פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

הרכב החלבון של שסתום המיטרל האנושי עדיין לא ידוע חלקית, משום שהניתוח שלו מסובך על ידי תאימות נמוכה ולכן על ידי ביוסינתזה חלבונית נמוכה. עבודה זו מספקת פרוטוקול ביעילות לחלץ חלבון לניתוח של proteome שסתום מיטרלי.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ניתוח של proteome הסלולר יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות עקב פיתוח של טכנולוגיות המאפשרים זיהוי בקנה מידה גדול וכימות של חלבונים הנוכחי במערכות ביולוגיות מורכבות.ידע שנרכש מתוך גישה proteomic יכול להוביל הבנה טובה יותר של המנגנונים הפתוגניים המונחים ביסוד מחלות, ומאפשרת זיהוי של סמני מחלה אבחנתיים ופרוגנוסטיים חדשים, וכן, בתקווה, של מטרות טיפוליות. עם זאת, שסתום מיטרלי הלב מייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic בגלל הסלולר נמוכה ב proteoglycan ו קולגן מועשר תאיים מטריקס. זה עושה את זה מאתגר לחלץ חלבונים לניתוח proteomic העולמי. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול התואם ניתוח חלבון לאחר מכן, כגון proteomics כמותי immunoblotting. זה יכול לאפשר את המתאם של נתונים דאגהG ביטוי חלבון עם נתונים על ביטוי mRNA כמותי ניתוח כמותי אימונוהיסטוכימיים. ואכן, גישות אלה, כאשר ביצע יחד, יוביל להבנה מקיפה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות, מ mRNA כדי שינוי שלאחר החלבון translational. לכן, שיטה זו יכולה להיות רלוונטית לחוקרים המעוניינים במחקר physiopathology שסתום הלב.

Introduction

עדויות האחרונות שינו את ההבנה של התפקידים של מנגנונים רגולטוריים רבים המתרחשים לאחר סינתזת mRNA. ואכן, תהליכים טרנסלציוניים, פוסט-תעתיקיים ופרוטוליטיים יכולים להסדיר את שפע החלבון ולתפקודו. הדוגמה - שאומרת כי ריכוזי ה- mRNA הם פרוקסי לאלה של החלבונים המתאימים, בהנחה שרמות התמלילים הן הגורם העיקרי לשפע החלבון - תוקנו חלקית. למרות זאת, רמות התמליל רק מנבאות באופן חלקי את כמות החלבון, מה שמרמז על אירועים פוסט-תעתיק להתרחש כדי לווסת את החלבונים בתוך תאים 1 , 2 .

יתר על כן, חלבונים בסופו של דבר להכתיב את הפונקציה של התא ולכן להכתיב פנוטיפ שלה, אשר יכול לעבור שינויים דינמיים בתגובה גורמים אוטוקרינית, פאראקרין, אנדוקרינית; מתווכים עם דם; טֶמפֶּרָטוּרָה; טיפול תרופתי; ואת המחלה לפתחמנט. לפיכך, ניתוח הביטוי התמקדו ברמת החלבון הוא שימושי כדי לאפיין את proteome ולפרם את השינויים הקריטיים המתרחשים אליו כחלק מחולי המחלה 3 .

לכן, את ההזדמנויות כי proteomics הנוכחי כדי להבהיר בריאות ומחלות התנאים הם אדירים, למרות האתגרים הטכנולוגיים הקיימים. התחומים המבטיחים במיוחד של מחקר, שבהם יכולים פרוטאומיסטים לתרום: זיהוי של ביטוי חלבון שונה בכל רמה ( כלומר, תאים שלמים או רקמות, תאים תת-תאיים ונוזלים ביולוגיים); זיהוי, אימות ואימות של סמנים ביולוגיים חדשים המשמשים לאבחון ולפרוגנוזה של מחלות; וכן, בתקווה, זיהוי של מטרות חלבון חדש שניתן להשתמש בהם למטרות טיפוליות, כמו גם להערכת יעילות התרופות ואת הרעילות 4 .

לכידת המורכבות שלהפרוטאום מייצג אתגר טכנולוגי. כלים proteomic הנוכחי מציעים את ההזדמנות לבצע בקנה מידה גדול, תפוקה גבוהה ניתוח עבור זיהוי, כימות, ואימות של רמות חלבון השתנה. בנוסף, הכנסת שיטות חלוקה והעשרה, שמטרתן למנוע את ההפרעה הנגרמת על ידי החלבונים השופעים ביותר, שיפרה גם את זיהוי החלבון על ידי הכללת החלבונים הפחות שופעים. לבסוף, proteomics הושלמה על ידי ניתוח של שינויים לאחר translational, אשר בהדרגה מופיעים כמו מאפננים חשובים של תפקוד החלבון.

עם זאת, ההכנה המדגם התאוששות חלבון בדגימות ביולוגי תחת ניתוח עדיין להישאר הגבלת הצעדים של זרימת העבודה proteomic ולהגדיל את הפוטנציאל האפשרי pitfalls 5 . ואכן, ברוב טכניקות ביולוגיה מולקולרית כי חייב להיות מותאם, הצעדים הראשונים הם homogenizat רקמותיון ותאי תא, במיוחד במהלך ניתוח של חלבונים בשפע נמוכה עבורם שיטות הגברה לא קיימים. בנוסף, הטבע הכימי של חלבונים יכול להשפיע על ההתאוששות שלהם. לדוגמה, ניתוח של חלבונים הידרופובי מאוד הוא מאתגר מאוד, כי הם מזרזים בקלות במהלך ההתמקדות isoelectric, בעוד חלבונים ממברנה טרנס הם כמעט בלתי מסיסים (נסקרת ב הפניה 5). יתר על כן, השתנות הרכב הרקמה יוצרת מחסום משמעותי לפיתוח שיטת החילוץ האוניברסלית. לבסוף, כי כמעט כל הדגימות הקליניות הן של כמות מוגבלת, זה חיוני כדי לאפשר הכנת חלבון עם התאוששות מקסימלית reproducibility מ כמויות מדגם מינימלי 6 .

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול אופטימיזציה עבור החילוץ חלבון מן השסתום המיטרלי של הלב האנושי, המייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic. שסתום מיטרלי רגיל הוא compמבנה lx שוכב בין אטריום שמאל החדר השמאלי של הלב ( איור 1 ). זה משחק תפקיד חשוב בשליטה על זרימת הדם מן אטריום החדר, מניעת backflow ולהבטיח את רמת נאותה של אספקת חמצן לכל הגוף, ובכך לשמור על פלט לב נאותה. עם זאת, הוא נחשב לעתים קרובות רקמה "לא פעילה", עם תאיות נמוכה כמה רכיבים, בעיקר מטריקס תאיים. הסיבה לכך היא, בתנאים נורמליים, התאים intervitial valvular תושב (VICs) להציג פנוטיפ שקט עם שיעור נמוך biosynthesis חלבון 7 .

עם זאת, הוכח כי במצב פתולוגי, מספר VICs ב spongiosa עולה סינתזת החלבון שלהם מופעל, יחד עם שינויים פונקציונליים אחרים פנוטיפי 8 . לכן, אין זה מפתיע כי הנתונים המינימליים הזמיניםהספרות מתמקדת בניתוח של שסתומים מיטרליים פתולוגיים 9 , 10 , שבהם מספר מוגבר של VICs מופעל עשוי להסביר את המספר הגבוה יחסית של חלבונים מזוהים.

לסיכום, פרוטוקול זה עשוי לשמש כדי להבין את ההבנה של מנגנונים פתוגניים האחראים על מחלות שסתום מיטרלי באמצעות מחקר של מרכיבי חלבון מיטרלי שסתום. ואכן, הבנה גדולה יותר של התהליכים הפתולוגיים הבסיסיים יכולה לסייע בשיפור הניהול הקליני של מחלות שסתום, אשר האינדיקציות הנוכחיות שלהם להתערבות מבוססות במידה רבה על שיקולים המודינאמיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בפרוטוקול זה, לבבות האדם נאספים במהלך explantation multiorgan (זמן איסכמיה קר של 4-12 שעות, כלומר 6 ± 2 שעות) מתורמים רב איברים שלא נכללו בהשתלת איברים מסיבות טכניות או פונקציונליות, למרות פרמטרים אקו-קרדיוגרפיים רגילים. הם נשלחים לבנק רקמות לב וכלי דם של מילאנו, מונזינו Cardiologic מרכז (מילאנו, איטליה) עבור הבנקאות של שסתומים אבי העורקים ריאתי. העלונים האחוריים המיטרליים אינם משמשים למטרות קליניות, ולכן הם נאספים במהלך בידוד שסתום אבי העורקים וריאתי לאחר קבלת הסכמה מדעת מצד קרובי התורמים. רקמת ההשתלה והמחקר נאספת רק לאחר הסכמת ההורים; בגיליון ההסכמה, הם מסמיכים (או לא) את השימוש ברקמת הלב למחקר רק אם אינו מתאים לשימוש קליני בבני אדם ( כלומר, בעיות מיקרוביולוגיות, תפקודיות וסרולוגיות), בהתאם להנחיות ועדת האתיקה שלמרכז קרדיולוגי של מונזינו.

1. הכנת שסתום Mitral

  1. קציר שסתום מיטרלי האדם בהקדם האפשרי לאחר explantation איבר (זמן איסכמיה קרה של 4-12 שעות).
  2. בחדר נקי, הוצא את הלב מתיק ההובלה המכיל פתרון קר (4 מעלות צלזיוס) ( כלומר תמיסת מלח או אירוקולינים בינוניים או ויסקונסין). הכנס אותו לתוך דלי והכניס אותו ארון biosafety (זרימת אוויר אנכי ביוגזאר, Class A, Good Practices טוב (GMP) סיווג) להמשיך בהכנה שסתום.
  3. מניחים את הלב על עטיפה סטרילית חד פעמי בארון. בעזרת אזמל חד פעמי סטרילי, לחתוך את הלב לחלוטין, באופן אופקי לציר המרכזי שלה, על רמת החדרים השמאלית והימנית, כ 4 ס"מ מן השיא.
  4. הזז את אבי העורקים עולה ועורק הריאה כדי להציג את הגג הפרוזדורי השמאלי.
  5. עם מלקחיים autoclavable סטרילית ומבחר, לחתוך סביב האוזן השמאלית עלהגג פרוזדורי שמאל, מה שהופך את שסתום המיטרלית גלוי ומאפשר עבור עלון גדול metral (הקדמי) ואת העלון קטן metral (אחורי) להיות מזוהה.
    הערה: אנטרו-לרוחב ופרוסקופים המדיאלי האחורי מגדירים את הגבול של העלון הקדמי והאזור האחורי.
  6. באמצעות מספריים autoclable סטרילי מלקחיים שאינם טראומטיים, לנתח את אטריום שמאל ועובי דופן החדר סביב היקף שסתום המיטרלית כולה .
  7. זיהוי המשכיות שסתום מיטרו-אבי העורקים.
    הערה: החדר השמאלי מכיל את כל שסתום המיטרל והאקורדים.
  8. הפרד את העלון הקדמי של שסתום המיטרל מעלון שסתום המטרל האחורי, חותך את העלון האחורי לאורך ההכנסה עם החדר (הקומיסר).
  9. לשטוף את העלון האחורי של תמיסת מלח. חותכים את עלון לחתיכות קטנות (<1 ס"מ 2 ) ו בנפרד לעטוף אותם בנייר אלומיניום. הצמד להקפיא אותם עם חנקן נוזלי.
    זהירות: בצע את נוהלי הבטיחות הארגוניים בעת השימוש בחנקן נוזלי.
    1. לטהר את השולחן של הממשלה עם פתרון אלכוהול 70% איזופרופיל ו 6% מי חמצן פתרון בסוף ההליך.

2. חלבון מיצוי

  1. השתמש מלקחיים כדי לאסוף את המדגם מאוחסן חנקן נוזלי ומיד למקם אותו על קרח יבש בעוד עטוף בנייר אלומיניום. אל תשאיר את המדגם להפשר במהלך העברות.
  2. לפני שחיקה, צמרמורת חרסינה / זירקוניום ו העליונות של מערכת מלתעה ( למשל, CryoGrinder), יחד עם המדגם, על ידי לשים אותם בקבוק דיואר המכיל חנקן נוזלי (~ 500 מ"ל).
    זהירות: בצע את נוהלי הבטיחות הארגוניים בעת השימוש בחנקן נוזלי.
  3. שים את המרגמה ואת העלי בתיבה קלקר המכיל קרח יבש. הסר את המדגם מתוך רדיד אלומיניום והכניס אותו לתוך המלט.
  4. Grind tהוא מדגם עם העלי הגדול נגד המרגמה 15-20 פעמים, באמצעות מברג לסובב את העלי. מערבבים את המדגם עם קצה של מרית טרום צונן במהלך תהליך השחזה.
    1. חזור עם העלי הקטן.
  5. מעבירים את המדגם הקרקע צינור שקלול בעבר ( למשל, צינור צנטריפוגה 15 מ"ל) על ידי הפיכת הצינור, הצבתה על המלט, והפך אותם יחד כדי להעביר את המדגם לצינור. השתמש מרית מראש צונן לשחזר את כל החומר מן המרגמה.
    1. שמור את הצינור עם המדגם על קרח יבש, כדי למנוע מדגם הפשרה במהלך ההעברה.
  6. חישוב משקל נטו של המדגם.
  7. נקה את המלט ואת העלי אחרי כל מדגם ולטהר אותם על ידי מעוקר או חימום אותם ב 200 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  8. מעבירים את המדגם אבקת מן צינור צנטריפוגה כדי צינור זכוכית של homogenizer על ידי היפוך.
  9. הוסף Buree אוריאה מסונניםR (8 M אוריאה, 2 M thiourea, 4% w / v CHAPS, 20 מ"מ טריס, ו dithiotreitol 55 מ"מ) כדי צינור זכוכית, 200 μL של חיץ אוריאה עבור כל 10 מ"ג אבקת רקמה.
    הערה: שאריות אבקת שיורית שנותר צינור צנטריפוגה ניתן לשחזר באמצעות חלק נפח מחושב של חיץ אוריאה.
  10. Homogenize המדגם באמצעות stirrer מצויד עם מרגמה זכוכית borosilicate ו עליון polytetrafluoroethylene (PTFE). לאט לאט לחץ על העלי על המדגם עם תנועה מתפתל (1,500 סל"ד) 10 פעמים.
  11. לשחזר את supernatant ולהעביר אותו צינור נקי 1.7 מ"ל צנטריפוגות. שוב לחלץ את המדגם הנותר עם טריים אוריאה חיץ, הוספת חצי נפח בשימוש במהלך החילוץ הראשון.
  12. חזור על שלב 2.10.
  13. לשחזר את supernatant ולשלב אותו עם supernatant משלב 2.11. מניחים את supernatant משולב על מסובבת צינור במשך 30 דקות.
  14. צנטריפוגה הצינור למשך 30 דקות ב XG 13,000 ו 4 ° C.
  15. לשחזר את supernatant אד למדוד את ריכוז החלבון באמצעות assay חלבון Bradford, לפי הוראות היצרן. חנות המדגם ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

החילוץ והפירוק של חלבונים במאגר אוריאה תואם באופן ישיר עם שיטות proteomic מבוסס על isoelectrofocusing (דו מימדי אלקטרופורזה (2-DE) 11 ו בשלב נוזלי isoelectric התמקדות (IEF) 12 ) ועם immunoblotting לאחר דילול במאגר Laemmli 13 המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז 14 .

עבור ג 'ל חופשי המוני ספקטרומטר מבוסס שיטות ( כלומר, כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים לנתונים עצמאיים לנתח ספקטרומטריית מסה (LC / MS E ) ו דו מימדי LC / MS E (2D-LC / MS E )) 15 , דגימות מופק במאגר אוריאה המתואר צריך להיות מטופל נוסף כדי לחסל את אוריאה ו thiourea, אשר עלול להפריע עיכול חלבון הבאים הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית. Thiשלב זה יכול להתבצע באמצעות ערכות משקעים חלבונים מסחריים, בעקבות הוראות היצרן כדי לזרז את החלבונים. המדגם יכול להיות מומס לאחר מכן ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3 המכיל 0.1% דטרגנטים חדישים לעיכול חלבון 16 . משקעים של חלבונים יכולים לחסל מרכיבים חיץ, המשפיעים מינימלית על תוכן החלבון (התאוששות חלבון:> 85%), ובכך להפוך את המדגם מתאים לכל סוג של ניתוח.

היישום של פרוטוקול זה מיצוי חלבונים מן שסתומים מיטרליים האדם מותר לזיהוי של סך של 422 חלבונים, שילוב של ארבע גישות proteomics שונים שתוארו לעיל בפירוט 11 , 15 . באופן ספציפי, 169 חלבונים זוהו על ידי 2-DE, 330 חלבונים על ידי נוזל שלב IEF, 96 חלבונים על ידי LC / MS E , ו 148 חלבוניםעל ידי 2D-LC / MS E (טבלה 1).

כדי לסווג את 422 חלבונים שזוהו במונחים של לוקליזציה תת-תאית, נעשה שימוש בתוכנה לאנליזה של גנים (GO) ( למשל, Cytoscape). הרשת שנוצרה עם התוכנה ואת התוספת המקביל שלה הראה כי, מלבד החלבונים הצפוי מקומי באזור תאיים (ראה החלק הימני העליון של איור 2 ), רוב החלבונים המזוהים על ידי גישות proteomic היו מן האזור תאיים ( כלומר, ציטופלזמה, אברונים, שלפוחית, ו cytoskeleton). תאים חלבונים פנימיים זוהו גם ( איור 2 ).

תוצאות אושרו עוד בשלושה דגימות שסתום מיטרלי עצמאית. Immunoblotting שימש כדי לנתח קבוצה של ארבעה חלבונים ( כלומר, ספטין -11, ארבעה וחצי תחומים LIM חלבונים 1 (FHL-1), derMetopontin, ו- alpha crystallin B (Cryab)) אשר מעולם לא זוהו בשסתום המיטרלי הרגיל ( איור 3 ).

איור 1
איור 1: מבנה שסתום Mitral. מבט מלמעלה על הלב האנושי מראה את שסתום מיטרלי ( A ) סגור או פתוח ( B ). מבט קדמי של החדר השמאלי של הלב האנושי ( C ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ניתוח של חלבונים שסתום מיטרלי מזוהים בטווח של התפלגות הסלולר. Cytoscape ואת תוסף BiNGO שימשו כדי getaiN הפצה של מונחים אונטולוגיים של גנים (GO) מקטגוריות הרכיב הסלולרי. גודל המעגל הוא פרופורציונלי למספר רכיבי החלבון הנלווים למונחי ה- GO שנבחרו, וסולם הצבעים עבור ערך ה- p של הייצוג המוגזם מדווח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ניתוח Immunoblotting של SEptin-11, FHL-1, dermatopontin, ו Cryab בתמצית שלמה משלושה כרוזים שסתום האדם מיטרלי נורמלי. Immunoblotting בוצע באמצעות נוגדנים חד שבטיים העכבר נגד נוגדנים cryab ארנב ו polyclonal נגד ספטין -1, FHL-1, ו dermatopontin נוגדנים. אנאלחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

<Td> x <Td> <Td> פרוטאזום תת סוג בטא 4 מבשר <Td> </ Tr> <Td> Transgelin 2 <Td> <Tr> <Td>
הִצטָרְפוּת תאור 2-DE 2D-LC LC-MS E שלב IEF נוזלי
A6NMZ7 קולגן אלפא VI איקס
O00151 PDZ ו LIM תחום חלבון 1 איקס
O00299 כלוריד ערוץ חלבון תאיים 1 איקס
O00764 קינאז Pyridoxal איקס
O14558 מחממים הלם חלבון בטא 6 איקס
O43399 גידול חלבון D54 איקס
O43488 אפלוקסין B1 אלדהיד רדוקטאז חבר 2 איקס
O43707 אלפא אקטין 4 איקס איקס
O43866 אנטיגן CD5 כמו מבשר איקס
O60493 מיון nexin 3 איקס
O60701 UDP גלוקוז 6 dehydrogenase איקס
O75223 חלבון uncharacterized איקס
O75368 SH3 מחייב חומצה גלוטמית עשיר כמו חלבון איקס
O75390 ציטראז סינתזה המיטוכונדריה מבשר איקס
O75489 NADH dehydrogenase ubiquinone ברזל חלבון גופרית 3 מבשר המיטוכונדריאלי איקס איקס
O75608 Acyl חלבון thioesterase 1 איקס
O75828 קרבוניל רדוקטאז NADPH 3 איקס
O75874 Isiditrate dehydrogenase NADP cytoplasmic איקס
O75955 ציטוטים איקס
O94760 NG dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1 איקס
O94788 דיידרוגנאז רשתית 2 איקס
O95865 NG dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 איקס איקס
P00325 אלכוהול dehydrogenase 1B איקס איקס
P00338 L דיאטידרוגניז L איקס
P00352 דיידרוגנאז רשתית 1 איקס
P00441 Superoxide לדכא Cu Zn איקס איקס
P00450 מבשר קרולופלאסמין איקס איקס
P00488 גורם קרישה XIII מבשר שרשרת איקס
P00491 פוספורלאז איקס
P00492 Hypoxanthine גוספא פוספוריבוסילטרנספראז איקס
P00558 קינאז phosphoglycerate 1 איקס איקס
P00568 Adinylate קינאז isoenzyme 1 איקס
P00734 פרותומבין איקס איקס
P00738 הפטוגלובין איקס איקס איקס איקס
P00739 Haptoglobin קשור מבשר חלבון איקס
P00751 גורם משלים ב איקס איקס איקס
P00915 פחמימות אנהידראז 1 איקס
P00918 פחמימות אנהידראז איקס
P01008 Antithrombin השלישי מבשר איקס איקס איקס
P01009 אלפא 1 antitrypsin איקס איקס איקס איקס
P01011 אלפא 1 antichymotrypsin איקס איקס איקס איקס
P01019 מבשר אנגיוטנסינוגני איקס איקס
P01023 אלפא 2 macroglobulin איקס איקס
P01024 השלמה C3 איקס איקס איקס איקס
P01033 מעכב Metalloproteinase 1 מבשר איקס
P01042 קינינוגן 1 מבשר איקס
P01593 AG באזור VI שרשרת קאפה איג איקס
P01598 Ig kappa chain VI אזור האיחוד האירופי איקס
P01600 Ig kappa שרשרת VI אזור Hau איקס איקס
P01611 Ig kappa שרשרת VI אזור Wes איקס
P01620 Ig kappa שרשרת V III אזור SIE איקס
P01625 Ig kappa שרשרת V IV אזור לן איקס
P01766 BRO V III באזור שרשרת כבדה איג איקס איקס
P01781 Ig כבד שרשרת V III אזור GAL איקס
P01834 Ig קאפה שרשרת אזור C איקס איקס איקס איקס
P01842 Ig למבדה שרשרת C אזורים איקס איקס איקס
P01857 Ig gamma 1 שרשרת איקס איקס איקס איקס
P01859 Ig gamma 2 שרשרת איקס איקס איקס איקס
P01860 Ig gamma 3 שרשרת איקס איקס איקס
P01861 Ig gamma 4 שרשרת איקס איקס איקס
P01871 שר50 איקס איקס איקס
P01876 Ig אלפא 1 שרשרת איקס איקס איקס איקס
P01877 Ig אלפא 2 שרשרת באזור C איקס
P02144 מיוגלובין איקס איקס
P02452 קולגן אלפא 1 אני שרשרת איקס איקס איקס איקס
P02511 אלפא Crystallin B שרשרת איקס
P02545 למינציה AC 70 kDa lamin איקס איקס איקס איקס
P02647 Apolipoprotein AI איקס איקס איקס איקס
P02649 Apolipoprotein E איקס איקס איקס איקס
P02671 שרשרת אלפא פיברינוגן איקס איקס איקס איקס
P02675 פיברינוגן איקס איקס איקס איקס
P02679 שרשרת גמא פיברינוגן איקס איקס איקס איקס
P02689 מיאלין P2 חלבון איקס
P02735 סרום עמילואיד מבשר חלבון איקס
P02741 C מבשר חלבון תגובתי איקס
P02743 סרום עמילואיד P מרכיב איקס איקס איקס איקס
P02746 משלים C1q משנה תת יחידה ב איקס איקס
P02747 משלים C1q משנה תת יחידה C מבשר איקס
P02748 רכיב משלים C9 איקס איקס איקס
P02749 בטא 2 גליקופרוטין 1 איקס איקס איקס איקס
P02750 Leucine עשיר אלפא 2 מבשר glycoprotein איקס
P02751 פיברונקטין איקס איקס
P02760 מבשר חלבון AMBP איקס איקס איקס איקס
P02763 אלפא 1 חומצה גליקופרוטאינים 1 איקס איקס איקס
P02765 אלפא 2 מבשר גליקופרוטין HS איקס
P02766 מבשר טרנסתיירטין איקס איקס איקס
P02768 אלבומין בסרום איקס איקס איקס איקס
P02774 ויטמין D מחייב חלבון מבשר איקס
P02787 סרוטראנספרין איקס איקס איקס איקס
P02788 מבשר Lactotransferrin איקס
P02790 Hemopexin איקס איקס איקס איקס
P02792 Ferritin שרשרת האור איקס
P04004 ויטרונקטין איקס איקס איקס איקס
P04075 פרוקטוז ביספוספט אלדולס א איקס
P04083 נספח A1 איקס איקס איקס איקס
P04179 Superoxide dissutase Mn מבשר המיטוכונדריאלי איקס
P04196 Histidine עשיר מבשר glycoprotein איקס
P04217 אלפא 1B מבשר גליקופרוטין איקס איקס
P04350 Tubulin ביתא 4 שרשרת איקס
P04406 Glyceraldehyde 3 פוספט dehydrogenase איקס איקס איקס איקס
P04792 מחממים הלם חלבון בטא 1 איקס איקס איקס איקס
P05091 Aldehyde dehydrogenase מבשר המיטוכונדריה איקס איקס
פלזמה פרוטאז C1 מעכב מבשר איקס
P05156 גורם משלים אני מבשר איקס
P05413 חומצת שומן חומצה לב מחייב הלב איקס
P05452 Tetranectin מבשר TN איקס איקס
P05787 סוג קראטין II cytoskeletal 8 איקס
P06396 גלסולין איקס איקס איקס איקס
P06576 ATP סינתזה תת מבטא מיטוכונדריה מבשר איקס איקס
P06732 קריאין קינאז M סוג איקס איקס
P06733 אלפא enolase איקס איקס איקס איקס
P06753 Tropomyosin אלפא 3 שרשרת איקס איקס
P07108 Acyl CoA מחייב חלבון איקס
P07195 L לקטיד dehydrogenase B שרשרת איקס איקס איקס
P07196 אור פוליפפטיד Neurofilament איקס
P07197 פוליפרופיד בינוני Neurofilament איקס איקס
P07237 פרוטאין דיסולפיד איזומרז מבשר איקס איקס
P07339 מבשר קפסין D איקס איקס
P07355 נספח א 2 איקס איקס איקס איקס
P07360 מרכיב משלים C8 מבשר שרשרת גמא איקס
P07437 טובולין שרשרת ביתא איקס איקס איקס איקס
P07585 דקורין איקס איקס איקס איקס
P07737 פרופילין 1 איקס
P07858 מבשר קפסין B איקס
P07900 מחממים הלם חלבון HSP 90 אלפא איקס איקס
P07951 Tropomyosin ביתא שרשרת איקס
P07954 Fometate hydratase מבשר המיטוכונדריה איקס
P07996 טרומבוספונדין 1 איקס איקס איקס
P08107 הלם חום 70 kDa חלבון 1A 1B איקס איקס איקס איקס
P08123 קולגן אלפא 2 אני שרשרת איקס איקס איקס איקס
P08133 נספח A6 איקס איקס
P08238 מחממים הלם חלבון HSP 90 בטא איקס איקס
P08253 72 kDa סוג IV מבשר קולגן איקס
P08294 תאית superoxide dissutase Cu Zn מראשהסמן איקס איקס איקס
P08590 פוליפפטיד אור מיוזין 3 איקס איקס
P08603 גורם משלים ח איקס איקס איקס איקס
P08670 וימנטין איקס איקס איקס איקס
P08729 סוג קראטין II cytoskeletal 7 איקס
P08758 נספח A5 איקס איקס איקס איקס
P09211 גלוטתיון S Transferase P איקס איקס איקס
P09382 גלקטין 1 איקס איקס איקס
P09417 Dihydropteridine רדוקטאז איקס
P09493 Tropomyosin 1 שרשרת אלפא איקס איקס
P09525 נספח A4 איקס איקס
P09651 הטרוגניות ribonucleoprotein A1 איקס
P09871 משלים C1s מבשר המשנה איקס
P09936 מסוף הידרוזיס קרבוקסיל isozyme L1 איקס
P09972 פרוקטוז ביספוספט אלדולז ג איקס
P0C0L4 השלמה C4 מבשר איקס
P0CG05 IgLambda 2 שרשרת C אזורים איקס
P0CG38 POTE ankyrin תחום משפחה אני איקס
P10515 Dhyydrolipoyllysine שאריות acetyltransferase רכיב של deydrogenase pyruvate מורכבים איקס
P10768 פורמולגלוטיון איקס
P10809 60 kDa חום הלם חלבון מבשר המיטוכונדריה איקס
P10909 קלוסטרין איקס איקס איקס איקס
P10915 Hyaluronan ו proteoglycan קישור חלבון 1 מבשר איקס איקס
P11021 78 kDa gחלבון מוסדר איקס איקס איקס
P11047 יחידת איקס
P11142 הלם חום cognate 71 חלבון kDa איקס איקס איקס איקס
P11177 Phyvate dehydrogenase E1 רכיב משנה תת מבשר המיטוכונדריה איקס
P11217 שריר גליקוגן phosphorylase טופס איקס
P11310 שרשרת בינונית ספציפית acyl coa dehydrogenase מבשר המיטוכונדריה איקס
P11413 גלוקוז 6 פוספט 1 dehydrogenase איקס
P11766 אלכוהול dehydrogenase בכיתה 3 צ 'י שרשרת איקס
P12036 Neurofilament כבד פוליפפטיד איקס
P12109 קולגן אלפא 1 VI שרשרת איקס איקס איקס איקס
P12110 קולגן אלפא 2 שרשרת VI איקס איקס איקס איקס
P12111 קולגן אלפא 3 שרשרת VI איקס איקס איקס
P12277 קריאין קינאז מסוג B איקס
P12429 נספח A3 איקס איקס
P12814 אלפא אקטין 1 איקס איקס
P12829 פוליפפטיד אור מיוזין 4 איקס
P12882 מיוזין 1 איקס
P12883 מיוזין 7 איקס איקס
P12955 XEP Pro Dipeptidase איקס
P13489 מעכב Ribonuclease איקס
P13533 מיוזין 6 איקס איקס
P13611 Versican מבשר חלבון הליבה איקס איקס
P13639 גורם הארכה 2 איקס
P13716 דלתא חומצה אמינולאית איקס
P13796 פלסטין 2 איקס
P13804 העברת אלקטרונים flavoprotein מטהרת אלפא מיטוכונדריאלי מבשר איקס
P13929 בטא אנולז איקס איקס
P14136 אסטרוציט חלבון פיבריללי חומצי איקס
P14314 גלוקוזידאז 2 מקדם ביתא מבטל איקס
P14550 אלכוהול dehydrogenase NADP איקס
P14618 קינאז Pyrovate isinymes M1 M2 איקס איקס איקס
P14625 </ Td> Endoplasmin מבשר איקס איקס
P15121 הפחתה איקס
P15259 Phosphoglycerate mutase 2 איקס
P16152 קרבוניל רדוקטאז NADPH 1 איקס
P17066 הלם חום 70 ק"ג חלבון 6 איקס איקס איקס
P17174 Asperate aminotransferase cytoplasmic איקס
P17540 קריאין קינאז מבשר מיטוכונדריאלי איקס
P17661 דסמין איקס איקס איקס איקס
P17980 26S פרוטאז רגולטורית תת 6A איקס
P17987 T חלבון מורכב 1 אלפא משנה איקס
P18206 וינסולין איקס איקס
P18428 Lipopolysaccharide מבשר חלבון מבשר איקס
P18669 טרשת נפוצה של phosphoglycerate 1 איקס
P19105 מיוזין רגולטורית שרשרת האור 2 איקס איקס
P19623 Spermidine סינתזה איקס
P19652 אלפא 1 חומצה glycoprotein 2 מבשר איקס איקס
P19823 אלפא טריפסין מעכב כבד שרשרת H2 איקס
P19827 מעכב טריפסין אלפא כבד שרשרת H1 איקס איקס
P20073 נספח A7 איקס
P20618 פרוטאזום יחידת משנה סוג ביתא 1 מבשר איקס
P20774 מימקן איקס איקס איקס איקס
P21266 גלוטתיון S איקס
P21333 פילמין א איקס איקס
P21796 מתח תלוי בחלבון הערוץ הסלקטיבי של אניון1 איקס
P21810 ביגלייקן איקס איקס איקס איקס
P21980 פרוטאין גלוטמין גמא גלוטמיילטרנספראז 2 איקס איקס
P22105 טנאסקין X איקס איקס
P22314 הפעלת אנזים E1 איקס
P22352 גלוטתיון peroxidase 3 מבשר איקס איקס
P22626 הטרוגניות ribonucleoproteins A2 B1 איקס
P22695 Ubiquinol ציטוכרום c רדוקטאז מורכב חלבון הליבה 2 מבשר המיטוכונדריאלי איקס
P23141 כבד carboxylesterase 1 מבשר איקס
P23142 פיבולין 1 איקס איקס איקס איקס
P23284 Pptidyl prolyl cis trans isomerase B מבשר איקס
P23381 טריפטופניל tRNA synthtase cytoplasmic איקס
P23526 Adenosylhomocysteinase איקס איקס
P23528 קופילין 1 איקס
P24752 Acetyl CoA acetyltransferase מבשר המיטוכונדריה איקס
P25311 אבץ אלפא 2 glycoproteiמבשר איקס
P25705 ATP סינתזה יחידת משנה אלפא מיטוכונדריה איקס
P25788 סוג אלפא תת-פרוטאזומי 3 איקס איקס
P25789 סוג אלפא תת-פרוטאזומי 4 איקס
P26447 חלבון S100 A4 איקס
P27348 14 3 3 חלבון איקס איקס
P27797 מבשר קלריצולין איקס
P28066 סוג אלפא תת-פרוטאזומי 5 איקס
P28070 איקס איקס
P28072 פרוטאזום תת סוג ביתא 6 מבשר איקס
P28074 פרוטאזום subunit ביתא סוג 5 מבשר איקס
P28331 NADH ubiquinone oxidoreductase 75 kDa מבשר מיטוכונדריאלי מבשר איקס
P28838 ציטוזול אמינופפטידאז איקס
P29218 מונוספטאטוז אינוסיטול איקס
P29401 Transketolase איקס
P29692 גורם הארכה 1 דלתא איקס
P29966 Myarioylated alanine עשיר C מצע קינאז איקס
P30040 חלבון reticulum Endoplasmic ERP29 מבשר איקס
P30041 Peroxiredoxin 6 איקס איקס
P30043 Flavin רדוקטאז איקס
P30044 Peroxiredoxin 5 מבשר המיטוכונדריה איקס
P30085 UMP CMP קינאז איקס
P30086 חלבון מחייב phosphatidylthamolamine 1 איקס
P30101 פרוטיN דיסולפיד isomerase A3 מבשר איקס איקס איקס
P30613 Pyrovate קינאז isozymes RL איקס
P30740 מעכב elastase ליקוציט איקס
P31025 Lipocalin 1 מבשר איקס
P31937 3 מבשר המיטוכונדריאלי hydroxyisobutyrate dehydrogenase איקס
P31942 הטרוגניות ribonucleoprotein H3 איקס
P31943 הטרוגניות ribonucleoprotein H איקס
P31946 14 3 3 חלבון ביתא אלפא איקס איקס
P31948 פוספופרוטין המופעל על ידי מתח 1 איקס
P31949 חלבון S100 A11 איקס
P32119 Peroxiredoxin 2 איקס איקס
P34931 הלם חום 70 kDa חלבון 1 כמו איקס איקס
P34932 הלם חום 70 ק"ג חלבון 4 איקס
P35232 לאסור איקס
P35237 סרפין B6 איקס
P35443 טרומבוספונדין 4 איקס
P35555 פיברילין 1 איקס איקס
P35579 מיוזין 9 איקס איקס איקס
P35580 מיוזין 10 איקס איקס
P35609 אלפא actinin 2 איקס
P35625 מעכב Metalloproteinase 3 איקס איקס
P35998 26S פרוטאז רגולטורית תת יחידה 7 איקס
P36871 Phosphoglucomutase 1 איקס איקס
P36955 פיגמנט אפיתל נגזר גורם איקס איקס
P37802 איקס איקס
P37837 Transaldolase איקס
P38117 העברת אלקטרונים איקס
P38646 מתח 70 מבשר המיטוכונדריה חלבון איקס איקס
P39687 Acucic leucine עשיר phosphoprotein גרעיני 32 בן משפחה א איקס
P40121 מקרופאג המכסה חלבון איקס
P40925 Malate dehydrogenase cytoplasmic איקס
P40926 מבשר מיטוכונדריאלי איקס
P41219 פריפרין איקס
P42330 1 חבר C3 איקס
P45880 מתח תלוי בחלבון הערוץ הסלקטיבי של אניון איקס
P47755 F אקטין מכסת חלבון תת יחידה אלפא 2 איקס איקס
P47756 F אקטין מכסת חלבון תת חטיבה איקס איקס
P47985 Ubiquinol ציטוכרום c רדוקטאז ברזל גופרית תת מבשר המיטוכונדריה איקס
P48047 ATP סינתזה O מבשר מיטוכונדריאלי איקס
P48637 גלוטתיון סינתטיז איקס
P48741 הלם חום 70 ק"ג חלבון 7 איקס איקס
P49189 4 trimethylaminobutyraldehydehyase dehyderogenase איקס
P49368 T חלבונים מורכבים 1 יחידת גמא איקס
P49747 סחוס חלבון אוליגומרי מטריקס איקס איקס איקס איקס
P49748 שרשרת ארוכה מאוד acyl ספציפי COA dehydrogenase מבשר המיטוכונדריה איקס
P50395 מעבדה איקס X </ Td>
P50454 מבשר סרפין H1 איקס
P50995 נספח A11 איקס
P51452 חלבון ספציפי phosphatase 3 איקס
P51884 לומיקני איקס איקס איקס איקס
P51888 מבשר קדום איקס איקס איקס איקס
P52565 Rho תמ"ג דיסוציאציה 1 איקס
P52566 Rho תמ"ג דיסוציאציה 2 איקס
P54652 הלם חום הקשורים 70 חלבון קדה 2 איקס איקס איקס איקס
P55072 טרנספורמציה טרשתית אנדופלסמית ATPase איקס
P55083 Microfibril הקשורים glycoprotein 4 מבשר איקס איקס
P57053 היסטון H2B סוג F איקס
P60174 איסומראז תלת-פוספט איקס איקס איקס
P60660 פוליפפטיד אור מיוזין 6 איקס איקס
P60709 אקטין cytoplasmic 1 איקס איקס איקס איקס
P60981 דסטין איקס
P61086 הצטברות אנזים Ubiquitin E2 25 kDa איקס
P61088 הצטברות אנזים Ebiquitin איקס
P61224 ראס קשור חלבון ראב 1b מבשר איקס
P61978 הטרוגניות ribonucleoprotein K איקס איקס
P61981 14 3 3 חלבון גמא איקס איקס איקס
P62258 14 3 3 חלבון epsilon 14 3 3E איקס
P62491 ראס הקשורים חלבון איקס
P62714 סרום threonine חלבון phosphatase 2A קטליטי יחידת משנה ביתא isoform איקס
P62736 שריר אקטין שריר חלק איקס איקס איקס
P62805 היסטון H4 איקס
P62826 GTP מחייב חלבון גרעיני רן איקס
P62873 חלבון גואנין נוקלאוטיד מחייב GIGSGT יחידת משנה ביתא 1 איקס
P62879 גואנין נוקליאוטידים מחייב חלבון GIGSGT subunit ביתא 2 איקס
P62937 פפטידל prolyl cis trans isomerase א איקס איקס
P62987 חלבון ריבוזומלי 60 ליטר איקס
P63104 14 3 3 3דאטה דלתא זטה איקס איקס איקס איקס
P63241 מקדם ייזום תרגום אוקריוטים 5 א 1 איקס
P63244 גואנין נוקליאוטידים מחייב חלבון יחידת משנה ביתא 2 כמו 1 איקס
P63267 אקטין גמא אנטריק שריר חלק איקס איקס
P67936 Tropomyosin אלפא 4 שרשרת איקס
P68032 שריר הלב של אקטין אלפא 1 איקס
P68104 גורם הארכה 1 אלפא 1 איקס איקס איקס
P68133 אקטין שרירי השלד
P68363 טובולין אלפא 1B שרשרת איקס איקס איקס
P68371 טובולין בטא 2C שרשרת איקס איקס איקס
P68402 טסיות גורם הפעלת acetylhydrolase IB תת יחידה איקס
P68871 המוגלובין איקס איקס איקס
P69905 המוגלובין יחידת משנה אלפא איקס איקס
P78371 חלבון מורכב 1 בטא יחידה איקס
P78417 גלוטתיון טרנספרס אומגה 1 איקס איקס
P80748 Ig למבדה שרשרת VIאזור II LOI איקס
P98095 פיבולין 2 איקס איקס
Q01082 Spectrin בטא בשר המוח 1 איקס
Q01449 Myosin רגולטורית שרשרת האור 2 איזופורם פרוזדורי איקס
Q01518 Adenylyl cyclase הקשורים חלבון 1 איקס
Q01995 Transgelin חלקלק שריר חלבון 22 אלפא איקס
Q03252 Lamin B2 איקס איקס
Q03591 גורם משלים H הקשורים חלבון 1 מבשר איקס
Q04917 14 3 3 חלבון eta איקס איקס
Q06323 יחידת משנה מורכבת של פרוטאזום activator 1 איקס
Q06828 פיברומודולין איקס איקס איקס איקס
Q06830 פרוקסידוקסין 1 איקס איקס
Q07507 דרמטופונטין איקס איקס איקס איקס
Q07960 Rho GTPase הפעלת חלבון 1 איקס
Q08257 קוקסנון חמצון איקס
Q08431 לקטרין איקס איקס
Q12765 S1 איקס
Q13011 דלתא 3 5 דלתא 2 4 dienoyl CoA איזומראז מבשר המיטוכונדריה איקס איקס
Q13228 סלניום חלבון מחייב 1 איקס איקס
Q13404 הצטברות אנזים Ebiquitin E2 גרסה 1 איקס
Q13409 דינאין ציטופלסמה 1 שרשרת ביניים 2 איקס
Q13509 Tubulin ביתא 3 שרשרת איקס איקס איקס
Q13642 ארבעה וחצי תחומים חלבון LIM 1 איקס
Q13765 פוליפפטיד המתהווה הקשורים אלפא משנה מורכבת איקס
Q13885 N Tubulin ביתא 2A שרשרת איקס איקס
Q14194 חלבון הקשור Dihydropyrimidinase 1 איקס
Q14195 חלבון הקשור Dihydropyrimidinase 3 איקס איקס איקס איקס
Q14624 מעכב טריפסין אלפא כבד שרשרת H4 מבשר איקס
Q14697 ניטרלי אלפא glucosidase א מבשר איקס
Q14764 החלבון העיקרי של קמרון איקס
Q14767 גורם המרה גורם צמיחה ביתא מחייב חלבון 2 איקס איקס
Q14894 מומו גבישי הורמון הורמון בלוטת התריס הורמון בלוטת התריס איקס
Q15063 מבשר Periostin איקס איקס איקס איקס
Q15084 פרוטאין דיסולפיד איזומראז A6 מבשר איקס
Q15113 פרופולגן C endopeptidase משפר 1 מבשר איקס
Q15181 פירווספטאטז אנאורגני איקס
Q15365 פוליפרופילן מחייב פוליאתילן 1 איקס
Q15366 פוליפרופילן מחייב פוליאתילן 2 איקס
Q15582 שינוי גורם הבטא גורם חלבון איקס איקס איקס
Q15819 Ubiquitin אנזים מצומד E2 גרסה 2 איקס
Q16352 אלפא אינטרקסין איקס
Q16473 טססקין איקס
Q16555 חלבון הקשור Dihydropyrimidinase 2 איקס איקס איקס
Q16698 2 4 דינויל CoA רדוקטאז מבשר המיטוכונדריה איקס
Q16891 קרום פנימי מיטוכונדריאלי איקס
Q562R1 בטא כמו חלבון 2 איקס
Q6S8J3 POTE ankyrin תחום בן משפחה E איקס
Q6UWY5 Olfactomedin כמו חלבון 1 מבשר איקס איקס
Q71U36 Tubulin אלפא 1A שרשרת איקס איקס איקס
Q7Z7G0 יעד מבשר Nesh SH3 איקס איקס איקס
Q8WUM4 מוות מתוכנן של תאים 6 אינטראקציה חלבון איקס
Q8WWX9 Thioredoxin כמו מבשר מ 'selenoprotein איקס
Q92597 חלבון NDRG1 איקס
Q92945 אלמנט במעלה הזרם איקס
Q96CN7 Isochorismatase תחום המכיל חלבון 1 איקס
Q96CX2 BTB POZ תחום המכיל חלבון איקס
Q96KK5 היסטון H2A סוג 1 H איקס איקס
Q96KP4 דיפפטידאז ציטוזולי לא ספציפי איקס
Q99426 Tubulin ספציפי chaperone ב איקס
Q99497 פרוטאין DJ 1 איקס איקס
Q99536 חלבון שלפוחית ​​שלפוחית ​​סינפטית איקס איקס איקס
Q99714 3 hydroxyacyl COA dehydrogenase סוג 2 איקס
Q99715 קולגן אלפא 1 XII שרשרת איקס איקס
Q99798 מבשר hydratease מבשר המיטוכונדריה איקס
Q9BQE3 Tubulin אלפא 6 שרשרת איקס
Q9BUF5 Tubulin ביתא 6 שרשרת איקס איקס
Q9BUT1 סוג hydroxybutyrate dehydrogenase 2 איקס
Q9BVA1 Tubulin ביתא 2B שרשרת איקס איקס איקס
Q9BXN1 אספורין איקס X </ Td> איקס איקס
Q9H0W9 אסטר הידראולזי C11orf54 איקס
Q9H4B7 Tubulin ביתא 1 שרשרת איקס
Q9NRN5 Olfactomedin כמו חלבון 3 מבשר איקס איקס
Q9NRV9 חלבון מחייב Heme 1 איקס
Q9NSB2 סוג קראטין II קורטיקולרי Hb4 איקס איקס
Q9NVA2 11 בספטמבר איקס
Q9UBR2 מבשר קאתפסין Z איקס
Q9UBX5 פיבולין 5 איקס איקס
Q9UK22 F חלבונים רק 2 איקס
Q9Y277 תרכובת חלבון אניון תלויי מתח 3 איקס
Q9Y281 קופילין 2 איקס
Q9Y490 טלין 1 איקס
Q9Y696 כלוריד ערוץ חלבון תאיים 4 איקס
Q9Y6C2 אמילין 1 איקס איקס

טבלה 1: רשימת החלבונים שזוהו בתמיסת רקמת המסתם המיטרלית כאשר הוחלו ארבע גישות פרוטאומיות שונות: אלקטרופורזה דו מימדי (2)-DE), דו מימדי LC-MS E (2D-LC / MS E ), LC / MS E , ו- IEF בשלב נוזלי. השיטה שבה כל חלבון זוהה הוא דיווח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צעד קריטי אחד של פרוטוקול זה הוא השימוש של חנקן נוזלי להקפיא את המדגם כדי לצנן את מערכת המטחנה. השימוש בחנקן נוזלי מונע השפלה ביולוגית ומאפשר אבקה יעילה, אבל זה דורש הכשרה ספציפית לטיפול בטוח.

בפרוטוקול זה תכונות מערכת המטחנה עבור מדגם שחיקה כי דגימות קטנות קשה להתאושש מרגמה רגילה ועלי. במקרה זה, דגימות קטנות להתפשט כמו אבקה דקה על פני השטח מרגמה, טיוח אוסף קשה. יתרון נוסף הוא כי המטחנה ממונע, אשר מאפשר מספר גדול יותר של דגימות להיות מעובד בצורה לשחזור וללא עייפות הוסיף. מגבלה אחת על השימוש במטחנה היא כי גודל המדגם אשר חייב להיות קטן (100 מ"ג או פחות) עבור העלי להיות לחוץ ביעילות נגד המרגמה. יתר על כן, מרכיבים מטחנת חייב להיות מחוממת לטמפרטורת החדר בין משתמש cleanin ז. כתוצאה מכך, ההליך הוא זמן רב, אם דגימות רבות מעובדים מדי יום, ערכות רבות נדרשים.

צעד קריטי נוסף הוא הכנת המאגר החילוץ. ריכוזי המלח, במיוחד עבור אוריאה (8 M) ו thiourea (2 M), הם גבוהים למדי; לכן, נפח המלח הוא כמעט מחצית הנפח הכולל של הפתרון. יתר על כן, פירוק לא קל בהתחשב בכך החום יש להימנע, כי ב 37 מעלות צלזיוס יותר, אוריאה יכול להוביל carbamylation חלבון ב N termini של חלבונים / פפטידים ועל קבוצות שרשרת אמינו בצד של שאריות ליזין arginine 17 . לאחר מומס, חיץ אוריאה חייב להיות מסוננים עם מסננים 0.22 מיקרומטר והוא יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות מבלי להשפיע על יעילות החילוץ שלה, אבל זה חייב להתחמם ליותר מ 15 מעלות צלזיוס לפני השימוש כדי לאפשר פירוק מוחלט .

שינויים ופתרון בעיות

Ent "> בפרוטוקול זה, מיצוי חלבון מבוצע באמצעות חיץ אוריאה המתואר כי זה אחד הפתרונות הנפוצים ביותר חלבון מיצוי עבור מחקרים proteomic בשל תאימותו עם isoelectrofocusing ויעילותה solubilizing חלבונים מסיסים במשורה 18. זה כבר הראה כי חיץ זה יכול ביעילות רבה solubilize חלבונים מסיסים במשורה, כגון חלבונים ממברנה אינטגרלי 19 , או חלבונים כי הם נוטים מאוד צבירה, כגון tubulin 18. יתר על כן, מאגר זה תואם באופן מלא עם assay Bradford לקבוע ריכוז החלבון, זה יכול לשמש ישירות 2-DE ו נוזל שלב IEF מנתח.

עם זאת, חיץ זה אינו אידיאלי עבור solubilization של כל החלבונים הנוכחי במדגם. זה אפשרי כי מאגרים החילוץ שונים יכולים לחשוף חלבונים שאינם ניתנים לזיהוי על ידי פרוטוקול זה. לדוגמה, זה גם knoWn כי חלבונים ribosomal ו גרעיני יכול להיות טוב יותר שחולצו עם מיצוי חומצה או חומצה trichloroacetic / אצטון 20 , בעוד רמות ה- pH אלקליין מתאימים יותר חלבונים ממברנה 21 , 22 . לכן, השימוש במאגרים חלופיים עשוי לדרוש צעדים נוספים עבור משקעים חלבונים לחסל מלחים אשר מפריעים 2-DE או בשלב נוזלי IEF.

מגבלות הטכניקה

מספר החלבונים שזוהו על ידי פרוטוקול זה נמוך יחסית, אך ניתן לזהות את מספר הזיהויות ואת הכיסוי של הניתוח הפרוטאומי באמצעות שימוש במכשירים מודרניים יותר, אשר דיוק המסה שלהם ורצף הגדילה שלהם גדלו בצורה דרמטית בשנים האחרונות 23. ניתן לכסות חלק גדול של proteome, ללא כל צעדים prefractionation, על ידי העסקת שיפוע ארוך עבור ch נוזליהפרדות הרומנטוגרפיה יחד עם מכשיר ברזולוציה גבוהה MS שיש לו מהירות רצף מהיר 24 .

משמעות הטכניקה ביחס לשיטות קיימות / חלופיות

היכולת לזהות ולכמת חלבונים בשסתומי הלב של האדם, כגון השסתום המיטרלי, היא משימה חשובה ומאתגרת שתסייע בבירור מנגנונים של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים במחלות שסתום. הגדרת השינויים של proteome שסתום מיטרלי יגדיל מאוד את ההבנה של הטבע של תהליכים ביולוגיים הקשורים עם מצב המחלה של הרקמה.

הידע הנוכחי על physiopathology של שסתום מיטרלי מוגבל ו מתקבל בדרך כלל באמצעות ניתוח של חלבונים בודדים המעורבים בתהליכים ספציפיים, כגון remodeling מטריקס תאיים, המוסטאזיס, דלקת, או מתח חמצוני 25 9 , 10 .

ניתן לייחס את היעדרם של מחקרים פרוטאומיים מקיפים למורכבותה של רקמה נמוכה זו, שהיא עשירה בחלבונים מטריקס תאיים ( כלומר, פרוטוגליקנים, קולגן ואלסטין). חלבונים אלה מהווים כ 80% מהכמות הכוללת, מה שמקשה על ניתוח של חלבונים בשפע נמוך 26 .

לכן, היה צורך להקים פרוטוקול מיצוי יעיל כדי למקסם את solubilization חלבון על מנת לתאר את proteome של רקמה זו. פרוטוקול זה מותר עבור מיצוי ~ 50 מיקרוגרם של חלבון מ 1 מ"ג של רקמות. זוהי תשואה נמוכה יחסית בהשוואה לרקמה "רכה"כמו כבד (~ 135 מיקרוגרם מ 1 מ"ג של הרקמה), אבל זה מספיק כדי לבצע ניתוח חלבון על דגימות בודדות. זה רלוונטי במיוחד כאשר מגדירים את השונות האינדיווידואלית של התופעה.

יתר על כן, שיטה זו יש את היתרון של להיות תואם עם יישומים אנליטיים רבים. חלבונים שסתום מיטרלי מומס במאגר החילוץ המוצע ניתן להשתמש ישירות עבור immunoblotting ו proteomic הניתוח מבוסס על אלקטרופורזה דו מימדי נוזל שלב isoelectrophoresis 11 , 12 או, לאחר משקעים חלבון לחסל הפרעה רכיב חיץ, עבור מבחני אחרים, כגון ספקטרומטריית מסה ללא ג'ל 15 .

עם היישום של פרוטוקול החילוץ הזה, אפיון ממצה יותר של מרכיבי החלבון של רקמות שסתום מיטרלי רגיל הושג באמצעות זיהוי של intracel רביםחלבונים חלביים. חלבונים אלה ממוקמים בציטוזול או באברונים, לא רק במטריצה ​​החוץ-תאית, ויש להם תפקודים מולקולריים וביולוגיים שונים. חלבונים מעניינים אחרים ( כלומר, Cryab , septin-11, FHL-1 ו- dermatopontin) זוהו גם הם. חלבונים אלה יש פונקציות ידועים שסתום מיטרלי, אבל התכונות הביולוגיות שלהם מציע תפקיד אפשרי במחלות שסתום.

יישומים עתידיים או כיוונים לאחר מאסטרינג טכניקה זו

עם פרוטוקול זה, ניתן לקשר נתונים לגבי ביטוי חלבון עם נתונים על ביטוי mRNA כמותי ולא כמותי immunohistochemical מנתח. ואכן, כאשר משתמשים יחד, גישות אלה יוביל להבנה מקיפה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס המחלה, מ mRNA כדי שינוי שלאחר החלבון translational. לכן, שיטה זו יכולה להיות עניין לחוקרים המתמקדים physiopathology שסתום הלב. סְנַפִּירברית, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על שסתום מיטרלי חזירי, אשר נושא דמיון קרוב לשסתום האדם 27 והוא משמש מודל ניסיוני להערכת תפקוד שסתום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

משרד הבריאות האיטלקי תמך במחקר זה (RC 2013-BIO 15). אנו מודים לברברה מישלי על עזרתה הטכנית המצוינת.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422, (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4, (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62, (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104, (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15, (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38, (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9, (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193, (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85, (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37, (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18, (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21, (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2, (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93, (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10, (8), M110.003699 (2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151, (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118, (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53, (5), 432-438 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics