بروتوكول تنقية مصممة HPLC أن ينتج عالية النقاء اميلويد بيتا اميلويد بيتا 42 و 40 الببتيدات، قادرة على قليل وحدات تشكيل

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Warner, C. J., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation. J. Vis. Exp. (121), e55482, doi:10.3791/55482 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

مرض الزهايمر هو اضطراب الاعصاب الذي آثار أكثر من 35 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. 1 متورط بشدة في بداية وتطور هذا المرض، هو غاية تجميع عرضة، الببتيد مسعور اميلويد بيتا (Aβ). يتراوح 2 Aβ 36-43 الأحماض الأمينية في الطول، ولكن يعتقد أن 42 الأحماض الأمينية البديل، اميلويد بيتا 42 (Aβ42)، هو الشكل الأكثر سمية من البروتين. 3 ويرجع في معظم جزئيا إلى قدرة Aβ42 لتشكيل بسهولة قابل للانتشار، والأنواع بلازميدة قليلة القسيمات التي يعتقد أن تكون الكيانات السمية العصبية بشكل خاص. 4 من أجل تعزيز فهمنا للالببتيد Aβ، فمن الضروري الحصول بشكل روتيني المواد عالية النقاء. وقد تبين وجود شوائب التتبع إلى تغيير كبير في خصائص تجميع ميل الببتيد. 5

تيraditionally، وقد تم ذلك السائل اللوني (HPLC) فصل عالية الأداء من الببتيدات مسعور مثل Aβ من خلال استخدام مزيج من C 4 أو C 8 الأطوار الثابتة القائمة على السيليكا والطور المتحرك الحمضية. 6 ومع ذلك، يمكن لمثل هذه الظروف تحديا لتنقية الببتيد. نقطة تساوي الكهربية منخفضة من الببتيد Aβ (PI ما يقرب من 5.5) 7 يعني أنه في ظل الظروف الحمضية، يتم زيادة الببتيد تجميع ونتيجة لذلك يتم إنتاج واسعة، غير حلها، قمم HPLC التي غالبا ما تكون صعبة لعزل (الشكل 2A). وعلاوة على ذلك، فإن مثل هذه القمم واسعة غالبا ما تحتوي على الشوائب التي قد تؤثر على الشخصية تجميع الببتيد، وعادة تتطلب الجولات اللاحقة من تنقية والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على كمية من الببتيد المنتجة.

بولي (الستايرين / divinylbenzene) مرحلة ثابتة، PLRP-S، يمثل وسيلة بديلة لpurifيينغ الببتيدات مسعور. وقد استخدمت في مرحلة ثابتة في تنقية عدد من البروتينات المختلفة ورسوله الأحماض النووي الريبي (مرنا). 9 مرحلة ثابتة PLRP-S يتطلب أي يجند ألكيل إضافي للفصل المرحلة العكسي، والأهم من ذلك هو مستقر كيميائيا عند درجة الحموضة العالية الأمر الذي يؤدي إلى deaggregation من الببتيد. 7 هنا، نحن الإبلاغ عن مصممة بروتوكول تنقية HPLC أن ينتج عالية النقاء اميلويد بيتا 42 (Aβ42) وبيتا 40 الببتيدات (Aβ40) اميلويد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1260 Infinity II quarternary pump Agilent G7111B http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector Agilent G7114A http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop Agilent 0101-1232 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop Agilent G1328C http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting Bracket Agilent 1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) Agilent PL1512-5501 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptide Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) Fisher Scientific A669-500
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
HPLC grade water Fisher Scientific W5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea Sigma-Aldrich Z227250
Normject 5 cc sterile syringe Fisher Scientific 1481729
16 Gauge SS Needle Rheodyne 3725-086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362, (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47, (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, (18), 10417-10422 (2003).
  4. Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192, (1), 106-113 (2008).
  5. Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377, (2), 565-574 (2008).
  7. Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7, (3), 166-178 (2000).
  8. Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763, (1-2), 65-70 (1997).
  9. Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23, (9), 1456-1464 (2015).
  10. Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22, (34), 11967-11970 (2016).
  11. Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, (23), 2348-2351 (1999).
  12. Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
  13. Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
  14. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, (1), 330-335 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics