सीटू में Shewanella oneidensis MR1 की विलक्षण फिल्म ने सालवी और तोफ-सिम्स द्वारा

Chemistry

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Summary

यह लेख एक microfluidic रिएक्टर, तरल वैक्यूम अंतरफलक पर विश्लेषण के लिए प्रणाली द्वारा सक्षम अपनी हाइड्रेटेड राज्य में रासायनिक मानचित्रण के लिए उड़ान माध्यमिक आयन जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एक सीटू में समय के लिए एक जैव फिल्म के बढ़ते के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है । ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ Shewanella oneidensis एमआर-1 को मॉडल के तौर पर इस्तेमाल किया गया ।

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Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

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Abstract

बैक्टीरियल फिल्म सतह से जुड़े समुदायों है कि काफी को समझने के लिए अपने स्वयं के उत्पादन extracellular बहुलक पदार्थ (EPS) और पर्यावरण माइक्रोबायोलॉजी में अपनी भूमिकाओं का अध्ययन कर रहे हैं । इस अध्ययन के लिए तरल वैक्यूम इंटरफेस (सालवी) में विश्लेषण के लिए प्रणाली के लिए जैव फिल्म लगाव की खेती और समय की उड़ान माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (तोफ-SIMS) द्वारा एक जीवित फिल्म की सीटू रासायनिक मानचित्रण में प्राप्त करने के लिए एक विधि की रूपरेखा । यह दोनों बाहर और हमारे विशेष सेटअप के साथ सालवी चैनल के भीतर जीवाणुओं के संवर्धन के माध्यम से किया जाता है, साथ ही साथ ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के माध्यम से करने के लिए इस से पहले तोफ-SIMS विश्लेषण से पूर्व फिल्म की उपस्थिति और मोटाई का पता लगाने । हमारे परिणाम अपनी प्राकृतिक हाइड्रेटेड राज्य में Shewanella फिल्म की विशेषता चोटियों दिखाने के लिए, अपने स्थानीयकृत पानी क्लस्टर पर्यावरण पर प्रकाश डाला, साथ ही EPS टुकड़े, जो एक ही फिल्म के निर्जलित से काफी अलग हैं राज्य. ये परिणाम एक निर्वात आधारित रासायनिक इमेजिंग साधन के साथ सीटू जैव फिल्म इमेजिंग में के लिए अनुमति देता है कि सालवी की सफलता की क्षमता प्रदर्शित करता है ।

Introduction

बैक्टीरियल फिल्म सतह से जुड़े समुदायों जो समय के साथ विकसित किया है बैक्टीरिया के लिए एक बचाव के लिए प्रतिकूल शारीरिक और यांत्रिक उत्तेजनाओं बदलती है, जिसमें कोशिकाओं को देते है और कई संभव वातावरण में जीवित रहने में सक्षम हैं । 1 , 2 जैव-फ़िल्मों की काफी जांच की जाती है और कई क्षेत्रों में आवेदन किया है जैसे कि बायोमेडिकल, इंजीनियरिंग, कृषि, और औद्योगिक अनुसंधान और विकास । 1 , 2 इन जटिल माइक्रोबियल समुदायों के रासायनिक मानचित्रण को समझने, उनके स्व-उत्पादित extracellular पॉलिमर पदार्थों (ईपीएस) और उनके स्थानीय जल-क्लस्टर वातावरण सहित, एक सटीक और विस्तृत प्राप्त करने के लिए आवश्यक है उनकी जैविक गतिविधियों का चित्रण । 2

एक उच्च हाइड्रेटेड राज्य के भीतर और विकास के लिए मौजूद है । इस तरह के समय की उड़ान माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (तोफ-SIMS) निर्वात में अस्थिर तरल पदार्थ का अध्ययन करने में कठिनाई के कारण के रूप में वैक्यूम आधारित सतह विश्लेषण तकनीकों का उपयोग करने में एक बड़ी चुनौती प्रस्तुत करता है । नतीजतन, वैक्यूम आधारित सतह विश्लेषण तकनीक केवल उनके सूखे राज्य में फिल्म के नमूनों का अध्ययन करने के लिए लगभग विशेष रूप से सीमित किया गया है । हालांकि, इसके सूखे राज्य में एक जैव फिल्म का अध्ययन अपने सच्चे जैविक microenvironment की सही जांच को रोकता है । यह अक्सर EPS अखंडता और बायोमास फिल्म आकृति विज्ञान, जो सूखी फिल्म जन वर्णक्रम के लिए सीटू तरल अध्ययन के परिणाम की तुलना के बाद प्रदर्शन किया गया है के लिए कठोर परिवर्तन का कारण बनता है । 3 , 4 यह लेख तरल वैक्यूम इंटरफेस (सालवी),5,6 एक microfluidic रिएक्टर में विश्लेषण के लिए हमारी प्रणाली के उपयोग को रोजगार के द्वारा अपने प्राकृतिक हाइड्रेटेड राज्य के भीतर का अध्ययन करने के लिए एक समाधान प्रस्तुत करता है कि एक polydimethylsiloxane (PMDS) के बने microchannel में अपनी पतली सिलिकॉन नाइट्राइड (पाप) झिल्ली के नीचे तरल होता है, इस प्रकार माध्यमिक आयन जांच बीम तक सीधी पहुंच प्रदान करते हुए अभी भी एक निर्वात के भीतर तरल मैट्रिक्स के संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने चैंबर. 7 , 8

एस oneidensis श्री-1 के लिए हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन एक्सप्रेस रूपांतरित (GFP) इस फिल्म प्रक्रिया के लिए एक मॉडल जीव के रूप में चुना गया था अपनी चयापचय बहुमुखी प्रतिभा और पर्यावरण और एप्लाइड माइक्रोबायोलॉजी, जो आधारित था में आम उपयोग के कारण चित्रण धातु की कमी और extracellular इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण के लिए अपनी अनूठी क्षमता पर भारी । 9 , 10 , 11 इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से आसान सतत फिल्म-मोटाई निगरानी के लिए अनुमति दी GFP की उपस्थिति, एक fluorescein isothiocyanate (FITC) फिल्टर का उपयोग कर. हमारे पिछले अध्ययनों से इस पाप का सबूत है operando प्रतिदीप्ति इमेजिंग में १०० micrometers तक की मोटाई के लिए फिल्म विकास के लिए छवि का उपयोग करने के लिए इस बैक्टीरिया के पक्ष में4 , 12 जबकि इस पत्र में केवल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से फिल्म की उपस्थिति की पुष्टि के बारे में चर्चा करेंगे, सालवी सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग (यानी, संरचित रोशनी के रूप में अन्य ऑप्टिकल इमेजिंग तरीकों के साथ संगत है माइक्रोस्कोपी (सिम)9) और फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) इमेजिंग4) । ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए फिल्म की मोटाई मापने की सेवा कर सकते हैं, और की एक 3d छवि प्राप्त, के रूप में यह प्रकट होता है, इसकी मोटाई और पाप खिड़की के लिए अपने लगाव की पुष्टि के रूप में इस फिल्म के आकार । 9 जबकि GFP SIMS विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया था, GFP के बिना एस oneidensis विकास वक्र के लिए इस्तेमाल किया गया था, ऑप्टिकल घनत्व के इस ही आवश्यक माप के रूप में और किसी भी फ्लोरोसेंट इमेजिंग की आवश्यकता नहीं थी । आम तौर पर, GFP टैग और विकास वक्र में untagged प्रजातियों के बीच का अंतर नगण्य है । साथ ही, जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है S. oneidensis MR-1 GFP प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में, इस कार्यविधि को किसी भी जीवाणु तनाव कि सालवी के भीतर खेती के लिए आवश्यक हो सकता है के लिए डिज़ाइन किया गया हालांकि, बैक्टीरियल तनाव की जरूरत का ज्ञान दिया, जैसे समय, तापमान, और ऑक्सीजन पर्यावरण के रूप में कुछ वृद्धि की स्थिति के लिए बैक्टीरिया का तनाव को समायोजित संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है इस्तेमाल किया जाएगा । विकास माध्यम के लिए, इस प्रक्रिया का उपयोग करता है "nanowires" मध्यम, tryptic सोया शोरबा (TSB) के बिना डेक्सट्रोज, और tryptic के लिए डेक्सट्रोज सोया आगर (TSA) संवर्धन । "nanowires" माध्यम की संरचना विशेष रूप से विकास के लिए तैयार की गई है और झिल्ली और periplasm के विस्तार की निगरानी के लिए है कि छोटे तारों के आकार लेने के लिए दिखाई देते हैं, और मध्यम संरचना किया गया है पिछले अनुसंधान के भीतर स्थापित । 13 , 14

हमारे पिछले प्रोटोकॉल पर सीटू तरल तोफ-सिम्स में लाभ सचित्र है कि सालवी को प्रोटीन स्थिरीकरण और पाप के लिए लगाव के लिए प्रस्ताव है, साथ ही साथ तोफ-SIMS विश्लेषण और डेटा में कमी पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल । 12 के बजाय डेटा में कमी कदम दोहराना, इस कागज के बजाय स्थापित करने और हमारे सालवी microchannel भीतर फिल्म की खेती के अनूठे दृष्टिकोण पर ध्यान केंद्रित की सेवा करेंगे, साथ ही इमेजिंग कदम से पहले के रूप में फिल्म की उपस्थिति और मोटाई का पता लगाने के लिए ते तोफ-सिम्स विश्लेषण. जबकि जैव फिल्म पहले केवल निर्वात-आधारित सतह विश्लेषणात्मक तकनीक के चैंबर के भीतर नमूनों सूखे के लिए सीमित किया गया है, विस्तृत EPS और लाइव फिल्म के जैव फिल्म रासायनिक मानचित्रण अब इस नई क्षमता की वजह से सीटू में प्राप्त किया जा सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. सामग्री की तैयारी

  1. मध्यम टयूबिंग
    1. सीरम की बोतलों की तैयारी (एक प्रति फिल्म संस्कृति की जरूरत है और तीन विकास वक्र प्रति आवश्यक)
      नोट: के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, किसी भी वृद्धि इस प्रक्रिया के लिए उपयोग किया जा सकता है ब्याज के जीवाणुओं के तनाव के लिए आवश्यक पोषक तत्वों प्रदान करने के लिए उपयुक्त माध्यम; इस मामले म, & #34; nanowires & #34; मीडिया और TSB बिना डेक्सट्रोज माध्यम का उपयोग एस oneidensis एमआर-1 GFP के विकास के लिए किया गया था । < सुप वर्ग = "xref" > १३
      1. जमा 20 मिलीलीटर की वृद्धि मध्यम १ ७० मिलीलीटर सीरम बोतल में, डाट कैप और बोतल समेटना । साफ बाँझ एल्यूमीनियम पंनी का एक टुकड़ा के साथ शीर्ष कवर.
      2. आटोक्लेव 30 मिनट के लिए एक तरल चक्र के साथ बोतल में १२१ & #176; C. इसके बाद, कमरे के तापमान पर निष्फल सीरम बोतल की दुकान ।
    2. Anaerobic संस्कृति ट्यूबों
      1. जमा 5 विकास माध्यम के एमएल एक Anaerobic कल्चर ट्यूब में एयर headspace के साथ, डाट पर रख दिया और बोतल समेटना । बाँझ पंनी के साथ शीर्ष कवर.
  2. तैयारी बुलबुला जाल टयूबिंग
    1. एक 22 गेज सुई का उपयोग कर, ध्यान से एक छेद एक सीरम की बोतल रबर डाट के माध्यम से पंच.
    2. कट 20 मे से 1/32 & #34; polytetrafluoroethylene (PTFE) एक रेजर के साथ टयूबिंग ऐसी है कि टयूबिंग के खंड के एक छोर बताया है ।
    3. बिंदु अंत का उपयोग कर, रबर डाट के शीर्ष भाग में छेद के माध्यम से PTFE टयूबिंग धागे । जब तक मोटे तौर पर 2 सेमी डाट के माध्यम से है और एक उस्तरा के साथ PTFE ट्यूब के बिंदु अंत में कटौती के माध्यम से ट्यूब पुश एक सपाट अंत है ।
    4. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के सवार को हटाने और सिरिंज के खुले अंत में कदम 1.2.3 से रबर डाट फिट. PTFE टयूबिंग के 2 सेमी अंत सिरिंज के बैरल के भीतर है । यह बुलबुला जाल है ।
    5. बुलबुला जाल लपेटो (PTFE टयूबिंग, रबर डाट, और सिरिंज) एल्यूमीनियम पंनी और आटोक्लेव टेप के साथ सुरक्षित के साथ कदम 1.2.4 में बनाया है । आटोक्लेव १२१ पर गुरुत्वाकर्षण चक्र के साथ टयूबिंग बंध्याकरण करने के लिए पन्ना पैकेज & #176; सी के लिए 30 मिनट के लिए तैयार कमरे के तापमान पर सील पन्नी पैकेज जब तक २.४ चरण में उपयोग के लिए ।
  3. बैक्टीरियल ग्रोथ वक्र
    नोट: इस प्रोटोकॉल सालवी में फिल्म को बढ़ाने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में oneidensis एमआर-1 का उपयोग करता है । हालांकि, इस प्रक्रिया के लिए अंय एरोबिक्स या anaerobically बढ़ बैक्टीरिया को समायोजित अनुकूलित किया जा सकता है । निर्भर करता है जो तनाव का उपयोग किया जाता है, विकास के समय और पर्यावरण तदनुसार समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
    नोट:-८० & #176; सी बैक्टीरियल फ्रीजर स्टॉक्स डेक्सट्रोज और ग्लिसरॉल के बिना TSB के एक 1:1 मिश्रण के शामिल थे । विकास वक्र उदाहरण < सबल वर्ग में दिखाया गया है = "xfig" > चित्रा 1 बी कोई TSB के साथ डेक्सट्रोज की एक स्टार्टर संस्कृति का उपयोग कर तैयार किया गया था, संबंधित ०.२ मिलीलीटर मात्रा में तीन बार ७० एमएल सीरम बोतलों के लिए 20 एमएल & #34; nanowires & #34; TSB के निशान हटाने के लिए मध्यम । हालांकि, यह प्रोटोकॉल मानता है कि केवल एक वृद्धि माध्यम का उपयोग किया जाएगा, और कि अनुवर्ती स्थानांतरण नहीं किए जाएंगे, क्योंकि यह S. oneidensis के लिए इन विशेष माध्यम समाधानों के साथ किया गया था । हालांकि इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित नहीं, इस तरह अतिरिक्त स्थानान्तरण शुरू में अमीर TSB के लिए बैक्टीरिया जमा के रूप में सिफारिश कर रहे हैं जमे हुए कोशिकाओं को ठीक करने में मदद करता है; और तीन बाद के स्थानान्तरण & #34; nanowires & #34; सुनिश्चित करता है कि सभी TSB गया है और कि ठेठ वृद्धि गतिशीलता उत्पंन हो रही है ।
    1. Inoculating स्टार्टर कल्चर
      1. से बैक्टीरियल ग्लिसरॉल स्टॉक निकालते हैं-८० & #176; सी फ्रीजर और शेयर को एक दस्ताने के साथ जितना जल्दी हो सके गल हाथ से गर्म करें । इस फ्रीजर स्टॉक को जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में ले जाएं ।
      2. बीएससी के भीतर
      3. , एक 22G के लिए फ्रीजर शेयर के ०.१ मिलीलीटर हस्तांतरण संलग्न सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें एक छाया हुआ और समेटना anaerobic संस्कृति कोई डेक्सट्रोज, 1.1.2 चरण में तैयार के साथ विकास के माध्यम से 5 मिलीलीटर युक्त ट्यूब । उचित जैविक अपशिष्ट कंटेनर में शेष फ्रीजर स्टॉक के निपटान, के रूप में ठंड फिर कोशिकाओं सदमे सकता है ।
      4. एक शेखर में स्टार्टर संस्कृति मशीन/30 & #176 पर १५० घुमाव प्रति मिनट (rpm) में और ६०० एनएम (आयुध डिपो ६०० ) में एक ऑप्टिकल घनत्व लेने के लिए जब उपयोग के लिए तैयार पढ़ सुनिश्चित करें । विकास और आयुध डिपो ६०० के समय रिकॉर्ड करें कि यह हर बाद के उपयोग के लिए एक ही समय में किया जा सकता है कि इस तरह के परिणाम प्रतिलिपि हैं । एक उदाहरण के रूप में, इस स्टार्टर संस्कृति के लिए 15 एच बढ़ने की अनुमति दी और लगभग १.०.
      5. के एक आयुध डिपो ६०० में इस्तेमाल किया गया था
    2. Inoculating ग्रोथ मीडियम
      1. स्टेप 1.1.1.2 में तैयार तीनों सीरम की बोतलों को लें, और स्टार्टर कल्चर को 1.3.1.3 में तैयार करें, और दोनों को बीएससी में लाएं ।
      2. बीएससी के भीतर
      3. , एक बाँझ 1 मिलीलीटर एक 22G सुई संलग्न के साथ सिरिंज का उपयोग कर, स्टार्टर संस्कृति से सीरम बोतलों में से प्रत्येक के लिए समाधान के ०.१ मिलीलीटर हस्तांतरण, क्रमशः.
      4. ७०% इथेनॉल के साथ सीरम की बोतलों के शीर्ष निष्फल और निष्फल एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर, लेबल उचित है, और एक मशीन के भीतर एक कक्षीय शेखर को हस्तांतरण । १५० rpm के लिए कक्षीय शेखर सेट और 30 & #176 के लिए मशीन सेट; C. जब तक पहली आयुध डिपो ६०० डेटा बिंदु लिया जाता है, चरण 1.3.3.
      5. के भीतर
    3. कयने के ओडी ६०० डाटा अंक
      1. जमा कर एक कोरा तैयार करते है १०० & #181; फिल्टर-निष्फल आसुत (DI) जल एक बाँझ cuvette में के एल । cuvette के शीर्ष के आसपास प्लास्टिक आयल फिल्म लपेटें ताकि पानी प्रदूषित नहीं होगा । कमरे के तापमान पर स्टोर । वृद्धि वक्र के लिए कोई भी डेटा पॉइंट्स डालने से पहले यूवी/विज़ Spectrophotometer के साथ इस रिक् त का प्रयोग करें cuvette और दबाकर & #34; blank & #34;.
        नोट: हर ४८ एच एक नया खाली गलत पढ़ने से बचने के लिए तैयार किया जाना चाहिए, के रूप में नियमित रूप से एक खाली जगह अच्छा अभ्यास है ।
      2. प्रत्येक ओडी के लिए
      3. ६०० डाटा पॉइंट पर, सीरम की बोतलों को मशीन से स्टेप 1.3.2.3 में तैयार करके निकाल दें और एक निष्फल बीएससी में ट्रांसफर करें । प्रत्येक सीरम बोतल से inoculated माध्यम के ०.१ मिलीलीटर ले और तीन अलग लेबल बाँझ cuvettes में जमा.
      4. के बाद, डालें cuvette में संस्कृति युक्त पराबैंगनी दृश्य (यूवी/विज़) Spectrophotometer और एक समय में आयुध डिपो ६०० एक पढ़ा है, और उस समय बिंदु के लिए सभी तीन रीडिंग रिकॉर्ड ।
        नोट: S. oneidensis एमआर-1 के लिए, डेटा अंक 1, 14, 28, ३२, ४१, ५७, ८१, और टीका के बाद १०५ एच में लिया गया था । जीवाणुओं के मृत्यु के चरण पूरे हो जाने पर वृद्धि पूर्ण होती है । इन बिंदुओं तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए अगर वहां विशेष रूप से विकास के समय और इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया बैक्टीरिया की प्रवृत्ति पर ज्ञान की कमी है । यदि वृद्धि की प्रवृत्ति के बारे में अनिश्चितता है, तो डेटा बिंदुओं को अधिक बार संग्रहीत किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, प्रत्येक तीन h के लिए पहले 12 h, प्रत्येक छह h के लिए क्रमिक ३६ h, पर 12 h अंतराल के लिए निंन १०० h, और 24 h अंतराल पर अंतिम १२४ h.
      5. के लिए
      6. का उपयोग कर आयुध डिपो ६०० डेटा अंक y-अक्ष के रूप में और समय के रूप में x-अक्ष, ग्राफ एक ग्राफिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक समय बिंदु के लिए मानक विचलन त्रुटि सलाखों के साथ लिया तीन अंक के औसत का एक वक्र । S. oneidensis MR-1 growth वक्र में प्रदर्शित किया जाता है < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 बी प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में.
      7. कदम 1.3.3.4 में तैयार ग्राफ का उपयोग कर, विकास वक्र के लॉग-चरण खंड की समय सीमा की पहचान । Shewanella के लिए, इस विकास के 12 और ३३ ज के बीच है; इसलिए यह आस्थगित किया जा सकता है कि विकास के 24 ज, Shewanella अपने प्रवेश के भीतर हो जाएगा विकास के चरण, यह मानते हुए कि बैक्टीरिया एक ही मीडिया और उपचार का उपयोग करने से पहले का उपयोग करें कि विकास वक्र के लिए इस्तेमाल किया गया था cultureed किया जाएगा.
< p class = "jove_title" > 2. संवर्धन द बैक्टीरिया

  1. दिन एक: Inoculating ने आगर प्लेट
    नोट: कार्यविधि का यह खंड एक agarose पीएलए के साथ उपयोग किया गया थाते एक कॉलोनी लेने के लिए, लॉग-चरण में इकाई (CFU) बनाने के बजाय तरल स्टार्टर विकास वक्र के लिए इस्तेमाल किया संस्कृति । यह एक ही वृद्धि की स्थिति को पुन: पेश करने के लिए ग्रहण किया जा सकता है, इस तथ्य के कारण कि डेक्सट्रोज बिना TSA इस्तेमाल किया गया था और बाद में & #34 का तबादला; nanowires & #34; विकास वक्र प्रक्रिया में मध्यम, और TSA एक ही तत्व है कि TSB शामिल है ।
    1. निकाल एस. oneidensis मिस्टर-1 GFPbacteria स्टॉक से-८० & #176; सी फ्रीजर और एक बर्फ की बाल्टी में जगह है, निष्फल बीएससी के अंदर इस बाल्टी जगह है ।
    2. बीएससी के भीतर
    3. , एक बाँझ 1 & #181 का उपयोग करें; L टीका पाश जमे हुए बैक्टीरिया स्टॉक की सतह परिमार्जन और टी लकीर एक agarose प्लेट की सतह के लिए पाश का उपयोग करने के लिए.
    4. प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ प्लेट के पक्षों को सील करने के बाद, प्लेट और एक 30 & #176 में स्टोर पलटना; सी मशीन 24 ज के लिए, जब तक व्यक्तिगत कालोनियों दिखाई देते हैं ।
  2. दिन दो: Inoculating सीरम की बोतल
    1. मशीन से प्लेट निकालकर बीएससी के अंदर खोल दें ।
    2. बीएससी के भीतर
    3. , DI water में ७०% इथेनॉल के साथ 1.1.1 कदम से एक तैयार सीरम की बोतल पर रबर डाट की सतह को साफ.
    4. आगर प्लेट से एक व्यक्ति CFU का चयन करें और, एक संलग्न 22 गेज सुई के साथ बाँझ सिरिंज का उपयोग कर, किसी भी पड़ोसी कालोनियों को छूने के बिना थाली से कॉलोनी को उखाड़ फेंक और की नोक के साथ माध्यम से कॉलोनी मिश्रण करने के लिए पर्याप्त विकास मीडिया जमा सुई.
      नोट: एक अकेले कॉलोनी का चयन किया जाना चाहिए कि प्लेट पर अन्य बैक्टीरिया से दूर पर्याप्त है, ऐसी है कि मध्यम किसी भी अन्य कॉलोनियों को छूने के बिना इस पर जमा किया जा सकता है.
    5. एक ही सिरिंज का उपयोग कर, प्लेट की सतह से तरल निकालने.
    6. सिरिंज के भीतर बाहर दोहन बुलबुले के बाद, सीरम की बोतल में तरल इंजेक्शन, और 30 के भीतर एक कक्षीय शेखर पर जगह & #176; सी 24 एच
      के लिए १५० rpm पर सेट नोट: बाहर सिरिंज के बुलबुले दोहन क्रम में सीरम बोतल को और अधिक ऑक्सीजन शुरू करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, बोतल के लिए और अधिक ऑक्सीजन शुरू करने के रूप में प्रयोगात्मक स्थितियों को बदलने और बैक्टीरिया के लिए विकास के समय के बीच निरंतरता को कम कर सकते हैं.
  3. दिन दो: की नसबंदी से सालवी Microchannel
    नोट: टयूबिंग प्रणाली की बांझपन को बढ़ावा देने के लिए, कदम है कि टयूबिंग और एक नया सिरिंज के साथ प्रतिस्थापन से सिरिंज अलग की आवश्यकता है बीएससी के भीतर किया जाना चाहिए । ऐसा करने के लिए, बस धातु सिरिंज धारक unपंगा लेना द्वारा सिरिंज पंप से सिरिंज अलग, और एक बाँझ बीएससी करने के लिए संलग्न टयूबिंग के साथ सिरिंज लाने. जब टयूबिंग प्रणाली प्रक्रियाओं में उल्लेख किया है, इस तरल जलाशय युक्त सिरिंज को संदर्भित करता है, PTFE टयूबिंग के लिए एक polyetheretherketon (तिरछी) इंजेक्टर के साथ संलग्न, ड्रिप कक्ष है, जो एक तिरछी सुई से जुड़ी फिटिंग है से जुड़ी सालवी प्रवेश टयूबिंग, साथ ही आउटलेट कंटेनर कि सालवी आउटलेट टयूबिंग के लिए बंद है ।
    1. एक नया सालवी डिवाइस का उपयोग करें और एक तिरछी नज़र फिटिंग और एक PTFE टयूबिंग के एक छोर पर इंजेक्टर देते हैं ।
      नोट: सालवी उपकरणों पिछले अनुसंधान और पेटेंट में विस्तृत डिवाइस निर्माण के बाद प्रत्येक प्रयोग के लिए ताजा तैयार कर रहे हैं । < सुप वर्ग = "xref" > ५ , < सुप वर्ग = "xref" > ६ , < सुप वर्ग = "xref" > ८ , < सुप वर्ग = "xref" > १५
    2. एक सिरिंज में ७०% इथेनॉल के 2 मिलीलीटर ले और सालवी पर झांकना फिटिंग करने के लिए कनेक्ट । एक सिरिंज पंप करने के लिए सिरिंज जोड़ने और एक बेकार बोतल के लिए सालवी के आउटलेट संलग्न करने के बाद, इथेनॉल DI पानी समाधान के लिए 20 & #181 पर सालवी के माध्यम से चलाने के लिए अनुमति; L/१.५ h.
    3. के लिए मिनट
    4. एक सिरिंज में निष्फल DI पानी की 4 मिलीलीटर ले और एक ही सालवी के प्रवेश करने के लिए कनेक्ट । सिरिंज को एक सिरिंज पंप से जोड़ने के बाद, पानी को 20 & #956 पर सालवी के माध्यम से चलाने के लिए अनुमति दें; L न्यूनतम 3 ज.
    5. के लिए/ एक बीएससी के भीतर
    6. , पन्ना 1.2.5 चरण में तैयार पैकेट खुला और TFE टयूबिंग के अंत करने के लिए 5 मिलीलीटर सिरिंज और बाँझ झांकना फिटिंग के अंत करने के लिए एक बाँझ तिरछी इंजेक्शन फिटिंग कनेक्ट. एक सिरिंज में बाँझ मध्यम के ~ 3 मिलीलीटर ले लो और TFE ट्यूब करने के लिए देते हैं । 5 मिलीलीटर ड्रिप चैंबर पलटना और, एक बाँझ सिरिंज का उपयोग, ड्रिप चैंबर में विकास माध्यम सुई जब तक यह 1 मिलीलीटर
    7. की कुल मात्रा तक पहुँचता है
    8. के अंत से कनेक्ट 5 मिलीलीटर सिरिंज ड्रिप चैंबर के प्रवेश करने के लिए सालवी.
    9. एक बाँझ सिरिंज में विकास माध्यम के 10 मिलीलीटर ले और ड्रिप टयूबिंग के प्रवेश करने के लिए कनेक्ट. सिरिंज को एक सिरिंज पम्प से जोड़ने के बाद, मीडियम को 20 & #181 पर सालवी के माध्यम से चलाने की अनुमति दें; L/मिनट 12 ज (या रातोंरात) के लिए । इन भागों सुरक्षित करने के लिए चिपकने वाला टेप का प्रयोग करें । पंनी या प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ आउटलेट बोतल कवर धूल कणों और उसमें निहित जीवों की संभावना को कम करने के लिए मध्यम दूषित । कैसे इस सेटअप दिखना चाहिए का एक विस्तृत चित्रण में पाया जा सकता है < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्रा १ एक .
      1. ड्रिप टयूबिंग ऊर्ध्वाधर होने की अनुमति है, जिसका अर्थ है कि सिरिंज पंप ड्रिप टेप के साथ सुरक्षित टयूबिंग के साथ एक ऊंचा सतह पर रखा जाना चाहिए, और नीचे एक सपाट सतह पर सुरक्षित सालवी के साथ ।
      2. 12 एच के लिए सालवी के माध्यम से मध्यम चलाने के लिए सुनिश्चित करें कि इथेनॉल के सभी निशान बैक्टीरिया के साथ inoculating से पहले microchannel और सालवी के टयूबिंग से हटा दिया गया है ।
      3. अतिरिक्त सुरक्षा के लिए
      4. , एक निष्फल पेट्री डिश के भीतर सालवी microchannel चैंबर रखने के लिए प्रवेश और आउटलेट टयूबिंग फिट कटौती पक्षों के साथ । इसके अतिरिक्त, इमेजिंग विश्लेषण करने से पहले पाप झिल्ली और चैनल की रक्षा करने के लिए खिड़की पर हमेशा टेप रखें.
  4. दिन तीन: टीका का सालवी Microchannel
    1. पूरे टयूबिंग प्रणाली को हटाने (ड्रिप अपशिष्ट बोतल से जुड़े सालवी के लिए जुड़े कक्ष से जुड़े सिरिंज) सिरिंज पंप से और इसे लाने के लिए एक निष्फल बीएससी । इसके अतिरिक्त, सीरम शीशी से कदम 2.2.5 से मशीन से निकालें और इसे लाने के लिए बीएससी ।
    2. ७०% इथेनॉल के साथ सीरम की बोतल डाट की सतह को साफ करने के लिए किसी भी संक्रमण को रोकने के लिए, और फिर एक बाँझ सिरिंज 22G सुई से बोतल से बैक्टीरिया के 4 मिलीलीटर निकालने के लिए उपयोग ।
    3. ड्रिप टयूबिंग के 5 एमएल चैंबर से सालवी अलग, और inoculated माध्यम से सीधे सालवी के प्रवेश के लिए सिरिंज कनेक्ट । एक बाँझ एल्यूमीनियम पंनी पैकेट के भीतर या बीएससी के भीतर ड्रिप टयूबिंग छोड़ दो ।
    4. के लिए 20 & #181 पर चलाने के लिए सिरिंज पंप करने के लिए सालवी और आउटलेट बोतल के साथ सिरिंज संलग्न; एल/3 के लिए मिनट लगाना सालवी के चैनल के लिए, में आदेश सालवी के भीतर समाहित तरल की कई मात्रा में परिवर्तन के लिए अनुमति देने के लिए ।
    5. बाद टीका, सिरिंज पंप से सालवी के साथ डिस्कनेक्ट और बीएससी के लिए ले आओ । कदम 2.4.3 से 5 मिलीलीटर ड्रिप चैंबर वापस सालवी के प्रवेश संलग्न करने के बाद, एक बाँझ सिरिंज में विकास माध्यम के 20 मिलीलीटर ले और ड्रिप टयूबिंग के प्रवेश करने के लिए देते हैं ।
    6. से संलग्न टयूबिंग लाने के लिए बीएससी से सिरिंज पंप करने के लिए और एक दर पर टयूबिंग के माध्यम से पारित करने की अनुमति मध्यम 2 & #181; L छह से दस दिनों के लिए मिनट, या जब तक प्रतिदीप्ति इमेजिंग (चरण 3 में चर्चा) के लिए अनुकूल दिखाई देने वाली फिल्म के विकास से पता चलता है तोफ-सिम्स विश्लेषण. ताजा माध्यम से फिर से भरना के रूप में यह विकास माध्यम की 10mL के साथ एक नया बाँझ सिरिंज भरने और पिछले विकास माध्यम से बाहर चला गया है के बाद सालवी को संलग्न द्वारा बीएससी के भीतर बाहर चलाता है.
      नोट: 2 & #181 पर टीका आरंभ करने के बाद; L/मिनट, प्रवाह दर कभी नहीं बढ़ाया जाना चाहिए या कम हो, प्रवाह की दर को बदलने के रूप में चैनल के भीतर कतरनी तनाव पैदा होता है और अलग से फिल्म । यह महत्वपूर्ण है कि इस प्रवाह की दर कभी नहीं बदला जाना चाहिए; इस के लिए तैयार करने के लिए, ~ 24 एच SIMS से पहले, ट्यूब बारीकी से निरीक्षण करने के लिए यकीन है कि वहां कोई बुलबुले इतना है कि कोई और अधिक मध्यम धक्का की जरूरत है बनाने के लिए ट्यूबिंग भर में एक तेज दर से ।
      1. microchannel में बुलबुले से बचें, क्योंकि वे चैनल के बाहर फिल्म धक्का कर सकते हैं । यह 5 मिलीलीटर ड्रिप टयूबिंग के नीचे के भीतर बुलबुले के सतर्क होना महत्वपूर्ण है जहां यह सालवी टयूबिंग को जोड़ता है । ताजा माध्यम तिरछी सुई के अंत में इंजेक्शन किया जा सकता है यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई हवा सालवी में मजबूर किया जाएगा ।
< p class = "jove_title" > 3. इस सालवी Microchannel के भीतर इस फिल्म की ऑप्टिकल इमेजिंग

  1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग
    नोट: इस प्रोटोकॉल के भीतर एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल Shewanella व्यक्त करने के लिए रूपांतरित हो जाता है GFP; जैसे, यह की आवश्यकता नहीं है दाग. यदि बैक्टीरिया को धुंधला करने की आवश्यकता है, यह हमेशा एक ही flowrate में किया जाना चाहिए ( जैसे , 2 & #181; L/मिनट) से बचने के लिए फिल्म टुकड़ी । इसके अतिरिक्त, जब कोशिकाओं पोषक तत्वों की उपलब्धता के बिना जाना है, वे अलग होगा । इसलिए, अगर किसी भी अतिरिक्त दाग की आवश्यकता है, दाग के बजाय विकास मध्यम करने के लिए इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं दाग की आपूर्ति से पहले किया जाना चाहिए ।
    1. ने बीएससी के अंदर ड्रिप ट्यूबिंग से सालवी को बाहर निकालकर सालवी को तिरछी फिटिंग से पंगा लेकर अनामिका-तिरछी नज़र से कस कर यूनियन को बंद कर दिया ।
    2. एक गिलास स्लाइड पर सुरक्षित रूप से सालवी microchannel चैंबर के टयूबिंग टेप, इस तरह कि खिड़की पूरी तरह से सपाट है और ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है । विंडो से सुरक्षात्मक टेप निकालें । मंच पर मंच clamps के बीच गिलास स्लाइड रखकर माइक्रोस्कोप की अवस्था के लिए स्लाइड दबाना.
    3. कि सालवी के शीर्ष 10x उद्देश्य है, जहां ध्यान के समायोजन लेंस खिड़की को छूने के लिए कारण नहीं होगा के अंत करने के लिए पर्याप्त करीब तैनात है माइक्रोस्कोप की अवस्था कम ।
    4. backlight पर स्विच और ध्यान का समायोजन करके 10x माइक्रोस्कोप उद्देश्य का उपयोग कर चैनल पाते हैं. इस समय, सुनिश्चित करें कि सालवी के पाप खिड़की के जीवाणु लगाव की उपस्थिति कोई inoculated बैक्टीरिया के साथ एक नियंत्रण चैनल की खिड़की की तुलना में स्पष्ट है । कक्षों के करीब इमेजिंग के लिए, 20x उद्देश्य पर स्विच करें । जब एक खाली सालवी चैनल की तुलना में, खिड़की से जुड़े बैक्टीरिया की उपस्थिति एक मजबूत हरी प्रतिदीप्ति होना चाहिए ।
    5. बंद backlight बारी और माइक्रोस्कोप बुध स्रोत पर बारी । 2-3 मिनट रुको और देखने के लिए और खिड़की से जुड़ी फिल्म की छवियों पर कब्जा करने के लिए माइक्रोस्कोप पर सेट FITC फिल्टर करने के लिए स्विच । एक उदाहरण के रूप में परिपक्व फिल्म के लिए तैयार है जब की तरह दिखेगा, < मजबूत वर्ग का उल्लेख = "xfig" > चित्रा १ .
    6. पारा स्रोत बंद करें और स्लाइड से सालवी अलग । यदि आवश्यक हो, तो 2 & #181 के लिए अनुलग्न करें; L/न्यूनतम मध्यम प्रवाह एक बार फिर इमेजिंग से पहले अधिक वृद्धि के लिए अनुमति देने के लिए फिर से, या के लिए माध्यमिक रोकथाम का उपयोग करने के लिए सालवी स्थानांतरित तोफ-SIMS विश्लेषण । यह जरूरत है अगर इस फिल्म की मोटाई काफी मोटी नहीं है, और विकास के लिए और अधिक समय के लिए आवश्यक है कि तोफ-SIMS विश्लेषण से पहले की आवश्यकता है । मध्यम प्रवाह को एक बार फिर से अनुलग्न करने के लिए, चरण 2.3.6 का संदर्भ लें ।
      नोट: यदि मध्यम प्रवाह के तहत वापस डाल, प्रतिदीप्ति इमेजिंग फिर से किया जाना चाहिए तोफ-SIMS विश्लेषण से पहले ।
      1. ने फिल्म विकास माध्यम को इसे तोफ तक खिला दिया-सिम्स एनालिसिस आयोजित किया जा सकता है. अनुशंसित नहीं, यदि आवश्यक हो, तो बंद सालवी 4 & #176; सी रात भर के भीतर संग्रहित किया जा सकता है, लेकिन तोफ-SIMS के निर्वात चैंबर में डालने से पहले कमरे के तापमान को गर्म करने की अनुमति दी जानी चाहिए । हालांकि, फिल्म की टुकड़ी को कम करने के लिए मध्यम प्रवाह से अलग होने के तुरंत बाद इसका विश्लेषण करें ।
< p class = "jove_title" > 4. तोफ-सिम्स डाटा अधिग्रहण

< p class = "jove_content" > नोट: यह खंड एक सिंहावलोकन के रूप में कार्य करता है, और अधिक विस्तार में हमारे पहले adsorbed प्रोटीन अणु तरल SIMS विश्लेषण का वर्णन प्रोटोकॉल के भीतर चर्चा की है । < सुप वर्ग = "xref" > 12

  1. स्थापित सालवी को तोफ-सिम्स Loadlock चेम्बर
    नोट: दस्ताने हर समय पर पहना जाना चाहिए जब सालवी डिवाइस हैंडलिंग और यह तोफ-SIMS मंच पर सतह के दौरान संभावित संदूषण से बचने के लिए स्थापित विश्लेषण. मंच पर
    1. माउंट सालवी और कई शिकंजा के साथ इसे ठीक । सुनिश्चित करें कि पाप खिड़की पेंच जकड़न समायोजन और PDMS microchannel चैंबर के तल पर सिलिकॉन वेफर टुकड़े डालने के द्वारा फ्लैट है । खिड़की से सुरक्षात्मक टेप निकालें, तो तोफ-SIMS loadlock चैंबर में मंच लोड ।
    2. खुला तोफ-सिम्स loadlock, पकड़ और मंच लोड हो रहा है मंच पर क्षैतिज सेट, और loadlock दरवाजा बंद । वैक्यूम पंप आरंभ करें और यह सुनिश्चित करने के लिए प्रतीक्षा करें कि उपयुक्त वैक्यूम पहुंच गया है ।
    3. मुख्य चैंबर में सालवी कदम एक बार निर्वात 1x10 के लिए स्थिर है-7 mbar.
  2. गहराई profiling और डेटा अंक एकत्रित
    1. तोफ-सिम्स में सुसज्जित ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर microfluidic चैनल खोजें ।
    2. डेटा प्राप्ति से पहले धनात्मक या ऋणात्मक मोड का चयन करें । सभी माप में प्राथमिक आयन बीम के रूप में 25 कीव द्वि 3 + बीम का प्रयोग करें, और सभी माप के दौरान सतह चार्ज को बेअसर करने के लिए इलेक्ट्रॉन बाढ़ बंदूक का उपयोग करें ।
    3. स्कैन १५० एनएस पल्स चौड़ाई के साथ द्वि 3 + बीम के व्यास के साथ एक गोल क्षेत्र पर ~ 2 & #181; m ६४ पिक्सल के साथ ६४ पिक्सल के संकल्प के साथ. १०० एनएम सिन विंडो के माध्यम से छिद्रण के बाद, एक और १५० एस के लिए स्कैन करने के लिए इमेजिंग के लिए उच्च तीव्रता डेटा इकट्ठा जारी है । पंच के माध्यम से के बाद, गिनती काफी गहराई से रूपरेखा क्षेत्र के भीतर वृद्धि होगी । स्थिर करने के बाद, यह उच्च तीव्रता वाले क्षेत्र के रूप में संदर्भित किया जा सकता है ।
    4. बेहतर जन संकल्प के साथ स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए डेटा संग्रह के लिए ५० ns के लिए पल्स चौड़ाई कम करें । के बारे में एक और २०० एस
    5. के लिए इस अधिग्रहण जारी
    6. तीन धनात्मक और तीन ऋणात्मक डेटा बिंदुओं को एकत्रित करने के लिए इन चरणों को दोहराएं ।
      नोट: स्थान के लिए सुनिश्चित हो पंच-क्षेत्रों के माध्यम से ऐसी है कि पाप खिड़की तोड़ नहीं होगा और समझौता खिड़की अखंडता से निर्वात के चैंबर में रिसाव ।
< p class = "jove_title" > 5. तोफ-सिम्स डाटा एनालिसिस

  1. मास अंशांकन प्रयोग IonToF लागेको
    1. तोफ-सिम्स (माप एक्सप्लोरर) का विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और फिर क्लिक करें & #34;p rofiles & #34;, & #34; स्पेक्ट्रा & #34; व & #34; image & #34; बटन, क्रमशः, गहराई प्रोफ़ाइल, m/z स्पेक्ट्रम, और छवि डेटा की प्रक्रिया के लिए ।
    2. को तोफ में प्राप्त डेटा फाइल्स को खोलना-सिम्स डाटा अधिग्रहण.
    3. ब्याज की गहराई profiling डेटा का चयन करें और स्पेक्ट्रा गहराई प्रोफ़ाइल लौकिक श्रृंखला के अनुसार पुनर्निर्माण ।
    4. प्रेस & #34; F3 & #34; को खोलने क & #34; जन अंशांकन & #34; window. विशिष्ट नमूना में मौजूद होने की उम्मीद कर रहे हैं, जो रासायनिक यौगिकों के आधार पर अंशांकन के लिए चोटियों का चयन करें.
  2. ब्याज चयन की चोटियों
    1. पीक चयन के रूप में नमूना विश्लेषण के लिए आवश्यक है, साहित्य या अन्य पिछले निष्कर्षों के अनुसार नमूने की विशेषता चोटियों का निर्धारण, यदि कोई हो. एम/जेड स्पेक्ट्रा में ब्याज की चोटियों की तीव्रता की तुलना करें । यदि आवश्यक हो, तो नई चोटियों जोड़ें या पीक सूची में हस्तक्षेप चोटियों को हटाएँ ।
    2. एक चोटी पर क्लिक करें, बाईं नीचे खिड़की पर लाल लाइनों लगता है । पूरे शिखर को बंद करने के लिए लाल रेखाओं को खिसकाएं ।
    3. मुख्य स्पेक्ट्रम विंडो में रासायनिक सूत्र मिलान एक चोटी का चयन करें, और फिर क्लिक करने के लिए & #34; जोड़ें पीक & #34; बटन विंडो के ऊपर.
  3. निर्यात जन नपे दता
    1. एक पीक सूची निर्यात गर्न, म & #34;P eak सूची & #34; menu, चय & #34; Save & #8230; & #34; द पीक सूची म & #34; itmil & #34; स्वरुप.
    2. एक गहराई प्रोफ़ाइल निर्यात करने के लिए, म & #34;P rofile & #34; window पर क्लिक करें, & #34; फाइल & #34; मेनू पर, उसके बाद & #34 का चयन करें; निर्यात & #34;, और उसके बाद का चयन & #34; सेव as & #34; क & #34;. txt & #34; File.
    3. एक एम/जेड स्पेक्ट्रम फाइल निर्यात करने के लिए, म & #34; स्पेक्ट्रा & #34; विंडो पर क्लिक करें, & #34; file & #34; मेनू पर, उसके बाद & #34 का चयन करें; निर्यात & #34;, और उसके बाद का चयन & #34; Save as & #34; क & #34;. txt & #34; file.
    4. छवि फ़ाइल निर्यात करने के लिए, & #34; image & #34; विंडो, प्रिंट स्क्रीन और छवि फ़ाइल के रूप में सहेजें ।
< p class = "jove_title" > 6. तोफ-SIMS डेटा प्लॉटिंग और प्रस्तुति

  1. डेटा आयात करने के लिए ग्राफ़िक उपकरण का उपयोग करें.
  2. y-अक्ष को खंगाला गया स्पेक्ट्रम दिखाने के लिए x-अक्ष और पीक तीव्रता के रूप में m/z का उपयोग करके एक भूखंड बनाएं । एक उदाहरण < सुदृढ वर्ग में दिया गया है = "xfig" > चित्रा २ A .
  3. मिश्रण दो आयामी (2d) अलग एम के चित्र/z और फार्म का एक मैट्रिक्स या तो सकारात्मक या नकारात्मक आयन मानचित्रण दिखाने के लिए । एक उदाहरण < सुदृढ वर्ग में दिया गया है = "xfig" > चित्रा २ बी .

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Representative Results

ये प्रतिनिधि परिणाम दर्शाते हैं कि किस प्रकार संलग्न जैव फिल्म की रासायनिक रुपरेखा को पहचाना और समझा जा सकता है, जैसा कि तोफ-सिम्स के माध्यम से प्राप्त किया गया है. के बाद तोफ से मास स्पेक्ट्रा की साजिश करने के बाद-SIMS डेटा अधिग्रहण, प्रक्रियाओं खंड में संक्षेप में प्रकाश डाला, चोटी की पहचान के क्रम में आयोजित किया जाना चाहिए प्रत्येक संबंधित एम/ इस तरह के विभिंन जल समूहों, फैटी एसिड, और प्रोटीन टुकड़े के रूप में, अध्ययन बैक्टीरिया के भीतर मौजूद होने की उंमीद कर रहे है कि बैक्टीरिया और विशिष्ट रासायनिक टुकड़े पर व्यापक स्पेक्ट्रोमेट्री पर साहित्य की समीक्षा के माध्यम से किया जा सकता है । 16 , 17 , 18 , 19 , 20 इन प्रतिनिधि परिणाम केवल नकारात्मक मास स्पेक्ट्रा के रूप में एस oneidensis एमआर-1 और एक DI पानी नमूना द्वारा प्राप्त दिखा । सकारात्मक स्पेक्ट्रा की व्याख्या एक समान प्रक्रिया का पालन करें ।

चित्र 1 एक इस प्रोटोकॉल के अनुसार योजनाबद्ध सेटअप से पता चलता है जब सालवी microchannel में एक फिल्म की खेती । ऊपर छोड़ दिया पर, सिरिंज एक सिरिंज पंप से जुड़ा हुआ है, जो मध्यम PFTE टयूबिंग प्रणाली भर में और microchannel के भीतर एक निरंतर दर से बह रहता है. सिरिंज पंप ड्रिप चैंबर के ऊपर रखा जाता है, जो पिछड़े को प्रदूषित करने से रोकता है मध्यम जलाशय को तैराकी से गतिशील जीवों को रोकने के लिए धारा । मध्यम ड्रिप चैंबर जलाशय से सीधे सालवी, जो microchannel के माध्यम से और एक सील आउटलेट बोतल को आउटलेट टयूबिंग के माध्यम से गुजरता है की PFTE टयूबिंग में बहती है । पाप खिड़की से बिंदीदार लाइनों बिंदु एक परिपक्व एस oneidensis एमआर-1 GFP कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कब्जा कर लिया, ३.१ कदम में विस्तृत की एक छवि के लिए । चित्र 1 बी एक विकास वक्र के एक उदाहरण से पता चलता है इस प्रोटोकॉल, एस oneidensis एमआर-1 के लिए मॉडल जीव का उपयोग कर स्थापित किया । इस ग्राफ में वृद्धि के चरणों से यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि विकास का लाग-चरण इन विशिष्ट खेती की स्थितियों में 15-32 ज के बीच होता है. इस ग्राफ से अतिरिक्त जानकारी से पता चलता है कि 0-15 एच विकास के अंतराल चरण है, और 33-105 एच विकास के स्थिर चरण का प्रतिनिधित्व करता है । चित्र 1 C एक परिपक्व फिल्म का एक उदाहरण दिखा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ अधिग्रहीत छवि है ।

चित्र 2 एक microfluidic चैनल के भीतर एक हाइड्रेटेड एस oneidensis एमआर-1 फिल्म के नकारात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रा दिखाता है, के रूप में सीटू तरल तोफ-SIMS में द्वारा प्राप्त की । इस ग्राफ का एक उदाहरण से पता चलता है चयनित मास रेंज (m/z 100-350) के बीच की तुलना एस oneidensis एमआर-1 और DI पानी, बाद एक प्रणाली नियंत्रण के रूप में प्राप्त किया गया । चित्र 2 बी श्री-1 में ब्याज की चोटियों के 2d छवियों की तुलना प्रदर्शित करता है फिल्म और DI पानी तोफ-SIMS द्वारा प्राप्त की । एक बार दिलचस्प एम/z मूल्यों का अध्ययन से पहचाना जा सकता है मास स्पेक्ट्रा, एम/जेड मूल्यों के संभावित चोटी पहचान ठीक से रासायनिक टुकड़ों को जिंमेदार ठहराया, के रूप में IonToF SIMS सॉफ्टवेयर पुस्तकालय और साहित्य सर्वेक्षण द्वारा समर्थित है । चित्रा 2में ब्याज की चोटियोंएक पानी क्लस्टर्स शामिल (यानी, m/z १०७ (ज2ओ)5oh-, १२५ (एच2ओ)6ओह-, १४३ (एच2ओ)7oh-, १६१ (एच2 o)8ओह-, १७९ (एच2ओ)9ओह-, १९७ (h2o)10ओह-, २१५ (h2O)11ओह-, २३३ (h2o)12ओह-, २५१ (एच2ओ) 13 ओह-, २६९ (एच2ओ)14ओह-, २८७ (एच2ओ)15ओह-, ३२३ (एच2ओ)17ओह-, ३४१ (एच2ओ)19ओह-))9, के रूप में संबंधित चोटियों के ऊपर लाल रेखाओं द्वारा चिह्नित, कोरम संवेदन संबंधित यौगिकों (अर्थात, m/z १७५ c10h92-), EPS शोधकार्य (m/z १२३ c2h4पीओ4-, १५९ P 28एच-, २१६ सीआर27-, २८५ octadecanoethiols, ३२५ ध्रुवीय यौगिकों, सी12 ध्रुवीय यौगिकों)15,16,18, और फैटी एसिड चेन टुकड़े (यानी m/z १२७ [C2H3(CH2)3सीओओ]-, २५५ C16:0 फैटी एसिड, २७९ linoleic एसिड, सी18एच312-, ३२५ सी21एच४०2 -, ३४१ सतह लिपिड, 18-मेे बंधे के माध्यम से thioester लिंकेज, stearic एसिड सी18एच३५2-, आयनों की monoacylglyceryls के palmitic एसिड सी19एच176 -). 16 , 19

चूंकि यह फिल्म हाइड्रेटेड है, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि कुछ चोटियों पर फिल्म के नमूने में देखा DI पानी में पाए जाने वाले लोगों के समान हैं । ये वाटर क्लस्टर चोटियों चित्रा 2में प्रत्येक चोटी के ऊपर एक लाल रेखा के साथ चिह्नित कर रहे हैं, सहित m/z १०७, १२५, १४३, १६१, १७९, १९७, २१५, २३३, २५१, २६९, २८७, ३२३, और ३४१ और इसी को (एच2ओ)5OH- (एच2ओ) ओह- (एच2ओ)7ओह- (एच2ओ)8ओह- (एच2ओ)9ओह- (h2o)10ओह- (h2 o)11ओह- (h2o)12ओह- (h2o)13ओह- (h2o)14ओह- (h2o)15ओह- (एच2ओ)17ओह- (एच2ओ)19ओह-, क्रमशः । 9 के रूप में इस बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम में कई विशेषता जल समूहों की व्यापकता है, इस परिणाम एक हाइड्रेटेड जैव फिल्म में मौजूद रासायनिक जल क्लस्टर पर्यावरण का एक मजबूत सबूत प्रदान करता है । साथ ही, गैर-जल क्लस्टर संबंधित चोटियों दोनों स्पेक्ट्रा में मनाया आमतौर पर PDMS, microfluidic चैनल के एक घटक से, आमतौर पर हस्तक्षेप चोटियों के रूप में जिंमेदार ठहराया जा सकता है । उदाहरण के लिए, PDMS से एक आम ज्ञात हस्तक्षेप चोटी नकारात्मक आयन मोड में एम/जेड १३७ है ।

जब कि di पानी के लिए, के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, कुछ चोटियों di पानी में मौजूद नहीं हैं, अभी तक वे इस फिल्म में प्रदर्शित करने के लिए कि बायोमास फिल्म SIMS मास स्पेक्ट्रा की तुलना । उदाहरण के लिए, चोटी पर m/z २५५ ([ch3(ch2)14सीओओ]-, palmitic एसिड) में उच्च तीव्रता पर मौजूद है इस फिल्म का नमूना है, लेकिन DI पानी के नमूने में बिल्कुल नहीं । यह सुझाव है कि संकेत सीome से इस फिल्म में, सबसे अधिक संभावना है कि इस फिल्म और/ चित्रा 2में कई रोचक चोटियों की पहचान की गई । उदाहरण के लिए, EPS संबंधित चोटियों m/z १२३ शामिल हैं-, पाया ग24पो4-, १५९ (पी28एच-), २१६ (सीआर2O7-), २८५ (octadecanoethiols), और ३२५ (ध्रुवीय यौगिकों, सी 12 ध्रुवीय यौगिकों) । 17 , 18 , फैटी एसिड से जुड़ी 20 चोटियों १२७ ([सी2एच3(CH2)3सीओओ]-) होना पाया गया, २५५ ([ch3(ch2)14सीओओ]-, palmitic एसिड), २७९ ([ch3 (CH2)15सीओओ]-, linoleic अम्ल), ३१७ (सी21एच३३2-), ३२५ (सी21एच४०2-), और ३४१ (भूतल लिपिड, 18-मेे बंधे के माध्यम से thioester लिंकेज, stearic एसिड सी18एच३५2-, आयनों के monoacylglyceryls के palmitic एसिड सी19एच176-). 16 , 19 अंत में, एक क्विनोलोन संकेत कोरम संवेदन संकेत संबंधित चोटी के सी10एच9NO2- एम/जेड १७५ पर मनाया गया ।

चित्र 2 बी एस oneidensis एमआर-1 फिल्म (शीर्ष पंक्ति) और DI पानी (नीचे पंक्ति) के बीच चार अलग दिलचस्प आयनों के वितरण के 2 डी छवियों को प्रदर्शित करता है । m/z मान १०७ ((एच2ओ)5ओह-) नमूनों के भीतर महत्वपूर्ण तीव्रता का एक पानी क्लस्टर से पता चलता है, m/z मान १७५ (C10H9NO2-) एक कोरम संवेदन संबंधित संकेत दर्शाया गया है, m/z २५५ एक फैटी एसिड है([ch3(ch2)14सीओओ]-, palmitic एसिड), और m/z ३४१ (सी21एच४१2) 1 एएमयू जन सटीकता के कारण लिपिड टुकड़े और पानी समूहों दोनों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । 9 उज्ज्वल 2d चित्रों के क्षेत्रों में आणविक आयन की छवि में मौजूद एक उच्च गिनती का संकेत मिलता है । के रूप में की उंमीद है, QS यौगिक के लिए संकेत है, और लिपिड अब तक की मात्रा में अधिक से अधिक थे के भीतर फिल्म नमूना । जबकि पानी क्लस्टर के लिए संकेत (एम जेड १०७) मजबूत था भर में फिल्म के नमूने, यह भी DI पानी के नमूने में मौजूद था, के रूप में की उंमीद है । अंत में, एम/जेड ३४१ में संकेत करने के लिए किया गया था सजातीय के भीतर फिल्म नमूना है, लेकिन बहुत ही कमजोर DI पानी के नमूने के भीतर । जबकि एम/जेड ३४१ एक जल क्लस्टर पीक था, यह भी कई अलग फैटी एसिड और सतह लिपिड के प्रतिनिधि था । 16 डेटा के सामांय होने के बाद इस फिल्म के नमूने के भीतर अपनी मजबूत उपस्थिति से पता चलता है कि लिपिड टुकड़े की उपस्थिति दूर पानी समूहों की उपस्थिति का वजन ।

Figure 1
चित्र 1 : प्रायोगिक योजनाबद्ध । (A) यह प्रयोगशाला के भीतर प्रकट होता है के रूप में फिल्म सेटअप के प्रायोगिक योजनाबद्ध प्रदर्शित करता है । ऊपर छोड़ दिया पर शुरू, मध्यम सिरिंज (1), जो सिरिंज पंप (2) से जुड़ा हुआ है से बहती है, जिस पर तरल के माध्यम से चलता है दर को नियंत्रित करने । तीर पूरे सिस्टम में प्रवाह दिशा का संकेत देते हैं । सिरिंज (1) TFE टयूबिंग (4) के लिए एक तिरछी इंजेक्टर फिटिंग (3) के माध्यम से जुड़ा हुआ है । मध्यम एक ड्रिप चैंबर (5) के माध्यम से संक्रमण से बचने के लिए बहती है, और अंततः सालवी (6) के माध्यम से सील आउटलेट कंटेनर (7) के लिए चलता है । सिरिंज पंप एक ऊंचा सतह पर तैनात (9) ऐसी है कि ड्रिप चैंबर (5) सपाट सतह (8) के लिए सीधा किया जा सकता है कि सालवी (6) पर रखा गया है । (B) "nanowires" माध्यम में Shewanella oneidensis एमआर-1 के लिए वृद्धि वक्र । समय 0-15 h अंतराल चरण का प्रतिनिधित्व करता है, समय 15-33 h लॉग चरण का प्रतिनिधित्व करता है, समय 33-105 h स्थिर चरण का प्रतिनिधित्व करता है, और समय १०५ h या अब मृत्यु चरण का प्रतिनिधित्व करता है । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । () प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ अधिग्रहीत एक परिपक्व फिल्म का चित्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : की तुलना तोफ-SIMS नकारात्मक स्पेक्ट्रा के हाइड्रेटेड Shewanella oneidensis फिल्म और श्री-1 मध्यम में सालवी microchannel । () m/z सिम्स मास स्पेक्ट्रा के Shewanella oneidensis में श्री-1 मध्यम और DI पानी । बाद में एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । लाल रेखाएं विशेषता जल क्लस्टर चोटियों के स्थानों को इंगित करती हैं । () 2 डी छवि के बीच ब्याज की चोटियों की तुलना फिल्म और DI पानी । बाएं से दाएं, छवियां एक जल क्लस्टर (m/z १०७ (H2O)5OH-) प्रदर्शित करते हैं, एक कोरम संवेदन/हार्मोन सिग्नल (एम/जेड १७५, सी10एच9NO2-), एक फैटी एसिड (m/z २५५, [ch3(ch 2)14सीओओ]-, palmitic एसिड), और सतह लिपिड/EPS टुकड़े (एम/जेड ३४१, 18-विदेश मंत्रालय, सी21एच४१2-) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

लॉग-चरण में inoculating के बाद, यह महत्वपूर्ण है कि दिन और तापमान की संख्या का परीक्षण करने से पहले यह स्वस्थ है और इमेजिंग के लिए काफी मोटी है, जैसा कि चरण ३.१ में वर्णित है विकसित करना चाहिए । इस प्रक्रिया को विशेष रूप से कमरे के तापमान पर संवर्धन ए एस oneidensis MR1 फिल्म कवर; हालांकि अलग कमरे के तापमान में वृद्धि की दर को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए, यह समझने के लिए ऑप्टिकल इमेजिंग का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है कि क्या तोफ-सिम्स विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने से पहले फिल्म तैयार है । इसी तरह, बैक्टीरिया के विभिंन उपभेदों विभिंन विकास की स्थिति और लंबाई की आवश्यकता के लिए विश्लेषण के लिए एक वांछनीय मोटाई प्राप्त । जबकि चित्रा 1b में वृद्धि वक्र बैक्टीरिया के प्रवेश चरण २०० को दर्शाया 12-32 ज हो, और इस प्रक्रिया के दौरान 24 घंटे में इस्तेमाल किया गया था, यह ध्यान दें कि इस समय के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है महत्वपूर्ण है लॉग-चरण के रूप में वृद्धि की स्थापना के बिना बैक्टीरिया के अंय उपभेदों के लिए स्वतंत्र. जबकि लॉग चरण 12 से ३३ के बीच था और एस oneidensis के लिए विकास के एच, 24 एच तथ्य यह है कि यह जहां ऑक्सीजन के विकास दर को सीमित करने के लिए शुरू किया गया था विकास के हिस्से में था के कारण चुना गया था, के अंत की दिशा में लॉग-चरण । प्रयोगों से पता चला है कि इस समय कोशिकाओं को nanowires उत्पादन शुरू किया था, इस प्रकार के लिए सफल है कि कम ऑक्सीजन के वातावरण में जीवित रह सकता है फिल्म के रूप में प्रधानमंत्री । 3 , 13 नतीजतन, लॉग चरण के दौरान बैक्टीरिया का उपयोग करने के लिए चुना समय अनुसंधान अनुभव और ज्ञान से प्रभावित होना चाहिए अध्ययन किया जा रहा बैक्टीरिया के प्रायोगिक अध्ययन पर साहित्य से प्राप्त की । इसके अतिरिक्त, एक अलग विकास वक्र बैक्टीरिया के सभी अलग उपभेदों है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग कर फिल्म विकास के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के लिए लॉग चरण समझ स्थापित किया जाना चाहिए । 2 µ l/मिनट की वृद्धि दर की गणना की गई ताकि अधिकतम विकास दर को एस oneidensis एमआर-1 से अधिक न किया जा सके, और कुल समय को एक परिपक्व ऐसी फिल्म प्राप्त करने के लिए चुना गया जो ऊंचा और अलग होने की संभावना नहीं थी । इन दरों के अनुसार अलग बैक्टीरिया के ज्ञान के लिए समायोजित किया जा सकता है इस स्थापना के साथ इस्तेमाल किया जाएगा ।

फिल्म विकास के लिए सालवी का उपयोग करने के लिए कुछ सीमाएं चैनल के भीतर भी शामिल है और साथ ही बैक्टीरिया की संभावना है कि चैनल के फ्लैट दीवारों को संलग्न करने के लिए । एक निरंतर दर पर वृद्धि के बावजूद, इस प्रोटोकॉल के भीतर 2 µ l/मिनट होने की सिफारिश की, अब भी हो सकता है अगर इस फिल्म के लिए बहुत लंबे समय के लिए विकसित करने की अनुमति दी है जमता । ऐसी स्थिति में और बिना किसी चेतावनी के, इस फिल्म खिड़की से अलग कर सकते है और दुकान को शामिल करने के लिए सालवी से बाहर निकलें । केवल यांत्रिक शक्ति (अर्थात, गतिमान) सालवी को जोड़कर भी उत्पन्न हो सकती है, जिसे टाला नहीं जा सकता. हालांकि, यह एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत तोफ-सिम्स विश्लेषण से पहले पाप खिड़की करने के लिए इस फिल्म के लगाव को देखने के द्वारा जांच में रखा जा सकता है । एक अंय सीमा PDMS microchannel की चिकनाई जो यह मुश्किल कुछ बैक्टीरिया के लिए संलग्न कर सकते है शामिल हैं । हालांकि, इस सालवी के डिजाइन में परिवर्तित किया जा सकता है चैनल को काटने का निशानवाला किनारों बनाने के द्वारा समायोजित करने के लिए, यदि बैक्टीरिया का लगाव एक मुद्दा है । अंत में, सेल गिनती विकास वक्र निर्धारण के लिए आयुध डिपो६०० रीडिंग के एवज में किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, अध्ययनों से ओडी६०० पठन के लिए कक्ष गणनाओं के प्रत्यक्ष और सुसंगत सहसंबंध दिखाए गए हैं । 21 इसलिए, आयुध डिपो६०० में फिल्म विकास का मूल्यांकन करने में पर्याप्त समझा जाता है ।

इस तकनीक के लिए सीमाएं कुछ हैं, के रूप में सालवी मूलतः एक संस्कृति डिश है जो कई अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए बहुत बहुमुखी प्रतिभा के रूप में कार्य करता है, जैसे एक दस्ताने बॉक्स के भीतर anaerobically, या किसी भी तापमान के भीतर पर्यावरण चैंबर नियंत्रित । कुछ मामूली सीमाओं के सापेक्ष आर्द्रता, तापमान, सूरज की रोशनी के पास स्थान है, जो अभी भी के लिए समायोजित किया जा सकता है, प्रत्येक विशिष्ट बैक्टीरिया इष्टतम विकास की स्थिति के लिए जैसे बेकाबू कमरे की स्थिति शामिल हैं । इसके अलावा, इन तकनीकी चुनौतियों में से कुछ एक मशीन के साथ तापमान या आरएच मध्यस्थता सुविधाओं के साथ एक फिल्म सेटअप में दूर किया जा सकता है ।

साळवी एक निर्वात-संगत microfluidic इंटरफेस है । इस काम में, एक २०० x ३०० µ एल microfluidic चैनल के लिए इस्तेमाल किया गया था संस्कृति को ऑप्टिकल और तरल SIMS इमेजिंग के साथ फिल्म के बाद । तरल पदार्थ वैक्यूम आधारित तकनीक का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए एक तकनीकी चुनौती मौजूद है, क्योंकि वे अस्थिर और वैक्यूम में तरल चरण में बनाए रखने के लिए मुश्किल हैं. इस प्रकार तोफ के रूप में वैक्यूम तकनीक-SIMS पारंपरिक रूप से केवल शुष्क और क्रायोजेनिक नमूनों के लिए प्रतिबंधित किया गया है । 22 इसके अतिरिक्त, सालवी विविध इमेजिंग और स्पेक्ट्रोस्कोपी माइक्रोस्कोपी और स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीकों की एक किस्म का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 4 , 9 हमारे समूह लगातार तरल पदार्थ और ठोस तरल इंटरफेस के सीटू विश्लेषण में विभिन्न सालवी अनुप्रयोगों का विस्तार करने के लिए काम किया है । 15 , 23 , 24 हमारे हाल ही के प्रयास को प्रभावी ढंग से पाप झिल्ली को बैक्टीरिया लगाव दिखाया गया है । 9 प्रारंभिक लगाव के बाद, समय के साथ मध्यम के नित्य प्रवाह को सफलतापूर्वक सालवी के पाप खिड़की पर सीधे एक फिल्म खेती करने के लिए दिखाया गया है । तोफ-SIMS के दौरान, प्राथमिक आयन बीम व्यास में 2 µm के छेद बौछार करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस आयाम को पाप खिड़की से जुड़ी जैव फिल्म की कोशिका लंबाई के समान है, इस प्रकार अपने स्वाभाविक रूप से हाइड्रेटेड microenvironment में फिल्म की एक रासायनिक प्रोफ़ाइल प्रदान करते हैं । यह बेहद महत्वपूर्ण है एक जैव फिल्म की रासायनिक पहचान के अंतर के कारण, EPS की उपस्थिति, और पानी के क्लस्टर पर्यावरण जब अपने हाइड्रेटेड राज्य में सूखे नमूनों के साथ जैव फिल्म की तुलना । 9 के उपयोग के बिना सालवी, तोफ-SIMS केवल शुष्क और क्रायोजेनिक नमूनों पर आयोजित किया जा सकता है, रासायनिक मानचित्रण जो अपनी प्राकृतिक हाइड्रेटेड राज्य में एक नमूना के रासायनिक प्रोफ़ाइल पर कब्जा करने में विफल रहता है प्रदान करते हैं ।

के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है, यह ड्रिप ट्यूबिंग के ऊपर सिरिंज पंप रखने के लिए ड्रिप टयूबिंग के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है कि सालवी microchannel के लिए सीधा हो । इसके अतिरिक्त, बुलबुले के लिए उपकरण की टयूबिंग के भीतर फंस बनने की संभावना कम हो जाएगा, अगर आउटलेट PFTE टयूबिंग (आउटलेट बोतल के भीतर) प्रवेश ट्यूबिंग (ड्रिप चैंबर से जुड़ी) से कम है । सालवी विकास के लिए बैक्टीरिया की खेती की एक और महत्वपूर्ण कदम पहले विशेष जीवाणु तनाव का एक विकास वक्र है कि इस्तेमाल किया जाएगा प्राप्त करने के लिए है, के रूप में १.३ कदम के भीतर वर्णित है । यह ऑप्टिकल घनत्व माप के साथ विकास घटता प्राप्त करने के द्वारा किया जा सकता है । एक विकास वक्र, जैसा कि चित्रा 1बीमें दिखाया गया है, समय सीमा है जिस पर बैक्टीरिया के प्रवेश के भीतर हो जाएगा समझने के लिए महत्वपूर्ण है विकास के चरण, जब यह माना जा सकता है कि बैक्टीरिया स्वास्थ्यप्रद हैं । विकास के इस चरण के भीतर बैक्टीरिया का उपयोग एक स्वस्थ फिल्म microenvironment के निर्माण की सुविधा और यह सुनिश्चित करता है कि इस फिल्म की उंमीद की दर से बढ़ेगी । सालवी microchannel ७०% इथेनॉल और DI पानी के साथ कमरे के तापमान में निष्फल है, क्योंकि यह तोफ-सिम्स के साथ प्रयोग करने से पहले नसबंदी के लिए autoclaved नहीं किया जा सकता । यह तथ्य यह है कि autoclaving दोनों सालवी की खिड़की को नुकसान पहुंचा सकता है और चैनल के लिए पानी भाप परिचय के कारण है । विकास के कई दिनों के बाद, microchannel प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ जांच की जानी चाहिए बैक्टीरियल लगाव को मांय करने के लिए । एक उदाहरण चित्रा 1सीमें पाया जा सकता है, इस छवि को एक परिपक्व फिल्म दिखाने के लिए लिया गया था । मध्यम के प्रवाह पथ के कारण, बैक्टीरिया और अधिक अनुकूल है और microchannel के किनारों के साथ बढ़ता है, के रूप में इस स्थान है जहां प्रवाह और कतरनी-बलों lowes हैटी.

संक्षेप में, सालवी एक उत्कृष्ट विधि है जिसके लिए संस्कृति और अध्ययन करने के लिए सीटू रासायनिक मानचित्रण में उपयोग कर फिल्म, के रूप में यह अपने प्राकृतिक हाइड्रेटेड राज्य में रहने वाले जैव फिल्म प्रदान करने के लिए निर्वात आधारित इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए अनुमति देता है । यह अनूठा दृष्टिकोण एक फिल्म के वाटर क्लस्टर microenvironment के बारे में अधिक जानकारी प्रदान कर सकता है, साथ ही इसके ईपीएस प्रतिफलों की गहरी समझ हासिल करने के लिए । इस जानकारी के लिए एक जैव फिल्म की जैविक गतिविधियों को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और विभिंन अनुप्रयोगों में इस तरह के रूप में बायोमेडिकल, जैव चिकित्सा अभियांत्रिकी, कृषि, और औद्योगिक अनुसंधान और विकास में उपयोग किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम समर्थन के लिए प्रशांत नॉर्थवेस्ट राष्ट्रीय प्रयोगशाला (PNNL) पृथ्वी और जैविक विज्ञान (EBD) मिशन बीज प्रयोगशाला निर्देशित अनुसंधान और विकास (LDRD) कोष के लिए आभारी हैं । वाद्य का उपयोग एक डब्ल्यू आर विले पर्यावरण आणविक विज्ञान प्रयोगशाला (EMSL) जनरल प्रयोक्ता प्रस्ताव के माध्यम से प्रदान की गई थी । EMSL PNNL में जैविक और पर्यावरणीय अनुसंधान (मांक) के कार्यालय द्वारा प्रायोजित एक राष्ट्रीय वैज्ञानिक उपयोगकर्ता सुविधा है । लेखक पांडुलिपि पढ़ने सबूत और उपयोगी प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए Dr. Yuanzhao डिंग धंयवाद । PNNL कांट्रेक्ट डे के तहत डीईओ के लिए बैटल द्वारा AC05-76RL01830 का संचालन किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

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References

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