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF051521
wax liner FLEXcon FLEXMARK 80 D/F PFW LINER to assist with patterning adhesive
acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266  to fabricate frame
self-adhesive sheets Fellowes CRC52215 to use as protective slip
absolute ethanol VWR 89125-172 to sanitize work area
bovine serum albumin AMRESCO 0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls Fisher Scientific 22-071-066 to use as positive and negative samples
anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) Arista Biologicals  CGBCG-0701 to treat conjugate layer
goat anti-α-hCG antibody Arista Biologicals  ABACG-0500 to treat capture layer
10X phosphate buffered saline Fisher Scientific BP3991
Oxoid skim milk powder Thermo Scientific OXLP0031B
Tween 20 AMRESCO M147

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References

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