Optimerat protokoll för extraktion av proteiner från humanmitralventilen

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Proteinkompositionen av den mänskliga mitralventilen är fortfarande delvis okänd, eftersom dess analys är komplicerad av låg celluläritet och därför genom låg proteinbiosyntes. Detta arbete ger ett protokoll för att effektivt extrahera protein för analys av mitralventilproteomen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Analys av det cellulära proteomet kan bidra till att belysa de molekylära mekanismer som ligger till grund för sjukdomar på grund av utvecklingen av teknik som möjliggör storskalig identifiering och kvantifiering av proteinerna som finns i komplexa biologiska system. Den kunskap som erhålls från ett proteomiskt tillvägagångssätt kan potentiellt leda till en Bättre förståelse för de patogena mekanismer som ligger till grund för sjukdomar, vilket möjliggör identifiering av nya diagnostiska och prognostiska sjukdomsmarkörer och förhoppningsvis av terapeutiska mål. Emellertid representerar hjärt mitralventilen ett mycket utmanande prov för proteomanalys på grund av den låga celluliteten i proteoglykan och kollagenberikad extracellulär matris. Detta gör det svårt att extrahera proteiner för en global proteomanalys. Detta arbete beskriver ett protokoll som är kompatibelt med efterföljande proteinanalys, såsom kvantitativ proteomik och immunoblottning. Detta kan möjliggöra korrelation av data omG-proteinuttryck med data om kvantitativt mRNA-uttryck och icke kvantitativ immunhistokemisk analys. Faktum är att dessa tillvägagångssätt, när de utförs tillsammans, kommer att leda till en mer övergripande förståelse av de molekylära mekanismerna som ligger bakom sjukdomar, från mRNA till posttranslationell proteinmodifiering. Således kan denna metod vara relevant för forskare som är intresserade av studien av hjärtfluid-fysiopatologi.

Introduction

Nya bevis har förändrat förståelsen av rollerna hos de många regleringsmekanismer som uppstår efter mRNA-syntes. I själva verket kan translations-, post-transkriptionella och proteolytiska processer reglera proteinöverflöd och -funktion. Dogmen - som säger att mRNA-koncentrationer är proxier mot de motsvarande proteinerna, förutsatt att transkriptnivåerna är huvudbestämmaren för proteinöverskridande - har delvis reviderats. Inledningsvis förutspår transkriptnivåer endast partiellt proteinöverflöd, vilket tyder på att post-transkriptionella händelser Förekommer för att reglera proteinerna i cellerna 1 , 2 .

Vidare dikterar proteiner i slutändan cellens funktion och dikterar därmed sin fenotyp, som kan genomgå dynamiska förändringar som svar på autokrina, parakrina och endokrina faktorer. Blodburna mediatorer; temperatur; Drogbehandling; Och sjukdomsutvecklingmenade. Således är en expressionsanalys inriktad på proteinnivån användbar för att karakterisera proteomen och att riva upp de kritiska förändringar som uppträder för den som en del av sjukdomspatogenes 3 .

Därför är de möjligheter som proteomik presenterar för att klargöra hälso- och sjukdomstillstånd formidabel trots de nuvarande tekniska utmaningarna. De särskilt lovande forskningsområden som proteomics kan bidra med omfattar: identifiering av förändrat proteinuttryck på vilken nivå som helst ( dvs hela celler eller vävnader, subcellulära fack och biologiska vätskor); Identifiering, verifiering och validering av nya biomarkörer användbara för diagnos och prognos av sjukdom; Och förhoppningsvis identifiering av nya proteinmål som kan användas för terapeutiska ändamål, liksom för bedömning av läkemedelseffektivitet och toxicitet 4 .

Fånga komplexiteten hosProteomen representerar en teknisk utmaning. De nuvarande proteomiska verktygen erbjuder möjlighet att utföra storskalig analys med hög genomströmning för identifiering, kvantifiering och validering av förändrade proteinnivåer. Dessutom har införandet av fraktionerings- och anrikningstekniker, som syftar till att undvika störningen orsakad av de mest rikliga proteinerna, förbättrat proteinidentifiering genom att inkludera de minst rikliga proteinerna. Slutligen har proteomics kompletterats med analysen av posttranslationella modifieringar, vilka gradvis framträder som viktiga modulatorer av proteinfunktion.

Provberedningen och proteinåtervinningen i de biologiska proverna som analyseras är emellertid fortfarande de begränsande stegen i det proteomiska arbetsflödet och ökar potentialen för möjliga fallgropar 5 . I själva verket är de första stegen i vävnadshomogenizat i de flesta molekylärbiologitekniker som måste optimerasJon och celllys, speciellt under analysen av proteiner med låg överensstämmelse för vilka amplifieringsmetoder inte existerar. Dessutom kan den kemiska naturen hos proteiner påverka sin egen återhämtning. Analysen av högt hydrofoba proteiner är till exempel mycket utmanande, eftersom de lätt fäller ut under isoelektrisk fokusering, medan trans-membranproteiner är nästan olösliga (ses i Referens 5). Dessutom skapar variationen i vävnadskompositionen en betydande barriär för att utveckla en universell extraktionsmetod. Slutligen, eftersom nästan alla kliniska prover är av begränsad mängd, är det väsentligt att möjliggöra proteinberedning med maximal återhämtning och reproducerbarhet från minimala provmängder 6 .

I det här arbetet beskrivs ett optimerat protokoll för proteinutvinning från den normala mitralventilen för mänsklig hjärt, vilket representerar ett mycket utmanande prov för proteomanalys. Den normala mitralventilen är en kompLexstrukturen ligger mellan vänstra atriumet och hjärtans vänstra kammare ( Figur 1 ). Det spelar en viktig roll i kontrollen av blodflödet från atriumet till ventrikeln, förhindrar återflöde och säkerställer den korrekta nivån av syreförsörjning till hela kroppen och därigenom upprätthålla en tillräcklig hjärtutgång. Det anses emellertid ofta vara en "inaktiv" vävnad, med låg celluläritet och få komponenter, huvudsakligen i den extracellulära matrisen. Detta beror på att, vid normala förhållanden, de invändiga valvulära interstitiella cellerna (VICs) presenterar en vilande fenotyp med en biosyntesfrekvens med låg protein 7 .

Det har emellertid visat sig att i ett patologiskt tillstånd ökar antalet VIC i spongiosa och deras proteinsyntes aktiveras tillsammans med andra funktionella och fenotypiska förändringar 8 . Därför är det inte förvånande att de minimala data som finns tillgängliga iLitteraturen fokuserar på analysen av patologiska mitralventiler 9 , 10 , där det ökade antalet aktiverade VIC kan förklara det relativt höga antalet identifierade proteiner.

Sammanfattningsvis kan föreliggande protokoll tjäna till att utveckla förståelsen för de patogena mekanismerna som är ansvariga för mitralventilsjukdomar genom studiet av mitralventilproteinkomponenter. En större förståelse för de underliggande patologiska processerna skulle kunna bidra till att förbättra den kliniska hanteringen av ventilsjukdomar, vars nuvarande indikationer för intervention i stor utsträckning beror på hemodynamiska överväganden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I det här protokollet samlas de mänskliga hjärtan under multipelexplantering (kall ischemi-tid på 4-12 h, medelvärde 6 ± 2 h) från multirorgdonorer som undantas från organtransplantation av tekniska eller funktionella skäl, trots normala ekokardiografiska parametrar. De skickas till hjärt- och kärlsjukdomar i Milano, Monzino Cardiologic Center (Milano, Italien) för bankering av aorta och lungventiler. De mitrala bakre broschyren används inte för kliniska ändamål, så de samlas in under aorta- och lungventilisoleringen efter informerat samtycke erhålls från givarnas släktingar. Vävnaden för transplantation och forskning samlas endast efter föräldrars medgivande. På godkännandebladet godkänner de (eller inte) användningen av hjärtvävnaden endast för forskning om den inte är lämplig för human klinisk användning ( dvs. mikrobiologiska, funktionella och serologiska problem) enligt de etiska kommitténs riktlinjerMonzino Cardiologic Center.

1. Mitralventilberedning

  1. Skörda den mänskliga mitralventilen så snart som möjligt efter organt explantation (kall iskemi tid 4-12 h).
  2. I ett rent rum, ta bort hjärtat från transportväskan innehållande en kall (4 ° C) lösning ( dvs. saltlösning eller balanserat medium Eurocollins eller Wisconsin). Lägg det i en hink och placera den i ett biosäkerhetsskåp (biohazard vertikalt luftflöde, klass A, Good Manufacturing Practices (GMP) klassificering) för att fortsätta med ventilförberedelsen.
  3. Placera hjärtat på ett sterilt engångsdraperi i skåpet. Använd en steril engångs skalpell, skär hjärtat helt vinkelrätt mot huvudaxeln, på nivån på vänster och höger ventrikel, ca 4 cm från toppunkten.
  4. Flytta den stigande aortan och lungartären för att visa det vänstra atriella taket.
  5. Med sterila autoklaverbara pincett och picks, klippa runt vänster öron påVänster atrielltak, vilket gör mitralventilen synlig och möjliggör identifiering av den stora mitralbroschyren (främre) och den lilla mitralbroschyren (bakre delen).
    OBS: Antero-lateral och de bakre mediala kommissionerna definierar gränsen på den främre broschyren och den bakre delen.
  6. Använd steril autoklaverbar sax och icke-traumatiska tångar, dissekera det vänstra atriumet och ventrikelväggens tjocklek runt omkretsen av hela mitralventilen .
  7. Identifiera mitro-aorta ventil kontinuitet.
    OBS: Vänster ventrikel innehåller hela mitralventilen och ackorden.
  8. Separera den främre mitralventilens bipacksedel från den bakre mitralventilens bipacksedel, skär den bakre bipacksedeln längs insatsen med ventrikeln (commissure).
  9. Tvätta den bakre bipacksedeln i saltlösningen. Klipp broschyren i små bitar (<1 cm 2 ) och vrid dem individuellt i aluminiumfolie. Snapfrysa dem med flytande kväve.
    Varning: Följ de organisatoriska säkerhetsförfarandena vid användning av flytande kväve.
    1. Sanitera skåpets bord med en 70% isopropylalkohollösning och en 6% väteperoxidlösning vid slutet av proceduren.

2. Protein extraktion

  1. Använd tång för att hämta provet som är lagrat i flytande kväve och placera det omedelbart på torris medan det fortfarande är insvept i aluminiumfolien. Låt inte provet tina under några överföringar.
  2. Innan slipningen kyler du porslin / zirkoniummortel och pistlar i ett kvarnsystem ( t.ex. CryoGrinder) , tillsammans med provet, genom att placera dem i en Dewar-kolv innehållande flytande kväve (~ 500 ml).
    Varning: Följ de organisatoriska säkerhetsförfarandena vid användning av flytande kväve.
  3. Sätt mortel och pistlar i en polystyrenlåda innehållande torris. Avlägsna provet från aluminiumfolien och sätt in det i morteln.
  4. Grind tHan provar med den stora stammen mot morteren 15-20 gånger, med skruvmejseln för att rotera pisteln. Blanda provet med spetsen av en förkyld spatel under slipningsprocessen.
    1. Upprepa med den lilla pisteln.
  5. Överför markprovet till ett tidigare vägt rör ( t.ex. 15 ml centrifugrör) genom att vrida röret, placera det över morteln och vrid dem ihop för att flytta provet till röret. Använd en förkyld spatel för att återvinna allt material från morteln.
    1. Håll röret med provet på torris för att undvika provtining under överföringen.
  6. Beräkna provets nettovikt.
  7. Rengör mortel och pestlar efter varje prov och dekontaminera dem genom autoklavering eller upphettning av dem vid 200 ° C i 2 timmar.
  8. Överför det pulveriserade provet från centrifugröret till glasröret i en homogenisator genom inversion.
  9. Tillsätt filtrerad ureabufféR (8 M urea, 2 M tiokarbamid, 4% vikt / volym CHAPS, 20 mM Tris och 55 mM ditiotreitol) till glasröret, 200 | il ureumbuffer för varje 10 mg pulveriserad vävnad.
    OBS: Återstående pulverprov kvar i centrifugröret kan återvinnas med användning av en del av den beräknade volymen ureabuffert.
  10. Homogenisera provet med en omrörare utrustad med en borosilikatglasmörtel och en polytetrafluoreten (PTFE) -pestel. Tryck långsamt på pesteln på provet med en vridningsrörelse (1500 rpm) 10 gånger.
  11. Återställ supernatanten och överför den till ett rent 1,7 ml centrifugrör. Igen extrahera det återstående provet med färsk ureabuffert och tillsätt hälften av volymen som användes under den första extraktionen.
  12. Upprepa steg 2.10.
  13. Återställa supernatanten och kombinera den med supernatanten från steg 2.11. Placera den kombinerade supernatanten på en rörrotator i 30 minuter.
  14. Centrifugera röret i 30 minuter vid 13 000 xg och 4 ° C.
  15. Återställ supernatanten anD mäta proteinkoncentrationen med hjälp av Bradford-proteinanalysen, enligt tillverkarens instruktioner. Förvara provet vid -80 ° C tills användning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utvinningen och upplösningen av proteiner i ureabufferten är direkt kompatibel med proteomiska metoder baserade på isoelektrofokusering (tvådimensionell elektrofores (2-DE) 11 och isofektrisk fokusering av flytande fas (IEF) 12 ) och med immunoblottning efter utspädning i Laemmli buffert 13 Innehållande en proteasinhibitor cocktail 14 .

För gelfria masspektrometri-baserade metoder ( dvs. vätskekromatografi kopplad till dataoberoende masspektrometrianalys (LC / MS E ) och tvådimensionell LC / MS E (2D-LC / MSE)) 15 extraherades proverna I den beskrivna karbamidbufferten måste ytterligare behandlas för att eliminera urean och tiourea, som skulle kunna störa den efterföljande proteindeltningen och vätskekromatografiseparationen. ThiS avsaltningssteg kan åstadkommas med användning av de kommersiella proteinutfällningssatserna, enligt tillverkarens instruktioner för att fälla ut proteinerna. Provet kan sedan lösas i 25 mM NH4HCO3 innehållande 0,1% klyvbara detergenter för proteinmjälkning 16 . Utfällningen av proteinerna kan eliminera buffertkomponenter, vilket minimerar proteininnehållet (proteinåtervinning:> 85%), vilket gör provet lämpligt för varje typ av analys.

Tillämpningen av detta protokoll för proteinutvinning från humana mitralventiler tillåtes för identifiering av totalt 422 proteiner, vilket kombinerar fyra olika proteomikmetoder som tidigare beskrivits i detalj 11 , 15 . Specifikt identifierades 169 proteiner med 2-DE, 330 proteiner genom flytande fas IEF, 96 proteiner av LC / MS E och 148 proteinerMed 2D-LC / MS E (tabell 1).

För att klassificera de 422 identifierade proteinerna i termer av subcellulär lokalisering användes en programvara för gen-ontologi (GO) -analysen ( t.ex. Cytoscape). Nätverket skapat med mjukvaran och dess motsvarande plugin visade att förutom de förväntade proteinerna lokaliserade i den extracellulära regionen (se den övre högra delen av figur 2 ) var de flesta proteinerna som identifierades genom proteomiska tillvägagångssätten från den intracellulära regionen ( Dvs cytoplasma, organeller, vesiklar och cytoskelet). Cell-ytproteiner identifierades också ( Figur 2 ).

Resultaten bekräftades ytterligare i tre oberoende mitralventilprover. Immunoblotting användes för att analysera en grupp av fyra proteiner ( dvs septin-11, fyra och en halv LIM-domäner protein 1 (FHL-1), derMatopontin och alfa-kristallin B (CryAB)) som aldrig har identifierats i den normala mitralventilen ( Figur 3 ).

Figur 1
Figur 1: Mitralventilstruktur. Uppifrån av det mänskliga hjärtat som visar den slutna ( A ) eller öppna ( B ) mänskliga mitralventilen. Framifrån av vänstra kammaren i ett mänskligt hjärta ( C ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: Analys av de identifierade mitralventilproteinerna i termer av cellfördelning. Cytoscape och plugin BiNGO användes för att obtaiN fördelningen av gen ontologi (GO) termer från cellkomponentkategorierna. Cirkelstorleken är proportionell mot antalet proteinkomponenter associerade med de valda GO-termerna och färgskalan för p-värdet av överrepresentation rapporteras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Immunoblottningsanalys av septin-11, FHL-1, dermatopontin och CryAB i hel extrakt från tre humana normala mitralventilblad. Immunoblotting utfördes med användning av musmonoklonal antikropp mot CryAB och kaninpolyklonala antikroppar mot septin-11, FHL-1 och dermatopontinantikroppar. Snälla duKlicka här för att se en större version av denna figur.

<td> x <td> <Td> Proteasome subunit beta-typ 4 prekursor <td> </ Tr> <Td> Transgelin 2 <td> <tr> <td>
Anslutning Beskrivning 2-DE 2D-LC LC-MS E Flytande fas IEF
A6NMZ7 Collagen alfa VI x
O00151 PDZ- och LIM-domänprotein 1 x
O00299 Klorid intracellulärt kanalprotein 1 x
O00764 Pyridoxalkinas x
O14558 Värmchokprotein beta 6 x
O43399 Tumorprotein D54 x
O43488 Aflatoxin B1-aldehydreduktaselement 2 x
O43707 Alfa aktinin 4 x x
O43866 CD5 antigen som föregångare x
O60493 Sortering av nexin 3 x
O60701 UDP glukos 6 dehydrogenas x
O75223 Okarakteriserat protein x
O75368 SH3-domänbindande glutaminsyra som är rik på protein x
O75390 Citratsyntas mitokondriell föregångare x
O75489 NADH dehydrogenas ubiquinon järn svavelprotein 3 mitokondriell föregångare x x
O75608 Acylproteintioesteras 1 x
O75828 Karbonylreduktas NADPH 3 x
O75874 Isocitrat dehydrogenas-NADP-cytoplasmatisk x
O75955 Flotillin x
O94760 NG NG dimetylarginindimetylaminohydrolas 1 x
O94788 Retinal dehydrogenas 2 x
O95865 NG NG dimetylarginindimetylaminohydrolas 2 x x
P00325 Alkohol dehydrogenas 1B x x
P00338 L-laktatdehydrogenas A-kedjan x
P00352 Retinal dehydrogenas 1 x
P00441 Superoxiddismutas Cu Zn x x
P00450 Ceruloplasminprekursor x x
P00488 Koagulationsfaktor XIII En kedjeprekursor x
P00491 Purin nukleosid fosforylas x
P00492 Hypoxantin-guaninfosforibosyltransferas x
P00558 Fosfoglyceratkinas 1 x x
P00568 Adenylatkinasisoenzym 1 x
P00734 protrombin x x
P00738 haptoglobin x x x x
P00739 Haptoglobinrelaterad proteinprekursor x
P00751 Komplementfaktor B x x x
P00915 Karbonanhydras 1 x
P00918 Karbonanhydras 2 x
P01008 Antitrombin III prekursor x x x
P01009 Alfa 1 antitrypsin x x x x
P01011 Alfa 1 antichymotrypsin x x x x
P01019 Angiotensinogenprekursor x x
P01023 Alfa 2-makroglobulin x x
P01024 Komplement C3 x x x x
P01033 Metalloproteinashämmare 1 prekursor x
P01042 Kininogen 1 prekursor x
P01593 Ig kappakedja VI region AG x
P01598 Ig kappakedja VI region EU x
P01600 Ig kappa kedja VI region Hau x x
P01611 Ig kappa-kedjan VI-regionen Wes x
P01620 Ig kappa-kedjan V III-regionen SIE x
P01625 Ig kappakedja V IV region Len x
P01766 Ig tung kedja V III region BRO x x
P01781 Ig tungkedjig V III region GAL x
P01834 Ig kappakedjiga C-regionen x x x x
P01842 Ig lambda kedje C regioner x x x
P01857 Ig gamma 1-kedjegrupp C x x x x
P01859 Ig-gamma 2-kedje C-regionen x x x x
P01860 Ig gamma 3-kedja C-regionen x x x
P01861 Ig-gamma 4-kedja C-regionen x x x
P01871 Ig-mu-kedjans C-region x x x
P01876 Ig alfa 1 kedjegrupp C x x x x
P01877 Ig-alfa 2-kedjiga C-regionen x
P02144 myoglobin x x
P02452 Kollagen alfa 1 I-kedja x x x x
P02511 Alfa-kristallin B-kedja x
P02545 Lamin AC 70 kDa laminat x x x x
P02647 Apolipoprotein Al x x x x
P02649 Apolipoprotein E x x x x
P02671 Fibrinogen alfa-kedja x x x x
P02675 Fibrinogen beta-kedja x x x x
P02679 Fibrinogen gamma kedja x x x x
P02689 Myelin P2-protein x
P02735 Serumamyloid En proteinprekursor x
P02741 C-reaktivproteinprekursor x
P02743 Serumamyloid P-komponent x x x x
P02746 Komplement C1q underkomponent subenhet B x x
P02747 Komplement C1q subkomponent subenhet C prekursor x
P02748 Komplementkomponent C9 x x x
P02749 Beta 2 glykoprotein 1 x x x x
P02750 Leucinrik alfa 2 glykoproteinprekursor x
P02751 fibronektin x x
P02760 AMBP-proteinprekursor x x x x
P02763 Alfa 1-syra glykoprotein 1 x x x
P02765 Alpha 2 HS glykoproteinprekursor x
P02766 Transthyretinprekursor x x x
P02768 Serumalbumin x x x x
P02774 Vitamin D-bindande proteinprekursor x
P02787 Serotransferrin x x x x
P02788 Laktotransferrinprekursor x
P02790 hemopexin x x x x
P02792 Ferritin lätt kedja x
P04004 vitronektin x x x x
P04075 Fruktosobisfosfat aldolas A x
P04083 Bilaga A1 x x x x
P04179 Superoxiddismutas Mn mitokondriell föregångare x
P04196 Histidinrik glykoproteinprekursor x
P04217 Alfa 1B glykoproteinprekursor x x
P04350 Tubulin beta 4-kedja x
P04406 Glyceraldehyd 3 fosfat dehydrogenas x x x x
P04792 Värmchokprotein beta 1 x x x x
P05091 Aldehyddehydrogenas mitokondriell föregångare x x
Plasmaproteas Cl-inhibitorprekursor x
P05156 Komplementfaktor I prekursor x
P05413 Fettsyrabindande proteinhjärta x
P05452 Tetranektinprekursor TN x x
P05787 Keratin typ II cytoskeletalt 8 x
P06396 gelsolin x x x x
P06576 ATP-syntas-subenhet beta-mitokondriell föregångare x x
P06732 Kreatin-kinas M-typ x x
P06733 Alfa enolas x x x x
P06753 Tropomyosin alfa 3-kedjan x x
P07108 Acyl CoA-bindande protein x
P07195 L-laktatdehydrogenas B-kedjan x x x
P07196 Neurofilamentljuspolypeptid x
P07197 Neurofilamentmediumpolypeptid x x
P07237 Proteindisulfidisomerasprekursor x x
P07339 Cathepsin D föregångare x x
P07355 Bilaga A2 x x x x
P07360 Komplementkomponent C8 gammakedjeprekursor x
P07437 Tubulin beta-kedja x x x x
P07585 dekorin x x x x
P07737 Profilin 1 x
P07858 Cathepsin B prekursor x
P07900 Värmekokprotein HSP 90 alfa x x
P07951 Tropomyosin beta-kedja x
P07954 Fumarathydratas mitokondriell föregångare x
P07996 Trombospondin 1 x x x
P08107 Värmechock 70 kDa protein 1A IB x x x x
P08123 Kollagen alfa 2 I-kedja x x x x
P08133 Bilaga A6 x x
P08238 Värmekokprotein HSP 90 beta x x
P08253 72 kDa typ IV-kollagenasprekursor x
P08294 Extracellulärt superoxid dismutas Cu Zn precursor x x x
P08590 Myosin-ljuspolypeptid 3 x x
P08603 Komplementfaktor H x x x x
P08670 vimentin x x x x
P08729 Keratin typ II cytoskeletal 7 x
P08758 Annexin A5 x x x x
P09211 Glutation S transferas P x x x
P09382 Galektin 1 x x x
P09417 Dihydropteridinreduktas x
P09493 Tropomyosin 1 alfa-kedja x x
P09525 Bilaga A4 x x
P09651 Heterogent nukleärt ribonukleoprotein Al x
P09871 Komplement C1s delkomponentprekursor x
P09936 Ubiquitin karboxylterminal hydrolasisozym L1 x
P09972 Fructosebisfosfat aldolas C x
P0C0L4 Komplement C4 En prekursor x
P0CG05 IgLambda 2 kedje C regioner x
P0CG38 POTE ankyrin domän familjemedlem I x
P10515 Dihydrolipoyllysinrest-acetyltransferaskomponent av pyruvatdehydrogenaskomplex x
P10768 S-formylglutationhydrolas x
P10809 60 kDa värmekokprotein mitokondriell föregångare x
P10909 klusterin x x x x
P10915 Hyaluronan och proteoglykan länkprotein 1 prekursor x x
P11021 78 kDa gLukosreglerat protein x x x
P11047 Laminin subunit gamma 1 prekursor x
P11142 Värmeschock kognitivt 71 kDa protein x x x x
P11177 Pyruvat dehydrogenas E1-komponent subunit beta mitokondriell föregångare x
P11217 Glykogenfosforylasmuskelform x
P11310 Medelkedjespecifik acyl CoA dehydrogenas mitokondriell föregångare x
P11413 Glukos 6 fosfat 1 dehydrogenas x
P11766 Alkohol dehydrogenas klass 3 chi kedjan x
P12036 Neurofilament tung polypeptid x
P12109 Kollagen alfa 1 VI kedja x x x x
P12110 Kollagen alfa 2 VI kedja x x x x
P12111 Kollagen alfa 3 VI kedja x x x
P12277 Kreatin-Kinas B-typ x
P12429 Bilaga A3 x x
P12814 Alpha-aktinin 1 x x
P12829 Myosin-ljuspolypeptid 4 x
P12882 Myosin 1 x
P12883 Myosin 7 x x
P12955 Xaa Pro dipeptidas x
P13489 Ribonukleasinhibitor x
P13533 Myosin 6 x x
P13611 Versican kärnproteinprekursor x x
P13639 Förlängningsfaktor 2 x
P13716 Delta-aminolevulinsyradehydratas x
P13796 Plastin 2 x
P13804 Elektronöverföring-flavoprotein-subenhet alfa-mitokondriell föregångare x
P13929 Beta-enolas x x
P14136 Glialfibrillär sur proteinastrocyt x
P14314 Glukosidas 2-subenhet beta-prekursor x
P14550 Alkohol dehydrogenas NADP x
P14618 Pyruvatkinas-isozymer M1 M2 x x x
P14625 </ Td> Endoplasminprekursor x x
P15121 Aldosreduktas x
P15259 Fosfoglyceratmutas 2 x
P16152 Karbonylreduktas NADPH 1 x
P17066 Värmechock 70 kDa protein 6 x x x
P17174 Aspartataminotransferascytoplasmatisk x
P17540 Kreatinskinomerisk mitokondriell föregångare x
P17661 desmin x x x x
P17980 26S-proteasreglerande subenhet 6A x
P17987 T-komplex protein 1-subenhet alfa x
P18206 vinkulin x x
P18428 Lipopolysackaridbindande proteinprekursor x
P18669 Fosfoglyceratmutas 1 x
P19105 Myosin regelbunden lätt kedja 2 x x
P19623 Spermidin syntas x
P19652 Alfa 1-syra glykoprotein 2-prekursor x x
P19823 Inter alfa trypsininhibitor tung kedja H2 x
P19827 Inter alfa trypsininhibitor tung kedja H1 x x
P20073 Bilaga A7 x
P20618 Proteasome subunit beta-typ 1 prekursor x
P20774 Mimecan x x x x
P21266 Glutathione S transferas Mu 3 x
P21333 Filamin A x x
P21796 Spänningsberoende anjonselektivt kanalprotein1 x
P21810 biglykan x x x x
P21980 Proteinglutamin-gamma-glutamyltransferas 2 x x
P22105 Tenascin X x x
P22314 Ubiquitin-aktiverande enzym E1 x
P22352 Glutationperoxidas 3 prekursor x x
P22626 Heterogena nukleära ribonukleoproteiner A2 B1 x
P22695 Ubiquinol cytokrom c reduktas komplex kärnprotein 2 mitokondriell föregångare x
P23141 Leverkarboxylesteras 1 prekursor x
P23142 Fibulin 1 x x x x
P23284 Peptidyl prolyl cis trans-isomeras B-prekursor x
P23381 Cytoplasmatisk tryptofanyl-tRNA-syntetas x
P23526 Adenosylhomocysteinase x x
P23528 Cofilin 1 x
P24752 Acetyl CoA acetyltransferas mitokondriell föregångare x
P25311 Zink alfa 2 glykoproteiN föregångare x
P25705 ATP-syntas-subenhet alfa-mitokondrial x
P25788 Proteasom subunit alfa typ 3 x x
P25789 Proteasom subunit alfa typ 4 x
P26447 Protein S100 A4 x
P27348 14 3 3 proteinet theta x x
P27797 Calreticulin prekursor x
P28066 Proteasom subunit alfa typ 5 x
P28070 x x
P28072 Proteasome subunit beta typ 6 prekursor x
P28074 Proteasome subunit beta typ 5 prekursor x
P28331 NADH ubiquinonoxidoreduktas 75 kDa subunit mitokondriell föregångare x
P28838 Cytosolaminopeptidas x
P29218 Inositolmonofosfatas x
P29401 transketolase x
P29692 Förlängningsfaktor 1 delta x
P29966 Myristoylerat alaninrikt C-kinasubstrat x
P30040 Endoplasmatisk retikulumprotein ERp29-prekursor x
P30041 Peroxiredoxin 6 x x
P30043 Flavinreduktas x
P30044 Peroxiredoxin 5 mitokondriell föregångare x
P30085 UMP CMP-kinas x
P30086 Fosfatidyletanolaminbindande protein 1 x
P30101 ProteiN-disulfid-isomeras A3-prekursor x x x
P30613 Pyruvatkinas-isozymer RL x
P30740 Leukocyt elastasinhibitor x
P31025 Lipokalin 1 prekursor x
P31937 3-hydroxisobutyrat dehydrogenas mitokondriell föregångare x
P31942 Heterogent nukleärt ribonukleoprotein H3 x
P31943 Heterogent nukleärt ribonukleoprotein H x
P31946 14 3 3 protein beta alfa x x
P31948 Stressinducerat fosfoprotein 1 x
P31949 Protein S100 A11 x
P32119 Peroxiredoxin 2 x x
P34931 Värmechock 70 kDa protein 1 som x x
P34932 Värmechock 70 kDa protein 4 x
P35232 prohibitin x
P35237 Serpin B6 x
P35443 Trombospondin 4 x
P35555 Fibrillin 1 x x
P35579 Myosin 9 x x x
P35580 Myosin 10 x x
P35609 Alpha-aktinin 2 x
P35625 Metalloproteinashämmare 3 x x
P35998 26S-proteasreglerande subenhet 7 x
P36871 Fosfoglukomutas 1 x x
P36955 Pigmentepitel-härledd faktor x x
P37802 x x
P37837 transaldolas x
P38117 Electron transfer flavoprotein subunit beta x
P38646 Stress 70 protein mitokondriell föregångare x x
P39687 Syra-leucinrik nukleär fosfoprotein 32-familjemedlem A x
P40121 Makrofaghuggande protein x
P40925 Malat dehydrogenas cytoplasmatisk x
P40926 Malat dehydrogenas mitokondriell föregångare x
P41219 peripherin x
P42330 Aldo-keto-reduktasfamilj 1-medlem C3 x
P45880 Spänningsberoende anjonselektivt kanalprotein 2 x
P47755 F aktin capping protein subunit alfa 2 x x
P47756 F aktin capping protein subunit beta x x
P47985 Ubiquinol cytokrom c reduktas järn svavel subunit mitokondriell föregångare x
P48047 ATP-syntas O-subenhets mitokondriell föregångare x
P48637 Glutation syntetas x
P48741 Värmechock 70 kDa protein 7 x x
P49189 4 trimetylaminobutyraldehyddehydrogenas x
P49368 T-komplex protein 1-subenhet gamma x
P49747 Bruskoligomermatrisprotein x x x x
P49748 Mycket långkedjig specifik acyl CoA dehydrogenas mitokondriell föregångare x
P50395 Rab GDP dissociation inhibitor beta x x </ Td>
P50454 Serpin Hl prekursor x
P50995 Annexin A11 x
P51452 Dual specificity protein phosphatase 3 x
P51884 lumikan x x x x
P51888 Prolargin föregångare x x x x
P52565 Rho GDP-dissociationsinhibitor 1 x
P52566 Rho BNP-dissociationsinhibitor 2 x
P54652 Värmchockrelaterat 70 kDa protein 2 x x x x
P55072 Transitional endoplasmatisk retikulum ATPas x
P55083 Mikrofibril associerad glykoprotein 4 prekursor x x
P57053 Histon H2B typ F x
P60174 Triosfosfatisomeras x x x
P60660 Myosin-ljuspolypeptid 6 x x
P60709 Actin cytoplasmisk 1 x x x x
P60981 Destrin x
P61086 Ubiquitin-konjugerande enzym E2 25 kDa x
P61088 Ubiquitin-konjugerande enzym E2 x
P61224 Rasrelaterad protein Rap 1b-prekursor x
P61978 Heterogent nukleärt ribonukleoprotein K x x
P61981 14 3 3 protein gamma x x x
P62258 14 3 3 protein-epsilon 14 3 3E x
P62491 Rasrelaterat protein x
P62714 Serin treoninprotein fosfatas 2A katalytisk subenhet beta isoform x
P62736 Actin aortisk slätmuskel x x x
P62805 Histon H4 x
P62826 GTP-bindande kärnprotein Ran x
P62873 Guanin-nukleotidbindande protein GIGSGT-subenhet beta 1 x
P62879 Guaninukleotidbindande protein GIGSGT-subenhet beta 2 x
P62937 Peptidylprolyl cis-transisomeras A x x
P62987 Ubiquitin 60S ribosomalt protein L40 x
P63104 14 3 3 proTein zeta delta x x x x
P63241 Eukaryotisk translationsinitieringsfaktor 5A 1 x
P63244 Guanin-nukleotidbindande proteinunderenhet beta 2 som 1 x
P63267 Actin gamma enterisk glattmuskel x x
P67936 Tropomyosin alfa 4-kedjan x
P68032 Actin alfa-hjärtmuskel 1 x
P68104 Förlängningsfaktor 1 alfa 1 x x x
P68133 Actin alfa skelettmuskel
P68363 Tubulin alfa 1B kedja x x x
P68371 Tubulin beta 2C-kedja x x x
P68402 Blodplättsaktiverande faktor acetylhydrolas IB subenhet beta x
P68871 Hemoglobin subunit beta x x x
P69905 Hemoglobin subunit alfa x x
P78371 T-komplex protein 1-subenhet beta x
P78417 Glutationtransferas omega 1 x x
P80748 Ig lambda-kedjan VIII-regionen LOI x
P98095 Fibulin 2 x x
Q01082 Spectrin beta kedja hjärna 1 x
Q01449 Myosin regulatorisk lätt kedja 2 atriell isoform x
Q01518 Adenylylcyklas associerat protein 1 x
Q01995 Transgelin Glatt muskelprotein 22 alfa x
Q03252 Lamin B2 x x
Q03591 Komplementfaktor H relaterat protein 1 prekursor x
Q04917 14 3 3 protein eta x x
Q06323 Proteasomaktivator komplex subenhet 1 x
Q06828 fibromodulin x x x x
Q06830 Peroxiredoxin 1 x x
Q07507 Dermatopontin x x x x
Q07960 Rho GTPas-aktiverande protein 1 x
Q08257 Quinonoxidoreduktas x
Q08431 Lactadherin x x
Q12765 SEcernin 1 x
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA-isomeras mitokondriell föregångare x x
Q13228 Selenbindande protein 1 x x
Q13404 Ubiquitin-konjugerande enzym E2-variant 1 x
Q13409 Cytoplasmisk dynein 1 mellankedja 2 x
Q13509 Tubulin beta 3 kedja x x x
Q13642 Fyra och en halv LIM-domäner protein 1 x
Q13765 Nascent polypeptidassocierad komplex subenhet alfa x
Q13885 N-tubulin beta 2A-kedjan x x
Q14194 Dihydropyrimidinasrelaterat protein 1 x
Q14195 Dihydropyrimidinasrelaterat protein 3 x x x x
Q14624 Inter alfa trypsininhibitor tungkedjig H4-prekursor x
Q14697 Neutral alfa glukosidas AB prekursor x
Q14764 Stort valvprotein x
Q14767 Latent transformerande tillväxtfaktor beta bindande protein 2 x x
Q14894 Mu-kristallint homolog-NADP-reglerat sköldkörtelhormonbindande protein x
Q15063 Periostinprekursor x x x x
Q15084 Proteindisulfidisomeras A6-prekursor x
Q15113 Prokollagen C endopeptidasförstärkare 1 prekursor x
Q15181 Oorganisk pyrofosfatas x
Q15365 Poly rC-bindande protein 1 x
Q15366 PolyrC-bindande protein 2 x
Q15582 Transformera tillväxtfaktor beta-inducerat protein x x x
Q15819 Ubiquitin-konjugerande enzym E2-variant 2 x
Q16352 Alpha internexin x
Q16473 Putative tenascin XA x
Q16555 Dihydropyrimidinasrelaterat protein 2 x x x
Q16698 2 4 dienoyl CoA reduktas mitokondriell föregångare x
Q16891 Mitokondriellt inre membran x
Q562R1 Beta-aktin som protein 2 x
Q6S8J3 POTE ankyrin domän familjemedlem E x
Q6UWY5 Olfactomedin som protein 1 prekursor x x
Q71U36 Tubulin alfa 1A-kedja x x x
Q7Z7G0 Mål av Nesh SH3-precursor x x x
Q8WUM4 Programmerad celldöd 6 interaktivt protein x
Q8WWX9 Thioredoxin som selenoprotein M prekursor x
Q92597 Protein NDRGl x
Q92945 Långt uppströms elementbindande protein 2 x
Q96CN7 Isokorismatasdomän som innehåller protein 1 x
Q96CX2 BTB POZ-domäninnehållande protein x
Q96KK5 Histon H2A typ 1 H x x
Q96KP4 Cytosolskt icke-specifikt dipeptidas x
Q99426 Tubulin-specifik chaperon B x
Q99497 Protein DJ 1 x x
Q99536 Synaptiskt vesikelmembranprotein x x x
Q99714 3-hydroxiacyl-CoA-dehydrogenas typ 2 x
Q99715 Kollagen alfa 1 XII kedja x x
Q99798 Akonita hydratas mitokondriell föregångare x
Q9BQE3 Tubulin alfa 6 kedja x
Q9BUF5 Tubulin beta 6 kedja x x
Q9BUT1 3 hydroxibutyrat dehydrogenas typ 2 x
Q9BVA1 Tubulin beta 2B-kedjan x x x
Q9BXN1 Asporin x x </ Td> x x
Q9H0W9 Esterhydrolas C11orf54 x
Q9H4B7 Tubulin beta 1 kedja x
Q9NRN5 Olfactomedin som protein 3 prekursor x x
Q9NRV9 Heme bindande protein 1 x
Q9NSB2 Keratin typ II cutikulär Hb4 x x
Q9NVA2 Septin 11 x
Q9UBR2 Cathepsin Z föregångare x
Q9UBX5 Fibulin 5 x x
Q9UK22 F-låda endast protein 2 x
Q9Y277 Spänningsberoende anjonselektivt kanalprotein 3 x
Q9Y281 Cofilin 2 x
Q9Y490 Talin 1 x
Q9Y696 Klorid intracellulärt kanalprotein 4 x
Q9Y6C2 EMILIN 1 x x

Tabell 1: Förteckning över proteinerna identifierade i mitralventilvävnadsextraktet när fyra olika proteomiska tillvägagångssätt applicerades: tvådimensionell elektrofores (2-DE), tvådimensionell LC-MS E (2D-LC / MSE), LC / MSE och vätskefas-IEF. Metoden genom vilken varje protein identifierades rapporteras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett kritiskt steg i detta protokoll är användningen av flytande kväve för att frysa provet och att kyla kvarnsystemet. Användningen av flytande kväve förhindrar biologisk nedbrytning och möjliggör effektiv pulverisering, men det kräver särskild träning för säker hantering.

I det här protokollet finns ett kvarnsystem för provslipning, eftersom små prov är svåra att återhämta sig från standardmortel och pistlar. I det här fallet sprids småprover som ett fint pulver över morterytan, vilket gör det svårt att göra insamling. En annan fördel är att kvarnen är motoriserad, vilket möjliggör ett större antal prov som ska bearbetas på ett reproducerbart sätt och utan extra utmattning. En begränsning av användningen av en kvarn är att provets storlek måste vara liten (100 mg eller mindre) för att pesteln ska pressas effektivt mot morteln. Vidare måste grindkomponenterna värmas upp till rumstemperatur mellan användningsområden för rengöring g. Följaktligen är förfarandet tidskrävande och, om många prover behandlas dagligen, behövs många uppsättningar.

Ett ytterligare kritiskt steg är beredningen av extraktionsbufferten. Saltkoncentrationerna, särskilt för urean (8 M) och tiourea (2 M), är ganska höga; Således är volymen av salt nästan halva den totala volymen av lösningen. Vidare är upplösningen inte lätt med tanke på att värme måste undvikas, eftersom urea vid mer än 37 ° C kan leda till karbamylering av proteiner vid N termini av proteiner / peptider och vid sidokedjaminogrupperna av lysin- och argininrester 17 . När det är löst, måste ureabufferten filtreras med 0,22 μm filter och kan förvaras vid -80 ° C i 4 veckor utan att påverka dess extraktionseffekt, men det måste värmas till mer än 15 ° C före användning för att möjliggöra fullständig upplösning .

Ändringar och felsökning

I detta protokoll utförs proteinutvinning med användning av den beskrivna ureabufferten eftersom den är en av de mest använda proteinutvinningslösningarna för proteomiska studier på grund av dess kompatibilitet med isoelektrofokusering och dess effektivitet vid solubilisering av svagt lösliga proteiner 18. Det har varit Visade att denna buffert mycket effektivt kan solubilisera svagt lösliga proteiner, såsom integrerade membranproteiner 19 eller proteiner som är mycket benägna att aggregera, såsom tubulin 18. Vidare är denna buffert fullständigt kompatibel med Bradford-analysen för att bestämma proteinkoncentrationen och Det kan användas direkt i 2-DE och flytande fas IEF analyser.

Denna buffert är emellertid inte idealisk för solubiliseringen av alla proteiner närvarande i ett prov. Det är möjligt att olika extraktionsbuffertar kunde avslöja proteiner som inte kan detekteras genom detta protokoll. Det är till exempel bra knoMed det att ribosomala och kärnproteiner kan extraheras bättre med syraxtraktion eller triklorättiksyra / acetonutfällning 20 , medan alkaliska pH-nivåer är mer lämpliga för membranproteiner 21 , 22 . Därför kan användningen av alternativa buffertar kräva ytterligare steg för proteinutfällning för att eliminera salter som stör 2-DE eller flytande fas-IEF.

Begränsningar av tekniken

Antalet proteiner som identifieras med detta protokoll är relativt låga, men antalet identifieringar och täckningen av proteomanalysen kan ökas ytterligare genom användning av modernare instrument, vars massakrecision och sekvenseringshastighet har ökat dramatiskt de senaste åren 23. Det är möjligt att täcka en stor del av proteomen utan några förfraktionssteg, genom att använda en lång gradient för flytande chRomatografiseparationer kopplade med ett MS-instrument med hög upplösning som har en snabb sekvenseringshastighet 24 .

Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder

Möjligheten att identifiera och kvantifiera proteiner i de mänskliga hjärtklaffarna, såsom mitralventilen, är en viktig och utmanande uppgift som kommer att bidra till att belysa mekanismerna för fysiologiska / patologiska processer vid ventilsjukdomar. Definiera förändringarna av mitralventilproteomet kommer avsevärt att öka förståelsen för naturen hos de biologiska processerna som är associerade med vävnads sjukdomstillstånd.

Den nuvarande kunskapen om mitralventilens fysiopatologi är begränsad och generellt erhållen genom analys av individuella proteiner som är involverade i specifika processer, såsom extracellulär matrisreformering, hemostas, inflammation eller oxidativ stress 25 9 , 10 .

Bristen på omfattande proteomiska studier kan hänföras till komplexiteten hos denna lågcellulära vävnad som är mycket rik på extracellulära matrisproteiner ( dvs proteoglykaner, kollagen och elastin). Dessa proteiner utgör omkring 80% av den totala mängden, vilket hindrar analysen av lågmängdsproteiner 26 .

Således var det nödvändigt att upprätta ett effektivt extraktionsprotokoll för att maximera proteinolubilisering för att beskriva proteomen hos denna vävnad. Detta protokoll tillät extraktionen av ~ 50 | ig protein från 1 mg vävnad. Detta är ett relativt lågt utbyte i jämförelse med "mjuk" vävnad, sådanSom lever (~ 135 μg från 1 mg vävnad), men det är tillräckligt att utföra en proteinanalys på enskilda prover. Detta är särskilt relevant när man definierar det individuella variabiliteten hos ett fenomen.

Vidare har denna metod fördelen av att vara kompatibel med många analytiska applikationer. Mitralventilproteinerna upplösta i den föreslagna extraktionsbufferten kan användas direkt för immunoblottning och proteomanalys baserad på tvådimensionell elektrofores och flytande fasisoelektrofores 11 , 12 eller efter proteinutfällning för att eliminera buffertkomponentinterferens för andra analyser, såsom Gelfri masspektrometri 15 .

Med tillämpningen av detta extraktionsprotokoll har en mer uttömmande karakterisering av proteinkomponenterna i normal mitralventilvävnad erhållits genom identifiering av många intracelLulära proteiner. Dessa proteiner är lokaliserade i cytosolen eller i organeller, inte bara i den extracellulära matrisen, och har olika molekylära och biologiska funktioner. Andra intressanta proteiner ( dvs CryAB, septin-11, FHL-1 och dermatopontin) identifierades också. Dessa proteiner har okända funktioner i mitralventilen, men deras biologiska egenskaper föreslår en möjlig roll i ventilsjukdomar.

Framtida applikationer eller anvisningar efter att ha behärskat denna teknik

Med detta protokoll är det möjligt att korrelera data avseende proteinuttryck med data om kvantitativa mRNA-uttryck och icke kvantitativa immunhistokemiska analyser. När de används tillsammans kommer dessa tillvägagångssätt att leda till en mer omfattande förståelse av de molekylära mekanismerna som ligger till grund för sjukdom, från mRNA till posttranslationell proteinändring. Således kan denna metod vara av intresse för forskare inriktade på hjärtfluid-fysiopatologi. FenaAllierat kan detta protokoll också appliceras på porcine mitralventilen, som har en nära likhet med den mänskliga ventilen 27 och används som en experimentell modell för utvärdering av ventilfunktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Det italienska hälsovårdsministeriet stödde denna studie (RC 2013-BIO 15). Vi tackar Barbara Micheli för hennes utmärkta tekniska hjälp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422, (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4, (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62, (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104, (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15, (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38, (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9, (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193, (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85, (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37, (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18, (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21, (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2, (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93, (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10, (8), M110.003699 (2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151, (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118, (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53, (5), 432-438 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics