والرزن ثقافة المشارك خاتم الابهري: أداة ملائمة تقييم إمكانات الأوعية الوسيطة Stromal الخلايا في المختبر

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا، نقدم تطبيق رواية للمقايسة حلقة الابهر التي تكون فيها الخلايا الوسيطة بريلابيليد مثقف يشترك مع شبكات غشائي المستمدة من الشريان الاورطي الفئران. يسمح هذا الأسلوب رواية التصور صاروخ موجه الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) والتكامل مع الشبكات بطانية، التحديد الكمي لخصائص الشبكة، وتقييم التعبير لجنة السلامة البحرية إيمونوفينوتيبيس والجينات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تولد الأوعية عملية معقدة وعالية التنظيم مسؤولاً عن توفير وصيانة نضح الأنسجة مناسبة. صيانة المفرج غير كافية والتشوهات المرضية يمكن أن ينتج الأمراض الدماغية الحادة، بينما يرتبط تطور الأوعية الدموية مفرط وفيرة مع السرطان وأمراض التهابات. نموذج واعدة برو-الأوعية العلاج هو استخدام الأوعية خلية المصادر، التي يمكن أن توفر العوامل التنظيمية، فضلا عن الدعم المادي لتطوير المفرج حديثا.

الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) مرشحتان التحقيق على نطاق واسع لتجديد الأوعية الدموية بسبب آثارها باراكريني وقدرتهم على كشف وموطنا للأنسجة الدماغية أو ملتهبة. على وجه الخصوص، في الفصل الأول الحبل السري البشري ارتشاح الخلايا (FTM هوكبفكس) مرشح واعدة جداً نظراً لخصائص مثل بيريسيتي، وإمكانات عالية التكاثري ومولتيلينيجي، وخصائص المناعي المميز، و paracrine قوية الشخصية. لتقييم فعالية يحتمل أن تكون الأوعية خلايا التجدد، شرط مسبق لاختبار لهم في موثوقية وفحوصات ما قبل السريرية "قابل للنقل". والرزن حلقة الابهر هو نموذج الأوعية السابقين فيفو يسمح لسهل التحديد الكمي لهياكل غشائي أنبوبي، يوفر خلايا داعمة التبعي والمصفوفة خارج الخلية (ECM) من البلد المضيف، ويستبعد مكونات التحريضية، وهو سريعة وغير مكلفة لإعداد. وهذا مفيد عند مقارنتها بنماذج في فيفو (مثلاً، فحص القرنية، مقايسة توصيل ماتريجيل)؛ يمكن تعقب الخلايا التي تدار المقايسة حلقة الابهر ومراقبة التفاعلات بين الخلايا مع تجنب الرفض المناعي كرة.

نقدم بروتوكول لتطبيق رواية للمقايسة حلقة الابهر، الذي يشمل البشرية MSCs في الثقافات المشتركة مع النامية شبكات غشائي الابهري من الفئران. يسمح هذا الفحص لتحليل مساهمة لجنة السلامة البحرية أنبوب تشكيل والتنمية من خلال التفاعلات مثل بيريسيتي المادية وقوتها لنشاط الترحيل إلى مواقع للأوعية، وتقييم قدرتها على أداء والتوسط تجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة. يوفر هذا البروتوكول مزيدا من المعلومات عن التغيرات في التعبير النمط الظاهري والجيني ماجستير أثر الثقافة المشارك.

Introduction

يحسن عملية معقدة من الأوعية ويحافظ نضح الأنسجة من خلال تعزيز التنمية السفينة دماء جديدة من القائمة من قبل المفرج1. أنها عملية محكم التنظيم، ومتوازنة بعوامل برو-الأوعية والأوعية المضادة. قد يؤدي أي نقص في هذا النظام لصيانة السفينة غير كافية أو النمو، مما تسبب في الأمراض الدماغية الحادة بما في ذلك مرض احتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية، واضطرابات الأعصاب. تطوير الأوعية الدموية مبالغ فيها غير مميزة للشروط بما في ذلك السرطان وأمراض التهابات2.

تطوير العلاجات التي تهدف إلى التحكم في الأوعية لتحقيق تجديد الأنسجة مواتية له أهمية رئيسية. على الرغم من التحقيقات السريرية والسريرية واسعة النطاق، فشلت محاولات لتنشيط الأوعية باستخدام عوامل برو-الأوعية وميكرورناس لتحقيق النتائج المرغوبة3،،من45. تتضمن الأسباب المحتملة لآثار عابرة: طول العمر المحدود للأوعية البروتينات والأحماض النووية، وعدد محدود من استهداف عوامل النمو6،7. على الرغم من أن الأوعية القابلة للذوبان عوامل ضرورية لبدء عملية تولد الأوعية، على الصيانة ووظائف من المفرج تعتمد على دعم أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء وبيريسيتيس8. مجال العلاجات برو-الأوعية الآن هو استكشاف مصادر خلية المحتملة الخلايا الجذعية، والسلف قد توفر عوامل الأوعية محلياً، بينما فعلياً دعم حديثا وضعه المفرج، تجديد ذاتية أو حتى التفريق في خلايا بطانية مثل9،10. إيجاد الأوعية الأمثل أنواع الخلايا مع القدرة على الوفاء بهذه المتطلبات الوظيفية يحمل وعدا كبيرا لتجديد الأنسجة الدماغية.

من أجل ترجمة العلاجات المحتملة يستند إلى الخلية بنجاح في التجارب السريرية، تحتاج الدراسات ما قبل السريرية إثبات فعاليتها وتسليط الضوء على الآليات الأوعية الكامنة. على الرغم من العدد الكبير من فحوصات الأوعية الثابتة، يفتقر المجال "المعيار الذهبي" في المختبر مقايسة التي موثوق يمكن تقييم الفعالية من المحتمل المرشح الخلية أنواع11،12، 13-معظم في المختبر الأوعية فحوصات (بما في ذلك فحوصات تشكيل الانتشار والهجرة وأنبوب غشائي) عادة تقييم آثار الخلايا أو مركبات على التغييرات الشكلية أو التمايز إلى خلايا بطانية أنبوبية وهياكل الشبكة14،15. بينما هذه الميزات حاسمة بالنسبة للأوعية، ينبغي أيضا تقييم مقايسة "قابل للنقل": 1) تكبير أو استبدال أنواع الخلايا الداعمة بما في ذلك بيريسيتيس أو خلايا العضلات الملساء، 2) تجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة و/أو الغشاء، و 3). كفاءة لتشجيع تشكيل ميكروفاسكولاتوري الوظيفية. في فيفو الأوعية النماذج، بما في ذلك فحص القرنية ومقايسة توصيل ماتريجيل، الخص المكروية فريدة من نوعها في فيفو ولكن تحدي عن الصعوبة في خلايا تتبع إدارة لمراقبة التفاعلات الفيزيائية. وعلاوة على ذلك، في فيفو النماذج، يمكن أن تحدث الرفض المناعي كرة بينما تقوم باختبار المرشحين العلاج خلية متمكنة المحتملة16. السابقين فيفو نماذج الأوعية، لا سيما مقايسة حلقة الابهر يمكن أن توفر: 1) السهل والمراقبة والتحديد الكمي لهياكل أنبوبية، وخلايا داعمة 2) التبعي، 3) ECM من المضيف واللوازم الصناعية، 4) الاستبعاد من الالتهابات المكونات، و 5) سريعة وغير مكلفة إعداد17،18. عادة، يمكنك اختبار الإنزيم حلقة الابهر إمكانات الأوعية الصغيرة البروتينات الافرازية، ووكلاء الدوائية، ونماذج القوارض المعدلة وراثيا19،،من2021.

MSCs هم المرشحين الواعدين لتجديد الأوعية الدموية أساسا من خلال23،22،paracrine بوساطة تأثيرات على24. MSCs قد ثبت أن تفرز عوامل الأوعية الرئيسية بما في ذلك الأوعية الدموية غشائي عامل النمو (VEGF)، تتمثل عامل النمو (هجف)، مثل الأنسولين عامل النمو-1 (منتدى إدارة الإنترنت-1)، عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (بفجف) الأساسية، وأنجيوبويتين-1 (إنج-1)25 ،26. ويمكن أيضا الكشف عن MSCs وموطن الدماغية أو التهاب الأنسجة، ولكن الآليات الدقيقة ما زالت قيد التحقيق. متزايدة، والأدب تدعم الفرضية القائلة بأن MSCs معظم تنشأ من ارتشاح الخلايا، وشارك عن علامات بيريسيتي، ويمكن أن تتصرف مثل بيريسيتيس27. هوكبفكس مصدر شباب من MSCs المستمدة من منطقة ارتشاح في الحبل السري البشري. أنها تمثل أن MSCs مع خصائص مثل بيريسيتي واتسمت من الحبال السري FTM والأجل. هوكبفكس FTM إثبات تعبير عالية من علامات بيريسيتي بما في ذلك خصائص المناعي المميز CD146 وفي NG2، إمكانات عالية التكاثري ومولتيلينيجي، وعرض paracrine قوية الشخصية28. هوكبفكس FTM نوع خلية مرشح مثالي لتعزيز التجديد للنسيج المصاب من خلال تعزيز المفرج الجديدة عن طريق خصائصها مثل بيريسيتي.

لاختبار إمكانيات الأوعية وخصائص مثل بيريسيتي من MSCs البشرية، هي عدد محدود جداً من فحوصات الأوعية الهجرة المتاحة حيث الإيجابية أنجيوتروبيك (يشار إليه فيما يلي "صاروخ موجه") وتجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة والتنمية البدنية يمكن أن يحقق التفاعلات بين أنواع الخلايا، في حين الحصول على بيانات كمية في التنمية ميكروفاسكولاتوري.

هنا نقدم بروتوكول يصف تطبيق رواية للمقايسة حلقة الابهر. وكانت MSCs البشرية مثقف يشترك مع النامية المستمدة من الفئران الابهري غشائي شبكات تقييم إسهامها في أنبوب تشكيل والنضج والتوازن. هذا الإصدار من مقايسة حلقة الابهر يقيم قدرة وفاعلية الخلية العلاج المرشحين الصفحة الرئيسية لمواقع الأوعية، نفذ والتوسط من أجل تجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة، والإسهام في التنمية أنبوبي غشائي من خلال إنشاء البدنية مثل بيريسيتي التفاعلات. بالإضافة إلى التحديد الكمي للأثر الصافي من MSCs على تشكيل شبكة غشائي في المختبر ومراقبة التفاعلات بين الخلايا، ونحن أيضا الأمثل بروتوكولا لعزل MSCs من الثقافات المشتركة. عن طريق إجراء التدفق الخلوي وقبكر، فمن الممكن لوصف التغييرات في تعبير النمط الظاهري والجيني ماجستير أثر الثقافة المشتركة. كنموذج أنواع الخلايا، قارنا أونتوجينيتيكالي المبكر (قبل الولادة) وأواخر المصادر (الكبار) من MSCs البشرية: FTM هوكبفكس والبشرية المشتقة من نخاع العظم MSCs (بمسك)، على التوالي، في مقايسة حلقة الابهر. ونحن نقترح أن المقايسة خاتم الابهري يمكن استخدامها لدراسة إمكانات الأوعية من أي نوع الخلية الداعمة ماديا عند قيد التحقيق للتطبيقات التجدد الأوعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع الدراسات التي تنطوي على الحيوانات وسجلت وفقا للمبادئ التوجيهية سيصلون 29. وأجريت جميع الدراسات بموافقة مجلس أخلاقيات البحوث المؤسسية (ريب عدد 4276). جميع الحيوانات إجراءات أقرتها "اللجنة رعاية الحيوان بالشبكة الصحية جامعة" (تورنتو، كندا)، وجميع الحيوانات تلقي الرعاية الإنسانية امتثالا دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، (الطبعة ال 8 المعاهد الوطنية للصحة 2011)-

1-"إعداد المقايسة خاتم الابهري"

  1. عزل الشريان الاورطي الفئران.
    1. يوثانيزي 8-الفئران سبراغ داولي عمرها 10 الأسبوع استخدام الخنق 2 CO: غاز CO مجموعة الدوائر 2 إلى 20% استبدال (معدل التدفق = 0.2 × حجم الدائرة في الدقيقة). تأكيد عدم وجود قرصه العاكسة والقلب يدق بواسطة بالباتينج الصدر.
    2. الرطب الفراء في منطقة الصدر باستخدام شاش معقم مع الإيثانول 70%. استخدام الملقط المعقم ومقص لجعل شق في خط الوسط الصدر وتخترق طبقات الجلد والعضلات.
    3. حالما يتم كشفها القفص الصدري، قص القفص الصدري على كل جانب، وإضعاف صعودا نحو 5 مم من القص على كل جانب. بعض النزيف المتوقع من الشرايين ربية في الجثث الطازجة.
    4. دفع بأنسجة الرئة والقلب إلى الجانب الأيمن التشريحية لفضح الشريان الاورطي. الشريان الاورطي هو الأبيض الملون السفينة يقع المجاورة للعمود الفقري-
    5. استخدام الملقط قرصه الشريان الاورطي (بعد القوس الاورطي) واستخدام مقص الجراحية جعل الشق الأول أثناء الضغط الشريان الاورطي بالملقط. عند قطع الشريان الاورطي، سيتم ملء تجويف الصدر بسرعة مع الدم، ولذلك من الأهمية بمكان أن تعمل بسرعة للحصول على الشريان الاورطي قبل تخثر الدم.
    6. استخدام الملقط لعقد الشريان الاورطي ولطف قشر الابهر نازلا، بعيداً عن العمود الفقري. سيتم السحب قطع الشرايين ربية دون مزيد من شقوق. الحصول على حوالي 10 سم من الأنسجة و/أو قبل أن يقسم إلى فرعين في تجويف البطن الشريان الاورطي وقطع الشريان الاورطي من الذبيحة. دفع الحجاب الحاجز إذا لزم الأمر في اتجاه والذيلية للوصول إلى تخفيض أجزاء من الشريان الاورطي.
      ملاحظة: قشر الشريان الاورطي برفق لأنه شديد القوة يمكن أن يؤدي إلى تمزق. إذا دموع الشريان الاورطي، السماح تخثر الدم لبضع ثوان، واستخدم منشفة ورقية لإزالة الدم متخثر، مما يتيح رؤية الشريان الاورطي المتبقية.
    7. مكان الشريان الاورطي في أنبوب 15 مل مع 10 مل من المثلج هانك ' s حل متوازن الملح (هبس) وتستكمل مع 1% البنسلين/ستربتوميسين (P/S). تبقى هذه الأنابيب على مدت
      ملاحظة: يمكن أن تستمر الأنسجة الابهري ح 1-2 على الجليد، لكن من الأفضل معالجته بأسرع ما يمكن.
  2. تحضير الوسائط الثقافة المقايسة حلقة الابهر في مجلس الوزراء السلامة عقيمة (BSC).
    1. تحضير متوسط نمو غشائي (EGM) باستخدام وحدة ترشيح لتصفية 500 مل متوسطة القاعدية غشائي (EBM) تستكمل مع 2% مصل بقرى الجنين (FBS)، جنتاميسين 1% وعوامل النمو (انظر الجدول للمواد). ضع 50 مل من وسائل الإعلام التي تمت تصفيتها في حمام المياه أو حبة في 37 درجة مئوية.
    2. استخدام وحدة أخرى في الترشيح لتصفية 100 مل EBM تستكمل مع 2% FBS و 1% P/S إلى أعد في EBM 2% FBS (EBM-FBS) وتخزينها في 4 ° C.
  3. معطف لوحات زراعة الأنسجة 12-جيدا مع القاعدية غشاء استخراج (BME) أثناء العمل على الجليد.
    1. مكان لوحة 12-جيدا على سطح بارد (حزمة الجليد كبيرة أو علبة). إضافة 200 ميليلتر/جيدا من استخدام BME المذابة الطازجة المبردة نصائح ماصة ودوامه BME ضمان طلاء حتى. العمل بسرعة لتفادي البلمرة متفاوتاً من BME.
      ملاحظة: ختان الشريان الاورطي نموذجي غلة خواتم الابهري 20. لحساب التباين بين فحوصات حلقة الابهر، إعداد ثلاثة على الأقل حلقة الابهر فحوصات كل مجموعة العلاج وتضمين عنصر تحكم. إذا سمح المصدر، ينصح بخواتم 6 كل مجموعة العلاج.
    2. وضع لوحات المغلفة في حاضنات هوميديفيد (95% رطوبة نسبية، 37 درجة مئوية، ونسبة 5% CO 2؛ وهذه الشروط تنطبق على جميع الخطوات حاضنة هوميديفيد الآخرة) عن 30 دقيقة 1,000 مكان ميليلتر ماصة نصائح العودة إلى-20 درجة مئوية للخطوة 1.5.3.
      ملاحظة: بينما يتم استخدام استخراج الغشاء القاعدي في تركيز المخزون، الاتساق وصلابة مراقبة صارمة في الوقت البلمرة. تأكد من الاحتفاظ بنفس الأوقات البلمرة الدقيق لجميع أوجه الشبه والتجارب المستقلة-
  4. قسم الشريان الاورطي إلى عصابات موحدة.
    1. تأخذ الشريان الاورطي من أنبوبة 15 مل ووضعه في طبق 10 سم مع 10 مل حبس جديدة تستكمل مع 1% ف/س.
    2. استخدام مجموعتين من الملقط بعناية فصل الزائد من النسيج الضام والأنسجة الدهنية، واستخدام مشرط للفروع المتبقية من الشرايين ربية متصلاً بالشريان الاورطي. وهذا يقلل التباين بين وحدات خاتم استناداً إلى مستويات مختلفة من الأنسجة المتبقية. إزالة أي بقايا تخثره الدم من داخل الشريان الاورطي.
    3. وضع المسطرة أو الشبكة تحت الطبق 10 سم قص التحديد 1-2 مم أبواب واسعة من الشريان الاورطي باستخدام مشرط معقم والملقط. قص الأجزاء الدقيقة قدر الإمكان للتقليل من التباين بين وحدات-
  5. تضمين الخواتم الابهر إلى BME.
    ملاحظة: إذا لم تكتمل تمزيقها خواتم الابهر قبل BME البلمرة الحضانة، إزالة لوحات المغلفة من حاضنات هوميديفيد وإضافة 100 ميليلتر من المراعية لكل بئر بإنهاء البلمرة. التوقيت الدقيق أمر بالغ الأهمية قد تتداخل البلمرة المفرط من BME مع الهجرة التنمية وخلية الشبكة البطانية. بمجرد إعداد الحلقات الابهري، إزالة في EBM من الآبار والمتابعة من الخطوة 1.5.2.
    1. إزالة الآبار BME المغلفة من حاضنات هوميديفيد والعودة إلى بكالوريوس العلوم-
    2. تلتقط حلقات الابهري الفردية مع الملقط ومكان واحد في منتصف كل بئر BME المغلفة بعناية. تكرار للحلقات المتبقية الابهري.
      ملاحظة: وسائط نقل جنبا إلى جنب مع الحلبة الابهري ينبغي أن يظل الحد الأدنى لتفادي مخالفات البلمرة.
    3. استخدام تبريد (-20 درجة مئوية) 1,000 ميليلتر ماصة نصائح لإضافة 300 ميليلتر من BME على رأس كل حلقة الابهر وتوزيعها بالتساوي BME حول البئر.
    4. العودة الخواتم الابهري المضمنة لحاضنات هوميديفيد عن 30 دقيقة
    5. إزالة اللوحات مع عصابة الابهري جزءا لا يتجزأ من حاضنات هوميديفيد
    6. وإضافة ببطء ميليلتر 1,000 لاجتماع فريق الخبراء (الخطوة المعدة وحرارة في 1.2.1) عن طريق وضع ماصة تلميح ضد الجدار للثقافة أيضا.
      ملاحظة: بيبيتينج مباشرة في وسائل الإعلام على BME يمكن تعطيل BME مبلمرة وتعيق التنمية شبكة غشائي المستمر. استخدام ماصة متعددة القنوات مناسبة إذا كانت متوفرة.
    7. وبعد 24 ساعة، إزالة ميليلتر 1,000 لاجتماع فريق الخبراء واستبدالها مع 1,000 ميليلتر من EBM-FBS أعد الخطوة 1.2.2، مرة أخرى ببطء بيبيتينج ضد الجانب للثقافة أيضا.
  6. الحفاظ على مقايسة حلقة الابهر بالاستعاضة عن 500 ميليلتر من EBM FBS مع 500 ميليلتر من جديد EBM-FBS (37 درجة مئوية) كل حاء 48
    ملاحظة: انظر ثانيةم 2 لبدء توسيع ثقافة ماجستير في نفس اليوم كحلقة الابهر مقايسة إنشاء. وهذا سيضمن أن MSCs مستعدون للثقافة المشتركة عندما تكون الشبكات بطانية استعداد.
  7. استخدام مجهر الحقل مشرق لمتابعة حلقة الابهر المقايسة غشائي شبكة التنمية (انظر الشكل 1 كمرجع لتطوير شبكة الأمثل). مرة واحدة الجانب المتعلق بشبكات غشائي كما هو مبين في الشكل 2، المضي قدما في إعداد حلقة الابهر المقايسة-ماجستير ثقافات المشارك (الفرع 3). الرجوع إلى الخطوة 4، 1 لمزيد من التفاصيل للتصوير بالشبكات غشائي.

2. زراعة الأنسجة

  1. تحضير حلول الأسهم وسائط زراعة الأنسجة.
    1. "هوكبفكس FTM الثقافة" (المحددة سابقا، ن ≥ 3 خطوط مستقلة لكل) 30 وبمسكس المتاحة تجارياً في ألفا-الفنزويلية وتستكمل مع 10% FBS و 1% P/س.
    2. تعقيم وسائل الإعلام استخدام 0.2 ميكرومتر المسامية حجم تصفية الزجاجات.
    3. تخزين الحلول وسائل الإعلام مستعدة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
  2. الثقافات بمسك والحفاظ على هوكبفك FTM في حاضنات هوميديفيد والمرور في كونفلوينسي 70-80% يحددها الطوري. استخدام وحدات التخزين المناسبة لوسائل الإعلام لحجم طبق استنبات الأنسجة المستخدمة (أي 10 مل في صحن 10 سم). استخدام هذه الشروط الثقافة للحفاظ على وباساجينج MSCs-
  3. ننأى
  4. مونولاييرس لجنة السلامة البحرية باساجينج أو حلقة الابهر المقايسة-ماجستير اشتركت الثقافات استخدام حل إنزيم الانفصال (طبق مل 4/10 سم) واحتضانها في الحاضنات هوميديفيد للحد الأدنى 3 ضمان المفرزة من الخلايا باستخدام مجهر الحقل مشرق؛ واحتضان لمدة 1-2 إضافية دقيقة إذا لزم الأمر-
  5. نقل الخلايا معزولة إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 غرام x للحد الأدنى 5
  6. نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلايا وريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من وسائط الإعلام الثقافة المناسبة (ألفا-الفنزويلية الإعلامية الكاملة باساجينج الخلايا أو FBS المراعية للثقافات المشارك الإنزيم/ماجستير خاتم الابهر) لعد استخدام عداد خلية.

