La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

Published 2/15/2017
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Neuroscience

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Summary

Una vez retirado del cuerpo, el tejido neuronal se ve afectada en gran medida por las condiciones ambientales, lo que lleva a una eventual degradación de los tejidos después de 6-8 h. Utilizando un método de incubación única, que sigue de cerca y regula el ambiente extracelular de los tejidos, la viabilidad del tejido se puede ampliar de manera significativa para> 24 h.

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Cameron, M. A., Kekesi, O., Morley, J. W., Bellot-Saez, A., Kueh, S., Breen, P., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. J. Vis. Exp. (120), e55396, doi:10.3791/55396 (2017).

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Abstract

Aguda preparaciones de tejidos neuronales, rodajas de cerebro y de la retina wholemount, por lo general sólo puede ser mantenido durante 6 - 8 h después de la disección. Esto limita el tiempo experimental, y aumenta el número de animales que se utilizan por estudio. Esta limitación específicamente impactos protocolos tales como imágenes de calcio que requieren pre-incubación prolongada con tintes de baño-aplicado. crecimiento bacteriano exponencial dentro de 3 - 4 h después de cortar está estrechamente correlacionada con una disminución de la salud de los tejidos. Este estudio describe un método para limitar la proliferación de bacterias en preparaciones agudas para mantener el tejido neuronal viable durante periodos prolongados de tiempo (> 24 h) sin la necesidad de antibióticos, los procedimientos estériles, o medios de cultivo de tejidos que contienen factores de crecimiento. Ciclando el fluido extracelular a través de la irradiación UV y mantener el tejido en una cámara de retención de encargo en 15 - 16 ° C, el tejido no muestra diferencias en las propiedades electrofisiológicas, o si calciognaling a través de colorantes de calcio intracelular en> 24 h postdissection. Estos métodos no sólo extender el tiempo experimental para aquellos que utilizan tejido neuronal aguda, pero se reducirá el número de animales necesarios para completar objetivos experimentales, y establecerá un estándar de oro para la incubación del tejido neuronal aguda.

Introduction

Electrofisiología y la imagen funcional (calcio, colorantes sensibles al voltaje) son dos de las técnicas experimentales más utilizados en la neurociencia. preparaciones de cortes de cerebro y de la retina wholemount, que será examinada aquí, proporcionan un medio de examinar las propiedades electrofisiológicas y conectividad sináptica y sin contaminación de anestésicos o relajantes musculares. Rodajas de cerebro y de la retina wholemount mantienen su integridad estructural, a diferencia de las culturas o los homogeneizados celulares, permitiendo el estudio de los circuitos cerebrales específicos y redes 1. Las grabaciones de tejido aislado tienen ventajas sobre las grabaciones en vivo como los movimientos asociados con el latido del corazón y la respiración se eliminan. Por otra parte, la visualización directa permite que las clases específicas de células para ser dirigidos, y la aplicación local de herramientas farmacológicas 2, 3.

patch-clamp grabaciones y Calcio tinte de carga en wholemount retina se complica por la existencia de la membrana limitante interna (ILM), que cubre la capa de células ganglionares de la retina (RGC) e impide el acceso directo a las células. Típicamente, esta membrana se raspa con una pipeta de vidrio para permitir la aplicación directa de una pipeta de parche y la formación de un sello gigaohmio en una sola célula. Además, los colorantes de calcio de baño aplicado no cruzan la ILM y, o bien deben ser inyectados debajo de esta membrana 4, retrógradamente transportado después de la inyección en el nervio óptico 5 o electroporación a través del tejido 6. Por otra parte, cuando se utiliza un modelo de roedor de la retinitis pigmentosa, el ratón rd / rd, la ILM es más gruesa y más impenetrable. Aquí, nosotros usamos una técnica para eliminar la ILM con la digestión enzimática 7, para permitir tanto ubicua de calcio colorante de carga, y el acceso directo a las células ganglionares de la retina para recordi patch-clampNGS 8.

grabaciones de éxito de cualquiera de las secciones de cerebro o de la retina wholemount dependen de la disección y la incubación del tejido neuronal viable. Típicamente, el tejido se extrae en la mañana del experimento y se incubó en fluido cerebroespinal artificial (ACSF) hasta que se utiliza para las grabaciones. Por lo general, el tejido sigue siendo viable durante 6 - 8 h, con una degradación significativa después de esta ventana de tiempo. Sin embargo, ambas secciones de cerebro y preparados retinae wholemount suelen producir más tejido que puede ser grabado desde dentro de este período de tiempo corto. En consecuencia, el tejido a menudo se desecha al final del día y la disección se completa de nuevo en días posteriores. Esto significa otro animal y se utiliza ~ 2 h de la configuración y la disección / tinción repetida. El siguiente protocolo describe un método para extender la vida de tejido neuronal durante más de 24 h, lo que significa un menor número de animales se utilizan, y el tiempo más experimental está disponible. Viabilidad del tejido wcomo se evaluó a través de la grabación de las propiedades electrofisiológicas y la dinámica del calcio, y estas propiedades eran indistinguibles entre <4 hy> 24 h postdissection.

Estos resultados indican que no sólo tienen una propiedad de una sola célula intacta y funcional después de una incubación prolongada, pero la actividad de la red, según la evaluación de calcio de imágenes y registros electrofisiológicos, es sin cambios> 24 h postdissection. Por otra parte, se muestra que los colorantes de calcio pueden permanecer en las células durante períodos prolongados sin causar efectos perjudiciales. La aplicación de este protocolo demuestra que la actividad funcional de las neuronas en el tejido neuronal aguda puede mantenerse durante largos períodos de tiempo, una vez que el entorno externo es altamente regulado. Además, como la viabilidad del tejido varía mucho entre laboratorios debido a diferentes protocolos de incubación, este método establece un estándar de oro para los parámetros ideales que se deben aplicar para reducir la variabilidad en la salud de neu agudaRonal tejido.

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Protocol

El protocolo siguiente se describe la preparación de C57BL / 6 y C3H / He (retinally degenere) tejido neuronal de ratón, pero las técnicas similares puede aplicarse a otras especies. Todos los animales estaban sanos y tratarse con las condiciones normales de temperatura, humedad, 12 h ciclo luz / oscuridad, el acceso libre a comida y agua, y sin ningún tipo de estímulos de estrés previstos. Todos los experimentos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el comité de la Universidad de Western Sydney Cuidado de Animales y Ética y de acuerdo con el uso de los animales y las directrices para el cuidado de Investigación de Animales (Autoridad # A9452, # A10396 y # A8967).

1. Preparación de la rebanada del cerebro

  1. Anestesiar al animal mediante inhalación de isoflurano (5%) y decapitar usando una guillotina de roedores. Retire el cerebro rápidamente, como se describe anteriormente 9 y colocarlo en solución enfriada con hielo fisiológica (LCRa) que contiene (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 25NaHCO 3, 25 de dextrosa, y saturado con carbógeno (95% O 2/5% de mezcla de CO 2; 310 mOsm; pH 7,4).
  2. Cortar rodajas de cerebro, en la región de interés, a 300 m de grosor con un microtomo vibración.
  3. Transferir las rebanadas de un sistema de incubación hecha a la medida que supervisa y controla estrechamente los niveles de pH (pH 7.2 a 7.4), el flujo y la temperatura Carbógeno, como se ha descrito previamente 10, 11.
  4. Conjunto temperatura inicial cámara a 35 ° C durante 15 - 30 min, y luego reducir lentamente a 15 - 16 ° C como se muestra en la Figura 1C. Incubar las rebanadas en el sistema de incubación hasta que se necesite, ya sea para electrofisiología o formación de imágenes.
    NOTA: Si las rebanadas deben ser utilizados para el calcio de imágenes, siga los pasos a continuación antes tejido enfriamiento por debajo de la temperatura ambiente.

2. Retina Wholemount Preparación y limitante interna para retirar la membrana

  1. Preparar wholemounts retina en régimen normal,las condiciones de iluminación de laboratorio o tenue luz roja / infrarroja.
  2. La eutanasia a los animales por dislocación cervical y los ojos inmediatamente enucleate. Hacer un pequeño corte a lo largo de la ora serrata, y el lugar, ya sea en medios de Ames, o ACSF que contiene (mM): 125 NaCl, 25 de NaHCO 3, 3 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 de glucosa, 0,5 L-glutamina, y saturar con carbógeno (95% O 2/5% de CO mezcla 2; ~ 300 mOsm; pH 7,4), a TA.
  3. Retirar inmediatamente la córnea, cristalino y vítreo cortando a lo largo de la ora serrata con pequeñas tijeras y la eliminación de la lente y el vítreo con fórceps. Coloque el tejido en el sistema de incubación a RT
    NOTA: tejido de la retina puede ser mantenido en el ojo de copa, después de la reducción lenta de la temperatura a 15-16 ° C, durante> 24 h en el sistema de incubación hasta que se necesite.
  4. Para extraer la ILM, transferir el ocular de la retina que contiene a un pequeño frasco de vidrio que contiene 30 U / ml de papaína, 1 mM de L-cistina, EDTA 0,5 mM y 0,005% de DNasa en Earl's-Solución salina equilibrada (BSS) a 37 ° C durante 20 min. Aplicar el 95% de O2 / 5% de CO 2 a la solución a través de la tapa, pero no hacer burbujas. Si se utiliza el tejido de animales jóvenes (<6 semanas), se diluye la solución a mitad de su fuerza.
    1. Deja de digestión enzimática, mediante la colocación del tejido en una solución de ovomucoide (10 mg / ml) y BSA (10 mg / ml) durante 10 min en BSS de Earl. tejido de lavado a fondo con LCRa antes de la transferencia al sistema de incubación y a reducir la temperatura a 15-16 ° C.
  5. Mantener el tejido de la retina en el ojo taza hasta que se necesite. Para su transferencia al microscopio, aislar la retina del ojo taza y se corta en 4 piezas con una hoja de afeitar. Si se requiere toda la retina, hacer cuatro cortes pequeños en la periferia de la retina para permitir que quede plano.
    NOTA: Para los experimentos de imagen, carga con el calcio-colorantes antes de la transferencia al sistema de incubación, véase más adelante.

3. Realizar el mantenimiento del tejido en la incubadora

    (Figura 1A, B).
  1. Hacer circular LCRa a través de una segunda cámara (cámara de UVC, construido como se ha descrito previamente 12) aislado de la cámara principal y se expusieron a 1,1 W luz UVC (254 nm, lámpara UV 5W / 2P esterilizador) con el fin de eradiate bacterias que flotan en la solución (Figura 1A). temporización luz de control UVC a través de un temporizador programable utilizando una función aleatoria que se activa en momentos que varían entre 15 y 26 min cada 15 - 30 minutos para evitar un calentamiento excesivo de la ACSF.
  2. Ajuste la velocidad de flujo en la cámara UVC a 12 ml / min, como se informó anteriormente 12. Cubrir la cámara UVC con papel de aluminio para evitar UVC iluminación fuera de la cámara, lo que puede dañar el tejido neuronal.
    NOTA: Para obtener tejido de la retina adaptada a la oscuridad, aplicar una cubierta a medida que la cámara principal para excluir la luz.
  3. Use una bomba peristáltica para Circulate la solución (LCRa) a través de las dos cámaras y un plato frío termoeléctrico Peltier refrigerador para enfriar o calentar la cámara principal a las temperaturas deseadas en el rango de 0 - 50 ° C. Para la incubación del tejido óptimo, use 15 - 16 ° C para la viabilidad a largo plazo.

4. El calcio colorante de carga

  1. Seleccionar colorantes de calcio en base a la preferencia del investigador individual. Aquí utilizamos Fura-2AM, Fluo-8 o Fluo-4am. Sin embargo, este método se puede aplicar a otros colorantes, así: disolver colorantes de calcio en DMSO a una solución de copolímeros de 1 mM y 1% de bloque (por ejemplo, ácido-127 Pluronic) a un volumen final de 50 l y se somete a ultrasonidos durante 10 min.
  2. Añadir solución a LCRa a una concentración final de 10 mM, copolímeros de bloque 0,01% para los cortes de cerebro, y 20 mM (retina), copolímeros de bloque 0,02% para la retina. En las retinas (papaína tratada) y las secciones de cerebro de animales jóvenes, la carga de la bañera durante 45 minutos a 37 ° C (Fura-2 AM) o a temperatura ambiente (Fluo-4 am, Fluo-8 AM).
    1. Para los animales adultos, (> 12 semanas) pipetear los colorantes (50 l) directamente en las secciones de cerebro, y mantener durante 75 min para permitir una mejor penetración del colorante en las capas profundas.
    2. Para asegurar una oxigenación adecuada de la rebanada sumergida durante la incubación colorante, preparar una cámara de carga de vidrio con una tapa cerrada (frasco circular de 2,5 cm de diámetro, 3,5 cm de altura) con tintes de calcio diluido en 2,5 ml de LCRa. Oxigenar continuamente con 95% O2 / 5% de CO 2. No hacer burbujas.
  3. Después de la carga de colorante, lavar el tejido con ACSF y traslado al sistema de incubación, reducir lentamente la temperatura a 15 - 16 ° C hasta su uso experimental.

5. Registros electrofisiológicos y de imagen

  1. Coloque el tejido en una cámara de grabación sumergida bajo el microscopio, y perfundir con oxigenada LCRa a una velocidad de flujo de 4-5 ml / min, ya sea a temperatura ambiente (~ 22 ° C) o temperatura fisiológica (~ 35 ° C). Hold el tejido en su lugar mediante el uso de un encargo a '' arpa '', hecha de hilos de nylon o de oro estirados y pegados a través de una pieza en forma de U de oro o de alambre de platino.
  2. Para electrofisiología:
    1. Preparar las pipetas de registro de 1,5 mm (1,19 mm de diámetro interior) de vidrio de borosilicato con un extractor de micropipeta para lograr una resistencia final 5-6 mO.
    2. Llenar la pipeta con 3-4 l de solución interna como se describe anteriormente 13 y visualizar células bajo infrarrojos contraste de interferencia diferencial (IR-DIC) utilizando una cámara CCD. La solución intracelular debe adaptarse cuidadosamente para cada experimento para lograr los resultados experimentales.
    3. Posición de la pipeta, mientras que el mantenimiento de una presión positiva aplicada a través de un orificio de aspiración en el soporte de la pipeta, en la membrana de una célula usando un micromanipulador. Dado que la ILM ha sido retirado de la retina, no se requiere ningún raspado membrana antes. Una vez que la pipeta está en la célula, aplicar negativo suavepresión a la pipeta para lograr un sellado gigaohmio. A continuación, la ruptura de la membrana celular con una breve cantidad de presión negativa.
    4. Hacer de células enteras grabaciones current- o de fijación de voltaje utilizando técnicas estándar, según corresponda.
  3. El calcio de imágenes:
    1. Para imagen radiométrica de Fura-2, utilice un ultra-alta velocidad de conmutación de longitud de onda para proporcionar longitudes de onda de excitación de 340 nm y 380 nm. Pasar la luz emitida a partir de células individuales a través de un filtro de emisión de 510 ± 20 nm, y capturar con una alta sensibilidad, una cámara digital de alta velocidad.
    2. Para una sola longitud de onda de excitación de Fluo-4, la luz de excitación a través de un filtro de 460 - filtro de paso de banda de 490 nm y la luz emitida a través de un 515 - filtro de paso de banda de 550 nm. Para la grabación más rápida y más sensible utilizar una cámara digital de alta velocidad, por ejemplo. Adquirir imágenes según sea necesario.
    3. Medir alteraciones en la fluorescencia como una función del tiempo, ya sea en una sola longitud de onda (Fluo-4) o el uso de la relación de longitud de ondamétodo (Fura-2), como se describe anteriormente 8, 14.

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Representative Results

estrecha regulación de la carga bacteriana y la temperatura del LCRa durante la incubación es esencial para mantener la viabilidad del tejido neuronal. Esto puede ser optimizado a través de irradiación con luz UVC y manteniendo la temperatura de la LCRa a 15 - 16 ° C (Figura 1). Por otra parte, la ACSF Parámetros de sello (APS; Figura 1C) proporciona el experimentador con un registro de las condiciones ambientales (pH y temperatura.), Lo que ofrece un estándar de oro para los parámetros al incubar el tejido neuronal, que, si se respetan, reducir la variabilidad entre experimentos.

Figura 1
Figura 1. Un sistema de incubación que permite a una regulación estricta del entorno del tejido. Un diagrama, esquemático del sistema de incubación compuesto por una placa de refrigeración Peltier, cámara principal, bomba peristáltica y la cámara de UVC. B,Vista lateral de la cámara principal que muestra los puntos de entrada y salida de la LCRa, así como las sondas de entrada carbógeno, de temperatura y de pH. El tejido se coloca en la malla como se indica. Todas las sondas de medida están unidos a la tapa para permitir la estabilidad estructural. C, los parámetros de aCSF sello que describe la temperatura y el pH de la LCRa durante la incubación. D, Vista superior de la cámara principal que muestra los orificios de montaje para las sondas de medición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La viabilidad del tejido se puede medir por medio de actividad de la red (Figura 2), así como varios métodos de formación de imágenes, incluyendo respuestas de calcio (Figura 2B, C). Para controlar la actividad de la red, se aplicó LCRa que contiene una alta concentración de cloruro de potasio (KCl; 30 mM) a nivel local,lo que llevó a la despolarización de las neuronas y la glía dentro de la vecindad de la aplicada K +. Esta despolarización pueden ser observados por el aumento de los transitorios de calcio (Figura 2B, C) y la actividad spiking (Figura 2D), que también sirve como un indicador fisiológico para la viabilidad celular. Nuestros resultados muestran que la actividad de clavar en rodajas que se incubaron durante> 24 h en el sistema de incubación fue similar a rebanadas "fresco" incubaron durante períodos más cortos (> 4 h; Figura 2D). Además, la viabilidad neurona individual, que se controla a través de los registros electrofisiológicos intracelulares de ambas propiedades de la membrana pasivos y activos, incluyendo el potencial de membrana en reposo, la resistencia de entrada, constante de tiempo, y el potencial de acción fue comparable a los parámetros descritos en la literatura 15 (Figura 2E, F ).


Figura 2. electrofisiológico y Calcio Propiedades de las secciones de cerebro después de una incubación prolongada. A, Imagen de un corte de cerebro toma 28 horas después de cortar con dos electrodos de registro extracelular utilizados para medir la actividad de la red. Un tercer electrodo (marcado con asterisco) se utiliza para inflar 30 mM de KCl. B, las imágenes Lapso de tiempo de rebanadas cargados con Fluo-04 a.m. durante> 24 h, que representan un aumento de los transitorios de calcio intracelular después de la aplicación del baño de KCl. C, los transitorios de calcio intracelular siguientes breve aplicación de KCl (30 mM; 1 s). Roja - señal media, gris - rastros de calcio en las células individuales, como se muestra en B. D, la grabación fisiológica extracelular de la actividad de la red antes y después de la aplicación de KCl (flechas rojas) fueron en gran parte sin cambios entre rebanadas "frescos" (<4 h postdissection) Y los que se incubaron durante> 24 h en la incubadora. Tenga en cuenta el aumento de la actividad de clavar inmediatamente después de la aplicación de KCl que indica neuronas viables que respondan a aumentar en [K +] con la despolarización. E & F, pasiva (E), y activos propiedades (F) de la membrana de la neurona piramidal siguientes 2 h (trazas azules) o 26 h (trazas negras) de incubación en el sistema de incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para proporcionar acceso directo a las células de la capa de células ganglionares de la retina de los ratones wholemount rd / rd retinally degenerados, la ILM fue digerido por la enzima papaína 7, 8. Después de la digestión, la CGR y células amacrinas desplazadas se pueden visualizar claramente under iluminación DIC (Figura 3A), y las células pueden utilizarse para efectuar grabaciones patch-clamp sin ningún raspado antes de la ILM. Grabaciones de corriente-clamp representante de una RGC se muestran en la Figura 3B. La despolarización de la célula a través de la pipeta de parche causada acción potencial de generación dependiente de la dosis, lo que indica la viabilidad de las células después del tratamiento con papaína.

La eliminación de la ILM también permitió tinción ubicua de la capa de células ganglionares (GCL) con Fura-2AM (Figura 3D) y células respondieron a la aplicación 30 mM KCl con un gran aumento de la relación 340/380 nm con respecto a F 0, lo que significa un gran aumento de la concentración de calcio intracelular (Figura 3E). Los niveles de calcio volvieron a la línea base después de la estimulación y las células podrían ser estimuladas posteriormente para producir una respuesta de amplitud similar. Por otra parte, estas respuestas fueron indistinguibles entre retinae registró a <4 hy> 24 h postdissection (Figura 3F, G).

figura 3
Figura 3: Registros electrofisiológicos y de calcio en la Retina Wholemount. Un diferencial de imagen, de contraste de interferencia de una grabación de patch-clamp de una célula ganglionar de la retina en la GCL después de digestión con papaína. B, células conservan dependiente de la dosis respuestas altas cuando despolarizada con 50, 100 y 150 pA respectivamente. C + D, La eliminación de la membrana limitante interna antes de la aplicación del baño de Fura-2AM permite la carga ubicua de las células ganglionares de la retina, la imagen tomada con 380 nm de excitación. E, cuando se aplica 30 mM KCl ASCF, 85% de células teñidas respondió con un aumento de la relación 340/380. F & G, el aumento de la proporción de 340/380 vuelve a la línea de base después de la aplicación de 30 mM de KCl (barras rojas), Y las células responden a la estimulación posterior ambos <4 h y> 24 h después de la disección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este artículo describe un método de incubación de extender la viabilidad del tejido neuronal aguda para los experimentos de formación de imágenes y electrofisiológicos, reduciendo así el número de animales necesarios para completar objetivos experimentales. Dos procesos principales gobiernan el deterioro del tejido neuronal a través del tiempo: i) el aumento de los niveles de bacterias, y el consiguiente aumento de la endotoxina bacteriana liberado, y ii) la excitotoxicidad que sigue el procedimiento de corte traumático 10. A medida que el tejido neuronal aguda es ambientalmente indefensa, la regulación estricta de las condiciones del tejido mediante una estrecha vigilancia de los niveles de pH, temperatura y bacterias es esencial para mantener la actividad celular, así como la integridad de la red. Disección, y el tratamiento de tejidos (digestión con papaína, calcio colorante de carga) pueden tomar más de 2 horas para completar, causando una reducción en el tiempo de experimentación. Sin embargo, ya que el tejido se puede mantener en el sistema de incubación de> 24 h sin una pérdida medible in viabilidad 7, 8, esta preparación sólo necesita ser completado una vez para obtener> 24 h de los resultados. Como parte de la estrategia de las 3R (reemplazo, reducción, refinamiento) destinado a proporcionar principios rectores para el uso ético de los animales 16, este método tendrá un gran impacto en la reducción del número de animales utilizados en este tipo de experimentos.

La digestión de la ILM de tejido retiniano wholemount permite una fácil orientación de las células en el GCL para patch-clamp grabaciones y ubicua de calcio colorante de carga por aplicación del baño. Estas técnicas son particularmente útiles para retinas degenerada en la que la ILM es mucho más gruesa y más difícil de romper por raspado con una pipeta de vidrio. Por otra parte, la preparación de papaína proporciona una forma de realizar registros de célula asociados a través de dos electrodos para registrar a partir de células acopladas brecha de la salida de la GCL, algo que no ha sido posible anteriormente. sin embargo, Digestión con papaína es probable que tenga algunos efectos en la fisiología normal de la retina como la expresión del receptor K + se ha demostrado que ser alterado en fotorreceptores siguiente disociación con papaína 6. También es posible que la arquitectura de la retina se ve afectada. Velte y Masland mostraron que aunque algunos somas y dendritas RGC fueron dañadas por tratamiento papaína para eliminar la ILM, podrían registrar con éxito de RGC dendritas distal a la soma en la mayoría de las neuronas, lo que indica la integridad estructural de las células y procesos 5. Es importante destacar que, dejando a la retina unido al epitelio pigmentario de la retina (RPE) y la esclerótica, como se describe anteriormente, aísla la retina externa de la difusión papaína y puede reducir los efectos adversos en los segmentos externos de los fotorreceptores cuando este protocolo se aplica a WT retinas. En ambos casos, el tratamiento de la papaína, o raspado de la ILM, algo de daño celular se producirá, el experimentador debe elegir el método adecuado para la experimpregunta ental.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma Aldrich VETEC V800372
Potassium chloride Sigma Aldrich P9333
N-Methyl-D-glucamine Sigma Aldrich M2004 
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S2554
Magnesium chloride Sigma Aldrich M9272 
Calcium chloride  Sigma Aldrich 223506
Papain Dissociation System Worthington  LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous Sigma Aldrich 276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance* Life technologies P-6867 20% solution in DMSO 
Fura-2 AM   Anaspec 84017
Fluo-4 AM   Life Technologies F23917
Fluo-8 AM Abcam Ab142773
Vibrating blade microtome  Leica Biosystem VT1200 S Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device 
Antivibration table Kinetic Systems Vibraplane  Vibraplane 9100/9200 
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI 
Microscope Objective Olympus XLUMPlanFLN 20x/1.00w 20X 
Microscope Objective Olympus LUMPlanFLN 60x/1.00w 60X
CCD Camera Andor Ixon +
High speed wavelength switcher Sutter instrument Lambda DG-4 
Patch clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries Sutter Instrument Co BF150-86-10
Microelectrode puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-40LP Low Profile Open Bath Chambers
Software Molecular Devices pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software Andor Andor iQ3
Braincubator Payo Scientific BR26021976 www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler TE Technology CP-121
Temperature Controller TE Technology TC-36-25 RS232

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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