맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Warner, C. J., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation. J. Vis. Exp. (121), e55482, doi:10.3791/55482 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

알츠하이머 병은 신경 퇴행성 질환 효과 만 35 명 이상의 세계이다. 질병의 발병 및 발달에 크게 관여 1은 매우 응집하기 쉬운 소수성 펩타이드 베타 아밀로이드 (Aβ)이다. Aβ가 그러나, 아밀로이드 베타 42 (Aβ42)는 단백질의 가장 독성 형태 42 아미노산 변이체 인 것으로 생각하고, 길이 36 내지 43 개의 아미노산의 범위이다. (3)이 용이 특히 신경 독성 엔티티 것으로 여겨진다 확산 성, 올리고머 성 종을 형성하는 Aβ42의 능력에 대부분 기인한다. 도 4는 Aβ 펩티드에 대한 이해를 증진하기 위하여, 일상적으로 고순도 재료를 얻는 것이 필수적이다. 미량 불순물의 존재는 크게 펩티드 응집 성향의 특성을 변화하는 것으로 나타났다. (5)

티raditionally 같은 소수성 Aβ 펩티드의 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 분리 C 또는 C 8 실리카 계 정지상과 이동상 산성의 조합을 사용하여 수행되었다. (6) 그러나, 이러한 조건은 펩티드의 정제에 도전을 제공 할 수있다. Aβ 펩티드의 낮은 등전점은 PI (약 5.5) (7)는 산성 조건 하에서, 펩티드의 응집이 증가되고, 그 결과 종종 분리하기 어려운 넓은 비 - 분해 HPLC 피크는 (도 2A)을 생산하는 것을 의미한다. 또한, 이러한 넓은 피크들은 펩티드의 응집 프로필 영향 및 일반적 극적 제조 펩타이드의 양에 영향을 미칠 수있는 정제의 후속 발사가 필요할 수 불순물을 함유한다.

폴리 (스티렌 / 디 비닐 벤젠) 정지상 PLRP-S는을 정제의 대안적인 수단을 나타낸다잉 소수성 펩타이드. 정지상 다른 단백질과 메신저 리보 핵산 (mRNA의) 다수의 정제에 사용되어왔다. 8, 9 PLRP-S 정지상은 역상 분리 추가적인 알킬 리간드를 필요로하지 않고,보다 중요한 펩티드 deaggregation 리드 높은 pH에서 화학적으로 안정하다. 7 여기서, 우리는 고순도 아밀로이드 베타 42 (Aβ42)과 아밀로이드 베타 40 (Aβ40) 펩타이드를 산출 맞춤형 HPLC 정화 프로토콜을보고합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1260 Infinity II quarternary pump Agilent G7111B http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector Agilent G7114A http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop Agilent 0101-1232 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop Agilent G1328C http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting Bracket Agilent 1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) Agilent PL1512-5501 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptide Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) Fisher Scientific A669-500
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
HPLC grade water Fisher Scientific W5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea Sigma-Aldrich Z227250
Normject 5 cc sterile syringe Fisher Scientific 1481729
16 Gauge SS Needle Rheodyne 3725-086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362, (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47, (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, (18), 10417-10422 (2003).
  4. Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192, (1), 106-113 (2008).
  5. Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377, (2), 565-574 (2008).
  7. Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7, (3), 166-178 (2000).
  8. Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763, (1-2), 65-70 (1997).
  9. Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23, (9), 1456-1464 (2015).
  10. Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22, (34), 11967-11970 (2016).
  11. Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, (23), 2348-2351 (1999).
  12. Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
  13. Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
  14. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, (1), 330-335 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics