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Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Biochemistry
 

Summary

Strukturen der supramolekularen Protein Baugruppen in atomarer Auflösung sind wegen ihre entscheidende Rolle in einer Vielzahl von biologischen Erscheinungen von hoher Relevanz. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um hochauflösende strukturelle Studien unlöslich und nichtkristalline makromolekularen Protein-Assemblys durch Magie-Winkel drehen Festkörper-Kernspinresonanz-Spektroskopie (MAS-NMR) durchführen.

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Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

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Abstract

Supramolekulare Protein Baugruppen Rolle grundlegende in biologischen Prozessen von Wirt-Pathogen-Interaktion, virale Infektion, die Ausbreitung von neurodegenerativen Erkrankungen. Solche Baugruppen bestehen in mehreren Protein-Untereinheiten organisiert in einer nicht-kovalente Weise makromolekularen Großobjekte zu bilden, die eine Vielzahl von zellulären Funktionen ausführen oder nachteilige Folgen nach sich ziehen können. Atomare Einblicke in die Versammlung Mechanismen und das Funktionieren des makromolekularen Assemblys bleiben oft knappen seit ihrer inhärenten Unlöslichkeit und nicht Kristallinität oft drastisch reduziert die Qualität der von den meisten Techniken gewonnenen Daten in der Strukturbiologie, wie Röntgen-Kristallographie und Lösung Kernspinresonanz (NMR) verwendet. Wir präsentieren hier Magic-Angle-Spinning Festkörper-NMR-Spektroskopie (NMR) als eine leistungsfähige Methode, um Strukturen der makromolekularen Versammlungen in atomarer Auflösung zu untersuchen. NMR kann atomare Details auf der montierten Anlage Größe und Löslichkeit uneingeschränkt offenbaren. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte aus der Produktion von 13C /15N Isotopen-Label makromolekularen Protein Baugruppen für den Erwerb von standard NMR-Spektren und deren Analyse und Interpretation. Als Beispiel zeigen wir die Pipeline eine NMR-Strukturanalyse einer faserigen Protein-Versammlung.

Introduction

Fortschritte in der Magie-Winkel drehen Festkörper-Kernspinresonanz-Spektroskopie (NMR) bieten ein effizientes Werkzeug für die strukturelle Charakterisierung von Proteinen makromolekularen Versammlungen in atomarer Auflösung. Diese Protein-Baugruppen sind ubiquitäre Systeme, die wesentliche Rollen in vielen biologischen Prozessen spielen. Ihre molekularen Strukturen, Interaktionen und Dynamik sind zugänglich durch NMR-Studien, wie für virale (Capsids1) und bakterielle Infektionsmechanismen (Sekretion Systeme2,3, Pili4), Membran Protein-komplexe5,6,7,8 und funktionale amyloiden 9,10,11. Diese molekularen Montageart kann auch Erkrankungen wie z. B. bei neurodegenerativen Erkrankungen provozieren, wo Proteine in fehlgefaltete, Amyloid Staaten montieren und dazu führen, dass aberrante Zelle Verhalten oder Zelle Tod 12,13. Protein-Baugruppen werden oft durch die symmetrische Oligomerisierung von vielfachen Kopien von Protein-Untereinheiten in großen supramolekularen Objekte in verschiedenen Formen, einschließlich Fibrillen, Filamente, Poren, Röhren oder Nanopartikel gebaut. Die quartäre Architektur ist definiert durch schwachen Wechselwirkungen zwischen Protein-Untereinheiten, die räumliche und zeitliche Versammlung zu organisieren und für anspruchsvolle biologischen Funktionen ermöglichen. Strukturelle Untersuchungen auf atomarer Skala auf diese Assemblys sind eine Herausforderung für hochauflösenden Techniken seit ihrer intrinsischen Unlöslichkeit und sehr oft ihre nicht-Kristallinität schränkt die Verwendung von konventionellen Röntgen-Kristallographie oder NMR-Lösung Ansätze. Magie-Winkel dreht (MAS) NMR ist eine neue Technik, atomarer Auflösung Daten über unlösliche makromolekularen Versammlungen und beweist seine Leistungsfähigkeit, atomare 3D-Modelle für eine wachsende Zahl von komplexen biomolekularen Systemen einschließlich zu lösen bakterielle Filamente, Amyloid Baugruppen und Viruspartikel 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Technischen Fortschritt auf hohen Magnetfeldern, methodischen Entwicklungen und Probenvorbereitung hat MAS-NMR in eine robuste Methode zu untersuchen, unlösliche Proteine in verschiedenen Umgebungen, insbesondere ihre biologisch relevante makromolekularen Staat oder in Zellmembranen, wodurch die Technik sehr komplementär zur Kryo-Elektronenmikroskopie montiert. In vielen Fällen kennzeichnet ein sehr hohes Maß an Symmetrie solche Protein-Baugruppen. MAS-NMR nutzt diese Funktion, wie alle Protein-Untereinheiten in einer Homomolecular Versammlung die gleiche lokale Struktur hätte und damit praktisch die gleiche NMR-Signatur, drastische Reduzierung der Komplexität der Analyse.

Ein effizientes Protokoll für strukturelle Studien von makromolekularen Protein Baugruppen durch moderate MAS (< 25 kHz) NMR wird in diesem Video präsentiert und können unterteilt werden in verschiedenen Stufen (Abbildung 1). Wir zeigen die kritischen Phasen des Workflows eine NMR strukturelle Studie am Beispiel einer faserigen Protein Baugruppe (siehe markierte Schritte in Abbildung 1), mit Ausnahme der Untereinheit Proteinreinigung, unterschiedlich für jedes protein Montage sind aber von entscheidender Bedeutung für strukturelle Studien und ohne auf die technischen/methodische Details der NMR-Spektroskopie und Struktur Berechnung für welche spezialisierten Tutorials online verfügbar. Während dieses Protokolls in erster Linie auf Festkörper-NMR-Experimente unter MAS Bedingungen durchgeführt wird, ausgerichtet die Verwendung von biologischen Umgebungen 23,24,25,26 , 27, wie z. B. ausgerichteten Bicelles ermöglichen die Untersuchung von Protein-Konformation und dynamische Proteinprotein Interaktion in Membran-ähnliche Medien ohne MAS-Technologie. Wir zeigen die Proteinexpression und Montageschritte sowie die Aufnahme von entscheidenden NMR-Spektren und deren Analyse und Interpretation. Unser Ziel ist es, Einblicke in die strukturelle Analyse Pipeline ermöglicht den Leser, eine atomarer Auflösung strukturelle Studie einer makromolekularen Versammlung durch NMR-Techniken durchzuführen.

Das Protokoll umfasst 3 Bereiche:

(1) Festkörper-NMR-Musterfertigung

Als Voraussetzung für einen Festkörper-NMR-Analyse, die Proteinbestandteile des makromolekularen Montage müssen ausgedrückt werden, Isotopen-Label, gereinigt und montiert in Vitro in der Native-ähnlichen komplexen Zustand (für ein Beispiel siehe Abbildung 2) . Damit hohen Empfindlichkeit der NMR, ist Isotop Bereicherung in 13C und 15N Kennzeichnung erforderlich durch minimale bakterielle Ausdruck Medien ergänzt mit 13C und 15N Quellen, wie einheitlich 13 C-markierten Glukose/Glycerin und 15NH4Cl bzw.. In der späteren Phase des Protokolls, selektiv 13C-markierten Proben produziert mit selektiv 13C-Label Quellen wie z. B. (1,3 -13C)- und (2 -13C)-Glycerin (oder (1 -13C)- und (2 -13C)- Glukose) werden verwendet, um die NMR-Analyse zu erleichtern. Beschriftete Mischprobe entspricht einer äquimolaren Mischung von entweder 50 % 15N- und 50 % 13C beschriftet oder 50 % (1,3 -13C)- und 50 % (2 -13C)-Glukose werden eingeführt, um die Erkennung von intermolekularen beschreiben Interaktionen. Ein hohes Maß an Protein Reinheit sowie strenge Bedingungen während der Montageschritt sind Schlüsselfaktoren, um eine homogene strukturelle Ordnung der Endprobe zu versichern.

2. vorläufige strukturelle Charakterisierung basierend auf eindimensionale (1D) Festkörper-NMR

Wir präsentieren Ihnen die wesentlichen Experimente für eine strukturelle Analyse von NMR. Eindimensionale (1D) Kreuz-Polarisation (CP) und WERTAUSPRÄGUNGEN / RINEPT28 Experimente, auf 13C-Kerne erkannt werden verwendet, starre und flexible Protein Segmente bzw. in der Baugruppe zu erkennen und zur Schätzung der Struktur- Homogenität und lokalen Polymorphismus (für ein Beispiel siehe Abbildung 3).

Rong > 3. Conformational Analyse und 3D Struktur Bestimmung

Abs. 1 und 2 betreffen die conformational Analyse, die über die NMR-Resonanz-Zuordnung von alle starren Rückstände der Assemblée Protein basiert, wie die chemischen Verschiebungen sehr empfindlich-Sonden an die lokalen Gegebenheiten sind und verwendet werden, können um vorherzusagen, die Phi/psi Verschneidung Winkel und damit bestimmen die Sekundärstruktur. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für eine sequentielle Resonanz-Zuordnung in der starren Kern einer Protein-Versammlung. Die 3D-Struktur Bestimmung basiert auf der Sammlung von Strukturdaten, z. B. Abstand Beschränkungen Codierung Nähen schließen (< 7-9 Å), sowohl intra- und intermolekularen Informationen enthalten. Abs. 3 und 4 beschreiben Langstrecken entfernten Zurückhaltung Sammlung und Interpretation. Weitreichende Kontakte sind definiert als intramolekulare 13C -13C Nähe durch Rückstand ich j, mit | i-j | ≥4, definieren dabei die tertiären Protein-Falte der Monomere Untereinheit oder als intermolekulare 13C -13C nähen, die intermolekularen Schnittstellen zwischen Protein Untereinheiten in der Baugruppe zu definieren. Intra- und intermolekularen Schnittstellen sind in Abbildung 5dargestellt. NMR-Beschränkungen erkannt durch 13C -13C und 15N -13C Wiederankoppelung Experimente in der Regel kodieren für internuklearen Entfernungen < 1 nm. Abs. 4 erklärt die Erkennung von intermolekulare Abstand Beschränkungen. In symmetrischen Proteins Baugruppen, die Verwendung von homogen beschrifteten Proben (d. h. 100 % gleichmäßig oder selektiv beschriftet) Untereinheit-Untereinheit intermolekularen Wechselwirkungen identifizieren begrenzt sind, als beide Intra - und inter - molecular Kontakte führen zu nachweisbare Signale. Die eindeutige Erkennung der intermolekularen Nähen wird erreicht, indem beschrifteten Mischproben, mit einer äquimolaren Mischung aus zwei unterschiedlich beschriftete Proben vor der Aggregation kombiniert. Unterabschnitt 5 führt kurz Struktur Modellierung.

Figure 1
Abbildung 1 : Workflow ein atomarer Auflösung strukturelle Studie von Festkörper-NMR. 13 C, 15N Isotop mit der Bezeichnung Proteinproduktion, Untereinheit Reinigung, Untereinheit Montage, Kontrolle der Montage Bildung, NMR-Experimente, NMR-Experiment-Analyse und Gewinnung von Abstand Beschränkungen und Modellierung der Struktur werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

1. Solid-State-NMR Probe Productiona

  1. Herstellung von einheitlich 13 C / 15 N-markierten Protein Untereinheiten
    1. Verwendung frisch verwandelt, pET24-Peptid-6Sein Plasmid-haltigen E. Coli BL21 (DE3) Zellen, ernten sie aus vorbereiteten Nährbodenplatte.
    2. Impfen eine 15 mL Vorkultur der vorgewärmten LB-Medium mit einer Kolonie. Bei 37 ° C mit 200 u/min schütteln über Nacht inkubieren.
    3. Übertragen die Vorkultur in 1 L der wichtigsten Kultur des vorgewärmten M9 Medium (siehe Zusammensetzung in Tabelle 1), enthält die erforderlichen Isotopen-markierte Kohlenstoff und Stickstoff.
      Hinweis: Dies ist einheitlich 13 C-markierten Glukose, selektiv (1 - 13 C)- oder (2 - 13 C)-mit der Bezeichnung Glukose 29 , 30 , 31 oder () 1,3 - 13 C)- oder (2 - 13 C)-mit der Bezeichnung Glycerin 32 , 33.
    4. Dies bei 37 ° C inkubieren und messen die OD 600, sobald die Kultur trübe wird. Wenn die OD 600 einen Wert von 0,8 erreicht hat, induzieren Proteinexpression mit 0,75 mM IPTG für 4 Std.
      Hinweis: Die optimale Induktion Bedingungen variieren von einem Protein zum anderen.
    5. Wiederherstellung der Zellen durch Zentrifugation für 30 min bei 6000 x g und 4 ° c
  2. Reinigung skizzieren (nicht im video Protokoll dargestellt)
    1. Lyse der Zellen mit standard-Techniken wie Ultraschall oder Lysozym Behandlung und Reinigen der Protein-Untereinheit mit Techniken hergestellt oder angepasst für die Protein-Montage untersucht.
      Hinweis: Das Protein kann in Einschlusskörperchen, überprüfen Sie für die Protein-Lokalisierung durch Lyse der Zelle und anschließende Zentrifugierung ausgedrückt werden. Wenn das Protein im Sediment mit den Trümmern der Zelle gefunden wird, es in Einschlusskörperchen gesammelt worden.
    2. Test-Ausdruck und Reinheit der Protein-Probe zum Beispiel von einem standard 12-15 % Tris-Tricine SDS-PAGE, siehe Abbildung 2A. Wenn die Reinheit ausreichend ist, das Protein kann zusammengebaut werden, sonst führen Sie eine zusätzliche Reinigungsstufe.
  3. In-vitro- Montage der Protein Filamente
    1. Proteinkonzentration in der gereinigte Lösung zu überprüfen. Wenn das Protein absorbierende Rückstände enthält, Messen Sie die Absorption in einem UV-Spektralphotometer bei 280 nm. Legen Sie den reinen Puffer in Spektralphotometer Kalibrierung und messen dann die Protein-Absorption.
    2. Berechnen Sie die Konzentration des Proteins mit der Absorptionskoeffizient von Protein-Untereinheit mit dem angepassten Bier-Lambert Gesetz: ein λ = ε λ x l X C; hier A ist die optische Dichte bei einer bestimmten Wellenlänge λ; ε ist die spezifische Absorptionskoeffizient; l ist die Länge der optischen Bahn in cm; c ist die Konzentration in Mol/L.
    3. Konzentrieren, das Protein zu einer Konzentration von 1 mM in eine zentrifugale Filter-Einheit. Führen Sie die Probe in die zentrifugale Filtereinheit ein und bei 4000 X g für 30 min Zentrifugieren Sie, mischen Sie die Lösung in der Filtereinheit sanft mit einem pipettieren, Protein Ablagerung am Filter zu vermeiden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist.
      Hinweis: Die optimale Montage-Konzentration hängt vom System und muss (in der Regel zwischen 0,1 - 1 mM) optimiert werden. Wenn einer äquimolaren beschrifteten gemischt Probe von zwei verschiedenen beschrifteten Eiweiß Chargen ist bereit (z.B. (50/50) (U - 15 N)-/ (U - 13 C)-mit der Bezeichnung), mischen erfolgen entweder vor oder direkt nach der Konzentration Schritt zu gewährleisten Homogenisierung der gemischten Lösung.
    4. Übertragen die Probe in ein Rohr und unter Agitation für eine Woche bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. In der Regel die Polymerisation der Untereinheiten in Filamente begleitet die Lösung immer trübe. Überprüfen Sie die mikroskopischen Fibrille Morphologie und Homogenität zum Beispiel mittels Elektronenmikroskopie (6300 X - 45000 X Vergrößerung), siehe Abb. 2 b.
    6. Zentrifuge der Probe für 1 h bei 20000 x g und 4 ° C. Entfernen Sie den Großteil der Überstand lassen nur genügend Flüssigkeit auf der Oberfläche zur Vermeidung von Probentrocknung zu decken. Überprüfen den Überstand für nicht zusammengebauten Untereinheiten auf die UV-Spektrophotometer.
    7. Der Probe durch das Hinzufügen von H 2 O und vorsichtig waschen Aufschwemmen den Inhalt mit einer Pipette. Tun Sie nicht Wirbel. Drehen Sie die Probe für 30 min bei 22000 x g und 4 ° c Waschschritt 3 Mal wiederholen. Während alle Waschschritte wenn das Pellet bewahrt seinen Aspekt nach Zentrifugation und überprüfen den Überstand für nicht zusammengebauten Untereinheiten auf die UV-Spektrophotometer.
    8. Fügen Sie 0,02 % (w/V) Natriumazid (NaN 3) bakterielle Kontamination zu vermeiden und Speichern der Probenmaterials bis zur Messung bei 4 ° c
  4. Solid-State-NMR Rotor füllen
    1. zweimal für 30 min bei 22000 x g und 4 ° c entfernen Höchstbetrag des Überstands Zentrifugieren; die resultierende Probe Konsistenz hängt von der Protein-Versammlung, und ist in der Regel eine Gel-artige Kaution.
    2. Verwenden eine Kapillare pipettieren die Probe in der NMR-Rotor einfügen.
      Hinweis: Hier präsentieren wir Ihnen das Verfahren auf eine 4 mm Durchmesser Rotor.
      1. Zentrifuge des Rotors auf einem Tisch Zentrifuge, sanft die Probe in den Rotor einzuführen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis der Rotor gefüllt ist. Halten Sie minimalen Platzbedarf um den Rotor mit dem Rotor-Deckel zu schließen. Wenn die Probenmenge nicht ausreicht, stellen eine handelsübliche einfügen zu füllen die Restflächen, die Probe Verteilung Homogenität in den Rotor zu gewährleisten.
        Hinweis: Abhängige auf die montierten Probe Konsistenz, es könnte sein, eine angemessenere zu einem dünnen Spatel, vor allem für sehr dichte Proben verwenden. Rotoren mit einem Durchmesser von 2,5 bis 4 mm bei moderaten MAS Frequenzen verwendet werden.
    3. Fügen Sie Spuren von 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic Säure (DSS) für interne chemische Verschiebung und Temperatur-Kalibrierung.
    4. Schließen die Kappe mit einer Schließvorrichtung.
    5. Unter einer Lupe überprüfen, ob die Kappe gut eingefügt und komplett geschlossen.

Figure 2
Abbildung 2: Vertreter ergibt sich für Protein-Untereinheit Reinigung und Montage. (A) 15 % Tris-Tricine SDS-PAGE von Protein-Untereinheit (einschließlich seiner 6-Tag) in den verschiedenen Phasen der Reinigung. Spur 1 - Protein Molekulargewicht Marker; Bahn 2 - E. Coli BL21 (DE3) Zellen uninduced Kontrolle; Bahn 3 - E. Coli BL21 (DE3) Zellen induziert mit 0,75 mM IPTG; Bahn 4 - solubilisiert Einschlusskörperchen Bahn 5 - überstand Bruchteile von Zelle lysate; Bahn 6 - gereinigt Bruchteil nach Nickel Metall Affinitätschromatographie (IMAC) FPLC und Entsalzung immobilisiert. (B) negativ gefärbt Protein Fibrillen durch TEM Bildgebung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. vorläufige strukturelle Charakterisierung basierend auf eindimensionale (1D) Festkörper-NMR

  1. Initial Setup und 1D Kreuz-Polarisation (CP)
    1. legen Sie den Rotor in der NMR-Magneten
    2. beginnen, Drehen Sie den Rotor mit einer Frequenz von 5 kHz und warten auf eine Stabilisierung der ± 10 Hz, dann beschleunigen bis 7 kHz. Tune und entsprechen 1 H, 13 C und 15 N-TV. Stellen Sie die Temperatur um 2 bis 10 ° C (275-283 K); Probenerwärmung bei 7 kHz MAS ist gering und Temperatureinstellung ist in der Regel nicht erforderlich bei dieser Frequenz MAS.
    3. Aufzeichnen ein Single-gepulste 1D 1 H Spektrum mit 16 Scans.
      Hinweis: Leistungsstufen müssen zuvor wurden optimiert auf eine Referenz-Verbindung (z. B. ein 13 C / < Sup > 15 N Histidin oder Glycin), um Ausgangswerte bieten für die Optimierung der Leistungsstufen in den Experimenten auf der Zielstichprobe; Dieses Verfahren ist eine Routine-Aufgabe und deshalb Out-of-Bereich in diesem Protokoll.
    4. Halten die Temperatur bei allen Experimenten zwischen 2 bis 10 ° C, in hydratisierte Proben, die die Temperatur in die relative Verschiebung der Masse Wasser 1 H Resonanz in Bezug auf die DSS Signal 34 niederschlägt. Messen Sie die Temperatur nach der Beziehung δ (H 2 O) = 7.83-T/96,9 mit einer Genauigkeit von 1 bis 2 ° C 35.
    5. Satz oben die gewünschte MAS Frequenz und warten Sie, bis die Stabilisierung von ±10 Hz.
      Hinweis: Hier wird aufgezeigt, für eine Frequenz von 11 kHz.
    6. Melodie und Spiel 1 H und 13 C Kanäle wieder und stellen Sie die Temperatur mit Hilfe eines Experiments 1D 1 H.
    7. Richten Sie eine 1D 1 H - 13 C CP 36.
      Hinweis: CP Experimente zeigen die Signale aus Rückständen in eine starre Konformation. Puls-Kalibrierung und Entkopplung Parameter können direkt auf der Probe optimiert werden, wenn die Empfindlichkeit hoch genug, um Signale nach weniger als ~ 32 Scans zu beobachten ist. Die erste Optimierung-Werte werden von der standard-Optimierung auf eine Referenz-Verbindung übernommen. CP-Kontaktzeit und Leistungsstufen werden auf maximale Signalstärke ausgewählt. In Proteinproben ist in der Regel die optimale CP Kontaktzeit zwischen 200 µs und 2 ms, die die Entkopplung Parameter auch von der Kalibrierung auf eine Referenz-Verbindung neu eingestellt werden sollte.
      1. Sorgfältig beobachten die Lokalisierung der Spinnerei Seitenbänder bei bestimmten MAS Frequenz.
    8. Aufzeichnen eine 1D 13 C CP Referenzspektrum, die als 1D spektralen Fingerabdruck dient. Typische Kennwerte sind 128 Scans, 1 ms CP Kontaktzeit, 100 kHz Entkopplung Kraft, eine Recycling-Verzögerung von 3 s und 25 ms des Erwerbs.
    9. Kalibrieren 1 H und 13 C chemische Verschiebungen nach der IUPAC-Empfehlungen- 37. Bestimmen Sie die Resonanzfrequenz des 1 H DSS Signals (chemische Verschiebung von 0 ppm); 13 C chemische Verschiebungen sind bezogen auf 1 H Schichten (in der Regel ~ 0.25144, abgeleitet aus dem Verhältnis von 13 C, 1 H Resonanz Frequenz 37).
    10. Prozess der 1D 1 H - 13 C CP zu experimentieren, ohne Apodisierung funktionieren (siehe Abb. 3A und B für den Nachweis einer homogen wohlgeordneten Protein-Baugruppe). Wählen Sie eine isolierte Spitze um die Linienbreite in der Probe, bezeichnend für strukturelle Ordnung und Homogenität zu schätzen. Typische 13 C Linewidths für geordnete biologische Protein Baugruppen unter MAS bei hohen Magnetfeldern im Bereich zwischen 20-150 Hz (gemessen als die gesamte Breite bei halber Höhe (FWHH)).
    11. Schätzen das Signal-Rausch-(S/N) Verhältnis im Spektrum CP.
      Hinweis: Das S/N-Verhältnis hängt von vielen Faktoren ab, darunter vor allem die Menge der Probe in den Rotor, der Grad der Starrheit des Protein-Struktur und das Vorhandensein von einem einzigen molekularen Konformation. Als Faustregel gilt, sollte ein Beispiel für mehrdimensionale NMR-Spektroskopie geeignet sein, wenn ein Signal in eine optimierte 1D 1 H - 13 C CP Spektrum aufgenommen mit 64 Scans beobachtet wird.
    12. Zoom in den Spektralbereich von Protein Rückgrat Carbonyl Resonanzen zwischen 165-180 ppm (hauptsächlich) lokalisiert. Schätzung des Sekundärstruktur Inhalts in der Versammlung durch die Position der Protein Rückgrat Carbonyl Resonanzen mit Resonanzen von Rückständen im α-helikale oder β-Strang Konformation verschoben downfield oder Upfield, bzw. (siehe Abbildung 3 b für eine meist α-helikale Untereinheit) 38.
  2. 1D WERTAUSPRÄGUNGEN experimentieren
    1. a 1 D 1 H - 13 C UNFÄHIGEN Experiment für hochmobile Teile (Sub-µs) die Protein-Baugruppe Sonde eingerichtet.
      Hinweis: GARP Entkopplung von ein paar kHz bei Erwerb 39 ist allgemein verwendet, interscan Wartenzeiten zu ermöglichen (in der Regel 1 s) ohne Beschädigung der Sonde.
    2. Aufzeichnen einer UNFÄHIGEN Referenzspektrum, wie Fingerabdruck für die Segmente mobile Protein dient; typische Kennwerte sind 128 Scans und einer Erfassungszeit von 25 ms.
    3. Prozess der 1 H - 13 C UNGESCHICKT experimentieren. Die Menge und die Positionen der Signale sind bezeichnend für die Menge an mobilen Rückstände und die Aminosäure-Zusammensetzung bzw..
      Hinweis: Auch ein 2D 1 H - 13 C UNFÄHIGEN Experiment aufzeichnen, wenn Signale im 1D UNFÄHIGEN Spektrum vorhanden sind (siehe Abbildung 3 für ein Beispiel), eine spezifische Aminosäure-Identifizierung zulassen. In mehrdeutige Zuordnung Fällen empfehlen wir, Überprüfung der Puffer Komponentenpositionen Signal durch Lösung NMR.
    4. Verwenden die BMRB Datenbank 40 und veröffentlichten Daten 38 um ihre entsprechenden Aminosäure in in der Nähe von zufälligen Spule Konformation der Resonanzen zuzuweisen; das Spektrum enthält nur mobile Puffer Komponenten, wenn keine Rückstände sind in einem hochmobilen Regime.

Figure 3
Abbildung 3: repräsentative Ergebnisse der NMR-Spektren Erwerb für eine gut strukturierte Protein-Baugruppe. (A) 13 C erkannt FID einer 1 H - 13 C-Kreuz-Polarisation-Experiment. (B) 1 H - 13 C Kreuz-Polarisation Experiment. C) 1 H - 13 C UNFÄHIGEN Experiment einer starren Protein-Versammlung; nur Puffer Komponenten sind sichtbar. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. Conformational Analyse und 3D Struktur Bestimmung

  1. sequentielle Resonanz Zuordnung
    1. eingerichtet, ein 2D 13 C - 13 C Proton angetriebene Spin Diffusion (PDSD) 41 zu experimentieren, um Intra-Rückstände 13 C - 13 C Korrelationen, einschließlich Seitenketten zu erkennen. Übernehmen Sie die Werte für die ersten 1 H - 13 C Kreuz-Polarisation Schritt 1D 1 H - 13 C CP Experiment.
      1. Die Mischzeit eingestellt bis 50 ms für einheitlich 13 C-markierten Proben und 100 ms für selektiv 13 C-markierten Proben. Stellen Sie die indirekten Erwerb Zeit zwischen 5-25 ms und dem direkten Erwerb zwischen 15-25 ms abhängig von der intrinsischen spektrale Auflösung, die durch das sichtbare Signal in der Free Induction Decay (FID) Länge (beispielhaft in geschätzt werden kann Abbildung 3A).
      2. Test mehrere Verarbeitungsparameter um optimale Werte in Bezug auf Signal-Rausch- und Auflösung des Spektrums zu finden, in der Regel ausreichende Verarbeitung erreicht werden mit einer Fensterfunktion Qsine mit einer Sinus-Glocke-Verschiebung (SSB) von 2,5-4.
    2. Einrichten, Datensatz und Prozess ein 2D 13 C - 13 C PDSD mit einem mittleren mischen Zeit Experiment sequentielle 13 C - 13 C Korrelationen verbinden meist i - i±1, erkennen aber auch i±2 und i±3 Rückstände, je nach Protein Rückgrat Steifigkeit und Sekundärstruktur Elemente. Die Mischzeit sollte zwischen 100-200 ms für einheitlich beschrifteten Proben eingestellt werden. Alle anderen Werte aus den kurzen mischen Zeit 2D 13 C - 13 C PDSD übernommen werden können.
    3. Einrichten, Datensatz und ein 2D 15 N - 13 C N ich CA ich und N ich CO ich experimentieren mit einem CP 1 H - 15 N und einen bestimmten CP 15 N - 13 C-Transfer-Prozess 42. 15 N - 13 C Polarisation Transfer in eine 1D Mode direkt auf das Beispiel von Interesse, basierend auf maximale Intensität im Großraum CA oder Carbonyl bzw. zu optimieren. EiterungCal-Werte für die spezifische CP Kontaktzeit sind zwischen 2 und 6 Ms.
    4. eingerichtet, aufnehmen und Verfahren eine Reihe von 2D 15 N-(13) C - 13 C zwecks Zuordnung Experimente.
      Hinweis: Die ersten 15 N - 13 C Polarisation Transfer Parameterwert kann übernommen werden von den N ich CA ich / N ich CO ich Experimente. Intra-Rückstände Korrelationen sind aus N ich etablierte Träumen (CA ich) CB ich und N ich (CA ich) CO ich, bzw. 43 und PDSD 13 C - 13 C Polarisation überträgt. Die Rückstände (i) Rückstände (i-1) sequentielle Vernetzung ergibt sich aus N ich (CO i-1) CA i-1 und N ich (CO i-1) CX i-1 Experimente, beide mit einem PDSD 13 C - 13 C Polarisation Transfer.
    5. Wählen Sie ein NMR-Analyse-Programm wie CcpNmr Analyse 44 oder SPARKY 45
    6. Laden die 2D Spektren in der Software (Beispiel mit CcpNmr Analyse) und laden Sie die primäre Proteinsequenz.
    7. Beginnen mit der Identifizierung der Aminosäure Arten sichtbar in der kurzen mischen 13 C - 13 C PDSD Spektrum. Verbinden Sie die Kohlenstoffatome der Spin-Systeme ermöglichen die " Rückstände-Typ " bestimmte Zuordnung; siehe Abbildung 4A für die Zuordnung von Threonin Rückstände. Wie viele Rückstände wie möglich zu identifizieren; Dies hängt von der Proteingröße Untereinheit, die spektrale Auflösung und Verteilung.
    8. Überlagern die kurzen Vermischung mit dem Zwischenprodukt mischen 13 C - 13 C PDSD Spektrum.
      Hinweis: Die zusätzlichen Gipfel sichtbar in der Mittelstufe-mischen PDSD ergeben sich meist aus sequenziellen (Rückstand ich - Rückstände i±1) Kontakte. Ein Beispiel für eine zwei-Rückstände sequentielle Zuordnung wird in Abbildung 4 b dargestellt.
      1. Markieren die Resonanz Gipfel eines Spin-Systems und Korrelationen in der Mittelstufe-mischen PDSD mit Resonanzfrequenzen von anderen Spin-Systemen zu finden. In kleine Proteine oder Peptide, es kann möglich sein, die gesamte sequentielle Resonanz Zuordnung basierend auf 2D 13 C - 13 C PDSD Experimente zu erreichen.
        Hinweis: In β-Strang Sekundärstruktur Motive Rückstände könnte i - Rückstände i±2 13 C - 13 C Kontakte intensiver Signale als sequentielle Kontakte aufgrund ihrer Nähe im Raum zeigen; im α-helikale Sekundärstruktur Motive Rückstand i - Rückstände i±3 13 C - 13 C Kontakte führen auch zu intensive Signale.
    9. Wenn Intermediate-mischen PDSD Experimente an selektiv 13 C-markierten Proben zur Verfügung stehen, überlagern sie auf das Mischen von kurzen Spektrum (falls vorhanden auf die selektiv 13 C beschriftet Probe) und weisen Sie die ergänzenden Gipfel, unter Berücksichtigung der selektiven 13 C Kennzeichnung Muster (1,3 - 13 C und 2 - 13 C Glycerin 32 , 33 oder 1 - 13 C und 2 13 C Glukose 29 , 30 , 31.
      Hinweis: Z. B. in einem 2 - 13 C Glycerin beschriftet Probe mehrere Aminosäure-Arten sind auf die Cα-Position ohne die angrenzenden Kohlebürsten markiert (Cβ und C ') gekennzeichnet, daher bevorzugt die Cα-Cα Transfer zwischen benachbarten Rückstände. In selektiv beschrifteten Proben könnte Langstrecken 13 C - 13 C Korrelationen bereits im zwischen-mischen 13 C - 13 C PDSD Experimente aufgebaut werden. Wenn ein Peak durch eine sequenzielle Korrelation erklärt werden kann, könnte es von einem langfristigen Kontakt entstehen. Sehr homogene Untereinheit Strukturen in der makromolekularen Versammlung bestellt, soll nur ein Satz von Resonanzen in den Spektren sichtbar. Wenn verdoppelt (oder weiter multipliziert) Resonanzen sind für 13 C-Atome sichtbar oder Protein Rückgrat Strecken, zwei (oder mehr) Konformationen für das Atom oder die primäre Sequenz-Strecke in der Baugruppe bzw. vorhanden.
    10. Nutzen das 2D NCA-Spektrum mit Intra-Rückstand 15 N - 13 Cα Korrelationen, um die 15 N Resonanzfrequenzen für jede Rückstände zu identifizieren. Wenn die Auflösung in der Dimension 13 C nicht ausreicht, verwenden die Zusatzinformationen über die Cβ Resonanz in 2D NCACB Ermittlung die Resonanzfrequenz der Intra-Rückstand 15 N.
    11. Verwenden Sie die 2D NCACB und NCACO Spektren mit Intra-Rückstand 15 N - 13 C - 13 C Korrelationen zu identifizieren (i) die Intra-Rückstände-15 N-Frequenz und (Ii) Mehrdeutigkeiten in der 13 C - 13 C zu beheben PDSD mit Hilfe der zusätzlichen 15 N Dimension. Die Umkehrung des Signals durch die Traum-Abgabe führt zu die Beobachtung von typischen Cα-Cβ Korrelationen für die Cα-Signal positiv ist und negativ Cβ Signal. Weitere Sidechain-13 C, wenn in das Spektrum sichtbar sind positive wieder.

Figure 4
Abbildung 4: 2-dimensionale 13 C - 13 C-NMR-PDSD Experimente auf eine geordnete, einheitlich 13 C, 15 N-markierten Protein Montage. (A) kurze Mischzeit PDSD (50 ms mischen). (B) Zuordnung der 2-Rückstand-Strecke Ile32 - Thr33 mit Überlagerung der kurzen Mischzeit PDSD mit einer lange Mischzeit PDSD (200 ms mischen). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Sekundärstruktur Entschlossenheit
    1. Verwendung 13 Cα, 13 Cβ chemische Verschiebungswerte zu berechnen, die sekundäre chemische Verschiebung 46 ΔδCα-ΔδCβ , bezeichnend für die Sekundärstruktur. 13 Cα(assigned) - 13 Cα (random Coil) und 13 Cβ(assigned) - 13 Cβ (random Coil) zu berechnen.
      Hinweis: Chemische Verschiebungswerte für Rückstände in zufälligen Spule Konformation erhalten Sie bei 38.
      1. Grundstück ΔδCα-ΔδCβ, negativen oder positiven Werte für > 3 Rückstände in Folge zeigen bzw. β-Strang oder α-helikale Konformation; Glycin und Prolin Rückstände könnten als ungewöhnlichen chemischen Verschiebungswerte zeigen Sie wirken oft wie " Sekundärstruktur Leistungsschalter ".
    2. Vorhersagen, die Protein Verschneidung Winkel aus den zugewiesenen chemische Verschiebungen mit TALOS + 47 , 48 oder PREDITOR 49 , 50. Die vorhergesagten Phi/Psi Verschneidung Winkeln reflektieren die Sekundärstruktur des Proteins subuNit und dienen als strukturelle Beschränkungen im gesamten Modellierungsprozess.
  2. Sammlung von strukturellen Beschränkungen
    1. Set oben und ein 2D 13 C - 13 C PDSD Experiment mit einer lange Mischzeit, weiträumige 13 C zu erkennen - 13 C Korrelationen aufzeichnen. Typische mischen Mal reichen von 400 ms bis 1 s. verwenden Sie selektiv 13 C beschriftet Beispiele wie die Spin-Verdünnung verbessert die Polarisation Transfer unter fernen Kohlebürsten.
    2. Überlagerung der lange mischen 2D 13 C - 13 C PDSD aufgenommen am selektiv beschriftet Probe auf der Mittelstufe mischen 13 C - 13 C PDSD, wenn möglich an derselben selektiv beschriftet Probe aufgenommen. Zusätzliche Spitzen ergeben sich aus Korrelationen zwischen weiter entfernten 13 C-Atomen. Bei Resonanz Zuordnung, selektive Kennzeichnung System berücksichtigen.
    3. Sorgfältig bewerten die Auflösung des Spektrums eine Zuordnung Toleranzfenster, d.h. abhängig von der spektralen Auflösung Resonanzen in einem bestimmten ppm-Bereich definieren, wie dies mit dem Signal beitragen kann. Die Standardabweichung der Zuordnung Präzision errechnet sich automatisch im NMR Zuordnungsprogramme wie CcpNmr Analyse oder SPARKY.
    4. Wenn ein Signal von einem sequentiellen erklärt werden kann (Rückstand ich - Rückstände i±1) oder einen Mittelstrecken-13 C - 13 C Kontakt (Rückstände i - Rückstände ich ± 2, 3 oder 4), pflegen diese Zuordnung seit weitergeleitete Polarisation Transfer kann erklären, die Korrelation sogar bei 13 C - 13 C Abstand oberhalb der erwarteten Kontakt Sichtweite.
    5. Klassifizieren die Zuordnungen von Langstrecken-13 C - 13 C Kontakte in eindeutige und mehrdeutige Frequenzsignale. Bei eindeutigen Frequenzzuteilungen, nur eine Resonanz Zuordnung ist möglich in Bezug auf die Zuordnung Toleranzfenster.
      Hinweis: Mehrdeutige Zuordnungen enthalten alle möglichen Resonanz Zuweisungen innerhalb der Toleranz. Die Mehrdeutigkeiten können gleichzeitig bei der Berechnung der Struktur durch iterative Runden der Disambiguierung auf Basis vorläufiger Strukturen berechnet nur die eindeutige Beschränkungen, wie in computational Routinen wie ARIA aufgehoben werden 51 oder UNIO 52. Darüber hinaus können Strukturdaten aus verschiedenen biophysikalischen Quellen (z.B. mutiert oder Untereinheit Struktur durch Lösung NMR oder Röntgen-Kristallographie, Masse-pro-Längenmessungen, Cryo-EM-Karte abgeschnitten) auch verwendet werden, für die Verringerung der Mehrdeutigkeit, Beispiele siehe 1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58.
  3. Erkennung von intermolekulare Abstand Beschränkungen in einer symmetrischen Protein-Baugruppe
    1. ein 2D 15 N - 13 C Schmerz-CP 59 Experiment auf einrichten eine gemischte (50/50) U - 15 N - / U - 13 C-Label Probe. Signale auf die Schmerz-CP-Spektrum erkannt sollte Inter molekulare 15 N - 13 C Nähe entstehen. Verwenden Sie die zuvor zugewiesenen Resonanzen um die Zuweisung der intermolekulare Kontakte durchzuführen.
    2. Richten Sie ein 2D 13 C - 13 C PDSD mit einer lange Mischzeit (> 600 ms) auf ein (50/50) gemischt (1,3 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-Glycerin oder (1 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-Glukose Probe.
      Hinweis: Signale erkannt in diesem 13 C - 13 C Spektrum ergeben sich aus intramolekularer und Inter molekularen 13 C - 13 C nähen. Die hohen Komplementarität der beiden Kennzeichnung Regelungen kann jedoch besondere Resonanz Paare eindeutig entstehen zwischen molekularen Kontakte, z. B. Serin CA in der (2 - 13 C)-Glukose Untereinheiten, die ein Serin-CB in korrelieren mit der Bezeichnung der (1 - 13 C)-Glukose Untereinheiten beschriftet.
      1. Overlay, das Spektrum der Mischprobe zu 2D 13 C - 13 C Spektren aufgenommen auf homogen beschriftet, Proben ((1,3-13C) - und (2 - 13 C)-Glycerin oder (1 - 13 C)- und (2 - 13 C)-Glukose mit der Bezeichnung Proben). Zusätzliche Signale im Spektrum auf der Mischprobe aufgenommen sollte zwischen molekularen Wechselwirkungen entspringen.
  4. Struktur Modellierung von NMR-Daten
    1. Vorbereitung der NMR-Zurückhaltung-Listen für die Berechnung der Struktur benötigt: (1) Proteinsequenz; (2) intramolekularer eindeutig Abstand Beschränkungen; (3) intramolekularer mehrdeutige Abstand Beschränkungen; (4) TALOS-basierte Verschneidung Winkel Fesseln; (5) zwischen molekularen eindeutig Abstand Beschränkungen; (6) zwischen molekularen mehrdeutige Abstand Beschränkungen; (7) zusätzliche Daten von anderen biophysikalischen Techniken (z.B. Masse pro Länge, Symmetrie Parameter).
    2. Mehrere Bewertungen geben Einblicke in Struktur Modellierung basierend auf NMR-Daten und in Verbindung mit ergänzenden Strukturdaten 14 , 60 , 15 , 19 , 61 , 62 beachten Sie, dass mehrdeutige Abstand Beschränkungen bei der Berechnung der Struktur in Bezug auf die vorläufige geklärt werden können strukturelle Modelle basieren auf eindeutigen Abstand Beschränkungen. Um Struktur Genauigkeit zu gewährleisten, sorgfältig zu beobachten, wenn die Struktur zu einem einzigen Falte konvergiert.

Figure 5
Abbildung 5 : Intra - und intermolekularen Kontakte in symmetrischen Proteins Baugruppen. Schematische Darstellung der Intra - und intermolekularen 13 C - 13 C weitreichende Kontakte in einer spiralförmigen makromolekularen Assembly. Die Untereinheiten sind farbig in weiß und rot zur Veranschaulichung der gemischten Kennzeichnung der Untereinheiten; d. h. vor der Montage eine 1:1 Mischung aus zwei unterschiedlichen Kennzeichnung Regelungen erfolgte (z.B. 1 - 13 C Glukose und 1 - 13 C Glukose). A) intramolekulare 13 C - 13 C langfristige Kontakte (blau gestrichelte Pfeil); B) intermolekulare 13 C - 13 C langfristige Kontakte (rot gestrichelte Pfeile). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Representative Results

Der typische NMR-Workflow umfasst mehrere Schritte, die in Abbildung 1dargestellt. In der Regel sind die Protein-Untereinheiten von in-vitro- heterologen Expression in E. Coliproduziert, gereinigt und montiert unter schütteln, aber manchmal auch unter statischen Bedingungen. Ausdruck und Reinigung des Protein-Untereinheit folgen SDS-Gel-Chromatographie (Abbildung 2A). Die Bildung von makromolekularen Versammlungen kann dann durch Elektronenmikroskopie (EM) Analyse bestätigt werden (siehe Abb. 2 b für ein Beispiel einer faserigen Versammlung).

Nach Einführung der Protein-Versammlung in der NMR-Rotor der Rotor wird eingefügt in das Spektrometer, MAS Frequenz und Temperatur geregelt und die Spektren aufgezeichnet. Erste Einblicke erhalten Sie von 1D NMR-Techniken. Abbildung 3 zeigt eine typische NMR FID erkannt auf dem 13C-Kanal auf einer Stichprobe von strukturell homogenen Protein, ein 1H -13C CP Spektrum, enthüllt die13C Resonanzen im starren Kern der Protein-Untereinheit in der Montage und ein 2D 1H -13C UNFÄHIGEN Spektrum, repräsentieren die mobile Rückstände. Für atomare Einblicke in den starren Kern der Baugruppenstruktur müssen multidimensional NMR-Experimente auf aufgezeichnet werden einheitlich und selektiv beschriftet Proben weisen Sie zuerst die NMR-Resonanzen und dann erkennen Langstrecke Nähen (siehe Abb. 4 ).

Alle Spektren werden verarbeitet und analysiert mit entsprechender Software zuweisen die NMR-Resonanzen und Extrahieren von Intra- und intermolekularen Abstand Beschränkungen (Abbildung 5). Die NMR Abstand Beschränkungen dienen entweder allein oder in Verbindung mit Daten aus komplementären Techniken, die in dem Modellierungsprogramm integriert werden können.

Abbildung 6 veranschaulicht für repräsentative Atomstrukturen makromolekularen Versammlungen durch NMR-Techniken gelöst mehrere filamentöse Baugruppen aus bakteriellen Anhängsel und Amyloid-Fibrillen.

Figure 6
Abbildung 6:filamentösen makromolekulare Strukturen bestimmt durch einen Festkörper-NMR-Ansatz: bakterielle Filamente und Amyloid-Protein Fibrillen. A) Typ1 Pilus von adhärent E. Coli, PDB Code 2N7H 4; B) ASC Filament, PDB Code 2N1F 63; ( C) Typ-III-Sekretion System Nadeln, PDB-Codes 2MME, 2LPZ und 2MEX zu 2,3,64; D) PDB Code 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 , Amyloid-Beta-AB42-Fibrillen und Osaka mutierten PDB Code 2MVX 57, Iowa mutierten PDB Code 2MPZ 58; E) Alpha-Synuclein Fibrillen, PDB Code 2N0A 68; F) HET-s Prion Domain, PDB Code 2RNM, 2KJ3 69,70. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Festkörper-NMR (NMR) ist eine Methode der Wahl für die Charakterisierung von Proteinen makromolekularen Versammlungen auf atomarer Ebene. Eines der zentralen Themen in NMR-basierte Strukturaufklärung ist die spektrale Qualität des untersuchten Systems, das ermöglicht die Schaffung struktureller 3D-Modelle von verschiedenen Präzision, in der Regel reichen von niedrig aufgelöste Modelle (mit den sekundären Elemente und wenig 3D Informationen strukturieren), Pseudo-3D Atomstrukturen. Die Quantität und Qualität von strukturellen Informationen aus mehrdimensionale NMR-Experimente ist der Schlüssel um eine hochauflösende NMR-Struktur der Versammlung zu berechnen.

Das beschriebene Protokoll stützt sich auf die Erkennung von 13C -13C und 15N -13C strukturelle Beschränkungen, erfordern die Aufnahme von mehreren 2D (und manchmal 3D) Spektren mit hohen Signal-Rausch. Bei moderaten MAS Frequenzen (< 25 kHz), die Probe wird in Rotoren mit Größen von 3,2-4 mm Durchmesser ermöglicht Proteinmengen von bis zu ~ 50 mg, abhängig von der Probe Hydratation eingeführt. Die Menge der Probe in der Rotor ist direkt proportional zu den Signal-Rausch-Verhältnis in NMR-Spektren, ein entscheidender Faktor für die Erkennung von weiträumigen Entfernung Fesseln und ihre eindeutige Zuordnung.

Die spektrale Auflösung ist ein entscheidender Parameter bei der sequentiellen Resonanz-Zuordnung und die Fesseln-Sammlung. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, müssen die Probe Vorbereitung Parameter optimiert werden, besonders bei der Reinigung der Untereinheit und Montagebedingungen (pH-Wert, Puffer, Zittern, Temperatur, etc.). Für Probe-Optimierung empfiehlt es sich, unbeschriftete Proben vorzubereiten für mehrere unterschiedliche, die Bedingungen für die Montage beobachtet wurde, und ein 1D 1H -13C CP Spektrum (in Schritt 2.1 beschrieben) auf jede vorbereitete Probe aufzeichnen. Die Spektren dienen zu vergleichen, spektrale Auflösung und Streuung zwischen den verschiedenen Zubereitungen, basierend auf deren optimalen Bedingungen ermittelt werden können.

Die Qualität der NMR-Daten hängt stark von der Wahl der NMR-Aufnahmeparameter, vor allem für die Polarisation Transfer Schritte. Die Verwendung von hohen Magnetfeldstärken ( 1H-Frequenz ≥600 MHz) ist Voraussetzung für hohe Empfindlichkeit und spektrale Auflösung erforderlich, wenn komplexe Ziele wie makromolekularen Protein Baugruppen vor.

Ein limitierender Faktor in vielen Fällen ist die Spektrometer-Verfügbarkeit. Daher sollte eine vernünftige Auswahl der Proben vorbereitet werden die Spektrometer-Sitzung vorausgehen. In jedem Fall, eine einheitlich 13C, 15N beschriftet Probe ist eine Voraussetzung für die sequentielle und Intra residual Resonanz Zuweisung durchzuführen. Proteine vom Festkörper-NMR-Techniken finden Sie unter71. Strukturaufklärung von makromolekularen Versammlungen auf moderate MAS Frequenzen erfordert selektiv 13C-markierten Proben; für die Erkennung von Langstrecken- 13C -13C und 13C -15N Proben basierend auf 1,3 - Kontakte13C- und 2 -13C-Gylcerol und/oder 1 -13C- und 2 -13C-Glukose Kennzeichnung sind häufig verwendet, wie oben beschrieben. Die Wahl zwischen zwei Kennzeichnung Systeme basiert auf der spektralen Signal-Rausch-Verhältnis und der Auflösung. Zur Unterscheidung zwischen Intra- und intermolekularen weitreichende Kontakte ergaben beschriftete und verdünnte Mischproben effizient.

Kurz gesagt, die entscheidenden Schritte für eine atomare NMR strukturelle Studie sind: (i) die Vorbereitung der Untereinheiten und Montage müssen optimiert werden, ausgezeichnete Probenmenge und Qualität zu erhalten, (Ii) Spektrometer-Parameter für Feld Stärke "und" Erwerb müssen sein sorgfältig ausgewählt; (Iii) selektive Strategien zur Kennzeichnung sind erforderlich für eine 3D-Struktur und die erforderliche Datenmenge hängt die Qualität der Daten und der Verfügbarkeit von ergänzenden Daten.

Trotz seiner Anwendbarkeit auf eine Vielzahl von supramolekularen Systemen von Membranproteinen bis hin zu Homomultimeric Nano-Objekte ist NMR oft durch die Notwendigkeit der mg-Mengen isotopisch beschriftete Material begrenzt. Die jüngsten technologischen Entwicklungen in Ultra-schnelle MAS (≥100 kHz) NMR eröffnen die Allee 1H erkannt NMR, und schieben die Grenze der geringe Probenmenge zu Sub-mg 72,73,74. 13C-markierten Proben sind für strukturelle Detailstudien jedoch unverzichtbar, die schränkt die Anwendung der NMR Proben montiert in Vitro oder Systeme ausgedrückt in Organismen, die auf minimaler Medium zu, wo überleben in der Zelle NMR ist eine neue Methode (für Bewertungen 75,76,77,78siehe).

Ein wichtiger Faktor im NMR Anwendung, hochauflösende 3D Strukturen zu erhalten ist die spektrale Auflösung: intrinsische Konformationsänderungen Heterogenität in einer Baugruppe kann Auflösung und Spektren Spektralanalyse einschränken. Rückstände spezifische 13C Kennzeichnung können in manchen Fällen eine Alternative zu bestimmten Abstand über strategische Rückstände zu informieren um strukturelle Modelle (für eine aktuelle Beispiele siehe 79,80) zu erhalten.

NMR für 3D Strukturbestimmung erfordert noch die Sammlung von mehreren Datensätzen mit oft langen Daten Abholzeiten auf ausgefeilte Instrumente, je nach der Ansatz und das System mehrere Tage bis Wochen auf einem 600-1000 MHz (1H-Frequenz) Spektrometer. Daher kann der Zugang zum Spektrometer Zeit ein limitierender Faktor in einer eingehenden Studie NMR.

Bei Homomultimeric Protein Baugruppen zur NMR-Daten von ausreichender Qualität, eine hohe Anzahl von strukturellen Beschränkungen wie in 3,57,64,70, NMR zu identifizieren gibt immer noch keinen Zugang zu den mikroskopischen Dimensionen. Daher ergänzen eine de Novo NMR Strukturaufklärung einer Homomultimeric Versammlung, EM oder Masse pro Länge (MPL) Daten im Idealfall NMR-Daten, um die Symmetrie Parameter ableiten. NMR-Daten allein bieten die atomare Intra- und intermolekularen Schnittstellen

NMR ist höchst komplementär mit strukturellen Techniken wie EM oder MPL Messungen, sondern die Daten ist auch perfekt kombinierbar mit atomaren Strukturen durch Röntgen-Kristallographie oder Lösung NMR auf mutierte oder abgeschnittene Untereinheiten erhalten. Eine wachsende Zahl von Studien kann in Literatur gefunden werden, wo die Verbindung von verschiedenen Strukturdaten zur Bestimmung atomarer 3D-Modelle von makromolekularen Versammlungen (siehe Abbildung 6 für repräsentative Beispiele) erlaubt hat.

Im Bereich der Strukturbiologie entpuppt sich NMR als vielversprechende Technik studierenunlösliche und nichtkristalline Assemblys auf atomarer Ebene, d. h. die Strukturdaten auf atomarer Skala. In dieser Hinsicht NMR ist das Gegenstück zur Lösung NMR und Röntgen-Kristallographie für molekulare Baugruppen, einschließlich Membranproteine in ihren nativen Umgebung und Protein Versammlungen wie virale Umschläge, bakterielle Filamente oder amyloiden sowie RNA und RNA-Protein-komplexe (siehe zum Beispiel81). Die äußerst vielseitige Anwendungen in-vitro- und in der zellulären Kontext, z. B. verfolgen von sekundären, tertiären und quartären strukturelle Änderungen, Interaktion Oberflächen mit Partner Moleküle auf atomarer Skala (z. B. 82) zu identifizieren und Mapping Molekulardynamik im Zusammenhang mit der montierten Anlagen zeigen das wichtige Potenzial der NMR in zukünftige strukturelle Studien bei komplexen biomolekularen Baugruppen.

Komponente M9 medium
NaCl 0,5 g/L
KH2PO4 3 g/L
Na2HPO4 6,7 g/L
MgSO4 1 mM
ZnCl2 10 ΜM
FeCl3 1 ΜM
CaCl2 100 ΜM
MEM-Vitamin-Mix 100 X 10 mL/L
13 C-Glukose 2 g/L
15 NH4Cl 1 g/L

Tabelle 1: Zusammensetzung des Mediums minimale Ausdruck für rekombinante protein Produktion in E. Coli BL21 Zellen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird finanziert durch die ANR (13-PDOC-0017-01 B.H und ANR-14-CE09-0020-01, A.L.), "Investitionen in die Zukunft" Programm IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016, B.H) verweisen ANR-10-IDEX-03-02, b.h., die Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090, A.L.), das RP7-Programm (RP7-Menschen-2013-CIG, A.L.) und der European Research Council (ERC) unter der Europäischen Union Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm (ERC Starting Grant, A.L., Übereinkommen Nr. 639020) und Projekt " WEAKINTERACT."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) Bruker -
triple resonance MAS SSNMR probehead  Bruker -
SSNMR rotors 4mm Bruker K1910
Centrifuge 5804 R  Eppendorf 5805000629
GeneQuant 1300 spectrometer Dutscher 28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L Dutscher 228001
MaxQ 4450 bench top orbital shaker Dutscher 78376
Tube Revolver Agitator Dutscher 79547
sonopuls HD 3100 Bandelin 3680
MicroPulser electroporator Biorad 165-2100 
mini-PROTEAN tetra cell system Biorad 165-8000
AKTA pure system GE Healthcare 29-0182-24
capillary microman M25 pipet Gilson  F148502
Name Company Catalog Number Comments
Materials
amiconR ultra-15 sigma Z740199-8EA
capillaries and pistons Gilson  F148112
spatula Fisher 13263799
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
D-glucose 13C6 Sigma 389374
Ammonium-15N-chloride Sigma 299251
1,3 13C2 glycerol Sigma 492639
2 13C glycerol Sigma 489484
Kanamycin Sigma K1876
Carbenicillin Sigma C3416
Sodium phosphate dibasic Sigma S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655
Sodium chloride Sigma 71380
calcium chloride Sigma C1016
Magnesium sulfate Sigma 208094
Iron Chloride Sigma 157740
Zinc chloride Sigma 793523
MEM Vitamin Solution (100×) Sigma M68954
IPTG Fisher BP1755
Trizma base  Sigma T1503
Tricine Sigma T0377
SDS Sigma 436143
sodium azide sigma 71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid  Sigma 178837
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Unicorn 6.3 GE Healthcare Akta systems
ccpNMR CCPN  spectrometer systems

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References

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