بروتوكول محسن لاستخراج البروتينات من صمام ميترال الإنسان

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

تكوين البروتين من صمام الصمام التاجي البشري لا يزال غير معروف جزئيا، لأن تحليله معقد من قبل الخلوية منخفضة، وبالتالي من خلال انخفاض البروتين الحيوي. هذا العمل يوفر بروتوكول لاستخراج البروتين بكفاءة لتحليل بروتيوم صمام الصمام التاجي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تحليل بروتيوم الخلوية يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الجزيئية الكامنة الأمراض بسبب تطوير التكنولوجيات التي تسمح على نطاق واسع تحديد وكمية من البروتينات الموجودة في النظم البيولوجية المعقدة.المعرفة المكتسبة من نهج البروتين يمكن أن تؤدي إلى فهم أفضل للآليات المسببة للأمراض الكامنة وراء الأمراض، والسماح لتحديد علامات التشخيص والتشخيص الرواية جديدة، ونأمل، من الأهداف العلاجية. ومع ذلك، فإن الصمام التاجي القلب يمثل عينة صعبة للغاية لتحليل البروتين بسبب انخفاض الخلوية في بروتيوغليكان والمصفوفة خارج الخلية المخصب الكولاجين. وهذا يجعل من الصعب استخراج البروتينات لتحليل البروتين العالمي. يصف هذا العمل بروتوكول متوافق مع تحليل البروتين لاحق، مثل البروتينات الكمية و إمونوبلوتينغ. وهذا يمكن أن يسمح للارتباط البيانات قلقز التعبير البروتين مع البيانات على التعبير الكمي مرنا وغير الكمي تحليل المناعية. في الواقع، هذه النهج، عندما يؤديها معا، سيؤدي إلى فهم أكثر شمولا للآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض، من مرنا إلى ما بعد متعدية تعديل البروتين. وهكذا، يمكن لهذه الطريقة تكون ذات صلة للباحثين المهتمين في دراسة أمراض القلب صمام فيسيوباثولوغي.

Introduction

وقد غيرت الأدلة الأخيرة فهم أدوار الآليات التنظيمية العديدة التي تحدث بعد التوليف مرنا. في الواقع، عمليات متعدية، ما بعد النسخي، وعمليات بروتين يمكن أن تنظم بروتين وفرة وظيفة. العقيدة - التي تقول أن تركيزات مرنا هي بروكسيات لتلك التي من البروتينات المقابلة، على افتراض أن مستويات النص هي المحدد الرئيسي للوفرة البروتين - وقد تم تنقيح جزئي. في المقام الأول، ومستويات النص تتنبأ جزئيا فقط وفرة البروتين، مما يشير إلى أن أحداث ما بعد النسخي تحدث لتنظيم البروتينات داخل الخلايا 1 ، 2 .

وعلاوة على ذلك، والبروتينات تملي في نهاية المطاف وظيفة الخلية، وبالتالي تملي النمط الظاهري، والتي يمكن أن تخضع لتغييرات ديناميكية في الاستجابة لعقاقير أوتوكرين، باراكرين، والغدد الصماء. الوسطاء المنقولين بالدم؛ درجة الحرارة؛ العلاج من الإدمان؛ وتطور المرضمنة. وهكذا، فإن تحليل التعبير تركز على مستوى البروتين مفيد لتوصيف بروتيوم وكشف التغيرات الحرجة التي تحدث لها كجزء من المرضية المرض 3 .

ولذلك، فإن الفرص التي توفرها البروتيوميات لتوضيح الظروف الصحية والمرضية هائلة، على الرغم من التحديات التكنولوجية القائمة. المجالات الواعدة بشكل خاص للبحوث التي يمكن أن تسهم بروتيوميكس: تحديد تغيير التعبير البروتين على أي مستوى ( أي خلايا كاملة أو الأنسجة، المقصورات تحت الخلوية، والسوائل البيولوجية). وتحديد والتحقق، والتحقق من المؤشرات الحيوية الرواية مفيدة لتشخيص وتشخيص المرض. ونأمل، وتحديد أهداف البروتين الجديدة التي يمكن استخدامها لأغراض علاجية، فضلا عن تقييم فعالية الدواء والسمية 4 .

التقاط تعقيديمثل البروتيوم تحديا تكنولوجيا. أدوات البروتين الحالية توفر الفرصة لأداء تحليل واسع النطاق، عالية الإنتاجية لتحديد، الكمي، والتحقق من صحة مستويات البروتين المتغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إدخال تقنيات تجزئة وإثراء، وتهدف إلى تجنب التدخل الناجم عن البروتينات الأكثر وفرة، كما تحسنت تحديد البروتين من خلال تضمين البروتينات الأقل وفرة. وأخيرا، تم تكملة البروتيوميات من خلال تحليل التعديلات بعد متعدية، والتي تظهر تدريجيا كمغيرات هامة من وظيفة البروتين.

ومع ذلك، فإن إعداد العينة واستعادة البروتين في العينات البيولوجية تحت التحليل لا تزال الخطوات المحددة في سير العمل البروتين وزيادة إمكانية وقوع المزالق المحتملة 5 . في الواقع، في معظم تقنيات البيولوجيا الجزيئية التي يجب أن تكون الأمثل، والخطوات الأولى هي الأنسجة هوموجينيزاتأيون وتحلل الخلية، وخصوصا خلال تحليل البروتينات وفرة منخفضة التي أساليب التضخيم لا وجود لها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطبيعة الكيميائية للبروتينات يمكن أن تؤثر على الانتعاش الخاصة بهم. على سبيل المثال، تحليل البروتينات مسعور للغاية صعبة للغاية، لأنها تتعجل بسهولة خلال التركيز إسويلكتريك، في حين البروتينات عبر غشاء تقريبا غير قابلة للذوبان (راجع في المرجع 5). وعلاوة على ذلك، فإن تقلب تكوين الأنسجة يخلق حاجزا كبيرا لتطوير طريقة استخراج عالمية. وأخيرا، لأن ما يقرب من جميع العينات السريرية هي من كمية محدودة، فمن الضروري لتمكين إعداد البروتين مع الانتعاش القصوى والتكاثر من الحد الأدنى من كميات عينة 6 .

يصف هذا العمل بروتوكول الأمثل لاستخراج البروتين من صمام القلب التاجي البشري العادي، الذي يمثل عينة صعبة للغاية لتحليل البروتين. صمام التاجي العادي هو كومبهيكل ليكس الكذب بين الأذين الأيسر والبطين الأيسر للقلب ( الشكل 1 ). فإنه يلعب دورا هاما في السيطرة على تدفق الدم من الأذين إلى البطين، ومنع ارتجاعي وضمان المستوى المناسب من إمدادات الأكسجين إلى الجسم كله، وبالتالي الحفاظ على الناتج القلبي الكافي. ومع ذلك، فإنه غالبا ما يعتبر أن يكون "غير نشط" الأنسجة، مع الخلوية منخفضة وعدد قليل من المكونات، وذلك أساسا في المصفوفة خارج الخلية. وذلك لأنه، في الظروف العادية، الخلايا الخلوية صمام المقيمين (فيكس) تقديم النمط الظاهري هادئ مع انخفاض معدل البروتين الحيوي 7 .

ومع ذلك، فقد ثبت أنه في حالة المرضية، وعدد من مراكز فيينا الدولية في زيادة الإسفنجية وتفعيل تخليق البروتين، جنبا إلى جنب مع غيرها من التغيرات الوظيفية والمظاهر الظاهرية 8 . ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن الحد الأدنى من البيانات المتاحة فيوتركز الأدب على تحليل الصمامات التاجية المرضية 9 ، 10 ، والتي قد زيادة عدد فيك المنشط قد يفسر العدد المرتفع نسبيا من البروتينات التي تم تحديدها.

في الختام، فإن هذا البروتوكول قد تعمل على تطوير فهم الآليات المسببة للأمراض المسؤولة عن أمراض الصمام التاجي من خلال دراسة مكونات بروتين صمام التاجي. والواقع أن الفهم الأكبر للعمليات المرضية الكامنة يمكن أن يساعد على تحسين الإدارة السريرية لأمراض الصمامات التي تعتمد مؤشراتها الحالية للتدخل إلى حد كبير على اعتبارات الدورة الدموية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

في هذا البروتوكول، يتم جمع قلوب الإنسان خلال إكسبلانتاتيون متعدد الأجسام (وقت نقص التروية الباردة من 4-12 ساعة، يعني 6 ± 2 ح) من الجهات المانحة متعددة الأعضاء استبعادها من زرع الأعضاء لأسباب تقنية أو وظيفية، على الرغم من المعلمات مخطط صدى القلب العادي. يتم إرسالها إلى بنك الأنسجة القلبية الوعائية في ميلانو، مركز مونزينو كارديولوجيك (ميلان، إيطاليا) لمصارف الصمامات الأبهري والرئوي. لا تستخدم المنشورات الخلفية التاجية للأغراض السريرية، لذلك يتم جمعها خلال عزل الصمام الأبهري والرئوي بعد الحصول على موافقة مستنيرة من أقارب المانحين. يتم جمع الأنسجة لزرع والبحوث إلا بعد موافقة الوالدين. على ورقة الموافقة، فإنهم يأذنون (أو لا) استخدام الأنسجة القلبية للبحث فقط إذا لم يكن مناسبا للاستخدام السريري البشري ( أي الميكروبيولوجية والوظيفية، والمرضية المشاكل)، وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاق منمركز مونزينو كارديولوجيك.

1. إعداد الصمام التاجي

  1. حصاد صمام الصمام التاجي البشري في أقرب وقت ممكن بعد الجهاز إكسلانتاتيون (وقت نقص التروية الباردة من 4-12 ح).
  2. في غرفة نظيفة، وإزالة القلب من حقيبة النقل التي تحتوي على البرد (4 درجات مئوية) حل ( أي محلول ملحي أو متوازنة وروكولينز المتوسطة أو ولاية ويسكونسن). وضعه في دلو ووضعه في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية (بيوهازارد تدفق الهواء العمودي، فئة A، تصنيف ممارسات التصنيع الجيدة (غمب) للمضي قدما في إعداد صمام.
  3. وضع القلب على ثنى المتاح العقيمة في مجلس الوزراء. باستخدام مشرط العقيمة القابل للتصرف، وقطع القلب تماما، عموديا على محورها الرئيسي، على مستوى البطينين الأيسر والأيمن، حوالي 4 سم بعيدا عن قمة.
  4. نقل الشريان الأورطي الصاعد والشريان الرئوي لعرض السقف الأذيني الأيسر.
  5. مع ملقط أوتوكلافابل معقمة ويختار، وقطع حول أوريكل الأيسر علىتركت الأذيني سقف، مما يجعل الصمام التاجي مرئية والسماح للنشرة التاجية كبيرة (الأمامي) ومنشور التاجي الصغيرة (الخلفي) التي سيتم تحديدها.
    ملاحظة: أنتيرو الجانبي والمسامير الإنسية الخلفي تحديد الحدود من النشرة الأمامية والمنطقة الخلفية.
  6. باستخدام مقص قابل للتعقيم معقمة والملقط غير الصدمة، تشريح الأذين الأيسر وسماكة جدار البطين حول محيط صمام التاجي كله .
  7. تحديد استمرارية الصمام الشريان الأورطي.
    ملاحظة: البطين الأيسر يحتوي على صمام التاجي كله والحبال.
  8. فصل نشرة الصمام التاجي الأمامي من النشرة الخلفية الصمام التاجي، وقطع المنشور الخلفي على طول الإدراج مع البطين (الصوار).
  9. غسل النشرة الخلفية في محلول ملحي. قطع النشرة إلى قطع صغيرة (<1 سم 2 ) ولفها بشكل فردي في رقائق الألومنيوم. المفاجئة تجميد لهم مع النيتروجين السائل.
    تنبيه: اتبع إجراءات السلامة التنظيمية عند استخدام النيتروجين السائل.
    1. تطهير الجدول من مجلس الوزراء مع 70٪ محلول الأيزوبروبيل و 6٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين في نهاية الإجراء.

2. استخراج البروتين

  1. استخدام ملقط لالتقاط العينة المخزنة في النيتروجين السائل ووضعه على الفور على الجليد الجاف في حين لا تزال ملفوفة في رقائق الألومنيوم. لا تترك العينة إلى ذوبان الجليد أثناء أي نقل.
  2. قبل طحن، والبرد الخزف / الزركونيوم هاون و بيستليس من نظام طاحونة (على سبيل المثال، كريوغريندر)، جنبا إلى جنب مع العينة، عن طريق وضعها في قارورة ديوار تحتوي على النيتروجين السائل (~ 500 مل).
    تنبيه: اتبع إجراءات السلامة التنظيمية عند استخدام النيتروجين السائل.
  3. وضع هاون والمدقة في مربع البوليسترين التي تحتوي على الثلج الجاف. إزالة العينة من رقائق الألومنيوم ووضعها في هاون.
  4. طحن روقال انه عينة مع مدقة كبيرة ضد هاون 15-20 مرات، وذلك باستخدام مفك لتدوير المدقة. مزج العينة مع طرف ملعقة قبل المبردة أثناء عملية الطحن.
    1. كرر مع المدقة الصغيرة.
  5. نقل عينة الأرض إلى أنبوب وزنه سابقا (على سبيل المثال، 15 مل أنبوب الطرد المركزي) عن طريق قلب الأنبوب، ووضعه على هاون، وعكسها معا لنقل العينة إلى الأنبوب. استخدام ملعقة قبل المبردة لاستعادة جميع المواد من الهاون.
    1. إبقاء الأنبوب مع العينة على الجليد الجاف لتجنب عينة ذوبان أثناء نقل.
  6. حساب الوزن الصافي للعينة.
  7. تنظيف الهاون والمدقات بعد كل عينة وتطهيرها عن طريق التعقيم أو تسخينها في 200 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  8. نقل عينة المسحوق من أنبوب الطرد المركزي إلى أنبوب زجاجي من الخالط عن طريق انقلاب.
  9. إضافة تصفية اليوريا بوف(8 M اليوريا، 2 M ثيوريا، 4٪ ث / V تشابس، 20 ملي تريس، و 55 ملي ديثيوتريتول) إلى أنبوب زجاجي، 200 ميكرولتر من اليوريا العازلة لكل 10 ملغ من الأنسجة المسحوقة.
    ملاحظة: المتبقية عينة مسحوق اليسار في أنبوب الطرد المركزي يمكن استردادها باستخدام جزء من حجم المحسوبة من اليوريا العازلة.
  10. تجانس العينة باستخدام النمام مجهزة هاون الزجاج البورسليكات و بيتيترافلوروثيلين (بتف) مدقة. اضغط ببطء المدقة على العينة مع حركة التواء (1500 دورة في الدقيقة) 10 مرات.
  11. استعادة طاف ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي 1.7 مل نظيفة. مرة أخرى استخراج العينة المتبقية مع العازلة اليوريا الطازجة، مضيفا نصف حجم المستخدمة خلال الاستخراج الأول.
  12. كرر الخطوة 2.10.
  13. استعادة طاف والجمع بينه وبين طاف من الخطوة 2.11. وضع طاف مجتمعة على مدورة أنبوب لمدة 30 دقيقة.
  14. الطرد المركزي أنبوب لمدة 30 دقيقة في 13،000 زغ و 4 درجة مئوية.
  15. استرداد طاف أد قياس تركيز البروتين باستخدام فحص البروتين برادفورد، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تخزين العينة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخراج و حل البروتينات في العازلة اليوريا هو متوافق مباشرة مع الأساليب البروتينية على أساس إزلكتروفوكوسينغ (ثنائي الأبعاد الكهربائي (2-دي) 11 والتركيز السائل تركيز كهروضوئية (إيف) 12 ) مع إمونوبلوتينغ بعد التخفيف في العازلة ليملي 13 تحتوي على كوكتيل البروتيني مثبط 14 .

أما بالنسبة لطرائق قياس الطيف الكتلي الخالية من الجل ( أي اللوني السائل المقترن بتحليل الطيف الكتلي المستقل للبيانات) لك / مس E ) و لك / مس E ثنائي الأبعاد (2D-لك / مس E )) 15 ، في العازلة اليوريا وصف تحتاج إلى مزيد من العلاج للقضاء على اليوريا و ثيوريا، والتي يمكن أن تتداخل مع الهضم البروتين اللاحقة وفصل اللوني السائل. ثيs يمكن تحقيق خطوة تحلية باستخدام مجموعات بروتين هطول الأمطار التجارية، في أعقاب تعليمات الشركة المصنعة لترسيب البروتينات. ويمكن بعد ذلك حل العينة في 25 ملي نه 4 هكو 3 تحتوي على 0.1٪ المنظفات الانقسام للبروتين الهضم 16 . وهطول الأمطار من البروتينات يمكن القضاء على المكونات العازلة، مما يؤثر على الحد الأدنى من محتوى البروتين (استعادة البروتين:> 85٪)، مما يجعل العينة مناسبة لكل نوع من التحليل.

تطبيق هذا البروتوكول لاستخراج البروتين من الصمامات التاجية الإنسان يسمح لتحديد ما مجموعه 422 البروتينات، والجمع بين أربعة نهج بروتيوميات مختلفة وصفت سابقا في التفاصيل 11 ، 15 . على وجه التحديد، تم التعرف على 169 البروتينات من قبل 2-دي، 330 البروتينات من قبل إيف المرحلة السائلة، 96 البروتينات من قبل لك / مس E ، و 148 بروتيناتبواسطة 2D-لك / مس E (الجدول 1).

لتصنيف 422 البروتينات التي تم تحديدها من حيث توطين تحت الخلوية، تم استخدام برنامج لتحليل الجينات أونتولوغي (غو) (على سبيل المثال، سيتوسكيب). الشبكة التي تم إنشاؤها باستخدام البرنامج والمكونات المقابلة لها أظهرت أنه إلى جانب البروتينات المتوقعة المترجمة في المنطقة خارج الخلية (انظر الجزء العلوي الأيمن من الشكل 2 )، فإن معظم البروتينات التي حددتها النهج البروتين كانت من المنطقة داخل الخلايا ( أي السيتوبلازم ، العضيات، الحويصلات، والهياكل الخلوية). كما تم تحديد البروتينات سطح الخلية ( الشكل 2 ).

كما تم تأكيد النتائج في ثلاثة عينات صمام تاجي مستقلة. تم استخدام إمونوبلوتينغ لتحليل مجموعة من أربعة بروتينات ( أي سبتين -11، أربعة ونصف ليم المجالات البروتين 1 (فل-1)، ديرماتوبونتين، و ألفا-كريستالين B (كرياب)) التي لم يتم تحديدها في صمام التاجي العادي ( الشكل 3 ).

شكل 1
الشكل 1: هيكل صمام التاجي. المنظر العلوي، بسبب، القلب الإنساني، العرض، ال التعريف، مغلق، ( A )، أو، إستهل، ( B )، الإنسان، ميترال، فالف. المنظر الأمامي، بسبب، ال التعريف، اليسار، البطين، بسبب، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، القلب الإنساني، ( C ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تحليل بروتينات الصمام التاجي المحددة في التوزيع الخلوي. تم استخدام سيتوسكيب و بينغو المساعد إلى أوبتاىن توزيع مصطلحات علم الجينات (غو) من فئات المكونات الخلوية. حجم الدائرة يتناسب مع عدد من مكونات البروتين المرتبطة شروط غو المختارة، ويتم الإبلاغ عن مقياس اللون لقيمة p من الإفراط في التمثيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: تحليل إمونوبلوتينغ من سيبتين -11، فل-1، ديرماتوبونتين، و كرياب في مستخلص كامل من ثلاثة الإنسان العادي صمامات الصمام التاجي. تم تنفيذ إمونوبلوتينغ باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس ضد كرياب والأرانب بولكلونل الأجسام المضادة ضد سيبتين -11، فل-1، والأجسام المضادة ديرماتوبونتين. رجاءانقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

<td> س <td> <تد> بروتيزوم سوبونيت بيتا تايب 4 بريسورسور <td> </ tr> <تد> ترانسجيلين 2 <td> <tr> <td>
الانضمام وصف 2-DE 2D-LC لك-مس E المرحلة السائلة إيف
A6NMZ7 الكولاجين ألفا السادس س
O00151 بدز و ليم بروتين المجال 1 س
O00299 كلوريد البروتين قناة داخل الخلية 1 س
O00764 بيريدوكسال كيناز س
O14558 الحرارة صدمة بروتين بيتا 6 س
O43399 بروتين الورم D54 س
O43488 أفلاتوكسين B1 ألدهيد ريدوكتاس عضو 2 س
O43707 ألفا أكتينين 4 س س
O43866 مستضد CD5 مثل السلائف س
O60493 فرز نيكسين 3 س
O60701 أودب الجلوكوز 6 نازعة س
O75223 البروتين غير المميز س
O75368 نطاق SH3 ملزمة حمض الغلوتاميك غنية مثل البروتين س
O75390 سترات سينثاس الميتوكوندريا السلائف س
O75489 ناد هيدروجيناس أوبيكينون بروتين الحديد الكبريت 3 السلائف الميتوكوندريا س س
O75608 بروتين أسيل ثيوستراس 1 س
O75828 كاربونيل ريدوكتاس نادف 3 س
O75874 إيزوسيترات نازعة سيتوبلازمية نادب س
O75955 Flotillin س
O94760 نغ نغ ديميثيلارجينين ديميثيلامينوهيدرولاس 1 س
O94788 نازعة الشبكية 2 س
O95865 نغ نغ ديميثيلارجينين ديميثيلامينوهيدرولاس 2 س س
P00325 الكحول نازعة 1B س س
P00338 L لاكتات نازعة سلسلة س
P00352 نازعة الشبكية 1 س
P00441 سوبر ديسموتاز النحاس الزنك س س
P00450 سيرولوبلازمين السلائف س س
P00488 عامل التخثر الثالث عشر سلائف السلسلة س
P00491 بورين نوكليوسيد فسفوريلاز س
P00492 هيبوكسانتين فوسفهوريبوسيلترانزفيراس غوانين س
P00558 فوسفوغليسرات كيناز 1 س س
P00568 أدينيلات كيناز إسونزيمي 1 س
P00734 البروثرومبين س س
P00738 هابتوغلوبين س س س س
P00739 هابتوغلوبين بروتين السلائف ذات الصلة س
P00751 عامل التكملة ب س س س
P00915 أنيدراز كربونية 1 س
P00918 أنيدراز كربونية 2 س
P01008 أنتيثرومبين الثالث السلائف س س س
P01009 ألفا 1 أنتيتريبسين س س س س
P01011 ألفا 1 أنتيتشيموتريبسين س س س س
P01019 أنجيوتنسينوجين السلائف س س
P01023 ألفا 2 ميكروغلوبولين س س
P01024 تكملة C3 س س س س
P01033 مثبط ميتالوبروتيناز 1 السلائف س
P01042 كينينوجين 1 السلائف س
P01593 إيغ كابا سلسلة في المنطقة أغ س
P01598 إيغ كابا سلسلة في منطقة الاتحاد الأوروبي س
P01600 إيغ كابا سلسلة في المنطقة هاو س س
P01611 إيغ كابا سلسلة في المنطقة ويس س
P01620 إيغ كابا سلسلة V إي المنطقة سي س
P01625 إيغ كابا سلسلة V المنطقة الرابعة لين س
P01766 إيغ سلسلة ثقيلة V إي المنطقة برو س س
P01781 إيغ السلسلة الثقيلة V إي المنطقة غال س
P01834 إغ كابا سلسلة C المنطقة س س س س
P01842 إيغ لامدا سلسلة C المناطق س س س
P01857 إغ غاما 1 سلسلة C المنطقة س س س س
P01859 إغ غاما 2 سلسلة C المنطقة س س س س
P01860 إيغ غاما 3 سلسلة C المنطقة س س س
P01861 إيغ غاما 4 سلسلة C المنطقة س س س
P01871 إغ مو سلسلة C المنطقة س س س
P01876 إيغ ألفا 1 سلسلة C المنطقة س س س س
P01877 إيغ ألفا 2 سلسلة C المنطقة س
P02144 الميوجلوبين س س
P02452 الكولاجين ألفا 1 أنا سلسلة س س س س
P02511 ألفا كريستالين سلسلة B س
P02545 لامين أس 70 كيلو دالتون لامين س س س س
P02647 أبوليبوبروتين أي س س س س
P02649 أبوليبوبروتين E س س س س
P02671 سلسلة ألفا الفبرينوجين س س س س
P02675 سلسلة بيتا الفبرينوجين س س س س
P02679 سلسلة فبرينوجين غاما س س س س
P02689 ميلين P2 البروتين س
P02735 المصل أميلويد بروتين السلائف س
P02741 C رد الفعل البروتين السلائف س
P02743 المصل أميلويد P المكون س س س س
P02746 تكملة الوحدة الفرعية الفرعية C1q B س س
P02747 تكملة C1q الفرعية المكون الفرعي C السلائف س
P02748 مكمل عنصر C9 س س س
P02749 بيتا 2 بروتين سكري 1 س س س س
P02750 ليوسين الغنية ألفا 2 بروتين سكري س
P02751 فبرونيكتين س س
P02760 أمب بروتين السلائف س س س س
P02763 ألفا 1 بروتين سكري حمض 1 س س س
P02765 ألفا 2 هس بروتين سكري س
P02766 ترانستهيريتين السلائف س س س
P02768 مصل الألبومين س س س س
P02774 فيتامين D ملزمة البروتين السلائف س
P02787 Serotransferrin س س س س
P02788 لاكتوترانسفيرين السلائف س
P02790 هيموبيكسين س س س س
P02792 سلسلة ضوء الفيريتين س
P04004 Vitronectin س س س س
P04075 الفركتوز بيسفوسفهات ألدولاز A س
P04083 أنيكسين A1 س س س س
P04179 ديسموتاز الفائق من السلائف الميتوكوندريا س
P04196 هستيدين غليكوبروتين الغنية السلائف س
P04217 ألفا 1B بروتين سكري س س
P04350 سلسلة توبولين بيتا 4 س
P04406 غليسيرالدهيد 3 نازعة فوسفات س س س س
P04792 بروتين الصدمة الحرارية بيتا 1 س س س س
P05091 ألدهيد نازعة السلائف الميتوكوندريا س س
البلازما البروتيني C1 المانع السلائف س
P05156 عامل التكملة الأول السلائف س
P05413 حمض الدهنية ملزمة البروتين البروتين س
P05452 تيترانيكتين السلائف تن س س
P05787 الكيراتين نوع الثاني الهيكل الخلوي 8 س
P06396 Gelsolin س س س س
P06576 أتب سينثيز فرعية بيتا الميتوكوندريا السلائف س س
P06732 الكرياتين كيناز نوع M س س
P06733 ألفا إينولاس س س س س
P06753 تروبوميوسين ألفا 3 سلسلة س س
P07108 أسيل كوا ملزمة البروتين س
P07195 L لاكتات نازعة سلسلة B س س س
P07196 نيوروفيلامنت ضوء ببتيد س
P07197 البولي ببتيد المتوسطة العصبية س س
P07237 بروتين كبريتيد إسوميراز بروتين س س
P07339 كاثبسين D السلائف س س
P07355 أنيكسين A2 س س س س
P07360 مكمل عنصر C8 سلسلة غاما السلائف س
P07437 سلسلة بيتولين بيتولين س س س س
P07585 Decorin س س س س
P07737 بروفيلين 1 س
P07858 كاثبسين B السلائف س
P07900 بروتين صدمة الحرارة هسب 90 ألفا س س
P07951 سلسلة تروبوميوسين بيتا س
P07954 فومارات هيدراتاس السلائف الميتوكوندريا س
P07996 ثرومبوسبوندين 1 س س س
P08107 صدمة الحرارة 70 كيلو دالتون بروتين 1A 1B س س س س
P08123 الكولاجين ألفا 2 أنا سلسلة س س س س
P08133 أنيكسين A6 س س
P08238 بروتين صدمة الحرارة هسب 90 بيتا س س
P08253 72 كيلو دالتون نوع الرابع كولاجيناز السلائف س
P08294 الفائق خارج الخلية ديسموتاز النحاس زن قبلursor س س س
P08590 ميوسين ضوء ببتيد 3 س س
P08603 عامل التكملة H س س س س
P08670 فيمنتين س س س س
P08729 الكيراتين نوع الثاني الهيكل الخلوي 7 س
P08758 أنيكسين A5 س س س س
P09211 الجلوتاثيون S ترانسفيز P س س س
P09382 غاليكتين 1 س س س
P09417 ديهيدروبتيريدين ريدوكتاس س
P09493 تروبوميوسين 1 سلسلة ألفا س س
P09525 أنيكسين A4 س س
P09651 البروتين النووي النووي غير المتجانس A1 س
P09871 تكملة السلائف المكونة C1s س
P09936 أوبيكيتين الكربوكسيل محطة هدرولاز إيزوزيم L1 س
P09972 الفركتوز بيسفوسفهات ألدولاز C س
P0C0L4 تكملة C4 سلائف س
P0CG05 زايلامدا 2 سلسلة C المناطق س
P0CG38 بوت أنكيرين عضو أسرة النطاق I س
P10515 ديهيدروليبويليزين بقايا مكون أسيتيلترانزفيراس من البيروفات مركب نازعة الهيدروجين س
P10768 S فورميللوتاثيون هدرولاز س
P10809 60 كيلو دالتون بروتين الصدمة الحرارية الميتوكوندريا السلائف س
P10909 Clusterin س س س س
P10915 هيالورونان و بروتيوغليكان ربط البروتين 1 السلائف س س
P11021 78 كيلو دالتون زالبروتين ينظم لوكوس س س س
P11047 لامينين فرعية غاما 1 السلائف س
P11142 صدمة الحرارة مماثلة 71 بروتين كيلو دالتون س س س س
P11177 بايروفات هيدروجيناس E1 المكون الوحيدات بيتا الميتوكوندريا السلائف س
P11217 شكل جليكوجين فسفوريلاز العضلات س
P11310 سلسلة متوسطة أسيل كوا نازعة سلائف الميتوكوندريا محددة س
P11413 الجلوكوز 6 الفوسفات 1 نازعة س
P11766 الكحول سلسلة نازعة 3 تشي سلسلة س
P12036 البولي ببتيد الثقيلة العصبية س
P12109 الكولاجين ألفا 1 سلسلة السادس س س س س
P12110 الكولاجين ألفا 2 سلسلة السادس س س س س
P12111 الكولاجين ألفا 3 سلسلة السادس س س س
P12277 الكرياتين كيناز نوع B س
P12429 أنيكسين A3 س س
P12814 ألفا أكتينين 1 س س
P12829 ميوسين ضوء ببتيد 4 س
P12882 ميوسين 1 س
P12883 ميوسين 7 س س
P12955 زا برو ديبيبتيديس س
P13489 ريبونوكلياز المانع س
P13533 ميوسين 6 س س
P13611 فيروسيكان البروتين الأساسية السلائف س س
P13639 عامل استطالة 2 س
P13716 دلتا أمينوليفولينيك حمض ديهيدراتاس س
P13796 بلاستين 2 س
P13804 الإلكترون نقل فلافوبروتين ألفا السلائف الميتوكوندريا س
P13929 بيتا إنولاز س س
P14136 الدبقية فبريلاري الحمضية البروتين الحمضية س
P14314 غلوكوسيديس 2 سوبونيت بيتا السلائف س
P14550 الكحول نادب نازف س
P14618 البيروفات كيناز ايزوزيم M1 M2 س س س
P14625 </ td> إندوبلاسمين السلائف س س
P15121 ألدوز ريدوكتاس س
P15259 الفوسفوغليسرات طفرة 2 س
P16152 كاربونيل ريدوكتاس نادف 1 س
P17066 صدمة الحرارة 70 كيلو دالتون بروتين 6 س س س
P17174 أسبارتات أمينوترانزفيراس السيتوبلازمية س
P17540 الكرياتين كيناز ساركوميريك السلائف الميتوكوندريا س
P17661 Desmin س س س س
P17980 26S البروتياز وحدة فرعية 6A س
P17987 T البروتين المعقدة 1 وحدة فرعية ألفا س
P18206 فينكولين س س
P18428 ليبوسوليزاكاريد ملزمة بروتين السلائف س
P18669 الفوسفوغليسرات طفرة 1 س
P19105 ميوسين سلسلة ضوء التنظيمية 2 س س
P19623 سبيرميدين سينثاس س
P19652 ألفا 1 بروتين سكري حامض 2 السلائف س س
P19823 إنتر ألفا التربسين مثبط سلسلة الثقيلة H2 س
P19827 إنتر ألفا التربسين المانع سلسلة الثقيلة H1 س س
P20073 أنيكسين A7 س
P20618 بروتيزوم سوبونيت بيتا نوع 1 السلائف س
P20774 Mimecan س س س س
P21266 الجلوتاثيون S ترانزفيرز مو 3 س
P21333 فيلامين أ س س
P21796 الجهد تعتمد أنيون انتقائية قناة البروتين1 س
P21810 Biglycan س س س س
P21980 بروتين الجلوتامين غاما غلوتاميل ترانزفيراس 2 س س
P22105 تيناسين X س س
P22314 أوبيكيتين تفعيل انزيم E1 س
P22352 الجلوتاثيون بيروكسيداز 3 السلائف س س
P22626 البروتينات النووية ريبونوكليوبروتين غير متجانسة A2 B1 س
P22695 أوبيكينول السيتوكروم ج المخفض البروتين الأساسية المعقدة 2 السلائف الميتوكوندريا س
P23141 كاربوكسيلستيراز الكبد 1 السلائف س
P23142 فيبولين 1 س س س س
P23284 الببتيديل بروليل رابطة الدول المستقلة عبر ايزوميراز ب السلائف س
P23381 تريبتوفانيل الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاس السيتوبلازمية س
P23526 Adenosylhomocysteinase س س
P23528 كوفيلين 1 س
P24752 الأسيتيل لجنة الزراعة أسيتيلترانزفيراس السلائف الميتوكوندريا س
P25311 الزنك ألفا 2 غليكوبروتيn السلائف س
P25705 أتب سينثيز الوحيدات الميتوكوندريا ألفا س
P25788 بروتيزوم الوحيدات نوع ألفا 3 س س
P25789 بروتيزوم الوحيدات نوع ألفا 4 س
P26447 بروتين S100 A4 س
P27348 14 3 3 بروتين ثيتا س س
P27797 كالريتيكولين السلائف س
P28066 بروتيزوم الوحيدات نوع ألفا 5 س
P28070 س س
P28072 بروتيزوم سوبونيت بيتا نوع 6 السلائف س
P28074 بروتيزوم سوبونيت بيتا نوع 5 السلائف س
P28331 ناد أوبيكينون أوكسيدوريدوكتاس 75 كيلو دالتون فرعية السلائف الميتوكوندريا س
P28838 سايتوسول أمينوببتيداس س
P29218 إينوزيتول مونوفوسفهاتاز س
P29401 ناقلة الكيتول س
P29692 استطالة عامل 1 دلتا س
P29966 ميريستولاتد ألانين الغنية C كيناز الركيزة س
P30040 بروتين الشبكة إندوبلازميك ERp29 السلائف س
P30041 بيروكسيروكسين 6 س س
P30043 فلافين ريدوكتاس س
P30044 بيروكسيروكسين 5 السلائف الميتوكوندريا س
P30085 أومب سمب كيناز س
P30086 فوسفاتيديلثانولامين بروتين ملزم 1 س
P30101 Protein ثاني كبريتيد إسوميراز A3 السلائف س س س
P30613 بايروفات كيناز إيزوزيميس رل س
P30740 الكريات البيض إلاستاز المانع س
P31025 ليبوكالين 1 السلائف س
P31937 3 هيدروكسيسوبوتيريت نازعة السلائف الميتوكوندريا س
P31942 ريبونوكلوبروتين النووي H3 غير المتجانسة س
P31943 البروتين النووي ريبونوكلي بروتين H غير المتجانسة H س
P31946 14 3 3 بروتين بيتا ألفا س س
P31948 الإجهاد الناجم عن فوسفوبروتين 1 س
P31949 بروتين S100 A11 س
P32119 بيروكسيروكسين 2 س س
P34931 صدمة الحرارة 70 كيلو دالتون بروتين 1 مثل س س
P34932 صدمة الحرارة 70 كيلو دالتون بروتين 4 س
P35232 Prohibitin س
P35237 سيربين B6 س
P35443 الثرومبوسبوندين 4 س
P35555 فبريلين 1 س س
P35579 ميوسين 9 س س س
P35580 ميوسين 10 س س
P35609 ألفا أكتينين 2 س
P35625 مثبط ميتالوبروتيناز 3 س س
P35998 26S بروتياز التنظيمية الفرعية 7 س
P36871 فسفوغلوكوموتاس 1 س س
P36955 ظهارة الصباغ المشتقة عامل س س
P37802 س س
P37837 ناقلة الألدول س
P38117 الإلكترون نقل فلافوبروتين بيتا س
P38646 الإجهاد 70 بروتين الميتوكوندريا السلائف س س
P39687 الحمضية ليوسين الغنية فوسفوبروتين النووي 32 عضو الأسرة A س
P40121 بلعم السد البروتين س
P40925 مالات نازعة سيتوبلازمية س
P40926 مالات نازعة الميتوكوندريا السلائف س
P41219 Peripherin س
P42330 ألدو كيتو ريدوكتاس الأسرة 1 عضو C3 س
P45880 الجهد تعتمد أنيون انتقائية قناة البروتين 2 س
P47755 F أكتين متوجا البروتينات ألفا 2 س س
P47756 F أكتين السد البروتين بيتا فرعية س س
P47985 أوبيكينول السيتوكروم ج ريدوكتاز الحديد الكبريت فرعية الميتوكوندريا السلائف س
P48047 أتب سينثاس س وحدة فرعية السلائف الميتوكوندريا س
P48637 الجلوتاثيون سينثيتاس س
P48741 صدمة الحرارة 70 كيلو دالتون بروتين 7 س س
P49189 4 تريمثيلامينوبوتيرالدهيد هيدروجيناز س
P49368 T البروتين المعقدة 1 غاما فرعية س
P49747 الغضاريف أوليغوميريك البروتين المصفوفة س س س س
P49748 سلسلة طويلة جدا أسيل كوا نازعة سلائف الميتوكوندريا محددة س
P50395 راب الناتج المحلي الإجمالي التفكك بيتا المانع س س </ td>
P50454 سيربين H1 السلائف س
P50995 أنيكسين A11 س
P51452 المزدوج خصوصية البروتين الفوسفاتيز 3 س
P51884 Lumican س س س س
P51888 برولارجين السلائف س س س س
P52565 رو الناتج المحلي الإجمالي التفكك المانع 1 س
P52566 رو الناتج المحلي الإجمالي التفكك المانع 2 س
P54652 صدمة الحرارة المتعلقة 70 كيلو دالتون بروتين 2 س س س س
P55072 الانتقالية إندوبلاسميك الشبكة أتباس س
P55083 ميكروفبريل المرتبطة بروتين سكري 4 السلائف س س
P57053 هيستون H2B نوع F س
P60174 تريوسيفوسفهات إيزوميراس س س س
P60660 ميوسين ضوء ببتيد 6 س س
P60709 أكتين السيتوبلازمية 1 س س س س
P60981 Destrin س
P61086 أوبيكيتين كونجوغاتينغ إنزيم E2 25 كدا س
P61088 أوبيكيتين كونجوغاتينغ إنزيم E2 س
P61224 راس ذات الصلة بروتين الراب 1b السلائف س
P61978 ريبونوكلوبروتين النووي غير المتجانسة K س س
P61981 14 3 3 بروتين غاما س س س
P62258 14 3 3 بروتين إبسيلون 14 3 3E س
P62491 راس البروتين ذات الصلة س
P62714 سيرين ثريونين بروتين الفوسفاتيز 2A الحفزية إيسوفورم بيتا س
P62736 أكتين الأبهري العضلات الملساء س س س
P62805 هيستون H4 س
P62826 غتب ملزمة البروتين النووي ران س
P62873 غوانين البروتين النوكليوتيدات ملزمة جيغسغت فرعية بيتا 1 س
P62879 غوانين البروتين النوكليوتيدات ملزمة جيغسغت فرعية بيتا 2 س
P62937 بيبتيديل بروليل رابطة الدول المستقلة عبر ايزوميراز A س س
P62987 أوبيكيتين 60S ريبوسومال بروتين L40 س
P63104 14 3 3 بروتيتا زيتا دلتا س س س س
P63241 عامل بدء ترجمة يوكاريوتيك 5A 1 س
P63244 قوانين النيوكليوتيدات البروتين ملزمة بيتا بيتا 2 مثل 1 س
P63267 أكتين غاما المعوية العضلات الملساء س س
P67936 تروبوميوسين ألفا 4 سلسلة س
P68032 أكتين ألفا عضلة القلب 1 س
P68104 عامل استطالة 1 ألفا 1 س س س
P68133 أكتين ألفا، والهيكل العظمي، موسكل
P68363 سلسلة توبولين ألفا 1B س س س
P68371 سلسلة توبولين بيتا 2C س س س
P68402 الصفائح الدموية عامل تفعيل أسيتيلهيدرولاس يب بيتا فرعية س
P68871 الهيموغلوبين وحدة فرعية بيتا س س س
P69905 الهيموجلوبين الفرعية ألفا س س
P78371 T بروتين مجمع 1 بيتا فرعية س
P78417 الجلوتاثيون ترانسفيراس أوميجا 1 س س
P80748 سلسلة إيغ لامدا السادسإي المنطقة لوا س
P98095 فيبولين 2 س س
Q01082 سبيكترين بيتا سلسلة الدماغ 1 س
Q01449 ميوسين سلسلة ضوء التنظيمية 2 الإسوية الأذينية س
Q01518 أدينيليل سيكليس البروتين المرتبطة 1 س
Q01995 ترانسجيلين بروتين العضلات السلس 22 ألفا س
Q03252 لمين B2 س س
Q03591 عامل التكملة H البروتين ذات الصلة 1 السلائف س
Q04917 14 3 3 بروتين إتا س س
Q06323 بروتيزوم المنشط معقدة فرعية 1 س
Q06828 Fibromodulin س س س س
Q06830 بيروكسيروكسين 1 س س
Q07507 Dermatopontin س س س س
Q07960 رو غتباس تنشيط البروتين 1 س
Q08257 كينون أوكسيدوريدوكتاس س
Q08431 Lactadherin س س
Q12765 Sإكرنين 1 س
Q13011 دلتا 3 5 دلتا 2 4 دينويل كوا إسوميراس السلائف الميتوكوندريا س س
Q13228 السيلينيوم ملزمة البروتين 1 س س
Q13404 أوبيكيتين مترافق انزيم E2 البديل 1 س
Q13409 السيتوبلازمية دينين 1 سلسلة وسيطة 2 س
Q13509 سلسلة توبولين بيتا 3 س س س
Q13642 أربعة ونصف ليم المجالات البروتين 1 س
Q13765 ببتيد الوليد المرتبطة ألفا معقدة معقدة س
Q13885 N توبولين بيتا 2A سلسلة س س
Q14194 ديهيدروبيريميديناز البروتين ذات الصلة 1 س
Q14195 ديهيدروبيريميديناز البروتين ذات الصلة 3 س س س س
Q14624 إنتر ألفا التربسين مثبط سلسلة ثقيلة H4 السلائف س
Q14697 محايد ألفا غلوكوسيديس أب السلائف س
Q14764 بروتين القبو الرئيسي س
Q14767 عامل التحول تحويل الكامنة بيتا ملزمة البروتين 2 س س
Q14894 مو كريستالين هومولوج نادب تنظيم الغدة الدرقية هرمون البروتين ملزمة س
Q15063 بيريوستين السلائف س س س س
Q15084 بروتين ثاني كبريتيد إسوميراز A6 السلائف س
Q15113 بروكولاجن C إندوببتيداز محسن 1 السلائف س
Q15181 بيروفوسفاتيز غير عضوي س
Q15365 بولي بروتين أرسي ملزم 1 س
Q15366 بولي بروتين أرسي ملزم 2 س
Q15582 تحويل عامل النمو بيتا يسببها البروتين س س س
Q15819 أوبيكيتين مترافق انزيم E2 فاريانت 2 س
Q16352 ألفا إنتيرنيكسين س
Q16473 المفترضة تيناسين زا س
Q16555 ديهيدروبيريميديناز البروتين ذات الصلة 2 س س س
Q16698 2 4 دينويل كوا ريدوكتاس السلائف الميتوكوندريا س
Q16891 الغشاء الداخلي الميتوكوندريا س
Q562R1 بيتا أكتين مثل البروتين 2 س
Q6S8J3 بوت أنكيرين عضو أسرة النطاق E س
Q6UWY5 أولفاكتوميدين مثل البروتين 1 السلائف س س
Q71U36 سلسلة توبولين ألفا 1A س س س
Q7Z7G0 الهدف من نيش SH3 السلائف س س س
Q8WUM4 الموت الخلية المبرمجة 6 التفاعل البروتين س
Q8WWX9 ثيوريدوكسين مثل سلينوبروتين M السلائف س
Q92597 بروتين NDRG1 س
Q92945 بعيدا عنصر المنبع البروتين ملزمة 2 س
Q96CN7 إيزوكوريسماتاس المجال يحتوي على البروتين 1 س
Q96CX2 بتب بوز مجال يحتوي على البروتين س
Q96KK5 هيستون H2A نوع 1 H س س
Q96KP4 ديبتبيداز نونتوبيسيفيك غير محددة س
Q99426 توبولين محددة تشابيرون ب س
Q99497 بروتين دج 1 س س
Q99536 سينابتيك حويصلة بروتين غشاء س س س
Q99714 3 هيدروكسياسيل لجنة الزراعة نوع نازعة 2 س
Q99715 سلسلة الكولاجين ألفا 1 زي س س
Q99798 أكونيتات هيدراتاس السلائف الميتوكوندريا س
Q9BQE3 سلسلة توبولين ألفا 6 س
Q9BUF5 سلسلة توبولين بيتا 6 س س
Q9BUT1 3 هيدروكسي بوتيرات نازعة نوع 2 س
Q9BVA1 سلسلة توبولين بيتا 2B س س س
Q9BXN1 Asporin س س </ td> س س
Q9H0W9 إستر هدرولاس C11orf54 س
Q9H4B7 سلسلة توبولين بيتا 1 س
Q9NRN5 أولفاكتوميدين مثل البروتين 3 السلائف س س
Q9NRV9 الهيم البروتين ملزمة 1 س
Q9NSB2 الكيراتين من النوع الثاني Hb4 س س
Q9NVA2 11 سبتمبر س
Q9UBR2 كاثبسين Z السلائف س
Q9UBX5 فيبولين 5 س س
Q9UK22 F مربع فقط البروتين 2 س
Q9Y277 الجهد تعتمد أنيون انتقائية قناة البروتين 3 س
Q9Y281 كوفيلين 2 س
Q9Y490 تالين 1 س
Q9Y696 كلوريد البروتين قناة داخل الخلية 4 س
Q9Y6C2 إميلين 1 س س

الجدول 1: قائمة من البروتينات التي تم تحديدها في استخراج الأنسجة صمام الصمام التاجي عندما تم تطبيق أربعة نهج البروتين المختلفة: الكهربائي ثنائي الأبعاد (2-DE)، ثنائي الأبعاد لك-مس E (2D-لك / مس E )، لك / مس E ، و إيف المرحلة السائلة. تم الإبلاغ عن الطريقة التي تم تحديد كل البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خطوة واحدة حاسمة من هذا البروتوكول هو استخدام النيتروجين السائل لتجميد العينة والبرد نظام طاحونة. إن استخدام النيتروجين السائل يمنع التدهور البيولوجي ويسمح بالمسحوق الفعال، ولكنه يتطلب تدريبا خاصا للتعامل الآمن.

في هذا البروتوكول يتميز نظام طاحونة لعينة طحن لأن عينات صغيرة من الصعب استرداد من هاون القياسية والمدقات. في هذه الحالة، عينات صغيرة تنتشر على شكل مسحوق ناعم على سطح الهاون، مما يجعل جمع الصعب. ميزة أخرى هي أن طاحونة هو بمحركات، والذي يسمح لعدد أكبر من العينات ليتم معالجتها بطريقة استنساخه ودون إضافة التعب. أحد القيود على استخدام طاحونة هو أن حجم العينة التي يجب أن تكون صغيرة (100 ملغ أو أقل) للمدقة للضغط بشكل فعال ضد الهاون. وعلاوة على ذلك، يجب أن تكون حرارة المكونات طاحونة لدرجة حرارة الغرفة بين الاستخدامات ل كليانين ز. وبالتالي، فإن الإجراء يستغرق وقتا طويلا، وإذا تم معالجة العديد من العينات يوميا، وهناك حاجة إلى مجموعات كثيرة.

خطوة حاسمة إضافية هي إعداد العازلة استخراج. تركيزات الملح، وخاصة بالنسبة اليوريا (8 م) وثيوريا (2 م)، مرتفعة جدا. وبالتالي، فإن حجم الملح هو ما يقرب من نصف الحجم الكلي للحل. وعلاوة على ذلك، فإن حل ليس من السهل النظر في أن الحرارة يجب تجنبها لأنه في أكثر من 37 درجة مئوية، اليوريا يمكن أن يؤدي إلى كارباميلاتيون البروتين في N تيرميني من البروتينات / الببتيدات وعلى المجموعات الجانبية سلسلة الأمين من ليسين وبقايا أرجينين 17 . مرة واحدة حلها، يجب أن يتم تصفية العازلة اليوريا مع مرشحات 0.22 ميكرون ويمكن تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع دون التأثير على فعالية استخلاصها، ولكن يجب أن تكون درجة حرارة إلى أكثر من 15 درجة مئوية قبل الاستخدام للسماح للحل الكامل .

التعديلات وتحري الخلل وإصلاحه

إنت "> في هذا البروتوكول، يتم تنفيذ استخراج البروتين باستخدام العازلة اليوريا وصفها لأنها واحدة من الأكثر شيوعا حلول استخراج البروتين للدراسات البروتين بسبب توافقه مع إسويلتروفوكوسينغ وكفاءتها في سولوبيليزينغ البروتينات القابلة للذوبان على نحو متقطع 18. وقد تم أثبتت أن هذا المخزن المؤقت يمكن أن يذوب بكفاءة جدا البروتينات القابلة للذوبان، مثل البروتينات غشاء لا يتجزأ 19 ، أو البروتينات التي هي عرضة للغاية للتجميع، مثل توبولين 18. وعلاوة على ذلك، هذا المخزن المؤقت متوافق تماما مع فحص برادفورد لتحديد تركيز البروتين، و ويمكن استخدامه مباشرة في 2-دي والتحليل السائل المرحلة إيف.

ومع ذلك، هذه المخزن المؤقت ليست مثالية لذوبان جميع البروتينات الموجودة في العينة. فمن الممكن أن المخازن استخراج مختلفة يمكن أن تكشف عن البروتينات لا يمكن الكشف عنها بواسطة هذا البروتوكول. على سبيل المثال، هو جيداون أن البروتينات الريبوزية والبروتينات النووية يمكن استخراجها بشكل أفضل مع استخراج حمض أو حمض ثلاثي كلورواسيتيك / الأسيتون هطول الأمطار 20 ، في حين أن مستويات درجة الحموضة القلوية هي أكثر ملاءمة للبروتينات الغشاء 21،22. ولذلك، فإن استخدام مخازن بديلة قد تتطلب خطوات إضافية لهطول البروتين للقضاء على الأملاح التي تتداخل مع 2-دي أو إيف المرحلة السائلة.

قيود التقنية

عدد البروتينات التي تم تحديدها من قبل هذا البروتوكول منخفضة نسبيا، ولكن عدد من هويات وتغطية تحليل البروتين يمكن زيادة زيادة من خلال استخدام الأدوات أكثر حداثة، والتي زادت دقة الشامل وسرعة التسلسل بشكل كبير في السنوات القليلة الماضية 23. فمن الممكن لتغطية جزء كبير من بروتيوم، دون أي خطوات تحريف، من خلال توظيف التدرج الطويل للالسائل تشوفصل الروماتوغرافيا إلى جانب أداة مس عالية الدقة التي لديها سرعة تسلسل سريع 24 .

أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بالطرق القائمة / البديلة

القدرة على تحديد وكمية البروتينات في صمامات القلب البشرية، مثل صمام التاجي، مهمة مهمة وصعبة من شأنها أن تساعد على توضيح آليات العمليات الفسيولوجية / المرضية في أمراض الصمام. تحديد التغيرات في صمام الصمام التاجي بروتيوم سيزيد كثيرا من فهم طبيعة العمليات البيولوجية التي ترتبط مع حالة المرض من الأنسجة.

المعرفة الحالية على فيسيوباثولوغي من الصمام التاجي محدودة ويتم الحصول عليها عموما من خلال تحليل البروتينات الفردية المشاركة في عمليات محددة، مثل إعادة عرض المصفوفة خارج الخلية، الارقاء، والتهاب، أو الاكسدة 25 9 ، 10 .

عدم وجود دراسات البروتين الشامل يمكن أن يعزى إلى تعقيد هذه الأنسجة منخفضة الخلوية التي هي غنية جدا في البروتينات المصفوفة خارج الخلية ( أي بروتيوغليكان، الكولاجين، والإيلاستين). تشكل هذه البروتينات حوالي 80٪ من المبلغ الإجمالي، مما يعيق تحليل البروتينات منخفضة وفرة 26 .

وهكذا، كان من الضروري إنشاء بروتوكول استخراج كفاءة لتحقيق أقصى قدر من الانحلال البروتين من أجل وصف بروتيوم من هذا النسيج. يسمح هذا البروتوكول لاستخراج ~ 50 ميكروغرام من البروتين من 1 ملغ من الأنسجة. هذا هو العائد المنخفض نسبيا بالمقارنة مع الأنسجة "لينة"، مثلكما الكبد (~ 135 ميكروغرام من 1 ملغ من الأنسجة)، ولكن يكفي لإجراء تحليل البروتين على عينات الفردية. ويكتسي ذلك أهمية خاصة عند تحديد التباين داخل الفرد للظاهرة.

وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة لديها ميزة كونها متوافقة مع العديد من التطبيقات التحليلية. بروتين صمام التاجي الذائبة في المخزن المؤقت استخراج يمكن استخدامها مباشرة ل إمونوبلوتينغ وتحليل البروتين على أساس الكهربائي ثنائي الأبعاد ورحلة السائل إسولكتروريسيس 11 ، 12 أو بعد هطول الأمطار البروتين للقضاء على التدخل عنصر العازلة، لفحوصات أخرى، مثل هلام خالية من الطيف الكتلي 15 .

مع تطبيق هذا البروتوكول استخراج، توصيف أكثر شمولا من مكونات البروتين من الأنسجة صمام الصمام التاجي العادي تم الحصول عليها من خلال تحديد العديد من إنتراسيلبروتينات. وتترجم هذه البروتينات في السيتوسول أو في العضيات، وليس فقط في المصفوفة خارج الخلية، ولها وظائف الجزيئية والبيولوجية المختلفة. كما تم تحديد بروتينات أخرى مثيرة للاهتمام ( أي كرياب ، سيبتين -11، فل-1، و ديرماتوبونتين). هذه البروتينات لها وظائف غير معروفة في الصمام التاجي، ولكن خصائصها البيولوجية تشير إلى دور محتمل في أمراض الصمامات.

التطبيقات أو الاتجاهات المستقبلية بعد اتقان هذه التقنية

مع هذا البروتوكول، فمن الممكن لربط البيانات المتعلقة التعبير البروتين مع البيانات عن التعبير مرنا الكمي والتحليلات المناعية غير الكمي. في الواقع، عندما تستخدم معا، وهذه النهج تؤدي إلى فهم أكثر شمولا للآليات الجزيئية الكامنة وراء المرض، من مرنا إلى ما بعد متعدية تعديل البروتين. وهكذا، فإن هذه الطريقة يمكن أن تكون ذات فائدة للباحثين تركز على القلب فيسيوباثولوغي صمام. زعنفةالحليف، ويمكن أيضا أن يطبق هذا البروتوكول إلى صمام الخنازير الخنازير، الذي يحمل تشابه وثيق لصمام الإنسان 27 ويستخدم نموذج تجريبي لتقييم وظيفة صمام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد دعمت وزارة الصحة الإيطالية هذه الدراسة (أرسي 2013-بيو 15). نشكر باربرا ميشيلي لمساعدتها التقنية الممتازة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422, (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4, (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62, (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104, (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15, (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38, (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9, (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193, (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85, (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37, (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18, (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21, (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2, (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93, (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10, (8), M110.003699 (2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151, (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118, (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53, (5), 432-438 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics