Un protocole Purification Tailored HPLC que les rendements de haute pureté amyloïde bêta 42 et bêta-amyloïde 40 Peptides, capable de former Oligomère

Biochemistry

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Summary

Nous rapportons ici un protocole de purification par HPLC sur mesure qui produit de haute pureté bêta-amyloïde 42 (Aß42) et de bêta-amyloïde 40 (Aß40) peptides, capable de former des oligomères. Bêta-amyloïde est un peptide hydrophobe fortement l'agrégation prédisposé impliquée dans la maladie d'Alzheimer. La nature amyloïdogène du peptide rend sa purification un défi.

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Warner, C. J., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation. J. Vis. Exp. (121), e55482, doi:10.3791/55482 (2017).

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Abstract

Introduction

La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative que les effets de plus de 35 millions de personnes dans le monde entier. Impliqué 1 fermement dans l'apparition et le développement de la maladie, est la très prédisposé agrégation, un peptide hydrophobe bêta - amyloïde (Aß). 2 Aß est comprise entre 36 et 43 acides aminés en longueur, cependant, on pense que la variante de l' acide 42-amino, bêta - amyloïde 42 (Aß42), est la forme la plus toxique de la protéine. 3 Cela est dû en grande partie à la capacité de Aß42 pour former facilement diffusables, les espèces oligomériques qui sont considérées comme des entités particulièrement neurotoxiques. 4 Afin d'approfondir notre compréhension du peptide Aß, il est essentiel d'obtenir régulièrement des documents de haute pureté. La présence de traces d'impuretés a été démontré que de modifier considérablement les propriétés d'agrégation de propension du peptide. 5

Traditionnellement, la chromatographie en phase liquide (HPLC) à haute performance de peptides hydrophobes tels que Aß a été accompli par l'utilisation d'une combinaison de C 4 ou C 8 phases stationnaires à base de silice et une phase mobile acide. 6 Cependant, ces conditions peuvent présenter un défi pour la purification du peptide. Le point bas du peptide Aß isoélectrique (pI environ 5,5) 7 signifie que dans des conditions acides, l' agrégation du peptide est augmentée et à la suite de larges pics HPLC non résolus qui sont souvent difficiles à isoler sont produites (figure 2A). En outre, ces larges pics contiennent souvent des impuretés qui peuvent avoir un impact sur le profil de l'agrégation du peptide, et souvent nécessiter des rondes subséquentes de purification qui peuvent influer considérablement la quantité de peptide produit.

Le poly (styrène / divinylbenzène) de la phase stationnaire, DPP-S, représente un autre moyen de purifying peptides hydrophobes. La phase stationnaire a été utilisée dans la purification d'un certain nombre de protéines et d'acides ribonucléiques messagers (ARNm). 8, 9 La phase stationnaire PLRP-S ne nécessite aucun ligand alkyle supplémentaire pour la séparation en phase inverse, et plus important encore est chimiquement stable à pH élevé qui conduit à la désagrégation du peptide. 7 Ici, nous rapportons un protocole de purification HPLC sur mesure qui donne une grande pureté bêta - amyloïde 42 (Aß42) et bêta - amyloïde 40 (Aß40) peptides.

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Protocol

1. Une CLHP preparative purification du peptide Aß42 Aß40 ou

  1. Préparer les tampons suivants pour la purification par HPLC.
    1. Préparer un tampon A (20 mM de NH 4 OH) en y ajoutant 1,3 ml de NH4OH (solution à 28%) pour 1 000 ml d'eau ultrapure.
    2. Préparer un tampon B (80% d' acétonitrile avec 20 mM de NH 4 OH) en y ajoutant 1,3 ml de NH4OH (solution à 28%) à une solution de 800 mL d'acétonitrile de qualité HPLC et 200 ml d'eau ultrapure.
    3. Préparer un tampon de dissolution de l' échantillon (0,1% de NH4OH) en ajoutant 100 pl de NH4OH (solution à 28%) pour 100 ml d'eau ultrapure.
  2. Configuration de l'instrument HPLC comme le montre la figure 1.
    1. Monter les bouteilles de solvant qui contiennent le tampon A et le tampon B aux entrées de la pompe HPLC en utilisant un tube de polymère. Fixer le tube en polymère à la pompe HPLC avec un raccord d'une seule pièce. Veiller à ce que le tube de polymèrechaque tampon est monté sur la soupape d'entrée correcte de l'appareil. Monter la pompe HPLC avec un dégazeur.
    2. Couple de la pompe HPLC avec l'entrée de la 300 Å 8 pm 25 300 mm colonne préparative х mm (figure 1B, colonne de gauche, voir la liste des matériaux) en utilisant un tube de polymère.
      1. Fixez le tube de polymère à la colonne préparative avec une seule pièce doigt ajustement serré. Faire en sorte que la colonne de polymère est orienté de la manière correcte.
        Remarque: la phase stationnaire de la colonne préparative est composée de poly (styrène-divinylbenzène) des particules. L'orientation correcte de la colonne de polymère est marqué sur l'enveloppe extérieure avec une flèche directionnelle unique.
    3. Connecter la sortie de la colonne du détecteur à double longueur d'onde en utilisant un tube de polymère et régler le détecteur de longueur d'onde de 214 nm et 280 nm.
      1. Modifier la longueur d'onde en modifiant les paramètres de détection de longueur d'onde dans le procédé de l'instrument d'installation choix dulogiciel intégré de HPLC.
    4. Fixer le tube de polymère à l'entrée du détecteur de longueur d'onde avec un doigt d'une seule pièce hermétique. Fixer le tube de polymère à la vanne de sortie du détecteur de longueur d'onde. Fixer le tube en polymère à la vanne de sortie du détecteur de HPLC avec un doigt d'une seule pièce hermétique. Ce sera le tube de prélèvement d'échantillon.
      NOTE: L'absence d'une forte chromophore sur le peptide Aß dicte que 214 nm est utilisée comme longueur d'onde de l'ultraviolet primaire (UV) pour la collecte des pics.

Figure 1
Figure 1: Configuration expérimentale de l'instrument utilisé pour la purification par HPLC des peptides bêta - amyloïdes. (A) La pompe HPLC quaternaire équipé d'un dégazeur et un détecteur de longueur d' onde variable fixé à 214 nm et 280 nm; Des colonnes (B) HPLC utilisés pour la purification des peptides bêta - amyloïdes, dede gauche à droite, 25 x 300 mm , colonne préparative 2, 7,5 x 300 mm 2 et semi - préparative colonne 4,6 x 250 mm , colonne analytique 2; (C) de l' injecteur manuel avec 20 pi d' acier inoxydable boucle d'injection utilisé pour la HPLC analytique; (D) de l' injecteur manuel avec 10 ml en acier inoxydable boucle d'injection utilisé pour la purification préparative préparative et semi. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Programmer le logiciel HPLC pour exécuter le procédé de purification tel que montré dans le tableau 1. Entrer dans le procédé de purification en changeant le paramètre d'itinéraire de solvant (dans le procédé de choix de l' instrument d'installation intégré dans le logiciel HPLC). Mettez la pompe HPLC en cliquant sur le bouton "on" sur le logiciel de HPLC.
    NOTE: La pompe commencera à fournir à partir du rapport du tampon A et le tampon B à travers la préparationarative colonne et l'instrument HPLC.
    1. Laissez le système pendant 30 min à équilibrer totalement.
Temps / min % De tampon A a % De tampon B b Débit d / min mL -1
0 80 20 6
45 75,5 24,5 6
45.01 80 20 6
52.01 80 20 6
52.02 73 27 6
85 73 27 6
92 5 95 c 6

<strong> Tableau 1: Calendrier pour la purification des peptides Aß42 et Aß40 en utilisant la colonne de 25 x 300 mm de polymère. un tampon A - H 2 O avec 20 mM NH 4 OH; b 80% de MeCN / 20% de H 2 O avec 20 mM de NH 4 OH; c Ran pendant 15 minutes pour laver la colonne avant la prochaine injection de l' échantillon; d Pour exécuter un taux de 6 mL / min sur l'instrumentation de HPLC d'écoulement, la limite de pression doit être réduite à 200 bar.

  1. La purification de l'échantillon de peptide Aß
    Note: Le peptide brut a été obtenu par une synthèse automatisée des peptides en phase solide. dix
    1. Dissoudre 3 mg de brut peptide Aß dans 4 ml de tampon échantillon de dissolution. Soniquer l'échantillon pendant 30-60 s à température ambiante et à une fréquence de 40 kHz pour faciliter la dissolution.
    2. Injecter la totalité de l'échantillon sur la colonne de HPLC en utilisant une seringue en plastique de 5 ml équipé d'un calibre 16aiguille en acier inoxydable. Exécuter le procédé de purification tel que décrit dans la sous-étape 1.3.
      Remarque: Le système permet l' injection de l' échantillon se faire par l'utilisation d'un injecteur manuel muni d'un acier inoxydable de 10 mL boucle d'injection (figure 1D). Le peptide Aß désiré éluer entre 72 et 74 min comme un pic aigu résolu (figure 2C).
    3. Recueillir l'échantillon dans un tube à centrifuger conique de 50 ml. Confirmer l'identité du pic Aß par injection directe par spectrométrie de masse de l'éluant recueilli. 11 Stocker l'éluant jusqu'à 12 h à -20 ° C.
      NOTE: Le stockage de la solution pour des périodes plus longues que 12 h est pas conseillée en raison du potentiel d'oxydation du peptide.
    4. Isoler le peptide purifié par congélation instantanée aliquote collectés / aliquotes du peptide Aß dans de l'azote liquide et lyophiliser. Effectuer une lyophilisation par séchage par congélation de l'échantillon à une température comprise entre -60 ° C et une pressionsûre de 20 mTorr pendant une période de 24 heures.
    5. Exécuter le protocole de HPLC analytique décrit ci-dessous pour déterminer la pureté du peptide Aß. peptides de magasins dans leur forme lyophilisée à -20 ° C pendant une période allant jusqu'à 6 mois.

2. Une HPLC analytique d'analyse de la protéine purifiée Aß

  1. Préparer les tampons HPLC comme indiqué dans la sous-section 1.1. du protocole ci-dessus.
  2. Configuration HPLC analytique selon l' étape 1.2.1 et comme cela est représenté sur la figure 1 avec la colonne analytique de 4,6 x 250 mm (figure 1B, colonne de droite) et l'injecteur manuel avec 20 ul d' acier inoxydable boucle d'injection (figure 1C) montée sur la instrument.
  3. Programmer le logiciel HPLC pour exécuter la méthode d' analyse indiquée dans le tableau 2 suivant les instructions semblables à celles de l' étape 1.3.
Temps /min % De tampon A a % De tampon B b Débit min Taux / mL -1
0 95 5 1
30 50 50 1

Tableau 2: Calendrier pour l'analyse de la pureté par HPLC du peptide Aß. un tampon A - H 2 O avec 20 mM NH 4 OH; b 80% de MeCN / 20% de H 2 O avec 20 mM de NH 4 OH.

  1. Analyse de pureté du peptide Aß
    1. Préparer une solution / ml du peptide purifié à 1 mg par dissolution du peptide dans la solution tampon d'échantillon.
      NOTE: La recette de la mémoire tampon peut être trouvée dans la sous-section 1.1. La concentration en protéine est déterminée en mesurant l'absorption de protéine à 280 nm (280 nm). 12 m coefficient d'extinction olar (ε) utilisé pour déterminer la concentration est ε = 1,490 dm 3 mol -1 cm -1. 13
    2. Injecter 20 ul de la solution à 1 mg / ml (222 uM) sur la colonne de CLHP et exécuter la méthode d'analyse qui a été installé à l'étape 2.3.
      NOTE: La solution restante non utilisée pour l'analyse peut être éclair congelé dans l'azote liquide et lyophilisée pour récupérer le peptide Aß. Détails de lyophilisation peuvent être trouvés dans la sous-section 1.4.4. Le peptide Aß éluera de la colonne analytique entre 16 et 18 minutes (figure 2D). Utiliser le logiciel d'analyse d'intégration intégrée qui accompagne l'instrument de HPLC pour déterminer la pureté du peptide Aß. La pureté est déterminée par intégration de chacun des pics individuels du spectre et calcul du peptide pic pourcentage de surface. En règle générale, une purification de> 95% doit être établie.

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Figure 2: traces HPLC représentatifs de Aß42. (A) Caractéristiques C 4 purification de la silice, conditions suivantes : tampon A: H 2 O avec 0,1% d' acide trifluoroacétique (TFA), tampon B: MeCN (acétonitrile) avec 0,1% de TFA, gradient: de 20 à 27% de tampon B pendant 40 min , puis en isocratique 27% de tampon B; (B) la purification préparative en utilisant la colonne de 25 x 300 mm 2 de polymère, conditions suivantes : Tampon A: H 2 O avec 20 mM de NH 4 OH, tampon B: 80% de MeCN / 20% de H 2 O à 20 mM NH4OH, gradient : 20 à 27% de tampon B pendant 70 min suivie par isocratique 27% de tampon B; (C) Optimisé purification préparative en utilisant la colonne de polymère 25 x 300 mm 2, les conditions sont décrites dans le tableau 1 situé dans la sous-section 1.3 du texte de description du protocole; (D) Analyse par HPLC en utilisant la colonne de polymère de 4,6 x 250 mm 2, diritions: Tampon A: H 2 O avec 20 mM de NH 4 OH, tampon B: 80% de MeCN / 20% de H 2 O à 20 mM NH4OH, gradient 5 à 50% de tampon B pendant 30 min. Pour les parties A, B et C du pic correspondant à Aß42 est marquée par un astérisque. Collection du pic Aß42 marquée dans la partie C révèle une pureté de> 95% comme indiqué dans la partie D. La spectrométrie de masse a été utilisé pour déterminer l'identité du pic Aß42. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Representative Results

La purification du peptide Aß42 en utilisant une combinaison de la phase stationnaire PLRP-S et un pH élevé des résultats de la phase mobile dans la formation d'un pic aigu résolu pour le peptide Aß à un temps de rétention entre 72 et 74 min (figure 2C). Confirmation de l'identité du pic se fait par injection directe par spectrométrie de masse de l'éluant recueilli. L'éluant peut être stocké à -20 ° C en solution pendant jusqu'à 12 heures. de longues périodes de stockage peut entraîner une oxydation de la protéine. Pour isoler le peptide purifié, l'éluant est congélation éclair dans de l'azote liquide et lyophilisée. HPLC analytique du peptide purifié révèle une pureté de> 95% (figure 2D). La même procédure peut être utilisée pour purifier le peptide Aß40 (figure 3A) , sans modification de la méthode. L' HPLC analytique indique une pureté de Aß40 soit supérieure à 95% (figure 3B). figure 3
Figure 3: traces HPLC représentatifs de Aß40. (A) Optimisé purification préparative en utilisant la colonne de polymère 25 x 300 mm 2, les conditions sont décrites dans le tableau 1 situé dans la sous-section 1.3 du texte de description du protocole. Le pic correspondant à Aß40 est marqué d'un astérisque. (B) Une HPLC analytique en utilisant les 4,6 x colonnes de polymère 250 mm 2, conditions suivantes : Tampon A: H 2 O avec 20 mM de NH 4 OH, tampon B: 80% de MeCN / 20% de H 2 O à 20 mM NH4OH, gradient : 5 à 50% de tampon B pendant 30 min. Collection du pic Aß40 marquée dans la partie A révèle une pureté de> 95% , comme indiqué dans la partie B. La spectrométrie de masse a été utilisé pour déterminer l'identité du pic Aß40. S'il vous plaît cliquez sur sone pour voir une version plus grande de cette figure.

Afin de confirmer que le peptide purifié peut former des mélanges oligomères, nous avons effectué une réticulation photo-induite des protéines non modifiées (PICUP) comme précédemment décrit 14, 15 et ont pu observer vigoureusement la formation d'oligomères. dix

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Discussion

La purification par HPLC du peptide Aß dépend fortement du choix à la fois la phase stationnaire employée dans la purification et la phase mobile choisi pour éluer le peptide. Le point bas du peptide et la forte propension pour l'agrégation isoélectrique rendent les conditions chromatographiques traditionnelles pour la séparation des protéines hydrophobes (C4 ou phase stationnaire C8 couplé avec un éluant mobiles acide) difficile, avec le peptide Aß élution comme prolongée large, non résolus pic (figure 2A).

Pour contourner ce problème, la phase stationnaire PLRP-S, chimiquement stable à un pH élevé a été trouvé efficace pour la purification du peptide Aß (figure 2B et 2C). L'utilisation d'une phase mobile à pH élevé minimisé le degré d'agrégation, et quand optimisé, a donné lieu à une forte, pic bien résolu. Dans le protocole optimisé, le pourcentage de tampon B a été rapidement switched de 20% à 27% au point de temps de 52 minutes et, par conséquent, a donné lieu à un pic Aß bien défini (figure 2C). Ce protocole optimisé repose sur toutes les impuretés hydrophobes étant élué de la colonne lors de l'augmentation initiale de 20 à 24,5% de la concentration du tampon B. Si les impuretés sont trouvés qui sont d'une hydrophobie similaire à celle du peptide Aß, puis l'optimisation du protocole de CLHP peut être justifiée. Le procédé optimisé était hautement reproductible parmi les lots individuels de synthèse Aß et était capable de purifier les 40 et 42 variantes du peptide sans aucune modification de la procédure optimisée (figure 3). Pour les deux peptides, la pureté telle que déterminée par HPLC analytique a été jugée supérieure à 95%.

Etant donné les rapports des traces d'impuretés altérant la propension à l'agrégation du peptide Aß, il est souhaitable qu'une caractérisation biophysique orthogonale être utilisée pour confirmerque le peptide purifié est capable de subir une oligomérisation. En utilisant les protocoles que nous avons choisi d'effectuer PICUP précédemment. 14, 15 analyse PICUP des protéines purifiées démontre le monomère caractéristique par la distribution de la population hexamère pour le peptide Aß40 et le monomère à travers la distribution heptamère associée avec le peptide Aß42. 10 Ces résultats confirment que la purification des peptides Aß à l' aide de la phase stationnaire PLRP-S et un pH élevé de résultats d'éluant mobiles dans les protéines Aß qui sont capables d'agrégation.

La procédure de purification rapporté est conçu pour être capable de purifier jusqu'à 3 mg du peptide Aß en un seul passage chromatographique. Pour cette procédure, il est essentiel de fixer le taux de l'instrument HPLC à 6 ml / min. Si des débits plus faibles de la pompe HPLC sont utilisés, le temps d'exécution HPLC devrait être étendu pour accueillir ce. Conversely, l'utilisation des débits plus élevés peut justifier une réduction du temps d'exécution HPLC. Toutefois, la réduction du temps de fonctionnement peut entraîner la co-élution du pic Aß avec d'autres pics et donc de diminuer la pureté du peptide Aß ont été recueillies. En outre, l'instrumentation de HPLC et la taille de la colonne chromatographique utilisée pour la purification peut grandement influer sur la quantité de matière qui peut être purifié en un seul passage. Si aucun pic est produite au moment éluant attendu du peptide Aß, et un grand pic est produite au moment de l'éluant correspondant au front de solvant, puis trop de matière a été initialement chargé sur la colonne. Réduire la quantité de matière injectée sur la colonne HPLC pour chaque essai va contourner ce problème. Une fois que le peptide Aß a été purifié, il est fortement recommandé que la solution soit lyophilisé aussi rapidement que possible. un stockage prolongé du peptide en solution peut entraîner une oxydation de Aß et par conséquent la formation d'impuretés. Le purité du peptide Aß doit toujours être déterminée par HPLC analytique. Des traces d'impuretés peuvent modifier la propension de l'agrégation du peptide de façon spectaculaire. Si le chromatogramme HPLC analytique indique la présence d'impuretés, l'échantillon doit être à nouveau soumis au protocole de purification par HPLC et la pureté de nouveau déterminée par HPLC analytique.

Il est à espérer que cette procédure adaptée pour la purification des peptides Aß42 et Aß40 sera bénéfique pour la communauté scientifique et de permettre aux utilisateurs d'obtenir une grande pureté Aß capable de formation d'oligomères. Il est probable que cette procédure pourrait être adaptée à d'autres peptides amyloïdogènes qui sont difficiles à isoler et purifier.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Agilent pour leur assistance technique. Kate Markham et Rafael Palomino sont crédités pour leur aide initiale dans la synthèse et la purification du peptide Aß et le Dr Hsiau-Wei Lee est remercié pour son aide dans la préparation de la figure 1 du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1260 Infinity II quarternary pump Agilent G7111B http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector Agilent G7114A http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop Agilent 0101-1232 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop Agilent G1328C http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting Bracket Agilent 1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) Agilent PL1512-5501 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptide Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) Fisher Scientific A669-500
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
HPLC grade water Fisher Scientific W5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea Sigma-Aldrich Z227250
Normject 5 cc sterile syringe Fisher Scientific 1481729
16 Gauge SS Needle Rheodyne 3725-086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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