3. إعداد "الابهري الثقافات" المشارك الإنزيم/ماجستير خاتم

المضمنة
  1. 10 البذور 4 MSCs في كل حلقة الابهر (9,000 الخلايا/سم 2/12-جيدا لوحة). استناداً إلى العدد فحوصات حلقة الابهر، وصمة عار قبل MSCs بصبغة الفلورسنت قابلة للحياة، نونترانسفيرابل. صيانة الآبار ثلاثة على الأقل من حلقات الابهر دون MSCs لمجموعة مراقبة.
    1. بوصمة عار 10 5 MSCs/mL EBM-FBS الإعلامية، إضافة 2.5 ميليلتر لصالحه، مزيج وسائط صبغة الفلورسنت غير قابلة للتحويل/مليلتر (5 ميكرون) إلى الأنبوبة 15 مل ومكان في الحاضنة هوميديفيد عن 30 دقيقة بلطف الأنبوب في منتصف الطريق من خلال الاحتضان.
    2. التالية 30 دقيقة بالحضانة، إضافة إلى حجم 1 من FBS EBM الطازجة إلى الخلايا الملون وتدور في ز 400 x للحد الأدنى 5
    3. إعادة وقف بيليه الخلية في 1 مل الإعلام EBM FBS
    4. وإزالة المادة طافية. تأكيد تلطيخ ناجحة من MSCs استخدام مجهر الأسفار.
  2. إزالة اللوحات المحتوية على حلقة الابهر من الحاضنة هوميديفيد وإزالة 500 ميليلتر من EBM FBS من كل بئر.
  3. البذور بعناية 10 4 MSCs في 500 ميليلتر من EBM FBS في كل حلقة الابهر جزءا لا يتجزأ من بيبيتينج بالتساوي حول شبكات بطانية. ضمان التوزيع حتى بالهز برفق لوحة الثقافة.
    1. إضافة FBS EBM إضافية لضمان أن الحجم الإجمالي لوسائط الإعلام بشأن ثقافات المشارك الإنزيم/ماجستير خاتم الابهري ميليلتر 1,000-
  4. استخدام مجهر الأسفار لتصور MSCs المسمى فلوريسسينتلي في مقايسة خاتم الابهري.

4-الفحص المجهري

  1. مجهرية مشرق الحقل استخدام الصورة في شبكات غشائي الفئران قبل حلقة الابهر المقايسة/الماجستير اشتركت الثقافات لقياسات أساسية (يوم 0) من خصائص الشبكة غشائي (مثلاً، شبكة طول شبكة الحلقات). الصورة 4 أرباع الدائرة الواحدة جيدا من الطوق الابهر إلى الجزء الأبعد من الشبكة البطانية داخل هذا رباعي. شبكات خاتم
    1. الصورة الابهري عقب حلقة الابهر المقايسة/ماجستير الثقافات شاركت في أيام 3 و 5 و 7. استخدم هذه الصور لقياس تأثير لجنة السلامة البحرية على تطوير شبكة غشائي.
  2. استخدام مجهر الأسفار للصورة MSCs المسمى مسبقاً في مقايسة حلقة الابهر. الثقافات
    1. ح من حلقة الابهر المقايسة/ماجستير التالية 24 المشارك، واستخدام مجهر الأسفار تصور صاروخ موجه لجنة السلامة البحرية، واستطالة والتكامل مع الشبكات بطانية. تتداخل الصور الفلورية من MSCs مع الصور الميدانية مشرق من خلايا بطانية لمراقبة كولوكاليزيشن من كل أنواع الخلايا.
    2. صورة MSCs المترجمة داخل شبكات غشائي المتقدمة الدانية للنسيج الدائري الابهر، و MSCs المترجمة داخل حديثا تطوير الشبكات البعيدة للنسيج الدائري الابهري ( الشكل 2).

5. التدفق الخلوي وقبكر

  1. يوم واحد قبل الناي بشبكات غشائي حلقة الابهر، ذوبان الجليد ديسباسي المجمدة في 4 درجات مئوية س/أ. القسم 5.3 مطابق للتدفق الخلوي و qPCR.
  2. دافئ 50 مل من ديسباسي و 50 مل من التربسين 0.5% في حمام المياه أو حبة 37 درجة مئوية.
  3. استرداد
  4. الخلايا للتحليل من ثقافات المشارك الإنزيم/ماجستير خاتم الابهري.
    1. بعد 1 أسبوع حلقة الابهر المقايسة/ماجستير ثقافة المشارك، قم بإزالة وسائط الثقافة وإضافة 1 مل من فوسفاتيبوفيريد المالحة (PBS) ببطء كل جيدا لمدة 3 دقائق وإزالة. كرر هذا يغسل مرتين أكثر.
    2. إضافة 800 ميليلتر من قبل استعد ديسباسي لكل بئر واحتضانها في الحاضنات هوميديفيد عن 15 دقيقة
    3. إزالة اللوحات من حاضنات هوميديفيد وتعليق ديسباسي من بيبيتينج (5-10 x) لتفريق BME نقل محتويات كل بئر في أنابيب منفصلة 15 مل.
    4. كرر الخطوة 5.3.3 مرة أخرى مع ديسباسي قبل حرارة جديدة حتى لا تبقى BME الملاحظ في الثقافة أيضا. إضافة إلى حجم 1 من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 3% FBS إلى تعليق خلية ديسباسي لإلغاء تنشيط في ديسباسي. إزالة الخواتم الابهري العائمة في تعليق خلية باستخدام تلميحات ماصة.
    5. تدور تعليق خلية في 400 x ز لإزالة الحد الأدنى 5 المادة طافية بعناية، تاركاً 3 مل تعليق خلية في أنبوب 15 مل.
      ملاحظة: بيليه واضح ومتين قد لا تكون مرئية ولكن BME وخلايا موجودة.
    6. التربسين
    7. أضف 3 مل من بريوارميد 0.5% إلى تعليق خلية ونشاط الخلايا ريسوسبيند (5-10 x من بيبيتينج). تبني الحلول الخلية تريبسينيزيد في حاضنات هوميديفيد للحد الأدنى 10
    8. إزالة تعليق خلية تريبسينيزيد من حاضنات هوميديفيد
    9. وإضافة 6 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 3% FBS وريسوسبيند تيم قليلةوفاق. تدور تعليق خلية في 400 غرام x للحد الأدنى 5
    10. بعناية إزالة جميع المادة طافية، تاركاً بيليه الخلية في الأنبوب وريسوسبيند الخلايا في 1 مل برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 3% FBS في كل أنبوبة.
    11. تصفية
    12. تعليق خلية 1 مل باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرون لإزالة الخلايا المجمعة و BME المتبقية من تعليق خلية. عد الخلايا الموجودة في 1 مل تعليق خلية باستخدام عداد خلية.
  5. إعداد الخلايا للتدفق الخلوي. تعليق
    1. إينكوباتي الخلية (10 5 خلايا في 200 ميليلتر PBS تستكمل مع 3% FBS) مع الأجسام الأولية (فيتك أو APC) مترافق fluorophore (هيئة تنظيم الاتصالات-1-85-، CD146، CD31) تركيز = 01:40) عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، محمية من الضوء.
      ملاحظة: كان الأمثل التدفق الخلوي ل MSCs قبل هونغ et al., 2013 28. الحد ني خلايا 10,000 مطلوب لقراءات دقيقة.
    2. بعد في الحضانة و 30 دقيقة، ريسوسبيند الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 3% FBS وأجهزة الطرد المركزي (400 x ز، 5 دقيقة)-
    3. الخلايا تبقى في 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى تحليل بالتدفق الخلوي (الأحداث على الأقل 1 × 10 4) ضمن ح 1. الاستراتيجية النابضة، انظر التكميلية الرقم 1. فرز البشرية MSCs استخدام مكافحة-هيئة تنظيم الاتصالات-1-85 (APC) (تركيز: 01:40 وفي 0.5% FBS/برنامج تلفزيوني) وفرز الخلايا إلى 350 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية لتحليل qPCR.
      ملاحظة: يمكن تخزين تفكيك خلايا في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر لتحليل قبكر المستقبل-
  6. إعداد الخلايا لتحليل قبكر.
    1. عزل الحمض النووي الريبي من تفكيك الخلايا باستخدام مجموعات عزل الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي والجودة-
    2. كدنا تحضير من يصل إلى 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي للواحد 100 ميليلتر المنتسخة العكسية رد فعل. القيام بخطوة ما قبل تضخيم إذا كانت منخفضة الغلة الحمض النووي الريبي (< 10 نانوغرام/ميليلتر). استخدام أقل من 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي سيؤدي إلى ارتفاع معدل السلبيات الكاذبة.
      ملاحظة: يمكن تخزين القوالب كدنا في-20 درجة مئوية لمزيد من التحليل لمدة تصل إلى 4 أشهر.
    3. أداء
    4. قبكر استخدام الأوعية التعبير صفائف منشئ ملفات التعريف للكشف عن التغييرات في التعبير الجيني. استخدام 5 نانوغرام من كدنا كل رد فعل (دورات 40، 60 درجة مئوية الصلب/توسيع نطاق درجة الحرارة). التعبير عن تغير إضعاف التعبير مقارنة بعينات كدنا MSC المشتقة غير متمايزة. تشغيل عناصر التحكم المناسبة السلبية (حلقة الابهر دون MSCs البشرية)-

6. شبكة القياس الكمي التالية الابهري حلقة الإنزيم/ماجستير المشارك "الثقافات"

  1. تحميل برامج التصوير مثل ImageJ جنبا إلى جنب مع "محلل الأوعية" المساعد 31-
  2. استيراد الصور الشبكة البطانية التي اتخذت وفتح باستخدام البرمجيات-
  3. تحويل مقاييس الصورة استناداً إلى مواصفات المجهر المستخدمة.
  4. استخدام أداة الخط مستقيم لقياس نمو شبكة شعاعي.
  5. عد الحلقات غشائي شبكة باستخدام أداة العداد الخلية (ينبغي أن يكون كمياً الحلقات مع الجانبين على الأقل 4)-
  6. للقياس الكمي إضافية من خصائص شبكة الاتصال، استخدام البرنامج المساعد "محلل الأوعية" أو الإضافات الأخرى المماثلة لتحليل قطاعات رئيسية، إجمالي طول الجزء، مجالات الشبكة الكلية، وعدد من الوصلات. استخدم أداة قناع غير واضحة لطمس الأنسجة حلقة الابهر والمساحات الفارغة لتجنب عمليات حسابية إيجابية زائفة.
  7. نقل القيم إلى إحصاءات البرنامج والرسم البياني غشائي خصائص شبكة اتصال بعد ثقافات المشارك الإنزيم/ماجستير خاتم الابهري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تدفق العمل التخطيطي لإنشاء المقايسة ثقافة المشارك الابهري خاتم/ماجستير يتجلى في الشكل 1. وتشمل الخطوات الرئيسية: الفئران الشريان الاورطي العزلة وتمزيقها وتضمين الخواتم الابهري، رصد تنتشر بطانية وتطوير الشبكة، وأخيراً وضع العلامات والقائمة MSCs. الجدول الزمني لتحليل شبكة غشائي يوجز الإطار للتحليلات الممكنة لكل فترة لاستزراع المشترك: اليوم 1، 5 & 7. هي أبرز ملاحظات إضافية مربعات منقطة.

تحديد مناطق متميزة هيكلياً في الثقافات الخلية البطانية الابهر خاتم يؤديها الحقل مشرق مجهرية، 3-5 د بعد الحلقات الابهري المضمنة في إدارة المحتوى في المؤسسة (الشكل 2). تتميز المنطقة غير منظم (الشكل 2A) كمنطقة لتكاثر الخلايا عالية ولكن المنظمة الهيكلية منخفضة في المنطقة المجاورة مباشرة للنسيج الابهري. الشبكات المتقدمة غشائي (الشكل 2) أشير إلى المناطق مع ارتفاع الهيكل التنظيمي، حيث اكتمل إنشاء الشبكات وتتألف أساسا من الحلقات المغلقة، حتى قبل إضافة MSCs. شبكات النامية (الشكل 2) تقع في المناطق البعيدة من الثقافات بطانية. هذه هي مواقع الهجرة الخلية البطانية، واستطالة كشكل هياكل شبكة جديدة. المناطق الثلاث المذكورة أعلاه يمكن تمييزها بسهولة في جميع أنحاء هذه التجارب وتستخدم عند الإشارة إلى حيث موطن MSCs في الثقافات المشتركة. ينبغي أن يكون MSCs بريلابيليد مثقف يشترك مع المقايسة حلقة الابهر عندما وضعت كل ثلاثة أجزاء الشبكة. التحديد الكمي لشبكات غشائي بعد ماجستير الثقافات المشتركة تشمل مناطق الشبكة المتقدمة والنامية (الشكل 2، الإطار الأبيض).

يسمح fluorescence الفحص المجهري للقياسات النوعية. ماجستير الهجرة والاندماج ومورفولوجيا بالتزامن مع تطوير شبكات غشائي في مقايسة ثقافة المشارك الابهري خاتم-ماجستير (الشكل 3). تم تصويرها MSCs المسمى مع fluorophore قابلة للحياة، هيولى ح 24 بعد الإدارة للثقافات المشتركة. هوكبفكس FTM عثر عليها في محيط الشبكات غشائي النامي، عرض مورفولوجيس خلية ممدود، وأسهمت في زيادة تطوير شبكات غشائي (الشكل 3 أ، ب). للمقارنة، المخزن بمسكس إلى شبكات النامي أثناء عرض أقل التفاعل مع خلايا بطانية (الشكل 3د). وقد أظهرت الصور عالية التكبير في ح 72 الحفاظ على هوكبفكس FTM تغطية عالية واستقرار الشبكات غشائي بينما بمسكس في الثقافات المشتركة المقدمة مع مورفولوجيس كروية مع محدودية الاندماج في الشبكات غشائي (3E الشكل وو). الملاحظة بوضوح الاختلافات الاختلافات النوعية، والوظيفية بين البشرية ماجستير أنواع. نوع خلية مرشح علاجية له صاروخ موجه كبيرة وخصائص التكامل غشائي (الشكل 3 ألف، ب & ه) تبرز بالمقارنة مع نوع خلية مع تكامل شبكة غشائي محدود وتكبير قدرات (الشكل 3، د & و).

التكبير عالية fluorescence مجهرية الصور تم الحصول عليها كذلك تشريح التفاعلات الفيزيائية بين خلايا بطانية وهوكبفكس FTM في شبكات أنبوبي. هوكبفكس FTM المسمى مسبقاً (الشكل 4A، الأخضر) تظهر الالتزام مع خلايا البطانية أونستينيد (الشكل 4 أ، الأبيض الأسهم). تم العثور على هوكبفكس FTM لتوفير الدعم الهيكلي للخلايا البطانية بوصفه سطح محور ومرفق بين العقد. يمكن أيضا أن تكون شبكات غشائي خاتم الابهري المسمى مسبقاً باستخدام fluorophore قابلة للحياة وبالمثل إلى لجنة السلامة البحرية تلطيخ (الشكل 4 باء، الأحمر). في الثقافات المشارك الملون مزدوجة، كشفت مجهرية fluorescence الالتصاقات ممدود بين أنواع الخلايا اثنين، تحصين ملاحظة التعاون والسلوك خلية داعمة.

التحديد الكمي لخصائص هيكلية الشبكة البطانية أجريت في اليوم الخامس من الثقافات المشتركة لجنة السلامة البحرية (الشكل 5). تم تعريف الأرباع موحدة للقياس في جميع أنحاء شبكة ring الابهري كامل غشائي (الشكل 2، الإطار الأبيض). وحسب نمو الشبكة يعني كالمسافة من الحلقات الدانية الشبكة المغلقة الأولى بخاتم الابهر إلى أبعد القاصي مغلقة الحلقات (حجم دائرة نصف قطرها) (الشكل 5 ألف). نمو شبكة يعني ماجستير خاتم الابهري الثقافات المشارك على النحو التالي: FTM هوكبفكس (2.98 ±0.3 ملم) وبمسكس (1.5 ±0.15 ملم). شبكات غشائي غير المعالجة المتقدمة قطرها يعني 1.9 هو مم. المقارنة الإحصائية بين المجموعات المعاملة MSC أثبتت أن هوكبفكس FTM أسهم في نمو الشبكة أكبر بكثير بالمقارنة مع بمسكس والشبكات غير المعالجة (ف ≤0.001). على شبكات غشائي غير المعالجة المتقدمة إلى حد كبير أكثر من بمسك التي تحتوي على الثقافات المشتركة (ف ≤0.01) (الشكل 5 (ب)).

إجمالي عدد الحلقات المحسوبة في كل رباعي ومعبرا عنها بتشكيل حلقة مجموع متوسط (الشكل 5). عدد متوسط من مجموع الحلقات المغلقة وكانت كما يلي: هوكبفك FTM تعامل الثقافات المشتركة (81 ±7)، بمسكس (26 ±3) ودون علاج سيد الخواتم (55 ±7). هوكبفكس FTM أسهمت في تشكيل حلقة غشائي أكبر بكثير بالمقارنة مع بمسكس (≤0.01ف ) والشبكات غير المعالجة (ف ≤0.01). بمسك اشتركت الثقافات غشائي أسفرت أقل شبكة الحلقات بالمقارنة مع الشبكات غير المعالجة (ف ≤0.01). يحدد هذا التحديد الكمي نوع خلية له تأثير إيجابي كبير على تطوير شبكة غشائي (FTM هوكبفك) وهو نوع من خلية حتى قد يؤثر على شبكات بطانية. للإشارة إلى أن تطوير شبكة زيادة كبيرة ولوحظ أن ترتبط أيضا بتغطية ماجستير في الشبكات غشائي. ويقترح أن التفاعلات المباشرة حاسمة بالنسبة ل MSCs تنفيذ مهمتهم داعمة.

يتم تمثيل المزالق المحتملة من المنشآت الثقافة المشارك حلقة الابهر في الشكل 6. البلمرة غير كافية أو غير متكافئ من BME هو مشكلة التي يمكن أن تتداخل مع شبكة غشائي نجاح التنمية. وستكفل توقيت البلمرة BME لمدة 30 دقيقة بالضبط، وتحويل وسائل الإعلام دون تعطيل البوليمر BME وظيفية سليمة، ومرحلة (الشكل 6A). تلوين MSCs لأوقات طويلة حضانة والسماح MSCs بيليه لفترات طويلة قد تتداخل مع مورفولوجيا الخلايا والنمط الظاهري على الثقافات المشتركة. يظهر الشكل 5B هوكبفكس FTM الملون ح 1 ويسمحلبيليه ل 1 ح قبل ثقافة المشارك، كلاهما يجري توقيت دون المستوى الأمثل. عدم إظهار الأفضلية لمواقع الشبكات غشائي هوكبفكس FTM وهي منتشرة في جميع أنحاء الشبكة. مقارنة بشكل صحيح يعامل الخلايا (الشكل 3) إلى أساءوا FTM هوكبفكس، عرض الخلايا أساءوا مورفولوجيا تقريب الخلية والتفاعلات خلية إلى خلية محدودة مع خلايا البطانية (الشكل 6B). وأخيراً، إذا تعذر إثبات المقايسة الابهري حلقة اليوم من التشريح، يمكن تخزينها في أورتاس في-80 درجة مئوية في EGM-جيم وسائل الإعلام وتستكمل مع 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) و 10% FBS. تطوير شبكة غشائي قد يستغرق 1-3 د أطول عند تطبيق خواتم الابهري المذابة مقارنة بأنسجة جديدة، ولكن الشبكات غشائي ستكون كافية لإنشاء ثقافة المشارك ماجستير (الشكل 6).

كإجراء بديل التقييم المشارك الثقافة حلقة الابهر، الكسر الخلوية الخواتم الابهري BME مضمنة يمكن استخراجه وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي (تكميلية الشكل 1). واعتبرت علامة محددة البشرية هيئة تنظيم الاتصالات-1-85 (تكميلية الشكل 1A، ب، محور y) الخلية إيجابية السكان من هوكبفك FTM التي تحتوي على الثقافات المشتركة MSCs البشرية. وسم المشاركة أظهر التعبير المنخفض علامة الخلية البطانية CD31 ("تكميلية الشكل" 1A) والتعبير عالية من علامة بيريسيتي CD146 ("تكميلية الشكل" 1B) ضمن السكان خلية إيجابية علامة محددة البشرية. مثل هذا التقييم يمكن فك إيمونوفينوتيبيك في نهاية المطاف ونسب الالتزام التغييرات من MSCs الناجمة عن التفاعل مع خلايا بطانية، وتقديم المزيد من معلومات قيمة حول نوع اختبار الخلية. من أجل الحصول على عدد كاف من الخلايا لتحليل FC، يمكن الجمع بين الخلايا المستخرجة من الآبار موازية في نفس المجموعة التجريبية. من المهم أن تنظر في استخدام ماجستير الملون من قبل غير المحتوية على الخواتم الابهر لتحليل التدفق الخلوي حيث أن الأسفار تذكرنا بصبغة قابلة للتطبيق لا تتداخل مع الإشارة الواردة من فلوروفوريس المتصلة بجسم. إلا ينبغي أن تتخذ النابضة السلبية fluorescence الخلية الملطخة مسبقاً في الاعتبار.

نحن فرز MSCs النموذج المستخرج حلقة الابهر المشارك الثقافات الإنسانية (يوم 7 من ثقافة المشارك) باستخدام الخلايا البشرية علامة سطح جسم محددة (هيئة تنظيم الاتصالات-1-85). هوكبفكس FTM وبمسكس استردادها من مقايسة حلقة الابهر جهزت لتحليل qPCR لاختبار الجينات الأوعية. استخدام صفيف qPCR متاحة تجارياً، قدمت ثلاث ثقافات المشارك حلقة الابهر كميات كافية من المواد الجينية لتحديد الجينات البشرية عامل النمو 84 (2A الشكل التكميلية). النتائج الأولية تشير إلى أن هوكبفكس FTM وبمسكس التعبير عن العوامل الرئيسية الأوعية يفرز على مستويات مماثلة ("الشكل التكميلية" 2B). بالإضافة إلى مقارنة مستويات التعبير من أنواع الخلايا المختلفة في المقايسة، أساس أثر نقل الخلايا إلى EBM المقايسة ينبغي النظر في وسائل الإعلام من وسائل الإعلام ثقافة التوسع. عند استخدام الخلايا من أعلى اللدونة المظهرية أو الوراثية، أن يدرج مجموعة مراقبة المقارنة من MSCs البشرية في وسائل الإعلام EBM-دون النسيج الابهري-في التقييم.

أوجه التشابه في التعبير عامل الأوعية من MSCs تشير إلى أن الفرق كبير في تكبير الشبكة بهم ليست نتيجة لأنشطة مختلفة باراكريني. هذا في التوافق مع ملاحظة سابقة تظهر زيادة التفاعل المباشر بين الخلايا لتشجيع تطوير شبكة بطانية.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لتطبيق رواية لإعداد المقايسة حلقة الابهر.
الخطوات الأساسية لإعداد وتحليل الثقافات MSC المشارك مع المقايسة حلقة الابهر يرد في مربعات صلبة وملاحظات إضافية مبينة في مربعات منقطة. شريط المقياس = 1,000 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: صورة الممثل لتحليل شبكة Ring الابهري.
شبكات بطانية وتنقسم إلى ثلاث مناطق متحدة المركز على أساس الاختلافات الهيكلية: المجال غير منظم بالقرب من حلقة الابهر الأنسجة (A) ووضع هيكل شبكات غشائي (ب) وتطوير شبكات وتقع في المحيط السابقين فيفو الأنسجة ثقافة (ج). يتم تعريف نمو شبكة شعاعي ورباعي موحد لعدد مرات تكرار حلقي داخل الشبكة المتقدمة غشائي (ب). العاشر: حلقة غشائي مغلقة عدها في رباعي موحد. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الفلورسنت "التصوير شبكة" المنطقة تعتمد على التكامل للبشرية MSCs في "مقايسة حلقة الابهر" بعد 24 & ح 72.
وأضيفت إلى شبكات أنبوب غشائي حلقة الابهر النامية هوكبفكس FTM (الأخضر) بريستينيد وبمسكس. الأسفار مجهرية الصور الملتقطة 24 ساعة بعد إنشاء عرض الثقافات المشتركة لجنة السلامة البحرية هوكبفكس FTM التي تهاجر من خلال إدارة المحتوى في المؤسسة والمنزل لشبكات غشائي النامية الطرفية (A). عرض أعلى تكبير الصور مورفولوجيس ممدود من هوكبفكس FTM في اتصال وثيق مع شبكات غشائي (ب). بمسكس عملية إدارة المحتوى في المؤسسة والمنزل لشبكات غشائي مع أي تفضيل ملحوظ لشبكات النامية الطرفية (ج) أقل. عرض بمسكس مورفولوجيس خلية كروية (د).
التكبير عالية fluorescence الصور مجهرية من MSCs بريستاينيد في مقايسة حلقة الابهر الفئران بعد 72 ساعة ثقافة المشارك (ه، و). يقدم هوكبفكس FTM مورفولوجيس ممدود أثناء عرض تغطية بطانية من خلال التفاعلات الخلية إلى الخلية مباشرة مع خلايا بطانية (الأسهم البيضاء الصلبة) في عقد الشبكة والأنابيب (ه) على حد سواء. بمسكس: الحفاظ على مورفولوجيس خلية كروية مجمعة في العقد الشبكة غشائي (F). ويمثل السهم المكسور اتجاه نمو غشائي شبكة من الأنسجة حلقة الابهر. C:، مقياس بار = ميكرومتر 1,000 ب، مقياس d:بار = 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: التكبير عالية Fluorescence الصور مجهرية الخلية بيريسيتي بطانية التفاعلات الفيزيائية.
تم العثور على خلايا بطانية أونستينيد المرتبطة بنتوءات مستمر الاتصال هوكبفكس FTM ملطخة مسبقاً في شبكة أنبوبية (A). الصور الفلورية شبكات بطانية ملطخة مسبقاً (EC، أحمر) مع الملون قبل FTM هوكبفكس (FTM) الأخضر تبين التفاعلات أتصدى خلية بطانية، التفاعلات بيريسيتي (ب). ألف: الجدول شريط = 100 شريط ب: مقياس ميكرومتر = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التقدير الكمي لنمو الشبكة في معاملة MSC المجموعات 5 د بعد إنشاء ثقافة المشارك.
مرحلة تضخم منخفض التباين مجهرية الصور أخذت من مجموعات العلاج حلقة الابهر لتدبير شبكة النمو والتنمية (A). يظهر السهم المتناثرة باتجاه نمو الشبكة. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. الفحص المجهري واستخدمت الصور تحديد خصائص شبكة الاتصال، بما في ذلك نمو الشبكة يعني ويعني تشكيل حلقة الشبكة في مقايسة واحد رباعي. هوكبفكس FTM التي أسهمت في نمو الشبكة أكبر بالمقارنة مع الثقافات المشتركة بمسك والشبكات غير المعالجة (ف ≤0.001) (ب). تم حساب قيمة ف استخدام ANOVA أحادي اتجاه أن تكون ف <0.0001 استخدام توكي في مرحلة ما بعد الاختبار (N = 3). تم قياس كمية حلقات شبكة مع أربعة على الأقل من الجانبين مغلقة (ج). هوكبفك FTM اشتركت الثقافات المتقدمة حلقات شبكة أكبر عند مقارنتها بالثقافات المشتركة بمسك (≤0.001 ف) والشبكات غير المعالجة (ف ≤0.01). تم حساب قيمة ف استخدام ANOVA أحادي اتجاه أن تكون ف < 0.0001 باستخدام اختبار توكي لوظيفة (N = 3). تم قياس كمية متوسط 4 مجالات الشبكات بطانية. شريط المقياس = 250 ميكرون. لمقارنة عشوائية، * = ≤0.05 ف، * * = p ≤0.01، * * * = ≤0.001 ف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6: الأخطاء المحتملة في إنشاء حلقة الابهر المقايسة.
خواتم الابهري جزءا لا يتجزأ من غير مكتملة BME البلمرة قد يؤدي إلى شبكات غشائي غير متناسقة وكسر (A). FTM هوكبفكس الملون لفترات طويلة مع الوقت كبيرة الفجوات بين تلطيخ ووضع الثقافات المشارك والعائد الأدنى صاروخ موجه والتفاعلات بين الخلايا البطانية (ب). الشبكة البطانية من الشريان الاورطي الفئران المخزنة في-80 درجة مئوية وإذابة للمقايسة حلقة الابهر (ج). ألف: الجدول شريط = 250 ميكرون ب، c: مقياس بار = 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

التكميلية الرقم 1: تدفق تحليل الخلوي هوكبفكس FTM البشرية المستخرجة من الثقافات المشتركة حلقة الابهر.
كسور الخلوية من الثقافات حلقة الابهر معزولة وتجهيزها لتحليل التدفق الخلوي. تم تطبيق Fluorophore جسم مترافق ضد علامة خلية محددة البشرية السطحية (هيئة تنظيم الاتصالات-1-85، آسيا والمحيط الهادئ) في تركيبة مع علامة غشائي (CD31، فيتك، (A)) أو أجسام مضادة محددة بيريسيتي ماركر (CD146، فيتك، (ب)). السكان خلية إيجابية بالنسبة لعلامة البشرية (محور ص) اختبار الإيجابية منخفضة غشائي علامة CD31 (A, Q2) وإيجابية عالية لعلامة بيريسيتي CD146 (ب، س 6). هذا يوحي بأن هوكبفكس FTM الحفاظ على خصائص الخلية ارتشاح في ثقافات المشاركين حلقة الابهر، ولم يطور النمط الظاهري بطانية. تم تعريف الأرباع على قطع استخدام عناصر تحكم ايستب مطابقة الأضداد الأساسية التطبيقية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية رقم 2: تحليل PCR الكمي من الجينات الأوعية الرئيسية.
التعبير الجيني مماثلة من الجينات الأوعية الرئيسية FTM هوكبفكس وبمسكس بعد 1-أسبوع الثقافة المشارك في مقايسة حلقة الابهر (A). يتم عرض القيم المقطعية الممثل في الجدول (ب). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك عدة مراحل حاسمة في إعداد مقايسة حلقة الابهر ناجحة ماجستير ثقافة المشارك التجربة. أولاً، أهم الخطوات عند عزل وتقطيع الشريان الاورطي: 1) الحصول على حصرا في الجزء الصدري من الشريان الاورطي؛ 2) بعناية إزالة الأوعية الدموية المتفرعة والضامة والأنسجة الدهنية و؛ 3) قطع المقاطع حتى من الشريان الاورطي (~ 1 ملم) للحد من تقلب بين كل فحص. ثانيا، تضمين ناجحة من عصابات الابهر إلى BME أمر حاسم لهذا التحليل. إذا كان لا تماما BME بلمرة أو بلمرة متفاوت، الخواتم الابهري جزءا لا يتجزأ من BME لن تكون قادراً على بدء تنتشر بطانية أو أنهم قد وضع شبكات غشائي متقطع. في حالة عدم كفاية البلمرة BME، فحوصات لا يمكن التعويل عليها للقياس الكمي. ثالثا، وسائل الإعلام بطانية كاملة عامل إثراء اللازم لتوفير الغذاء الخواتم الابهر لبدء تنتشر. مجرد حلقات حلقة الابهر بدأت تنتشر في السفينة، تشمل الخطوات المقبلة الحاسمة المقبلة نوع الخلية التي يتم اختبارها. وتحقيقا لهذه الغاية، يلزم MSCs بنجاح قبل الملون وإدارته للحلقات الابهري تبرعم. هناك اثنين من الإجراءات الحاسمة لهذا القسم. 1) اختيار اليوم المناسب للبذر: ينبغي أن تكون في مرحلة تطوير الشبكات ولا يمكن التوصل إلى تغطية عالية للثقافة أيضا. إذا لم تدار MSCs في الوقت مناسب، يصبح تحديا لقياس صافي آثار MSCs على تطوير الشبكة. 2) بريستاينينج MSCs قبل إضافة: إذا ملطخة الإفراط MSCs أو البقاء في بيليه لفترة طويلة من الوقت، التثاقل سوف يحدث أن يضعف صاروخ موجه والتكامل داخل شبكات بطانية. وأخيراً، التحديد الكمي للشبكات بسهولة يتحقق إذا تعد الضوابط المناسبة. خواتم الابهر دون MSCs ستضع شبكات بطانية للشريان الاورطي نفسه يدعم تنتشر، ولكن MSCs قد تعزز تنمية شبكة أكبر مع هياكل مختلفة لشبكة الاتصال كما هو موضح في هذه المخطوطة. التحديد الكمي لشبكات غشائي ينبغي أن يؤديها على الأقل 5 د التالية وضع المشارك الثقافات. بسبب نظام مغلق، استجابة الأوعية عابرة وشبكات غشائي بدء التدهور بعد حوالي 7 د. إذا كان غرض الملاحظة لتقييم تأثير نوع الخلية تم اختبارها على تطوير شبكات بطانية، ينبغي الحصول على الصور خلال الأسبوع الأول من استزراع المشترك.

إمكانية إدخال تعديل المقايسة الحالية يمكن أن يكون تطبيق الأنسجة البشرية الأساسية. كما يجعل قسم 1 ملم من الشريان الاورطي الجرذ وحدة واحدة للثقافة المشتركة، يمكن أن توفر أورتاس البشرية مع عدد كبير من المقاطع لقياسات عالية متسقة. وعلى الرغم من توافر مقيدة بدرجة عالية من الأنسجة الأولية قابلة للحياة البشرية، تقترح مخرجات عالية الجدوى المحتملة. عند وضع مقايسة لتقييمات واسعة النطاق، يمكن اعتبار تشكيل مسبقاً المقايسة وتخزين مكوناته حتى تصبح الخلايا ﻻختبار المتاحة. يمكن إعداد لوحات زراعة الأنسجة على طلاء BME وتخزينها في نموذج المجمدة والمجففة لفترات أطول من الوقت. أيضا، كما أننا تم اختبارها في المختبر، الفئران الابهري الأنسجة يمكن المجمدة والمخزنة لطلب لاحق، مما يجعل العمل مع العنصر الأكثر أهمية للمقايسة أكثر ملاءمة.

على الرغم من العديد من المزايا للمقايسة حلقة الابهر، هناك عدد قليل من القيود إدراجها. أولاً، أن إنشاء ثقافات الإنزيم يمكن أن يكون تحديا. في شكله الحالي، يتطلب التطبيق الروتيني كافية من المهارات اليدوية. يمكن إدخال أخطاء المشغل تقلبه. يمكن أن تكون متطابقة في نمو الشبكة، ويمكن أن تجعل من الصعب على تقييم موثوق بها تأثير الخلايا التي تدار وخصائص الأوعية هامة وبالتالي. ومع ذلك، هذه التحديات مماثلة إذا لم أصغر بالمقارنة مع تلك الوسائل الأخرى المتاحة، وفترة التدريب المطلوبة يمكن مريح قصيرة والاقتصادية بدلاً من تجارب في فيفو . الثانية، فترة تأخير بين التضمين النسيج الابهري السابقين فيفو وتطوير الشبكة الأولى التي يصادف وقت الإدارة خلية يحتاج إلى أن يعزى للمستخدم. ثالثا، التحديد الكمي لخصائص الشبكة البطانية يمكن أن تكون مضيعة للوقت ولكن يمكن حلها عن طريق تعيين معلمات السمة المميزة، بما في ذلك النمو شعاعي، أنبوب الأبعاد مش طول وشبكة. ويمكن إجراء ذلك باستخدام الحاسوب في تحليل الصور (الصورة ياء)، التي يمكن أن تقلل إلى حد كبير الوقت اللازم للقياس الكمي متسقة وموثوق بها. رابعا، يمكن أن يحدث التباين بين كل فحص نتيجة التضارب الطفيف في الأنسجة الحيوانية المصدر، ومعالجة من قبل المشغل. وجدنا أن هذا التحدي يمكن التغلب على نحو فعال، والتقدير الكمي يصبح موثوقة إحصائيا بإعداد تريبليكاتيس لكل مجموعة العلاج. وأخيراً، استخراج وفرز خلايا الإنسان والفئران المنشأ لتحليل ما بعد الفحص يمكن أن يكون تحديا. ومع ذلك، يمكن تطبيقها بروتيناسيس محددة، بما في ذلك ديسباسي، وحل الاسترداد خلية لاستعادة الخلايا لتحليل التعبير الجيني أو إيمونوفينوتيبيك.

مقارنة بالأساليب القائمة أما الثقافة نوع وحيد خلية بطانية أو يعيش النظم الحيوانية، يعرض هذا يستخدم تحليل التركيبة السابقين فيفو الابهري الأنسجة و BME. يمكن هذا الإعداد المستخدم للحصول على البيانات النوعية والكمية على حد سواء توضيح خصائص الأوعية خلية العلاج المرشحين. الجمع بين BME والأنسجة الخلوية متعددة السابقين فيفو يوفر خصائص محاكاة المكروية التي قد تواجه نوع الخلية العلاجية بعد الإدارة المحلية عن كثب. نظراً لإمكانية عدد كبير من أوجه الشبه ورقابة وثيقة على شروط الثقافة، يتم توفيرها المشغل مع نظام الذي يحتوي على العناصر اللازمة لتقييم موثوق بها، في حين القضاء على المتغيرات والتناقضات الموجودة في نماذج حيوانية. وعلاوة على ذلك، تقييمات أكثر جدوى لأنه يقلل من التكلفة والحاجة إلى إجراءات الحيوان المتكررة. فحوصات خلية مفردة والنماذج الحيوانية الأكثر تفتقر إلى العوامل والمتغيرات التي أدخلها الاستجابات المناعية وإلا تحدث في التطبيق السريري لخلية العلاج المرشحين. يغير استجابة التهاب الأوعية ومن ثم التأثير العلاجي للمواد مزروع أو خلايا لا يمكن تحديده كمياً بدقة. والرزن حلقة الابهر يستبعد العديد من المكونات التحريضية التي سوف تخل بقياسات المقايسة. ومع ذلك، أنه يحتوي على المقيمين الضامة التي هي الجهات الفاعلة الهامة في التنمية ميكروفاسكولاتوري32. بسهولة تحديد شبكة بطانية والخلايا البشرية بريستينيد، أثر السيتوكينات الالتهابية MSC يفرز، والعناصر الخلوية حتى للنظام المناعي، ويمكن بسهولة ملاحظة استخدام هذا الفحص.

ارتفاع سيطرة المستخدم على شروط المقايسة واستنساخه بطبيعة الإعداد التجريبية يسمح لإدخال عناصر إضافية للنظام. أولاً، يمكن استخدام مقايسة خاتم الابهري كنموذج لإصابة. بعد تضمين خواتم الابهر وتنتشر بطانية، يمكن إدخال فحوصات للإصابات الدماغية، العوامل التحريضية (تنف-α) أو البكتيرية lipopolysaccharide (LPS)، تليها لجنة السلامة البحرية بالإضافة إلى تحديد إمكانية إنقاذ الأوعية استجابة بعد الإصابة. ثانيا، توضيح الآليات الممكنة لكيف MSCs يسهم في استجابة الأوعية، نيوترالييمكن أن تستخدم الأجسام المضادة زينغ لإسكات المستقبلات المحتملة الحرجة لتفاعلات الخلية للخلية. أخيرا، يمكن مقايسة حلقة الابهر للتحقيق في خصائص paracrine MSCs، الإعداد في نظام ترانسويل لاستبعاد تأثير التفاعلات خلية إلى خلية من استجابة الأوعية ولكن التركيز على خصائص باراكريني.

باختصار، المقايسة خاتم الابهري يمكن تقييم القدرة وفاعلية الخلية العلاج المرشحين التوسط من أجل تجهيز وإدارة المحتوى في المؤسسة تهاجر إلى مناطق الأوعية، والإسهام في التنمية السفينة من خلال الاتصال الجسدي. ويمكن وضع خاتم الابهري السابقين فيفو مقايسة الأوعية كأداة فرز المسبق القيمة والكمية لخطوط الخلايا المرشحة للعلاج بالتجدد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الدكتور كليفورد ليبراتش L. حامل مشترك للبراءة: أساليب العزل واستخدام الخلايا المستمدة من أنسجة الحبل السري الاثلوث الأول. منح في كندا وأستراليا.

Acknowledgements

الكتاب أشكر الموظفين التالية وبحوث الأفراد: أندريه غوتييه-فيشر، ماثيو ليبراتش، تانيا باريتو، فيلاوتابيلاي ثارسان، وسارة لاروندي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56, (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10, (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105, (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3, (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits? Discov Med. 9, (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50, (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7, (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122, (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14, (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15, (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5, (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13, (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7, (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105, (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10, (7), e0131946 (2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98, (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10, (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212, (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80, (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes? Cell Stem Cell. 3, (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22, (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1, (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181, (8), 5711-5719 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics