In Situ Karakterisering av Shewanella oneidensis MR1 biofilm SALVI og ToF-SIMS

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikkelen presenterer en metode for å dyrke en biofilm for i situ tid-av-flight sekundære ion massespektrometri for kjemiske tilordning i hydrert tilstand, aktiveres av en microfluidic reaktoren, System for analyse på flytende vakuum grensesnittet. Den Shewanella oneidensis MR-1 med grønne fluorescens protein ble brukt som modell.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bakteriell biofilm er overflaten-assosiert samfunn som er vesentlig undersøkt for å forstå deres egenproduserte ekstracellulære polymere stoffer (EPS) og deres roller i miljømessige mikrobiologi. Denne studien skisserer en metode for å dyrke biofilm vedlegg til systemet for analyse på flytende vakuum grensesnitt (SALVI) og oppnå i situ kjemiske tilordning av en levende biofilm ved time of flight sekundære ion massespektrometri (ToF-SIMS). Dette gjøres gjennom dyrking av bakterier både utenfor og innenfor SALVI kanalen med våre spesialiserte oppsett, samt gjennom optisk tenkelig teknikker å oppdage biofilm tilstedeværelse og tykkelse før ToF-SIMS analyse. Våre resultater viser karakteristiske topper Shewanella biofilm i naturlig hydrert tilstand utheving på sin lokaliserte vann klyngemiljø, samt EPS fragmenter, som er vesentlig annerledes ut enn den samme biofilm dehydrert staten. Disse resultatene viser gjennombrudd evnen til SALVI som tillater i situ biofilm bildebehandling med et vakuum-baserte kjemiske tenkelig instrument.

Introduction

Bakteriell biofilm er overflaten-assosiert samfunn som har utviklet seg over tid som forsvar for bakterier å overleve varierende ugunstig fysiske og mekanisk stimuli, der celler er kjøpedyktig feste og overleve i mange mulige miljøer. 1 , 2 biofilm er vesentlig undersøkt og ha søknader i mange felt som biomedisin, biomedisinsk engineering, landbruk, og industriell forskning og utvikling. 1 , 2 forstå kjemiske tilordningen av disse komplekse mikrobielle samfunn, inkludert deres egenproduserte ekstracellulære polymere stoffer (EPS) og deres lokale vann-klyngemiljø, er viktig å få en nøyaktig og detaljert fremstilling av deres biologiske aktiviteter. 2

Biofilm finnes og vokse i svært hydratiserte staten. Dette utgjør en stor utfordring i å bruke vakuum-baserte overflaten analyseteknikker som tid-av-flight sekundære ion massespektrometri (ToF-SIMS) på grunn av vanskelighetene i å studere flyktig væske i vakuum. Som et resultat, er vakuum-baserte overflaten analyseteknikker begrenset nesten utelukkende til å studere biofilm eksempler på bare deres tørket tilstand. Men hemmer studerer en biofilm i tørket tilstand nøyaktig etterforskningen av sin ekte biologiske microenvironment. Det fører ofte til drastiske endringer EPS integritet og biofilm morfologi, som har vist etter sammenlignende tørr biofilm masse spectral resultater i situ flytende studier. 3 , 4 denne artikkelen presenterer en løsning for å studere biofilm i sin naturlige hydrert tilstand ved å ansette bruk av systemet for analyse på flytende vakuum grensesnitt (SALVI),5,6 microfluidic reaktoren som inneholder væske under sin tynne silicon nitride (synd) membranen i en microchannel laget av polydimethylsiloxane (PMDS), noe som gir direkte tilgang til sekundære ion sonde strålen samtidig opprettholde den strukturelle integriteten til flytende matrisen i et vakuum kammeret. 7 , 8

S. oneidensis MR-1 mutert for å uttrykke grønne fluorescens protein (GFP) ble valgt som en modell organisme for denne biofilm prosedyren illustrasjonen pga metabolske allsidighet og vanlig bruk i miljø og anvendt mikrobiologi, som var basert tungt på sin unike evne for metall reduksjon og ekstracellulære elektron overføring. 9 , 10 , 11 i tillegg tilstedeværelsen av GFP tillatt for enkel kontinuerlig biofilm-tykkelse overvåking gjennom fluorescens mikroskopi, bruke filtere fluorescein isothiocyanate (FITC). Våre tidligere studier har vist bevis av denne bakterien favoriserer vedlegg til vinduet synd med i operando fluorescens imaging for biofilm vekst til en tykkelse på opp til 100 mikrometer. 4 , 12 mens dette papiret vil bare diskutere bekreftelse av biofilm's tilstedeværelse gjennom fluorescens mikroskopi, SALVI er kompatibel med andre optisk tenkelig metoder som Super-oppløsning fluorescens imaging (dvs. strukturert belysning mikroskopi (SIM)9) og AC confocal mikroskopi (CLSM) imaging4for laserskanning). Optisk imaging kan tjene til å måle biofilm tykkelsen og få et 3D-bilde av formen på biofilm som den vises, bekrefter sin tykkelse og festet til vinduet synd. 9 mens GFP ble brukt i SIMS analyse, S. oneidensis uten GFP ble brukt av vekst kurve, som bare kreves målingen av optisk tetthet og ikke krever noen fluorescerende bildebehandling. Vanligvis forskjellen mellom GFP merket og ukodede arter i vekstkurve er ubetydelig. I tillegg, mens denne protokollen bruker S. oneidensis MR-1 GFP som en modell organisme for å beskrive prosedyren, er denne fremgangsmåten utformet for bakteriell belastning som kreves for dyrking i SALVI. Selv gitt kunnskap om bakterielle belastningen nødvendig, må noen vekst forhold som tid, temperatur og oksygen miljø for å imøtekomme stamme av bakterien som skal brukes. For vekst medium bruker denne fremgangsmåten "nanowires" medium, tryptic soya kjøttkraft (TSB) uten druesukker og tryptic soya agar (TSA) uten druesukker for dyrking. Sammensetningen av "nanowires" middels er spesielt utviklet for vekst og overvåking av utvidelser av membranen og periplasm av S. oneidensis som synes å ta form av små ledninger og middels sammensetningen er etablert i tidligere forskning. 13 , 14

Vår forrige protokoll på in situ flytende ToF-SIMS har illustrert fordelen at SALVI har å tilby protein immobilisering og vedlegg til synd, samt en detaljert protokoll på ToF-SIMS strekkodeanalyse og reduksjon. 12 i stedet for å gjenta data reduksjon trinn, dette papiret vil tjene i stedet fokusere på det unike tilnærmingen til oppsett og dyrke biofilm innenfor våre SALVI microchannel, samt tenkelig trinnene å oppdage biofilm tilstedeværelse og tykkelse tidligere ToF-SIMS analyse. Mens biofilm har tidligere vært begrenset til bare tørket prøver innenfor kammeret av vakuum-baserte overflaten analytiske teknikker, fås nå detaljert EPS og biofilm kjemiske kartlegging av live biofilm i situ på grunn av denne nye funksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse for materiale

  1. Forberedelse av middels rør
    1. Serum flasker (en nødvendig per biofilm kultur og tre trengs per vekstkurve)
      Merk: som nevnt i innledningen, noen vekst middels egnet til å gi næringsstoffer som trengs for stamme av bakterien rundt kan utnyttes for denne fremgangsmåten. i dette tilfellet " nanowires " media og TSB uten druesukker mediet ble brukt for veksten av S. oneidensis MR-1 GFP. 13
      1. innskudd 20 mL vekstmediet i en 70 mL serum flaske, cap stopperen og crimp flasken. Dekk toppen med en ren sterilt aluminiumsfolie.
      2. Autoclave flasken med en flytende syklus i 30 min på 121 ° C. deretter, lagre sterilisert serum flasken ved romtemperatur.
    2. Anaerob kultur rør
      1. sette inn 5 mL av vekstmediet på en anaerob kultur rør med luft headspace og sette på stopperen crimp flasken. Dekk toppen med sterilt folie.
  2. Forbereder boble felle rør
    1. bruker en 22 gauge nål, nøye slå et hull gjennom en serum flaske gummipropp.
    2. Cut 20 i 1/32 " polytetrafluoroethylene (PTFE) rør med en barberhøvel slik at en ende av segmentet rør er spisse.
    3. Bruker den spisse enden, tråd PTFE slangen gjennom hullet i den øverste delen av gummipropp. Trykk røret til omtrent 2 cm er gjennom stopperen og skjær den spisse enden av PTFE tube med en barberhøvel å ha en flat slutt.
    4. Fjern stempelet til en 5 mL sprøyte og gummipropp fra trinn 1.2.3 tilpasses den åpne enden av sprøyten. 2 cm slutten av PTFE slangen er i løpet av. Dette er boble fellen.
    5. Pakk boble fellen (PTFE rør, gummipropp, og sprøyten) i trinn 1.2.4 med aluminiumsfolie og sikre med autoklav tape. Autoclave folie pakken å sterilisere slangen med en tyngdekraft syklus ved 121 ° C i 30 min. lagre forseglet folie pakken ved romtemperatur før klar til bruk i trinn 2.4.
  3. Bakteriell vekstkurve
    Merk: denne protokollen bruker S. oneidensis MR-1 GFP som en modell organisme for voksende biofilm i SALVI. Denne fremgangsmåten kan imidlertid være tilpasset til andre bakterier vokse din aerobt eller anaerob. Avhengig av hvilken belastning brukes, vekst tid og miljø må justeres tilsvarende.
    Merk:-80 ° C bakteriell fryser aksjer var en 1:1 blanding av TSB uten druesukker og glyserol. Vekst kurve eksemplet i figur 1 B var forberedt med et forrett kultur TSB med ingen druesukker, overført i respektive 0,2 mL mengder tre ganger på 70 mL serum flasker med 20 mL " nanowires " medium for å fjerne spor av TSB. Men forutsetter denne protokollen at eneste vekstmediet brukes, og at etterfølgende overføringene ikke vil bli utført, da dette ble gjort med disse spesielle middels løsninger for S. oneidensis. Selv om ikke beskrevet i denne protokollen, er ekstra overføringer som dette anbefalt som opprinnelig innskudds bakterier til den rike TSB hjelper de frosne cellene komme; og tre påfølgende overføringer til " nanowires " sikrer at alle TSB er borte, og at typisk vekst dynamics oppstår.
    1. Vaksinere av startkulturer
      1. fjerne bakteriell glyserol lager fra-80 ° C fryseren og varm aksjen med en hansker hånd å tine så raskt som mulig. Flytte dette fryser-lager for biologisk sikkerhet regjering (BSC).
      2. I BSC, bruk en 1 mL sprøyte med en 22G nål knyttet til overføre 0,1 mL fryser lager slik avkortet og crimped anaerob kultur som inneholder 5 mL av vekst medium med ingen druesukker, utarbeidet i trinn 1.1.2. Kast TFR gjenværende fryser i den aktuelle biologiske avfall beholderen, som fryser igjen kan sjokkere cellene.
      3. Ruge av startkulturer i en shaker/inkubator på 30 ° C for 150 rotasjoner per minutt (rpm) og husk å ta en optisk densitet ved 600 nm (OD 600) lese når klar til bruk. Registrere vekst og OD 600 slik at det kan gjøres samtidig for hver etterfølgende bruk, slik at resultatene er reproduserbare. Som et eksempel, dette startkulturer var lov til å vokse 15 h og brukt på en OD 600 ca 1,0.
    2. Vaksinere oppblomstringen Medium
      1. ta tre serum flaskene forberedt i trinn 1.1.1.2 og startkulturer i 1.3.1.3, og ta både BSC.
      2. I BSC, med en bakteriefri 1 mL sprøyte med en 22G nål knyttet, overføring 0,1 mL løsning fra av startkulturer til hver av serum flasker, henholdsvis.
      3. Sterilize toppen av serum flasker med 70% etanol og dekk med sterilisert aluminiumsfolie, Merk korrekt, og overføre til en orbital shaker i en inkubator. Satt orbital shaker til 150 rpm og satt inkubator til 30 ° C. Incubate til første OD 600 datapunktet er tatt, i trinn 1.3.3.
    3. Få OD 600 datapunkter
      1. forberede en tom ved innskudd 100 µL av filter-steriliseres destillert deionisert (DI) vann i sterilt søppel. Pakk plast parafin film rundt toppen av cuvette slik at vannet ikke vil være forurenset. Lagre ved romtemperatur. Bruk dette tom med UV/Vis spektrofotometer før du tar noen datapunkter for vekstkurve ved innsetting av cuvette og trykke " tomt ".
        Merk: Hver 48 h en ny tom bør være forberedt på å unngå feil lesing, som regelmessig erstatte en tom er lurt.
      2. For hvert OD 600 datapunkt, fjerne serum flaskene forberedt i trinn 1.3.2.3 fra inkubatoren og overføre til en sterilisert BSC. Ta 0,1 mL av inokulerte medium fra hver serum flaske og innskudd i tre separat merket sterilt cuvettes.
      3. Etter blanking, sette cuvette som inneholder kulturen i det synlige ultrafiolett (UV/Vis)-spektrofotometeret og lese OD 600 en om gangen, og registrere alle tre målinger for at tidspunkt.
        Merk: For S. oneidensis MR-1, datapunktene ble målt på 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 og 105 h etter vaksinering. Veksten er fullført når bakterier har fullførte død fase. Disse punktene bør bli justert tilsvarende hvis det er mangel på kunnskap på bestemt vekst tid og tendensen til bakterier brukes i denne protokollen. Hvis det er usikkerhet om vekst tendensen, data punkter bør være samlet oftere, for eksempel hver tre h for første 12 h, hver seks h for påfølgende 36 h, ved 12 h intervaller for følgende 100 h og 24-timers intervaller for det Endelig 124 h.
      4. Bruker OD 600 datapunktene som y-aksen og tiden som x-aksen, lage en kurve av gjennomsnittet av de tre punktene tatt med standardavvik feilfelt for hvert tidspunkt bruker en grafisk programvare. S. oneidensis MR-1 vekstkurven vises i figur 1 B i representant resultatinndelingen.
      5. Bruker diagrammet forberedt i trinn 1.3.3.4, identifisere tidsrammen i delen Logg-fase vekstkurven. For Shewanella er mellom 12 og 33 h vekst; Derfor kan det konkluderes at på 24 h vekst, Shewanella blir i sin Logg-fase av vekst, forutsatt at bakteriene vil kultivert bruker samme media og behandling før bruk som ble brukt for vekstkurven.

2. Dyrking av bakterien

  1. dag: vaksinere Agar platen
    Merk: denne delen av prosedyren ble brukt med en agarose plate å ta en colony-forming unit (CFU) på Logg-fase, i stedet for den flytende startkulturer som brukes for vekstkurven. Dette kan antas for å gjenskape samme vekst vilkår, skyldes at TSA uten druesukker brukt og senere overført til " nanowires " medium i vekst kurve prosedyre og TSA har de samme ingrediensene som utgjør TSB.
    1. Ta S. oneidensis MR-1 GFPbacteria lager fra-80 ° C fryser og sted i en isen bøtte, sett denne bøtte i steriliserte BSC.
    2. Innenfor BSC, bruk en steril 1 µL inokuleringen sløyfe å skrape overflaten av frosne bakterier lager og bruke loopen T-strek overflaten av en agarose plate.
    3. Etter tetting sidene av platen med plast parafin film, invertere plate og lagre i en 30 ° C inkubator for 24 h, til enkelte koloniene vises.
  2. Dag to: vaksinere Serum flasken
    1. fjerne platen settefiskanlegg og åpne innenfor BSC.
    2. I BSC, rengjøre gummipropp på en forberedt serum flaske fra trinn 1.1.1 med 70% etanol i DI vann.
    3. Velg en personlige CFU agar platen og bruke sterile sprøyter med en vedlagt 22 måle pinne, innskudd nok vekst medier for å løsne kolonien fra platen uten å berøre nærliggende kolonier og bland kolonien med mediet med spissen av nålen.
      : Merk enkeltvis kolonien skal være merket som er langt nok unna andre bakterier på plate, slik at medium kan settes på det uten å berøre andre kolonier.
    4. Bruker samme sprøyten, ekstra væske fra overflaten av platen.
    5. Etter å peke ut bobler i sprøyten, injisere væske inn i serum flasken, og plasser på en orbital shaker innen 30 ° C satt på 150 rpm for 24 h.
      Merk: Trykke bobler av sprøyten er viktig for å unngå å innføre mer oksygen i serum flasken, innføre mer oksygen til flasken kan endre eksperimentelle forhold og redusere konsistens mellom vekst for bakterier.
  3. Dag to: sterilisering av SALVI Microchannel
    Merk: for å fremme sterilitet rørsystem, trinnene som krever koble sprøyten fra rør og erstatning med en ny sprøyte bør gjøres innen BSC. Gjør bare koble sprøyten fra sprøytepumpen ved å skru ut metall sprøyte holderen, og ta sprøyten med rør festet til et sterilt BSC. Når rørsystem er nevnt i prosedyrene, refererer dette til sprøyten som inneholder væske reservoaret tilknyttet med en polyetheretherketon (kikk) injektor PTFE slangen, knyttet til drypp kammeret, som har en titt injektor passende knyttet til den SALVI innløp rør, og uttaket beholderen som SALVI stikkontakt slangen er beseglet til.
    1. Bruker en ny SALVI enhet og knytte en titt montering og injektor til en ende av en PTFE slangen.
      Merk: SALVI enheter er forberedt frisk for hvert eksperiment følgende enhet fabrikasjon beskrevet i tidligere forskning og patenter. 5 , 6 , 8 , 15
    2. ta 2 mL 70% etanol sprøyter til og koble til titt montering på SALVI. Etter utløpet av SALVI vedlegges en avfall flaske koble sprøyten til en sprøytepumpe og tillate etanol DI vann løsningen å kjøre gjennom SALVI på 20 µL/min for 1,5 h.
    3. Ta 4 mL sterilisert DI vann sprøyter til og koble til mengden av den samme SALVI. Etter å koble sprøyten til en sprøytepumpe, la vannet gå gjennom SALVI på 20 μL/min for minst 3 h.
    4. Innenfor en BSC, åpne folie pakken i trinn 1.2.5 og koble en steril titt injeksjon passer til slutten av 5 mL sprøyte og sterile titt beslag på slutten av TFE slangen. Ta ~ 3 mL steril medium sprøyter til og knytte til TFE røret. Invertere 5 mL drypp kammeret, og bruker sterile sprøyter, injisere vekstmediet i drypp kammeret til den når et totalt volum på 1 mL.
    5. Koble enden av 5 mL sprøyte drypp kammeret i innløpet til SALVI.
    6. Ta 10 mL av vekstmediet sterile sprøyter til og koble til mengden av drypp slangen. Etter å koble sprøyten til en sprøytepumpe, kan mediet å kjøre gjennom SALVI på 20 µL/min 12 h (eller over natten). Bruke teip for å sikre disse delene. Dekk stikkontakt flasken med folie eller plast parafin film å minimere sannsynligheten for støvpartikler og organismer inneholdt deri for å forurense medium. Du finner en detaljert fremstilling av hvordan dette oppsettet skal se i figur 1 A.
      1. Tillate drypp slangen å være vertikal, betyr at sprøytepumpen bør plasseres på en opphøyd overflate med Dryppstopp rør sikret med tape, og med SALVI sikret på en flat overflate under.
      2. Kjøre medium gjennom SALVI 12 h å sikre at alle spor av etanol er fjernet fra microchannel og rør av SALVI før vaksinere med bakterier.
      3. For ekstra beskyttelse, holde SALVI microchannel kammer innenfor en sterilisert Petriskål, med sidene kuttet til å passe innløp og utløp rør. I tillegg holde tape alltid på vinduet for å beskytte SiN membran og kanal før imaging analyse.
  4. Dag tre: vaksinasjon av SALVI Microchannel
    1. fjerne hele rørsystem (sprøyte koblet til dryppe kammer koblet til SALVI koblet til avfall flasken) fra sprøytepumpen og bringe den til en sterilisert BSC. I tillegg fjerner serum ampullen fra trinn 2.2.5 settefiskanlegg og bringe den til BSC.
    2. Rengjør overflaten av serum flaske stopperen med 70% etanol å hindre enhver kontaminering, og bruk deretter sterile sprøyter med en vedlagt sterilt 22G nål for å trekke 4 mL av bakterier fra flasken.
    3. Løsne SALVI fra 5 mL Mysteriekammeret drypp slangen, og koble sprøyten med inokulerte medium direkte til mengden av SALVI. La drypp slangen i et sterilt aluminiumsfolie pakke eller innen BSC.
    4. Feste sprøyten med SALVI og utløp flaske til sprøytepumpe kjøres på 20 µL/min 3 h å vaksinere kanalen av SALVI, for å tillate flere endringer i volum av væsken innenfor SALVI.
    5. Etter vaksinasjon, koble sprøyten med SALVI fra sprøytepumpen og bringe BSC. Etter at mengden av SALVI tilbake til 5 mL drypp chamber fra trinn 2.4.3, ta 20 mL oppblomstringen medium sterile sprøyter til og fest i innløpet til drypp slangen.
    6. Bringe slangen festet til SALVI fra BSC til sprøytepumpen og tillate mediet gjennom slangen frekvensen av 2 µL/min seks til ti dager eller til fluorescens imaging (omtalt i trinn 3) viser gunstige synlig biofilm vekst for ToF-SIMS analyse. Fylle frisk medium som det renner ut i BSC ved å fylle nye sterile sprøyter med 10mL oppblomstringen medium og feste til SALVI etter forrige vekstmediet har kjørt.
      Merk: Etter vaksinering på 2 µL/min, flow rate bør aldri økes eller reduseres, som endrer infusjonshastigheten ville skape skjær-stress innenfor kanalen og koble biofilm. Det er viktig at denne strømningshastigheten bør aldri endres; for å forberede denne, ~ 24 h før SIMS, observere slangen tett for å gjøre at det ikke er noen bobler slik at det er ikke nødvendig å presse mer medium raskere gjennom slangen.
      1. Unngå bobler i microchannel, som de kan presse biofilm ut av kanalen. Det er viktig å være forsiktig i bobler i bunnen av 5 mL drypp slangen der den kobles til SALVI slangen. Frisk medium kan injiseres i slutten av KIKKING injektoren å sikre at ingen luften tvinges inn i SALVI.

3. Optisk tenkelig av Biofilm innen SALVI Microchannel

  1. Fluorescens mikroskopi Imaging
    Merk: Shewanella brukes som en modell organisme i denne protokollen er mutert for å uttrykke GFP, slik det krever ikke flekker. Hvis bakterier trenger flekker, bør dette alltid gjøres på den samme hastigheten (f.eks, 2 µL/min) å unngå biofilm avdeling. I tillegg når celler går uten næringsstoffer tilgjengelighet, vil de løsne. Derfor, hvis noen ekstra flekker, flekken skal settes inn til vekstmediet i stedet for vann før du leverer til stain cellene.
    1. Koble SALVI fra dryppe rør inne BSC og lukke SALVI Drei titt beslag å finger-stramme titt unionen.
    2. Tape slangen av SALVI microchannel chamber trygt på et glass lysbilde, slik at vinduet er helt flat og vender oppover. Fjerne beskyttelsesbåndet fra vinduet. Klemme lysbildet til scenen av mikroskopet ved å plassere av objektglass mellom objektklemmer på plattformen.
    3. Lavere scenen av mikroskopet slik at toppen av SALVI er plassert nært nok til slutten av 10 X målsettingen, der justering av fokus ikke vil føre til at linsen touch vinduet.
    4. Skru på bakgrunnslyset og finner du kanalen med 10 x mikroskop målet ved å justere fokus. På denne tiden, sørg for bakteriell feste vinduet synd på SALVI er tydelig i forhold til vinduet på en kontroll kanal med ingen inokulerte bakterier. Ved nærmere avbildning av celler, kan du bytte til 20 x målet. Sammenlignet med en tom SALVI kanal, tilstedeværelse av bakterier knyttet til vinduet bør ha en sterk grønne fluorescens.
    5. Slå av bakbelysningen og slå på mikroskopet kvikksølv kilden. Vente 2-3 minutter, og Bytt til FITC filteret satt på mikroskopet å utsikt og ta bilder av biofilm festet til vinduet. Som et eksempel på hva den modnet biofilm vil se ut når du er klar, se figur 1 C.
    6. Slå av kvikksølv kilden og koble SALVI fra lysbildet. Eventuelt legge til 2 µL/min middels flyt igjen å tillate mer vekst før imaging igjen, eller overføre SALVI sekundær containment bruk for ToF-SIMS analyse. Dette er nødvendig hvis biofilm tykkelse er avsluttet ikke er tykk nok og mer tid for vekst er nødvendig før ToF-SIMS analyse. Hvis du vil knytte til middels flyt igjen, se trinn 2.3.6.
      Merk: Hvis satt tilbake under middels flyt, fluorescens imaging bør gjøres igjen før ToF-SIMS analyse.
      1. Gir biofilm oppblomstringen medium å mate den til ToF-SIMS analyse kan utføres. Mens ikke anbefalt, hvis nødvendig, lukket SALVI kan lagres i 4 ° C over natten, men bør kunne varm til romtemperatur før du setter inn til vakuum kammeret av ToF-SIMS. Men analysere biofilm straks løsrevet fra middels flyt redusere biofilm løsgjøring.

4. ToF-SIMS datainnsamling

Merk: denne delen fungerer som en oversikt, og omtales i større detalj innenfor våre tidligere protokollen som beskriver adsorbert protein molekyl flytende SIMS analyse. 12

  1. Installere SALVI i ToF-SIMS Loadlock kammeret
    Merk: hansker bør brukes på alle tider når håndterer SALVI enheten og installere det på ToF-SIMS scenen for å unngå potensielle forurensing under overflaten analyse.
    1. Mount SALVI på scenen og fikse det med flere skruer. Kontroller at vinduet synd er med justering skrue tetthet og sette silisium wafer stykker nederst på PDMS microchannel kammeret. Fjerne beskyttelsesbåndet fra vinduet, og deretter legge scenen i ToF-SIMS loadlock kammeret.
    2. Åpne ToF-SIMS loadlock, holde og sette scenen vannrett på lasting plattformen og stenge loadlock. Starte vakuumpumpe og vente slik at egnet vakuum nås.
    3. Flytte SALVI til hovedkammeret når vakuum er stabilisert til 1 x 10 -7 mbar.
  2. Dybde profilering og innsamling datapunkter
    1. finne mikrovæskekanalen av optisk mikroskopet utstyrt i ToF-SIMS.
    2. Velg positiv eller negativ før datainnsamling. Bruk 25 keV Bi 3 + stråle strålen primære ion i alle målinger og bruk elektron flom pistolen for å nøytralisere overflaten lading under alle lengdemål.
    3. Skanning Bi 3 + strålen med 150 ns puls bredden på en runde område med en diameter på ~ 2 µm med 64 x 64 piksler oppløsning. Etter punching gjennom vinduet for 100 nm-synd, fortsette å søke etter en annen 150 s høy intensitet oppslagsfelt for bildebehandling. Etter punch-gjennom, vil teller øke betydelig i dybden profilering regionen. Etter å stabilisere, dette kan være referert til som regionen høyintensiv.
    4. Redusere puls bredden til 50 ns for datainnsamling å erverve spectra med bedre masse oppløsning. Fortsett dette oppkjøpet for om en 200 s.
    5. Gjenta disse trinnene for å samle minst tre positivt og tre negative datapunkt.
      Merk: Pass til verdensrommet punch gjennom områdene slik at vinduet synd ikke vil bryte og lekke inn i kammeret av vakuum fra kompromittert vinduet integritet.

5. ToF-SIMS dataanalyse

  1. masse kalibrering bruker IonToF programvare
    1. åpner analyseprogramvare ToF-Sims (måling Explorer) og klikker den " profiler ", " spectra " og " bilde " knapper, henholdsvis til prosessen dybde profil, m/z spektrum og bildedata.
    2. Åpen datafilene innhentet gjennom ToF-SIMS datainnsamling.
    3. Velg dybden profildata rundt og rekonstruere spectra ifølge dybde profil timelige serien.
    4. Trykk " F3 " åpne den " masse kalibrering " vindu. Velg topper for kalibrering basert på kjemiske forbindelser som forventes i bestemte prøven.
  2. Topper av interesse utvalg
    1. topp utvalg er nødvendig for eksempel analyse, bestemme karakteristiske toppene av prøven etter litteratur eller andre tidligere funn, eventuell. Sammenligne intensiteten av toppene av interesse til m/z spectra. Eventuelt legge til nye topper eller slette forstyrrelser topper i listen peak.
    2. Klikk på en topp, finner de røde linjene i vinduet venstre nederst. Flytt de røde linjene til omslutter hele toppen.
    3. Velg en topp matchende den kjemiske formelen i vinduet viktigste spektrum og deretter klikke den " legge til toppen " ovenfor vinduet. < /Li >
  3. Eksporter masse kalibrert Data
    1. å eksportere en topp liste, i det " topp liste " menyen " lagre … " topp listen i den " itmil " format.
    2. å eksportere en dybde profil, i den " profil " vindu, klikk på den " filen " menyen Velg " eksportere ", og velg deretter " lagre som " en " txt " filen.
    3. å eksportere en m/z spektrum fil, i den " Spectra " vindu, klikk på den " filen " menyen Velg " eksportere ", og velg deretter " lagre som " en " txt " filen.
    4. å eksportere en bildefil, i den " bildet " vinduet Skriv ut skjermen og lagre som bildefilen.

6. ToF-SIMS Data Plotting og presentasjon

  1. bruke grafisk verktøy for å importere dataene.
  2. Gjør en tomt med m/z som x-aksen og topp intensiteten som y-aksen for å vise rekonstruerte spekteret. Et eksempel er gitt i figur 2 A.
  3. Kombinerer rekonstruert todimensjonal (2D) bilder av ulike m/z og en matrise til å vise enten positive eller negative ion-tilordning-skjemaet. Et eksempel er gitt i figur 2 B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse representant resultatene tjene til å vise hvordan kjemiske profilen til den tilknyttede biofilm kan identifiseres og tolket, som oppnås gjennom ToF-SIMS. Etter plotting masse spectra fra ToF-SIMS datainnsamling, fremhevet kort i delen prosedyrer bør peak identifikasjon utføres for å tilordne identiteter til hver respektive m/z-verdien. Dette kan gjøres gjennom omfattende gjennomgang på massespektrometri på bakterier og bestemte kjemiske fragmenter som forventes å være til stede i bakterier studert, som ulike vann klynger, fettsyrer og proteinfragmenter. 16 , 17 , 18 , 19 , 20 disse representant resultatene viser bare til negative masse spectra som hentes av S. oneidensis MR-1 biofilm og en DI vann utvalget. Tolkning av positiv spectra følger omtrent.

Figur 1 En viser skjematisk oppsett i henhold til denne protokollen når dyrke en biofilm i SALVI microchannel. Øverst til venstre, er sprøyten knyttet til en sprøytepumpe, som holder middels flyter i en konstant hastighet gjennom PFTE rørsystem og inne microchannel. Sprøytepumpen er plassert over drypp kammeret, som hindrer bakover forurensning til middels reservoaret for å hindre motile organismene fra svømming opp-stream. Mediet flyter fra drypp kammer reservoaret direkte i PFTE slangen av SALVI, som går gjennom microchannel og gjennom slangen uttaket til en forseglet stikkontakt flaske. Prikkete peker fra vinduet synd til et bilde av en modnet S. oneidensis MR-1 GFP celler av fluorescens mikroskopi, i trinn 3.1. Figur 1 B viser et eksempel på en vekstkurve etablert med modell organismen for denne protokollen, S. oneidensis MR-1. Fra vekst fasene i denne grafen, kan det konkluderes at Logg-fasen av veksten skjer mellom 15-32 h i disse bestemte dyrking forholdene. Tilleggsinformasjon fra denne grafen viser at 0-15 h lag fasen av vekst, og 33-105 h representerer stasjonære fasen av vekst. Figur 1 C er et bilde som er kjøpt med fluorescens mikroskopi viser et eksempel på en modnet biofilm.

Figur 2 En viser de negative masse spektra av en hydrert S. oneidensis MR-1 biofilm innen mikrovæskekanalen, som ved i situ væske ToF-SIMS. Denne grafen viser et eksempel på valgte massen utvalg (m/z 100-350) sammenligningen mellom biofilm S.oneidensis MR-1 og DI vann, sistnevnte ble oppnådd som en system. Figur 2 B viser en sammenligning av 2D-bilder av toppene av interesse for MR-1 biofilm og DI vann ved ToF-SIMS. Når interessant m/z-verdier kan identifiseres å studere til masse spectra, potensielle peak identifikasjon av m/z-verdier er riktig knyttet til kjemiske fragmenter, som støttes av IonToF SIMS programvare bibliotek og litteratur undersøkelsen. Toppene av interesse i figur 2A inkluderer vann klynger (dvs. m/z 107 (H2O)5OH-, 125 (H2O)6OH-, 143 (H2O)7OH-, 161 (H2 O)8OH-, 179 (H2O)9OH-, 197 (H2O)10OH-, 215 (H2O)11OH-, 233 (H2O)12OH-, 251 (H2O) 13 OH-, 269 (H2O)14OH-, 287 (H2O)15OH-, 323 (H2O)17OH-, 341 (H2O)19OH-))9, som merket med røde linjer over respektive topper, quorum sensing relatert forbindelser biomarkers (dvs. m/z 175 C10H9ingen2-), EPS biprodukter (m/z 123 C2H4PO4-, 159 P 2 O8H-, 216 Cr2O7-, 285 octadecanoethiols, 325 polare forbindelser, C12 Polar forbindelser)15,16,18, og fettsyrer kjede fragmenter (dvs. m/z 127 [C2H3(CH2)3COO]-, 255 C16:0 fettsyrer, 279 linolsyre, C18H31O2-, 325 C21H40O2 -, 341 overflaten lipider, 18-MEA bundet gjennom thioester linkage, stearinsyre C18H35O2-, ioner av monoacylglyceryls palmitinsyre C19H17O6 -). 16 , 19

Siden biofilm er hydratiserte, er det ikke overraskende at noen topper sett i biofilm utvalget er like dem funnet i DI vann. Disse vann klynge topper er merket med en rød linje over hver topp i figur 2A, inkludert m/z 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287 323, og 341 og tilsvarende (H2O)5OH- (H2O) 6 OH- (H2O)7OH- (H2O)8OH- (H2O)9OH- (H2O)10OH- (H2 O)11OH- (H2O)12OH- (H2O)13OH- (H2O)14OH- (H2O)15OH- (H2O)17OH- (H2O)19OH-, henholdsvis. 9 som det er utbredelsen av mange karakteristiske vann klynger i dette masse spektrum, dette resultatet gir en sterk bevis på kjemiske vann klyngemiljøet i en hydrert biofilm. I tillegg relatert ikke vann klynge topper i begge spectra kan ofte bli tillagt som forstyrrelser topper, vanligvis fra PDMS, en del av mikrovæskekanalen. En vanlig kjent forstyrrelser topp fra PDMS er for eksempel m/z 137 i negative ion-modus.

Når sammenligne biofilm SIMS masse spectra som DI vann, som vist i figur 2A, noen topper finnes ikke i DI vannet, men de vises i biofilm. For eksempel toppen på m/z 255 ([lm3(CH2)14COO]-, palmitinsyre) er tilstede på høy intensitet i biofilm prøven, men ikke i DI vann utvalget. Dette ville foreslå at signaler come fra i biofilm, mest sannsynlig biofilm og/eller dens Egengenererte EPS. Mange interessante toppene ble identifisert i figur 2A. For eksempel EPS relatert topper inkludere m/z 123-, funnet C2H4PO4-, 159 (P2O8H-), 216 (Cr2O7-), 285 (octadecanoethiols) og 325 (polare forbindelser, C 12 Polar forbindelser). 17 , 18 , 20 topper tilknyttet fettsyrer ble funnet for å være 127 ([C2H3(CH2)3COO]-), 255 ([lm3(CH2)14COO]-, palmitinsyre), 279 ([CH3 (CH2)15COO]-, linolsyre), 317 (C21H33O2-), 325 (C21H40O2-) og 341 (overflate lipider, 18-MEA bundet gjennom thioester forbindelse stearinsyre C18H35O2-, ioner av monoacylglyceryls palmitinsyre C19H17O6-). 16 , 19 til slutt et kinolin signal quorum sansing signal knyttet toppen av C10H9ingen2- ble observert på m/z 175.

Figur 2 B viser 2D-bilder av fordelingen av fire forskjellige interessant ioner mellom S. oneidensis MR-1 biofilm (øverste rad) og DI vann (nederste rad). M/z verdien 107 ((H2O)5OH-) viser en vann klynge av betydelig intensiteten i prøvene, m/z verdien 175 (C10H9ingen2-) viser et quorum sensing relaterte signal, m/z 255 er en fettsyre ([lm3(CH2)14COO]-, palmitinsyre), og m/z 341 (C21H41O2-) kan representere både lipid fragmenter og vann klynger på grunn av 1 amu masse nøyaktigheten. 9 lysere områder 2D bildene viser høyere antall molekylær ion i bildet. Som forventet, signaler for QS sammensatte, og lipider var langt større i antall innenfor biofilm prøven. Mens signalet for vann klyngen (m/z 107) var sterkere hele biofilm prøven, var det også til stede i DI vann utvalget, som forventet. Til slutt, signalet på m/z 341 ble funnet for å være homogene i biofilm prøven, men veldig svakt i DI vann utvalget. Mens m/z 341 var en vann klynge topp, var det også representant for flere forskjellige fettsyrer og overflate lipider. 16 sin sterkere tilstedeværelse i biofilm prøven etter normalisering av dataene antyder at tilstedeværelsen av lipid fragmenter langt oppveier tilstedeværelsen av vann klynger.

Figure 1
Figur 1 : Eksperimentell skjematisk. (A) viser den eksperimentelle skjematisk av biofilm som det vises i laboratoriet. Starter øverst til venstre, middels renner fra sprøyten (1), som er knyttet til sprøytepumpen (2), kontrollere hastigheten som flytende flytter gjennom. Pilene angir flytretningen i hele systemet. Sprøyten (1) er koblet via en titt injektor montering (3) til TFE slangen (4). Middels renner gjennom et drypp kammer (5) å unngå forurensning, og til slutt flytter gjennom SALVI (6) til beholderen forseglet utløp (7). Sprøytepumpen er plassert på en opphøyd overflate (9) slik at drypp kammeret (5) kan være vinkelrett på flate overflaten (8) som SALVI (6) er plassert på. (B) vekst kurve for Shewanella oneidensis MR-1 i "nanowires" medium. Time 0-15 h representerer lag fase, tid 15-33 h representerer Logg fase, 33-105 h representerer stasjonære fase og tiden 105 h eller lenger representerer død fase. Feilfelt representerer standardavvik. (C) en bilde av en modnet biofilm kjøpt med fluorescens mikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Sammenligninger av ToF-SIMS negativ spektra av de hydrert Shewanella oneidensis biofilm og MR-1 medium SALVI microchannel. (A) m/z SIMS masse spektra av Shewanella oneidensis biofilm i MR-1 middels og DI vann. Sistnevnte ble brukt som en kontroll. Røde linjene indikerer plasseringen av karakteristiske vann klynge topper. (B) 2D-bilde sammenligning av topper rundt mellom biofilm og DI vann. Fra venstre til høyre, bildene viser en vann-klynge (m/z 107 (H2O)5OH-), et quorum sensing/hormon signal (m/z 175, C10H9ingen2-), en fettsyrer (m/z 255, [lm3(CH 2)14COO]-, palmitinsyre), og overflaten lipider/EPS fragmenter (m/z 341, 18-MEA, C21H41O2-). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etter vaksinere på Logg-fase, er det viktig å teste antall dager og temperaturen der biofilm skal vokse før det er sunn og tykk nok for bildebehandling, som beskrevet i trinn 3.1. Denne fremgangsmåten inneholder dyrking en S. oneidensis MR1 biofilm ved romtemperatur; men forskjellige romtemperatur kan påvirke hastigheten av vekst. Derfor er det viktig å bruke optisk tenkelig for å forstå om biofilm er klar før du fortsetter til ToF-SIMS analyse. Tilsvarende krever annen bakteriestammer ulike vekst forhold og lengde for å oppnå en ønskelig tykkelse for analyse. Mens vekstkurven i figur 1b viser logg fase 200 av bakterier til 12-32 h, og dette ble brukt på 24 h gjennom prosedyren, er det viktig å merke seg at denne gangen ikke kan brukes som Logg-fase for andre bakteriestammer uten etablere vekstkurve uavhengig. Mens Logg fasen var mellom 12 og 33 h vekst for S. oneidensis, ble 24 h valgt på grunn av at det var i delen av veksten der oksygen var begynt å begrense veksten av organismen, mot slutten av loggfilen-fase. Eksperimenter viste at dette var tiden cellene begynte å produsere nanowires, dermed primet å skjemaet vellykket biofilm som kunne overleve i oksygen miljøer. 3 , 13 derfor tid å bruke bakterier i loggen fasen bør være påvirket av forskning erfaring og kunnskap fått fra litteratur på eksperimentelle studier av bakterier blir studert. I tillegg må en separat vekstkurve opprettes for å forstå Logg-fasen for alle ulike stammer av bakterier som skal brukes for biofilm vekst ved hjelp av denne tilnærmingen. Veksten av 2 µL/min var beregnet så som ikke for å overskride maksimal veksten av S. oneidensis MR-1, og den totale tiden ble valgt til å få en eldre biofilm som ikke var overgrodd og utsatt for frakobling. Disse prisene kan bli justert tilsvarende til kunnskap om forskjellige bakterier skal brukes med dette oppsettet.

Noen begrensninger ved bruk av SALVI for biofilm vekst inkluderer biofouling i kanalen samt sannsynligheten for bakterier å feste til flat veggene i kanalen. Til tross for veksten i en konstant hastighet, anbefalt å bli 2 µL/min i denne protokollen, kan biofouling fortsatt oppstå hvis biofilm tillates å vokse for lenge. I slike tilfeller og uten forvarsel, kan biofilm koble fra vinduet og avslutte SALVI til uttaket kontroll. Biofouling kan også oppstå ved å legge mekanisk kraft (dvs.flytte) SALVI, som ikke kan unngås. Imidlertid kan dette holdt i sjakk ved å vise biofilm feste vinduet synd før ToF-SIMS analyse under lys mikroskop. En annen begrensning inneholder jevne PDMS microchannel som kan gjøre det vanskelig for noen bakterier å feste. Men kan dette endres i utformingen av SALVI å imøtekomme ved å opprette ribbet kantene til kanalen, hvis vedlegg av bakterier er et problem. Til slutt, celletall kan gjøres i stedet for OD600 målinger for vekst kurve besluttsomhet. For eksempel har studier vist direkte og konsekvent korrelasjon av celletall til OD600 målinger. 21 derfor OD600 anses tilstrekkelig til å evaluere biofilm vekst.

Begrensninger på denne teknikken er noen, som SALVI egentlig virker som en kultur parabol som har mye allsidighet for bruk i mange programmer, slik som anaerob i en hanskerommet eller i noen temperatur-kontrollerte miljømessige kammer. Noen mindre begrensninger omfatter ukontrollerbare romforhold som relativ fuktighet, temperatur, plasseres nær sollys, som er fortsatt mulig å overnatte, for hver spesifikke bakterier optimale forhold. I tillegg kan noen av disse tekniske utfordringer overvinnes med en inkubator med temperatur eller RH mekling funksjoner i biofilm oppsettet.

SALVI er et vakuum-kompatible microfluidic grensesnitt. I dette arbeidet, ble en 200 x 300 µL mikrovæskekanalen brukt til kultur biofilm med optisk og flytende SIMS imaging. Væsker presenterer en teknisk utfordring å studere bruker vakuum basert teknikker, fordi de er flyktig og vanskeligere å beholde i flytende fase i vakuum. Dermed har vakuum teknikker som ToF-SIMS vært tradisjonelt begrenset til bare tørr og kryogene. 22 i tillegg SALVI kan brukes for ulike bildebehandling og spektroskopi bruker en rekke teknikker mikroskopi og spektroskopi. 4 , 9 vår gruppe har arbeidet for å stadig utvide ulike SALVI programmer i situ analyse av væsker og faste-flytende stoffer grensesnitt. 15 , 23 , 24 vår siste innsats har effektivt vist bakterier vedlegg til synd membranen. 9 etter første vedlegg, stadige strømmen av middels over tid har blitt vist å vellykket dyrke en biofilm direkte på vinduet synd på SALVI. Under ToF-SIMS brukes den primære ion strålen å bombardere hull på 2 µm i diameter. Denne dimensjonen er cellen lengden på biofilm knyttet til vinduet synd gir en kjemisk profil av biofilm i sin naturlig hydrert microenvironment. Dette er svært viktig forskjell på en biofilm kjemiske identitet, EPS, og vann klyngemiljø når sammenligne biofilm i hydrert tilstand med tørket prøver. 9 uten bruk av SALVI, ToF-SIMS kan bare utføres på tørr og kryogene prøver, gir kjemisk tilordning som ikke klarer å fange kjemiske profilen til en prøve i sin naturlige hydrert tilstand.

Som vist i figur 1A, er det viktig å holde sprøytepumpen over drypp slangen for å tillate drypp slangen skal vinkelrett SALVI microchannel. I tillegg vil bobler være mindre sannsynlig i slangen for enheten, hvis stikkontakt PFTE slangen (innen stikkontakt flasken) er lavere enn innløp slangen (festet til drypp chamber). En annen viktig trinn i dyrking bakterier for SALVI vekst er å først få en vekstkurve av bestemt bakterier belastningen som skal brukes, som beskrevet i trinn 1.3. Dette kan gjøres ved å skaffe vekst kurver med optisk densitet mål. En vekstkurve, er som vist i figur 1B, viktig for å forstå tidsrammen som blir bakterier i logg-fasen av vekst, når det kan antas at bakterier er sunneste. Utnytte bakterier i denne fasen av vekst forenkler etablering av en sunn biofilm microenvironment og sikrer at biofilm vil vokse i sin forventede hastighet. SALVI microchannel er sterilisert i romtemperatur med 70% etanol og DI vann, så det kan ikke autoklaveres for sterilisering før å bruke med ToF-SIMS. Dette er på grunn av det faktum at autoklavering kan både skade vinduet på SALVI og introdusere vanndamp til kanalen. Etter flere dager med vekst, bør microchannel kontrolleres med fluorescens mikroskopi validere bakteriell vedlegg. Et eksempel kan finnes i figur 1C, dette bildet ble tatt for å vise en modnet biofilm. På grunn av strømningsbane av medium, bakterier mer gunstig fester og vokser langs kantene på microchannel, som denne plasseringen er der flyten og skjær-krefter er lowest.

Oppsummert er SALVI en utmerket metode for å kultur og studere biofilm bruker i situ kjemiske kartlegging, som gjør det mulig for å gi den levende biofilm i sin naturlige hydrert tilstand til den vakuum-basert bildebehandling masse spectrometer. Denne unike tilnærming kan gi mer informasjon om en biofilm vann klyngen microenvironment, så vel som å få en dypere forståelse av sin EPS biprodukter. Denne informasjonen kan brukes til å forstå en biofilm biologiske aktiviteter, og kan benyttes i ulike applikasjoner som biomedisin, biomedisinsk engineering, landbruk, og industriell forskning og utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) jorden og Biological Sciences (EBD) oppdrag frø Laboratory regissert forskning og utvikling (LDRD) fondet støtte. Instrumental tilgang ble gitt gjennom W. R. Wiley miljømessige molekylær Sciences Laboratory (EMSL) generelle brukeren forslag. EMSL er en nasjonal vitenskapelige bruker sponset av Office av biologiske og Environmental Research (BER) på PNNL. Forfatterne takker Dr. Yuanzhao Ding bevis lese manuskriptet og nyttig tilbakemelding. PNNL drives av Battelle for DOE under kontrakten DE-AC05-76RL01830.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36, (5), 347-355 (2011).
  2. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, (9), 623-633 (2010).
  3. Aldeek, F., et al. Patterned hydrophobic domains in the exopolymer matrix of Shewanella oneidensis MR-1 biofilms. Appl Environ Microbiol. 79, (4), 1400-1402 (2013).
  4. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of a hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139, (7), 1609-1613 (2014).
  5. Yu, X. Y., Yang, L., Cowin, J. P., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US Patent. (2013).
  6. Yu, X. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US Patent. (2014).
  7. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J Vac Sci Technol A. 29, (6), (2011).
  8. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and ToF-SIMS. Lab Chip. 11, (15), 2481-2484 (2011).
  9. Ding, Y., et al. In Situ Molecular Imaging of the Biofilm and Its Matrix. Anal Chem. (2016).
  10. Yang, J., Ghobadian, S., Montazami, R., Hashemi, N. Proceedings of the Asme 11th Fuel Cell Science, Engineering, and Technology Conference, 2013. (2013).
  11. Yu, F., Wang, C. X., Ma, J. Applications of Graphene-Modified Electrodes in Microbial Fuel Cells. Materials. 9, (10), (2016).
  12. Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J Vis Exp. (108), e53708 (2016).
  13. Hill, E. A. Effects of Electron-Transport-System Impairment on Hydrogen Gas Production by the Bacterium Shewanella oneidensis MR-1. Washington State University. Master's thesis (2007).
  14. McCormick, A. J., et al. Biophotovoltaics: oxygenic photosynthetic organisms in the world of bioelectrochemical systems. Energy Environ Sci. 8, (4), 1092-1109 (2015).
  15. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, 855-859 (2014).
  16. Keune, K., Hoogland, F., Boon, J. J., Peggie, D., Higgitt, C. Evaluation of the "added value" of SIMS: A mass spectrometric and spectroscopic study of an unusual Naples yellow oil paint reconstruction. Int J mass Spectrom. 284, (1-3), 22-34 (2009).
  17. Lee, M. Mass Spectrometry Handbook. John Wiley & Sons Inc. 988 (2012).
  18. Petrovic, M., Barcelo, D. Determination of anionic and nonionic surfactants, their degradation products, and endocrine-disrupting compounds in sewage sludge by liquid chromatography/mass spectrometry. Anal Chem. 72, (19), 4560-4567 (2000).
  19. Vickerman, J. C. Molecular Imaging and Depth Profiling by Mass Spectrometry--Sims, MALDI or DESI. Analyst. 136, (11), (2011).
  20. Weng, L. T., Bertrand, P., Stonemasui, J. H., Stone, W. E. E. Tof Sims Study of the Desorption of Emulsifiers from Polystyrene Latexes. Surf Interface Anal. 21, (6-7), 387-394 (1994).
  21. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis crowth. A correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44, (1), 287-289 (2013).
  22. Dohnalkova, A. C., et al. Imaging hydrated microbial extracellular polymers: comparative analysis by electron microscopy. Appl Environ Microbiol. 77, (4), 1254-1262 (2011).
  23. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf Interface Anal. 46, 224-228 (2013).
  24. Yu, J. C., et al. Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging. Chem Commun. 52, (73), 10952-10955 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics