En skræddersyet HPLC Oprensning protokol, der giver høj renhed Amyloid Beta 42 og Amyloid Beta 40 Peptider, der kan oligomer Formation

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Heri rapporterer vi en skræddersyet HPLC-oprensning protokol, der giver høj renhed amyloid beta 42 (Aβ42) og amyloid beta 40 (Aβ40) peptider, der kan oligomerdannelse. Amyloid beta er et stærkt sammenlægning tilbøjelige, hydrofobt peptid impliceret i Alzheimers sygdom. Det amyloidogene natur af peptidet gør dets oprensning en udfordring.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Warner, C. J., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation. J. Vis. Exp. (121), e55482, doi:10.3791/55482 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Alzheimers sygdom er en neurodegenerativ lidelse, effekter over 35 millioner mennesker verden over. 1 Impliceret kraftigt i indtræden og udvikling af sygdommen, er den meget sammenlægning tilbøjelige, hydrofobt peptid amyloid beta (Ap). 2 Ap spænder fra 36 til 43 aminosyrer i længde, imidlertid antages det, at den 42-aminosyrevariant, amyloid beta 42 (AP42), er den mest toksiske form af proteinet. 3 Dette skyldes i de fleste dele til evnen af Ap42 til let at danne diffunderbare, oligomere arter, som menes at være særligt neurotoksiske enheder. 4 For at fremme vores forståelse af Ap-peptidet, er det vigtigt at rutinemæssigt opnå høj renhed materiale. Tilstedeværelsen af ​​sporurenheder er blevet vist at dramatisk ændre aggregering tilbøjelighedsdata egenskaber af peptidet. 5

Traditionally har højtydende væskekromatografi (HPLC) separation af hydrofobe peptider, såsom Ap blevet gjort ved anvendelse af en kombination af C 4 eller C 8 silicabaserede stationære faser og en sur mobil fase. 6 Imidlertid kan sådanne betingelser udgør en udfordring for oprensningen af peptidet. Den lave isoelektriske punkt Ap-peptidet (pi ca. 5,5) 7 betyder, at under sure betingelser, er peptidaggregering øges, og som et resultat brede, ikke-opløste HPLC toppe, som ofte er vanskeligt at isolere produceres (figur 2A). Endvidere har sådanne brede toppe indeholder ofte urenheder, som kan påvirke sammenlægning profil af peptidet, og almindeligvis kræver efterfølgende runder af oprensning som dramatisk kan påvirke mængden af ​​peptid produceres.

Poly (styren / divinylbenzen) stationær fase, PLRP-S, repræsenterer et alternativt middel til Purifying hydrofobe peptider. Den stationære fase er blevet anvendt i oprensningen af ​​en række forskellige proteiner og messenger ribonukleinsyrer (mRNA). 8, 9 PLRP-S stationære fase kræver ingen yderligere alkyl ligand for omvendt fase separation, og endnu vigtigere er kemisk stabilt ved høj pH, som fører til deaggregering af peptidet. 7 Heri rapporterer vi en skræddersyet HPLC-oprensning protokol, der giver høj renhed amyloid beta 42 (Aβ42) og amyloid beta 40 (Aβ40) peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Præparativ HPLC Oprensning af Aβ40 eller Aβ42 Peptid

  1. Fremstille følgende puffere til HPLC oprensning.
    1. Forbered puffer A (20 mM NH4OH) ved tilsætning 1,3 ml NH4OH (28% opløsning) til 1.000 ml ultrarent vand.
    2. Forbered puffer B (80% acetonitril med 20 mM NH4OH) ved tilsætning 1,3 ml NH4OH (28% opløsning) til en opløsning af 800 ml HPLC-kvalitet acetonitril og 200 ml ultrarent vand.
    3. Forbered prøve opløsning (0,1% NH4OH) ved tilsætning af 100 pi NH4OH (28% opløsning) til 100 ml ultrarent vand.
  2. Opsætning HPLC instrument som vist i figur 1.
    1. Monter opløsningsmiddel flasker, der indeholder puffer A og puffer B til indløbene af HPLC pumpe vha polymer slange. Fastgør polymer slange med HPLC pumpe med et stykke fitting. Sørg for, at polymer slange afhver buffer er monteret på den korrekte indgangsventil af instrumentet. Monter HPLC-pumpe med en afgasser.
    2. Par HPLC pumpe med indløb 300 Å 8 pm 25 mm х 300 mm præparativ søjle (figur 1B, længst til venstre kolonne, se Materialer List) under anvendelse polymer slange.
      1. Fastgør polymer slangen til den præparative søjle med et stykke finger tætsiddende. Sikre, at polymeren kolonne er orienteret på den korrekte måde.
        BEMÆRK: Den stationære fase af den præparative søjle består af poly (styren-divinylbenzen) partikler. Den korrekte orientering af polymeren søjlen markeret på det ydre hus med en enkelt retningspil.
    3. Tilslut udløbet fra kolonnen til dobbelt bølgelængde detektor under anvendelse polymer slanger og indstille bølgelængdedetektor til 214 nm og 280 nm.
      1. Alter bølgelængden ved at ændre påvisning bølgelængde parametre i opsætningen instrument metoden mulighed forindbygget HPLC software.
    4. Fastgør polymer slange til indløbet af bølgelængden detektor med et stykke finger tætsiddende. Vedhæfte polymer slange til udgangen ventil af bølgelængden detektoren. Fastgør polymer slange til udløbsventilen af ​​HPLC-detektor med et stykke finger tætsiddende. Dette vil være prøveindsamling slangen.
      BEMÆRK: Manglen på en stærk chromophor på Ap-peptidet dikterer, at 214 nm anvendes som det primære ultraviolet (UV) bølgelængde for peak samling.

figur 1
Figur 1: Eksperimentel opsætning af HPLC instrument, der anvendes til oprensning af amyloid beta-peptider. (A) Den kvaternære HPLC-pumpe udstyret med en afgasser og detektor med variabel bølgelængde indstillet til 214 nm og 280 nm; (B) HPLC-søjler, der anvendes til oprensning af de amyloid beta-peptider, fravenstre til højre, 25 x 300 mm 2 præparativ søjle, 7,5 x 300 mm 2 semi præparativ søjle og 4,6 x 250 mm analytisk søjle 2; (C) Manuel injektor med 20 pi rustfrit stål injektionsloop anvendes til analytisk HPLC; (D) Manuel injektor med 10 ml rustfrit stål injektionsloop anvendes til præparativ og semi præparativ oprensning. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Programmere HPLC software til at køre oprensningen fremgangsmåde som vist i tabel 1. Indtast rensningsmetode ved at ændre opløsningsmidlet parameter tidsplan (i setup instrument metode option indbygget i HPLC software). Tænd HPLC-pumpe ved at klikke på "on" knappen på HPLC software.
    BEMÆRK: Pumpen vil begynde at levere begynder forholdet mellem buffer A og buffer B gennem preparative søjle og HPLC instrument.
    1. Efterlad systemet i 30 min til fuldstændig ligevægt.
Time / min % Buffer A a % Af puffer B B Flow Rate d / ml min-1
0 80 20 6
45 75,5 24.5 6
45.01 80 20 6
52.01 80 20 6
52.02 73 27 6
85 73 27 6
92 5 95 c 6

<strong> Tabel 1: Tidsplan for oprensning af Aβ42 og Aβ40 peptider under anvendelse af 25 × 300 mm polymer kolonne. en buffer A - H2O med 20 mM NH4 OH; b 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4 OH; c Ran i 15 minutter for at vaske søjlen forud for den næste injektion af prøven; d For at kunne køre en strømningshastighed på 6 ml / min på HPLC-instrumentering, skal reduceres til 200 bar trykgrænsen.

  1. Oprensning af peptidet prøven Ap
    Bemærk: Det rå peptid blev opnået gennem automatiseret fast-fase peptidsyntese. 10
    1. Opløs 3 mg rå Ap-peptid i 4 ml opløsning prøvepuffer. Sonikeres prøven i 30-60 sekunder ved stuetemperatur og ved en frekvens på 40 kHz til hjælpe til opløsning.
    2. Injicer hele prøven på HPLC-søjlen under anvendelse af en 5 ml plastsprøjte forsynet med en 16-gaugenål af rustfrit stål. Kør oprensning fremgangsmåde som angivet i sub-trin 1.3.
      BEMÆRK: Systemet muliggør prøveinjektion ske gennem anvendelse af en manuel injektor udstyret med en 10 ml rustfri stål injektionsloop (figur 1D). Det ønskede Ap-peptid vil eluere mellem 72 og 74 minutter som en skarp løst top (figur 2C).
    3. Prøven opsamles i et 50 ml konisk centrifugerør. Bekræfte identiteten af ​​Ap top gennem direkte injektion massespektrometri af det opsamlede elueringsmiddel. 11 Gem eluenten i op til 12 timer ved -20 ° C.
      BEMÆRK: Opbevaring af opløsningen i perioder længere end 12 timer er ikke tilrådes på grund af risikoen for oxidation af peptidet.
    4. Isolere det oprensede peptid ved flash frysning den opsamlede aliquot / alikvoter af Ap-peptidet i flydende nitrogen og lyofiliseres. Udføre lyofilisering ved frysetørring af prøven ved en temperatur på -60 ° C og et pressikker på 20 mTorr i en periode på 24 timer.
    5. Kør analytisk HPLC-protokollen som beskrevet nedenfor for at bestemme renheden af ​​Ap-peptidet. Store peptider i deres lyofiliseret form ved -20 ° C i en periode på op til 6 måneder.

2. Analytisk HPLC-analyse af det oprensede Ap Protein

  1. Forbered HPLC buffere som beskrevet i underafsnit 1.1. af ovennævnte protokol.
  2. Installation analytisk HPLC som pr trin 1.2.1 og som vist i figur 1 med 4,6 × 250 mm analytisk søjle (figur 1B, længst til højre kolonne) og den manuelle injektor med 20 pi rustfrit stål injektionsloop (figur 1C) monteret på instrument.
  3. Programmere HPLC software til at køre den analytiske fremgangsmåde som vist i tabel 2 følgende instruktioner svarende til dem i trin 1.3.
Tid /min % Buffer A a % Af puffer B B Flow Rate / ml min-1
0 95 5 1
30 50 50 1

Tabel 2: Tidsplan for HPLC-renhed analyse af Ap-peptidet. en buffer A - H2O med 20 mM NH4 OH; b 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH.

  1. Renhed analyse af Ap-peptidet
    1. Der fremstilles en 1 mg / ml opløsning af det oprensede peptid ved opløsning af peptidet i prøven bufferopløsning.
      BEMÆRK: buffer opskriften kan findes i underafsnit 1.1. Proteinkoncentration bestemmes ved måling af protein absorption ved 280 nm (A 280 nm). 12 m Olar ekstinktionskoefficient (ε) anvendes til at bestemme koncentrationen er ε = 1.490 dm3 mol -1 cm-1. 13
    2. Injicer 20 pi af 1 mg / ml (222 pM) opløsningen på HPLC-søjlen og køre den analytiske metode, der blev opsat i trin 2.3.
      BEMÆRK: Den resterende opløsning ikke anvendes til analyse kan lynfryses i flydende nitrogen og lyofiliseret for at inddrive Ap-peptidet. Frysetørring detaljer kan findes i underafsnit 1.4.4. Ap-peptidet vil eluere fra den analytiske kolonne mellem 16 og 18 minutter (Figur 2D). Brug den indbyggede integrationsanalyse software, der følger med HPLC instrument til at bestemme renheden af ​​Ap-peptidet. Renhed bestemmes ved at integrere hvert af de enkelte toppe på spektret og beregning peptid-peak procentdel område. Typisk skal en oprensning af> 95% konstateres.

</ Html"Figur 2" src = "/ files / ftp_upload / 55.482 / 55482fig2.jpg" />
Figur 2: Repræsentative HPLC spor af Aβ42. (A) Traditionelt C4 silica oprensning, betingelser: Buffer A: H2O med 0,1% trifluoreddikesyre (TFA), buffer B: MeCN (acetonitril) med 0,1% TFA, gradient: 20 til 27% puffer B over 40 minutter efterfulgt ved isokratisk 27% puffer B; (B) Præparativ oprensning under anvendelse af 25 x 300 mm 2 polymer kolonne, betingelser: Puffer A: H2O med 20 mM NH4OH, buffer B: 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH, gradient : 20 til 27% buffer B over 70 minutter efterfulgt af isokratisk 27% puffer B; (C) Optimeret præparativ rensning ved hjælp af 25 x 300 mm 2 polymer kolonne, er betingelser beskrevet i tabel 1 ligger i underafsnit 1.3 i protokollen beskrivelse tekst; (D) Analytisk HPLC under anvendelse af 4,6 x 250 mm 2 polymer-søjle, condlinger: Buffer A: H2O med 20 mM NH4OH, buffer B: 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH, gradient-5 til 50% puffer B over 30 min. For dele A, B og C den top, der svarer til Aβ42 er markeret med en stjerne. Indsamling af de markerede Aβ42 top i del C viser en renhed på> 95% som vist i del D. Massespektrometri blev anvendt til bestemmelse af identiteten af ​​Aβ42 top. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oprensningen af Aβ42-peptidet under anvendelse af en kombination af PLRP-S stationær fase og en høj pH-resultater mobil fase i dannelsen af en skarp, løst top for Ap-peptidet ved en retentionstid mellem 72 og 74 min (figur 2C). Bekræftelse af identiteten af ​​toppen sker ved direkte injektion massespektrometri af den indsamlede eluent. Eluenten kan opbevares ved -20 ° C i opløsning i op til 12 timer. Længere tids opbevaring kan resultere i oxidation af proteinet. For at isolere oprensede peptid, elueringsmidlet er lynfryses i flydende nitrogen og lyofiliseret. Analytisk HPLC af det oprensede peptid viser en renhed på> 95% (figur 2D). Den samme fremgangsmåde kan anvendes til at oprense Aβ40-peptidet (figur 3A) uden modifikation af fremgangsmåden. Analytisk HPLC indikerer en renhed på Aβ40 at være større end 95% (figur 3B). Figur 3
Figur 3: Repræsentative HPLC spor af Aβ40. (A) Optimeret præparativ rensning ved hjælp af 25 x 300 mm 2 polymer kolonne, er betingelser beskrevet i tabel 1 ligger i underafsnit 1.3 i protokollen beskrivende tekst. Toppen svarende til Aβ40 er markeret med en stjerne. (B) Analytisk HPLC ved 4,6 x 250 mm 2 polymer kolonne, betingelser: Puffer A: H2O med 20 mM NH4OH, buffer B: 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH, gradient : 5 til 50% puffer B over 30 min. Indsamling af de markerede Aβ40 top i del A afslører en renhed på> 95% som vist i del B. Massespektrometri blev anvendt til bestemmelse af identiteten af Aβ40 top. Klik hendee for et større version af denne figur.

For at bekræfte, at det oprensede peptid kan danne oligomerblandinger, udførte vi fotoinduceret tværbinding af umodificerede proteiner (Picup) som tidligere beskrevet 14, 15 og kunne robust observere oligomerdannelse. 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HPLC oprensning af Ap-peptidet er meget afhængig af valget af både den stationære fase i oprensningen og den mobile fase valgt at eluere peptidet. Den lave isoelektriske punkt af peptidet og høj tilbøjelighed til aggregation gøre traditionelle kromatografiske betingelser for separation af hydrofobe proteiner (C4 eller C8 stationær fase kombineret med en sur mobil eluent) udfordrende, med Ap-peptidet eluering som en forlænget bred, ikke-løst top (figur 2A).

For at omgå dette problem, den PLRP-S stationær fase, kemisk stabil ved høj pH viste sig at være effektiv til oprensning af Ap-peptidet (figur 2B og 2C). Brugen af ​​en høj pH mobil fase minimeret graden af ​​aggregering, og når optimeret, gav anledning til en skarp, godt løst højdepunkt. I det optimerede protokol, procentdelen af ​​buffer B var hurtigt switched fra 20% til 27% ved 52-minutters tidspunktet og som et resultat, gav anledning til en veldefineret Ap top (figur 2C). Denne optimerede protokol er afhængig af alle de hydrofobe urenheder elueres fra søjlen under den indledende stigning i buffer B koncentration 20 til 24,5%. Hvis der findes urenheder, som er af samme hydrofobicitet som Ap-peptidet, kan derefter yderligere optimering af HPLC-protokollen være berettiget. Den optimerede metode var meget reproducerbar blandt individuelle partier af syntetiseret Ap og var i stand til at rense både 40 og 42 varianter af peptid uden nogen ændringer i optimerede procedure (figur 3). For begge peptider blev renhed som bestemt ved analytisk HPLC fundet at være større end 95%.

I betragtning af de rapporter om sporforureninger ændring sammenlægning tilbøjelighed Ap-peptidet, er det tilrådeligt, at en ortogonal biofysisk karakterisering anvendes til at bekræfteat det oprensede peptid er i stand til at undergå oligomerisering. Brug tidligere rapporterede protokoller vi valgte at udføre Picup. 14, 15 Picup analyse af de oprensede proteiner viser den karakteristiske monomer gennem hexamer populationsfordeling for Aβ40 peptidet og monomeren gennem heptamer fordeling forbundet med Aβ42-peptidet. 10 Disse resultater bekræfter, at oprensning af Ap peptider under anvendelse af den PLRP-S stationær fase og højt pH mobil eluent resulterer i Ap proteiner, som er i stand til aggregering.

Oprensningsproceduren rapporteres, er designet til at være i stand til at rense op til 3 mg af Ap-peptidet i en enkelt kromatografisk serie. Til denne procedure, er det vigtigt at indstille strømningshastigheden af ​​HPLC instrument på 6 ml / min. Hvis der anvendes lavere strømningshastigheder af HPLC pumpe, bør HPLC kørselstid udvides til at rumme denne. Conversely kan anvendelsen af ​​højere strømningshastigheder berettige en nedsættelse af HPLC kørselstid. reduktion af kørslen, kan imidlertid resultere i co-eluering af Ap top med andre toppe og derfor lavere renheden af ​​Ap-peptidet opsamles. Endvidere kan HPLC instrumentering og størrelse af kromatografikolonnen anvendes til oprensning i høj grad påvirke den mængde materiale, som kan renses i en enkelt kørsel. Hvis nogen top produceres på det forventede eluent tid af Ap-peptidet, og en stor top produceres på elueringsmidlet tid, der svarer til opløsningsmiddelfronten, så for meget materiale blev oprindeligt sat på søjlen. At reducere mængden af ​​materiale injiceret på HPLC-søjlen for hver kørsel vil omgå dette problem. Når Ap-peptidet er blevet oprenset, er det stærkt anbefales at opløsningen frysetørres så hurtigt som muligt. Langvarig opbevaring af peptidet i opløsning kan føre til oxidation af Ap og dermed dannelsen af ​​urenheder. Den puhed af Ap-peptidet bør altid bestemmes ved analytisk HPLC. Spormængder af urenheder kan ændre aggregeringen tilbøjelighed peptidet dramatisk. Hvis den analytiske HPLC spor viser tilstedeværelse af urenheder, så prøven skal igen udsættes for HPLC rensning protokollen og dens renhed igen bestemt ved analytisk HPLC.

Det er håbet, at denne skræddersyet procedure for rensning af Aβ42 og Aβ40 peptider vil være til gavn for det videnskabelige samfund og giver brugerne mulighed for at opnå høj renhed Ap stand oligomer dannelse. Det ville forventes, at denne procedure kan tilpasses andre amyloidogene peptider, som er vanskeligt at isolere og oprense.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Agilent for deres tekniske assistance. Kate Markham og Rafael Palomino er krediteret for deres første hjælp i syntese og rensning af Ap-peptid og Dr. Hsiau-Wei Lee takkede for hans hjælp i forberedelsen Figur 1 af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1260 Infinity II quarternary pump Agilent G7111B http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector Agilent G7114A http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop Agilent 0101-1232 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop Agilent G1328C http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting Bracket Agilent 1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) Agilent PL1512-5501 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptide Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) Fisher Scientific A669-500
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
HPLC grade water Fisher Scientific W5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea Sigma-Aldrich Z227250
Normject 5 cc sterile syringe Fisher Scientific 1481729
16 Gauge SS Needle Rheodyne 3725-086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362, (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47, (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, (18), 10417-10422 (2003).
  4. Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192, (1), 106-113 (2008).
  5. Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377, (2), 565-574 (2008).
  7. Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7, (3), 166-178 (2000).
  8. Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763, (1-2), 65-70 (1997).
  9. Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23, (9), 1456-1464 (2015).
  10. Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22, (34), 11967-11970 (2016).
  11. Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, (23), 2348-2351 (1999).
  12. Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
  13. Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
  14. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, (1), 330-335 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics